CN1188521C

CN1188521C - 编码具有合成噢哢类活性的蛋白质的基因

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Publication number: CN1188521C
Application number: CNB998007854A
Authority: CN
Inventors: 榊原圭子; 福井祐子; 田中良和; 久住高章; 水谷正子; 中山亨
Original assignee: Suntory Flower Industry Co Ltd; Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 1998-04-17
Filing date: 1999-04-16
Publication date: 2005-02-09
Anticipated expiration: 2019-04-16
Also published as: EP1001028A4; US6982325B1; EP1001028A1; JP4318321B2; IL133469A; WO1999054478A1; ATE328086T1; CA2294045C; CN1272140A; US20060020123A1; DE69931579D1; DE69931579T2; EP1001028B1; NZ501772A; CA2294045A1; US7592436B2; IL133469A0; CN1644690A; AU3171199A; ES2260905T3

Abstract

提供例如与金鱼草等花色有关的具有噢哢合成酶活性的蛋白质以及编码该蛋白质的基因、特别是cDNA、及其用途。通过将该基因导入查耳酮异构酶缺损的植物后使其表达，可以使该植物的花带有黄色。

Description

编码具有合成噢哢类活性的蛋白质的基因

所属技术领域

本发明是有关编码具有以查耳酮类为底物合成噢哢活性的蛋白质的基因及其应用的发明。更详细地说，本发明是有关编码具有以查耳酮类为底物合成噢哢类活性的多酚氧化酶的基因及其应用的发明。再详细点说，本发明例如是有关编码具有以查耳酮类为底物合成噢哢类活性的来自于金鱼草的蛋白质的基因及其应用的发明。

背景技术

花的颜色中，橙、红、紫和青主要是由称之花青甙的类黄酮产生的。黄色大多是由所谓类胡萝卜素、betalains的类黄酮以外的化合物产生的，但一部分植物的黄色是由类黄酮产生的。例如金鱼草、深波叶补血草、牵牛花、大丽花、蜡菊、菊芋、大波斯菊一部分品种中的花瓣中存在着属于噢哢类的化合物(齐藤、BIO HORTI 1、49-57、1990)。

作为噢哢类已知有4’，6-二羟基-噢哢、4，4’，6-三羟基-噢哢、金鱼草素、硫磺菊素、蜡菊噢哢等，金鱼草中含有金鱼草素和蜡菊噢哢、深波叶补血草中含有金鱼草素、牵牛花中含有金鱼草素、大丽花含有硫磺菊素、蜡菊含有蜡菊噢哢、菊芋含有硫磺菊素。

另外已知在菊科的金鸡菊属、向日葵属、肿柄菊属、百日菊属、Vinguiera属，杜鹃科的越桔属，莎草科的莎草属，豆科的金合欢属、紫檀属、大豆属，茜草科的玉叶金花属的一部分也有噢哢类化合物存在于植物体中(类黄酮(The flavonoids)，J.B，Harbone编，1988，Chapman &Hall，340-342)。

虽然花青素甙的生物合成途径正在深入地研究，而有关噢哢的生物合成，从其结构看出4’，6-二羟基-噢哢可由2’，4，4’-三羟基查耳酮合成的，关于它的反应也有报道说与过氧化物酶有关(Rathmel和Bendall，生物化学杂志(Biochem.J)127，125-132，1972)，但使用植物花瓣的提取液等明确测定噢哢的生物合成反应的例子还没有，阐明植物花瓣中发生了什么样的反应的报告也没有。另外纯化参与噢哢合成的酶的报告也没有。

发明的公开

在此本发明人试图阐明噢哢的生物合成系统，提供控制植物、特别是植物花色的手段。

本发明人建立了使用含噢哢类的金鱼草花瓣的粗提取液测定由查耳酮类合成噢哢类反应的分析方法。此时生成的噢哢类并不是以前人们认为的4’，6-二羟基-噢哢，而是金鱼草素，此次可测定的反应是到目前为止人们还不知道的反应。另外使用本分析方法从金鱼草的花瓣可以将以查耳酮类为底物合成噢哢(金鱼草素)的酶(金鱼草素合成酶)纯化至电泳上单一一条带。使用该纯化的酶样品弄清了该酶的生物化学性质。也确定了该酶的部分氨基酸序列。根据该氨基酸序列从来自金鱼草花瓣的cDNA文库得到了以查耳酮类为底物合成噢哢的噢哢合成酶的基因。

作为查耳酮类已知有四羟基查耳酮、五羟基查耳酮、紫铆因、2’，4，4’-三羟基查耳酮等。

另外得到的基因在作为多酚氧化酶活性中心的铜的结合区域具有同源性。因此就已知的一种多酚氧化酶-酪氨酸酶是否具有由查耳酮合成噢哢活性进行确认时，明确了酪氨酸酶也具有合成噢哢活性。

因此本发明提供编码具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的蛋白质的基因。进一步是提供编码具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的多酚氧化酶的基因。再进一步是提供编码具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的氨基酸序列如序列2所示的蛋白质的基因。另外本发明还提供含有上述基因的载体。

另外本发明还提供经上述载体转化的宿主。该宿主既可以是微生物、植物细胞、动物细胞等细胞，也可以是植物体。

本发明还提供以培养上述细胞，或栽培上述植物为特征的噢哢合成酶、例如金鱼草素合成酶的生成方法。生成的酶可以提取，还可以为了调节植物体内的颜色的色调使其发挥功能。这种情况下通过植物体内生成的酶合成噢哢类，该噢哢类可以调节植物体、例如花的颜色。

因此本发明也提供植物花色的调节方法，其特征是将具有以查耳酮类为底物合成噢哢类活性的酶基因，例如金鱼草素合成酶基因导入植物或植物细胞，使该基因表达，通过生成的酶在植物体内合成噢哢类。另外本发明也提供象上述那样花色被调节的植物。

另外本发明还提供噢哢类的合成方法，其特征是使上述的酶蛋白质作用于作为底物色素的查耳酮类化合物。

本发明还提供上述基因编码的酶蛋白质。

附图的简单说明

图1表示噢哢类和查耳酮类化合物的结构式。

图2表示噢哢生物合成的路线。

图3表示在使用了SYP8-17的黄色金鱼草的各个器官内进行的RNA印迹杂交解析结果。

图4表示在使用了SYP8-17的黄色金鱼草花瓣的各个发育阶段进行的RNA印迹杂交解析结果。

花瓣发育阶段(Petal stage)1：花蕾花瓣长达1厘米

花瓣发育阶段(Petal stage)2：花蕾花瓣长1-1.5厘米

花瓣发育阶段(Petal stage)3：花蕾花瓣长1.5-2.0厘米

花瓣发育阶段(Petal stage)4：花蕾花瓣长2.0-2.5厘米

花瓣发育阶段(Petal stage)5：花蕾花瓣长2.5-3.0厘米

花瓣发育阶段(Petal stage)6：开花的花瓣长3.0厘米以上

图5表示在使用了SYP8-17的黄色、粉红色、白色的各个金鱼草花瓣进行的RNA印迹杂交解析结果。

图6是表示由于添加噢哢合成酶SYP-8的抗体(抗SYP-8)以及其它的参照抗体(抗band A和抗β-半乳糖苷酶)引起的噢哢合成酶活性抑制情况图。

图7表示添加抗SYP8-IgG-Sepharose 4B时，上清中残存的SYP8蛋白量。

发明的实施方案

首先从黄色的金鱼草的花瓣利用各种层析法纯化金鱼草素合成酶。然后按照常规方法解析金鱼草素合成酶的部分氨基酸序列，合成对应于这些氨基酸序列的寡核苷酸。

另外从同样的金鱼草的花瓣纯化Poly A+RNA，利用常规方法建立cDNA文库。

以黄色的金鱼草花瓣的cDNA为模板，使用上述合成的寡核苷酸进行PCR，获得对金鱼草素合成酶特异的DNA片段。将该DNA片段亚克隆入载体中，构建质粒。

利用上述质粒含有的插入DNA筛选上述的cDNA文库，得到克隆。然后从该克隆分离质粒，确定碱基序列。

已知具有酶活性的蛋白质含有对其酶活性必需的区域和非必需的区域，非必需区域内即使一个或多个氨基酸去除(缺失)、附加和/或由其它的氨基酸置换而被修饰，该酶活性仍能维持。因此本发明不只是包含氨基酸序列如序列2所示的蛋白质，也包含具有在序列2所示氨基酸序列中除去或缺失、附加、和/或被其它氨基酸置换一个～数个氨基酸而修饰的氨基酸序列、而且维持以查耳酮类为底物合成噢哢活性的蛋白质，以及编码该蛋白质的基因。

另外已经知道具有同一酶活性的蛋白质有时会因等位基因变异而具有不同的氨基酸序列。进一步知道具有同一或同等酶活性的酶有多种分布，这些酶具有很高的氨基酸序列同源性。而且编码这些蛋白质的基因通过与本发明基因的杂交进行选择是有可能的。因此本发明也包含在严格条件下与序列1所示碱基序列的核酸进行杂交的，而且编码具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的蛋白质的基因，以及由该基因编码的蛋白质。

作为与序列1所示碱基序列的核酸进行杂交的，而且编码具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的蛋白质的基因，无论是对编码序列2记载的氨基酸序列的基因进行人工修饰过的基因，还是取自天然的基因都可以。取自天然的基因有从含有噢哢合成酶的植物、例如金鱼草、深波叶补血草、牵牛花、大丽花、蜡菊、菊芋等得到的cDNA或基因组DNA。杂交的严格程度，例如可以是5×SSC 50℃，优选条件是2×SSC 50℃，更优选0.2×SSC 50℃。

相对于具有酶活性的天然蛋白质的氨基酸序列来说，具有高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质往往具有与天然蛋白质同样的酶活性，这一点已被人们所了解。因此本发明也包含相对于序列2所示氨基酸序列，具有55％以上，优选60％以上，更优选70％以上，再优选80％以上，特别优选具有90％以上同一性的氨基酸序列的，而且具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的蛋白质，以及编码该蛋白质的基因。

具有同等酶活性的许多酶往往具有共同的抗原决定部位。因此本发明也包含与具有合成噢哢活性的蛋白质、特别是与氨基酸序列如序列2所示蛋白质的抗体特异结合的，而且具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的蛋白质，以及编码这些蛋白质的基因。

本发明的编码氨基酸序列如序列2所示的蛋白质的基因可以以cDNA或基因组DNA从金鱼草中获得。cDNA的克隆方法在实施例8～10中有具体的记载。为了获得基因组DNA，由金鱼草按照常规方法建立基因组DNA文库，通过利用上述的cDNA或其片段按照常规方法进行筛选获得基因组DNA。

本发明的编码的序列为具有序列2所示氨基酸序列被修饰的氨基酸序列的蛋白质的基因可以通过对编码氨基酸序列如序列2所示的蛋白质的DNA，例如cDNA的碱基序列通过常规方法进行定点突变、PCR法等基因操作进行修饰来制备。

与碱基序列如序列1记载的核酸杂交，而且具有以查耳酮为底物合成噢哢类的酶活性的基因中，来自天然的基因可以通过从能产生具有合成噢哢类的酶活性的植物中按照常规方法建立cDNA文库或基因组DNA文库，用例如碱基序列如序列1所示的cDNA或其片段作为探针筛选这些文库得到。此时的杂交条件可以使用前面叙述的条件。

另外由于从金鱼草中得到的噢哢合成酶是多酚氧化酶的一种，所以本发明人认为其它的多酚氧化酶也具有由查耳酮类合成噢哢类的活性，研究了作为多酚氧化酶来自红色面包霉以酪氨酸酶出售的酶是否具有合成噢哢的活性。结果表明酪氨酸酶具有合成噢哢的活性。由此明确了具有多酚氧化酶活性的酶具有以查耳酮为底物合成噢哢的活性。

具有多酚氧化酶活性的酶的生理作用现在还不清楚，主要分为儿茶酚氧化酶(酶编号：1.10.3.1)、漆酶(酶编号：1.10.3.2)和酪氨酸酶(酶编号：1.14.18.1)三类，酶的编号是按照对底物的特异性分类的。无论那一种都是酶反应中心是铜的铜酶，人们认为蛋白质的高级结构等产生底物特异性上的差别。

如上所述，由于在多酚氧化酶中与铜结合的区域存在着保守区域，所以可以制备以该区域的氨基酸序列为基础的引物，按照PCR法等常规方法得到多酚氧化酶基因(植物生理学(Plant Physiol)，107卷，1083-1089页，1995；植物生理学Plant Physiol，109卷，525-531页，1995；)，由此得到的基因可以获得编码具有合成噢哢活性的蛋白质的基因。

本发明还提供具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的上述蛋白质的制造方法。该方法的特征是：将构建的含有编码上述蛋白质的DNA的载体导入宿主，然后培养或培育该宿主，获得所期望的上述蛋白质。宿主可以是宿主细胞，也可以是植物等生物体。宿主细胞可以是原核细胞、特别是细菌细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)属细菌，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短芽孢杆菌Bacillusbrevis等，低等真核生物例如真菌类、如酵母、例如酵母Saccharomyces属酵母、如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，或霉菌，例如曲霉(Aspergillus)属霉菌、如米曲霉Aspergillus oryzae、黑曲霉Aspergillus niger等。

作为高等真核生物细胞宿主，如昆虫细胞、如蚕的细胞，动物细胞、如CHO细胞、人培育细胞、如Hela细胞等。

本发明的基因可以在生物体、例如动物、植物等中表达。有关在植物中的表达，下面有具体记载。

含有本发明的DNA的载体、特别是表达载体含有表达控制区，表达控制区依赖于宿主细胞。例如作为细菌表达载体的启动子可以使用trc启动子、tac启动子、lac启动子、T7启动子等，作为酵母表达启动子可以使用糖酵解系统酶基因的启动子、例如甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、半乳糖激酶启动子等，而作为动物细胞用的表达载体的启动子可以使用病毒启动子。

为了从培养物中获取具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的蛋白质，可以使用液相层析、亲和层析等蛋白质分离纯化中常用的手段。亲和层析可以利用与本发明的具有合成噢哢活性的蛋白质的抗体，例如抗血清或单克隆抗体的特异结合进行。

本发明的具有合成噢哢活性的蛋白质的抗血清(多克隆抗体)是通过如下过程制备的：将本发明的蛋白质、例如实施例4中得到的蛋白质与常用的佐剂一起免疫动物、例如兔子，然后从该动物获取抗血清。单克隆抗体制备方法是：按照常规方法将本发明的蛋白质免疫动物、例如小鼠，然后将从该小鼠得到的B淋巴细胞，例如脾细胞与老鼠等的脊髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞，再通过培育该细胞来制备单克隆抗体。

如果具备现在的技术水准，可将该cDNA连接于构成型的或诱导型的启动子的调控区下，使用土壤杆菌的系统或使用基因枪、电穿孔系统导入植物、例如矮牵牛花、蔷薇、石竹花、菊花、蓝猪耳、马鞭草、大丁草花、烟草、草莓、草原龙胆、龙胆、蓝猪耳、唐菖蒲、郁金香等，在花瓣等使噢哢合成酶表达也是有可能的。

可以预料噢哢合成酶表达的花瓣等可以合成噢哢，花瓣的颜色会变成黄色。这样得到的植物可以提供以前的品种不存在的新的颜色的花。而在有黄色品种的植物中虽然存在含有类胡萝卜素的植物品种(菊花和蔷薇等)，或是含有betalains的植物品种(仙人掌)，但由于这些黄色与噢哢类的黄色在色调上不同，所以在已有黄色品种植物的色幅扩大方面也是很有用的。

金鱼草中具有黄色花的品种有时缺少与噢哢合成酶共存的查耳酮异构酶的酶活性。由于查耳酮异构酶起到与噢哢合成酶竞争的作用，所以如果存在查耳酮异构酶，由四羟基查耳酮可以生成4’，5，7-三羟基黄烷酮(柚皮素)，最终变成花青素甙和黄酮。因此为了使噢哢合成酶基因在植物中表达，生产噢哢类化合物，该植物最好是查耳酮异构酶缺损的植物。

一般植物基因人为地抑制其活性是有可能的，特别是抑制参与类黄酮合成的基因的例子已了解了很多。人为抑制基因表达有反意义法和共抑制法，已知类黄酮合成系统的基因无论用那种方法抑制都是可能的。(van der Krol等、自然(Nature)(1988)333，866-869、Napoli等，植物细胞(Plant Cell)(1990)2，279-289)。同样抑制查耳酮异构酶基因的表达也是可能的。

查耳酮异构酶基因已经从许多植物品种得到了。例如矮牵牛花、苜蓿、金鱼草、苹果、菜豆、葡萄(Holton等，植物细胞Plant Cell(1995)，7，1071-1083)。比较这些查耳酮异构酶的氨基酸序列，无论那一品种的该序列都被很好地保守着。为了克隆参与类黄酮合成的某个基因只要将来自其它植物的基因作为探针就很容易得到，这样的例子很多。或者是比较已知的基因或氨基酸序列，利用保守的区域通过PCR也可以克隆。因此查耳酮异构酶基因无论从那种植物都可以得到(Gutterson，Hort.，科学(Sci.)，30卷，964～966页，1995)。

另外通过抑制黄烷酮3-羟化酶或二羟基黄酮醇4-还原酶的基因表达也可望达到同样的效果。由于这些酶的基因从很多品种植物都可得到(Gong等，植物分子生物学(Plant.Mol.Biol.)，35，915-927，1997)，所以通过使用与查耳酮异构酶同样的方法从那种植物都可以得到。

因此为了对在某一植物品种中具有来自噢哢类的黄色的花的品种进行育种，只要使噢哢合成酶在花瓣中表达就可以了。优选是抑制查耳酮异构酶基因的表达，只使噢哢合成酶表达。此时作为这些基因表达调节使用的启动子无论是构建的还是花瓣特异的都可以。这些技术可以进一步完善，如果与可将糖加到噢哢类的糖转移酶基因共同导入该植物的话，可以得到稳定的黄色花。这些操作只要具备现在的技术水准都是可能的。

另外已知就大丽花和金鱼草来说，花青素甙和噢哢共存时，花色变成褐色。通过向花中生产花青素甙的植物导入噢哢合成酶，培育褐色的花的品种也是有可能的。象这样的花作为新的花在产业上是很重要的了。

实施例

以下通过实施例，详细地叙述发明。

实施例1.四羟基查耳酮的制备

向4g 4’，5，7-三羟基黄烷酮(柚皮素)中加入20ml的50％(V/W)氢氧化钾，使其完全溶解。将该溶液于100℃保持90秒钟后，立刻用300ml冰水使溶液稀释冷却，停止反应。然后在通风橱内向该溶液中加入6N盐酸，将pH调至3以下，使沉淀生成。将生成的黄色沉淀过滤出，用最少量的乙醇溶解，然后一边用冰冷却，一边缓慢加入400ml冷水。放置过夜后，将经8000转、30分钟离心分离的沉淀再悬浮于水中，进行冷冻干燥。冷冻干燥后的四羟基查耳酮(THC)的重量有2.7g。

将粗THC溶解于最少量的甲醇中，通过分离用反相高效液相层析纯化THC。使用岛久社的YMC D-ODS-5 S-5 120A(2.0cm×25cm)，用40％(V/V)乙腈、0.03％(V/V)三氟乙酸水溶液洗脱，流速为4.5ml/分。THC大约在25分钟时被洗脱出，而4’，5，7-三羟基黄烷酮大约在29分钟时被洗脱出。收集THC级分，并冷冻干燥。在同一条件下再进行一次层析，制备成纯化的THC。

实施例2.金鱼草素的制备

将金鱼草品种蝶黄花瓣290g在液氮中粉碎，于2L含有0.1％TFA的50％乙腈中浸渍一个晚上。进行硅藻土过滤，将滤液减压浓缩后，用HP-20纯化。将黄色色素级分浓缩供分离HPLC用。使用岛久社的YMC D-ODS-5 S-5 120A(2.0cm×25cm)，A液用水，B液用0.1％TFA，50％乙腈，进行从B20到B60％的直线浓度梯度层析，时间为120分钟。结果蜡菊噢哢-6-葡萄糖苷于40分钟时洗脱出，金鱼草素-6-葡萄糖苷于53分钟时洗出，四羟基查耳酮-6-葡萄糖苷于100分钟时被洗出。得到的金鱼草素-6-葡萄糖苷经β-半乳糖苷酶水解就得到了金鱼草素。

实施例3.噢哢合成酶活性的测定方法

通过向加有50μl pH5.0的1M醋酸钠缓冲液和用水稀释的350μl的粗酶液中加入于乙醇中366nm的吸光度为462的THC 5μl使反应开始。在30℃下反应1小时后，加入含有1％(V/V)的TFA的90％(V/V)乙腈水溶液100μl停止反应后，利用HPLC测定活性。粗酶液使用的是后面的实施例4讲到的各纯化步骤中的粗酶液。

柱子使用的是YMC J’Sphere ODS M80(4.6×150mm)，流速为0.7ml/分。溶剂A为0.1％TFA，溶剂B为含有0.1％TFA的90％乙腈溶液，样品加到柱子上后，最初3分钟，保持A∶B＝7∶3，接下来的10分钟用直线浓度梯度使得A∶B＝6∶4，将该浓度保持5分钟，随后的1分钟使得A∶B＝7∶3，使该浓度保持5分钟。在该条件下底物THC大约在20.9分钟被洗脱出来。作为反应产物被检测出的是大约在8.8分钟被洗脱下来的化合物。该化合物就象后面叙述的那样是金鱼草素。

可知通过该反应可以由THC生成金鱼草素。

实施例4.噢哢合成酶的纯化

1)酶的纯化

将金鱼草开始着黄色的花和萼之间的白的花瓣除去的花蕾32175g作为起始材料进行酶的纯化。大约每600g花加冰冷却的缓冲液A(0.01M醋酸钠，pH5.0)2400ml、120g的聚乙烯聚吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrolidone)(PVPP)，然后用ワ-リング粉碎机进行1-1.5分钟破碎。

粉碎液于4℃下进行8000转、15分钟的离心分离，所得上清中加入硫酸铵至60％饱和，搅拌溶解后放置。于4℃下进行8000转，15分钟的离心分离，将沉淀悬浮于最小容量的缓冲液A中，对缓冲液A透析。将透析内液于4℃进行8000转、15分钟的离心分离，其上清作成硫铵分级浓缩液。将硫铵浓缩液于-20℃下冷冻保存用于SP-Sephadex C50层析。

2)SP-Sephadex C50

得到的硫铵分级浓缩液分三次进行以下操作。测定透析后的硫铵分级浓缩液的电导度，用冰冷却的去离子水稀释浓缩液，根据需要使电导度于4℃达到0.8-1mS。将硫铵分级浓缩液加到经缓冲液B(含有数μM的THC的缓冲液A)充分平衡的SP-Sephadex C50柱(6cm×25.5cm；约0.7L)。加样后用缓冲液B将柱子充分洗净。用缓冲液B(2.0L)和含有0.6MNaCl的缓冲液B(2.0L)间的直线浓度梯度洗柱子，同时按23ml分级。收集活性级分(约1200ml)，过滤灭菌，于4℃下保存用于Con ASepharose层析。

3)Con A Sepharose

Con A Sepharose层析分为级分A(1100ml含有374,000U)和级分B(2900ml含有831,000U)两次进行。将MnCl₂和CaCl₂溶解于级分A，使它们的浓度分别达到1mM，然后加到经缓冲液C(含有1mM MnCl₂、1mMCaCl₂、0.5MnaCl的缓冲液B)平衡的Con A Sepharose柱(2cm×12cm；约40mL)。加样后用大约0.3L的缓冲液C洗净柱子。流出液和洗净级分(300mL)中分别含有负荷前的大约50000U(各为原来的13％)的活性。

洗净后，通过缓冲液C(250mL)和含有0.2M甲基-α-D-葡萄糖苷、0.2M甲基-α-D-甘露吡喃糖苷的缓冲液C(250mL)之间的直线浓度梯度洗脱柱子，同时按4mL分级，收集活性级分(计78mL)。活性级分对缓冲液D(5mM磷酸钠缓冲液(pH5.0)，0.3mM CaCl₂、3-6μM THC)充分透析。洗净级分的活性与留待进行第二批层析的活性级分B合并再次进行层析。

将MnCl₂和CaCl₂溶解于剩下的级分B，使它们的浓度分别达到1mM，然后加到经缓冲液C平衡的Con A Sepharose柱(3.6cm×12cm；约120mL)。加样后用大约0.3L的缓冲液C洗净柱子。流出液和洗净级分(300mL)中几乎不含有活性。洗净后，通过缓冲液C(350mL)和含有0.2M甲基-α-D-葡萄糖苷、0.2M甲基-α-D-甘露吡喃糖苷的缓冲液C(350mL)之间的直线浓度梯度洗脱柱子，同时按8mL分级，收集活性级分(计150mL)。活性级分对缓冲液D充分透析后，与先前的样品合并得到活性级分(计250mL)。

4)Gigapite

将上述透析内液(250mL)加到经缓冲液D平衡过的Gigapite柱(生化学工业；2cm×16cm，50mL的开口柱)。加样后用缓冲液D(250mL)洗净柱子。然后用缓冲液D(200mL)和含有0.5M磷酸钾缓冲液(pH5.0)(200mL)间的直线浓度梯度洗脱柱子，同时按4ml分级，收集活性级分(约120ml)。

5)HiLoad 16/60 Superdex 75pg FPLC

将{3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate}(CHAPS)溶解于活性级分中，终浓度为0.1％，使用Amicon PM10膜进行超滤，将活性级分浓缩至18mL。浓缩的级分分6次进行以下操作。

使用FPLC系统，用含有0.07％CHAPS，0.15M NaCl的缓冲液B平衡冰冷却的HiLoad 16/60 Superdex 75pg柱，用0.5ml/min流速洗脱，按2ml分级，收集活性级分(计63mL)。

6)SP-Sepharose FF FPLC

将得到的活性级分对缓冲液E(含有0.07％ CHAPS的缓冲液B)于4℃下充分透析。用FPLC柱分两次进行以下的层析。用缓冲液E平衡冰冷却的SP-Sepharose FF柱(1×16cm)。将样品加到柱子上，使用缓冲液E作为A液，含有0.7M NaCl的缓冲液E作为B液。最初30分钟用95％A液、5％B液洗柱子，其后的120分钟进行到55％A液、45％B液的直线浓度梯度洗脱，之后的10分钟用同样的条件洗脱。流速0.5ml/min，按1.0ml分级，收集活性级分(计27.8mL)、过滤灭菌于4℃下保存。

7)Gigapite柱层析

活性级分中的22ml用Gigapite(1×14cm)FPLC进一步纯化。样品22ml对含有0.07％CHAPS的0.005M磷酸钾缓冲液(pH5.0)于4℃下透析过夜，按下面的条件进行FPLC，也观察到了活性和蛋白带之间的关系。作为A液使用含有0.07％CHAPS，0.3mM CaCl₂的0.005M磷酸钾缓冲液(pH5.0)，作为B液使用含有0.07％CHAPS的0.5M磷酸钾缓冲液(pH5.0)，将柱子和缓冲液冰冷却后进行层析。

用100％A液洗柱子，时间30分钟，流速5ml/min，然后用6秒时间达到95％A液、5％B液，接下来的149分54秒进行达到20％A液、80％B液直线浓度梯度洗脱，之后的155分钟内用同样条件洗脱，按1.0ml分级。

从层析和活性测定结果收集确认与活性关系密切的40kDa的蛋白质级分，供一级结构解析用。

实施例5.三类柱层析中的活性测定和SDS-PAGE

1)Superdex200 Smart system

取50μl样品用Superdex200 Smart system进行分级。用含有0.07％CHAPS、0.15M NaCl的0.01M醋酸钠(pH5.0)作为溶剂，于4℃下进行以下操作。流速40.0μl/min，按40.0μl分级，进行凝胶过滤层析。得到的样品进行活性测定和SDS-PAGE。酶活性是在分子量43kDa附近被洗脱出，样品中含有的蛋白质中40kDa蛋白质与活性最有关。

2)Alkyl-Sepharose HR5/5 FPLC

250μl样品对0.01M醋酸钠(pH5.0)于4℃下透析过夜，溶解硫酸铵使终浓度为2M。室温下进行Alkyl-Sepharose HR5/5 FPLC。作为A液使用含有2M(NH₄)₂SO₄的0.01M醋酸钠(pH5.0)，作为B液使用0.01M醋酸钠(pH5.0)。最初10分钟用100％A液洗柱子，在接下来的50分钟内进行最终达到B液100％的直线浓度梯度洗脱，后面的5分钟内用同样条件洗脱，按0.5ml分级。

每一级分各取400μl经Ultra Free C3GC(分级分子量10,000、Millepore)浓缩至40μl，取出其中的10μl进行SDS-PAGE分析，10μl用于活性测定。样品中含有的蛋白质中，发现40kD与活性密切相关。

3)Gigapite HR5/5 FPLC

300μl样品对含有0.07％CHAPS的0.005M磷酸钾缓冲液(pH5.0)于4℃下透析过夜，按下面的条件于室温下进行Gigapite HR5/5 FPLC。

作为A液使用含有0.07％ CHAPS，0.3mMCaCl₂的0.005M磷酸钾缓冲液(pH5.0)，作为B液使用含有0.07％CHAPS的0.5M磷酸钾缓冲液(pH5.0)，最初5分钟用100％A液洗柱子，接下来的6秒进行80％A液、20％B液洗脱，之后的44分54秒进行20％A液、80％B液直线浓度梯度洗脱，按0.5ml分级。进行活性测定和SDS-PAGE电泳。样品中含有的蛋白质中40kDa蛋白质与活性最有关。

以上Superdex200 Smart system、Alkyl-Sepharose FPLC以及Gigapite FPLC柱层析的结果表明大约40kDa的蛋白质与活性最相关。

实施例6.噢哢合成酶的性质

用纯化的噢哢合成酶进行反应，可以证实无论是由THC还是由五羟基查耳酮都可以纯化出金鱼草素。生成的产物经HPLC分析可以确认是金鱼草素。

该酶的分子量经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定为40kDa，用Superdex200凝胶过滤法测定是43kD。由此可知噢哢合成酶是个单体酶。1mM的一价铜离子、二价铜离子、二价铁离子、三价铁离子存在下90％以上酶活性被抑制。由于该酶可与Con A Sepharose结合，所以该酶可能是个含糖的酶。另外若添加过氧化氢，酶活性稍有上升。

以THC为底物反应时，有认为是金鱼草素的产物生成，大量收集该产物进行结构确定。将20ml含有10mM过氧化氢的1M醋酸钠缓冲液pH5.0、酶液20ml、水58ml、THC 10mg(0.5ml)混合，于30℃下保持3.5小时。反应后，使反应液吸附于Sep-pak C18，用甲醇洗脱。用蒸发器浓缩后，用分离用HPLC分离纯化。使用的柱子是YMC D-ODS-5 S-5 120A(2.5×25cm)。用含有0.03％TFA的40％乙腈水溶液进行洗脱，流速为4.5ml/分。回收大约17分钟时洗脱出的峰，干燥后得到大约4.9mg的生成物。用1HNMR、质谱确定结构，该化合物是金鱼草素。

实施例7.噢哢合成酶的氨基酸序列的确定

向得到的大约1nmol的噢哢合成酶样品加入终浓度为2％的SDS样品处理液，在非还原条件下使用制备型电泳装置(Biophoresis Atoh社)进行电泳，回收分子量41000的多肽。该多肽经使用了C4柱(Develosil300C4-HG-5)的反相HPLC进行分离，检测出一个峰，可以确认纯化的噢哢合成酶是纯的。

该多肽经赖氨酰内肽酶AP1消化。反应用缓冲液是40mM Tris-HCl(pH9.5)，含有0.01％的Tween20和2M尿素。消化物经使用了BakerbondODS(4.6mm×25cm)柱的反相HPLC分离纯化。即用0.05％三氟乙酸水溶液作为A液，用含有0.05％三氟乙酸的80％乙腈作为B液时，最初5分钟达到90％A液、10％B液。接下来的80分钟进行达到100％B液的直线浓度梯度洗脱，分离肽。

使用气相肽序列仪确定纯化出的肽的结构。确定的结构如下所示。

P5：(K)KLGYVYQDVEIP(序列编号：3)

P8：(K)IVYRQMVSSAK(序列编号：4)

P11：(K)TPQLFFGRPYRRGDQEF(序列编号：5)

P4-5：(K)IIDFELPXPSTTMRVRRAAHLVDDAYIXK(序列编号：6)

实施例8.金鱼草花瓣cDNA文库的建立

花瓣的cDNA文库的建立依据以下方法进行。从黄色的金鱼草的就要开出新鲜花的花瓣5g用R.McGookin等《分子生物学方法》(Method inMolecular Biology)vol.2(Humana Press Inc.1984)详细给出的硫氰酸胍/氯化铯方法获得RNA、使用寡核苷酸数dT30(日本Roche)，纯化PolyA+RNA。利用该PolyA+RNA，使用cDNA合成试剂盒，Uni-XR载体试剂盒(Stratagene)、λZAPII(Stratagene)作成载体，建立cDNA文库。建立方法依据Stratagene公司推荐的方法。得到的文库由16×10⁵噬斑形成单位(pfu)构成。

实施例9.利用递减法获得在黄色金鱼草中表达的基因

递减法是获得在某个组织或时期特异表达的基因的方法之一，这里利用PCR-Select^TM cDNA Subtraction kit(Clontech公司)按照推荐的方法进行。使用来自黄色金鱼草花瓣的cDNA作为tester、来自粉红色金鱼草花瓣的mRNA作为driver。最终使用TA克隆试剂盒(Invitogen社)将PCR扩增的DNA片段亚克隆到PCRII^TM载体中，确定了各自的碱基序列。

其中认为是命名为SYP8的基因编码的氨基酸序列如序列7所示。

RQMVSSAKTPQLFFGRPYRRGDQEFPGVGSIELVPHGMIHLWTGSENTPYGENMGAFY

STARDPIFFAHHSNVDRMWSIWKTLGGPRRTDLTDPDFLDASFVFCDENAEMVRVKVRDC

LDGKKLG (序列编号：7)

该氨基酸序列中，N-末端的25个氨基酸构成的序列和C-末端4个氨基酸构成的序列与实施例7中得到的序列P5、P8、P11一致。即确认该基因片段编码噢哢合成酶。

实施例10.全长噢哢合成酶基因的获得

利用DNA片段SYP8筛选前述金鱼草cDNA文库。引物的筛选用使用了非放射性系统检测试剂盒(Boehringer-社)方法进行。筛选了大约20万噬斑，结果得到很多的阳性噬斑。从中随机选择出20个噬斑，通过两次筛选分离出纯粹的噬斑，确定了其中最长的克隆SYP8-17的碱基序列。

碱基序列是通过合成寡核苷酸引物、用DNA Sequencer model 373A(ABI社)确定的。碱基序列和推测的氨基酸序列如序列1所示。利用该氨基酸序列进行数据检索时，该基因表现出与多酚氧化酶基因(GenBankAccession NO.L29451，D45385，Z11702)等有弱的同源性，可知该基因是一个新的基因。而与多酚氧化酶有同源性的主要区域是与作为多酚氧化酶的活性中心的铜的结合区域。

实施例11.噢哢合成酶基因的表达形式

利用SYP8-17进行黄色金鱼草的各个器官、花瓣的各个发育阶段的RNA印迹解析。另外也进行了黄色、粉红色、白色的各个金鱼草花瓣的RNA印迹解析。方法依据分子克隆(Molecular Cloning)(Sambrook等，冷泉港实验室出版社Cold Spring Harbour Laboratory Press，1989)。结果如图3、4和5所示。噢哢合成酶基因在花瓣中特异表达，而且在花瓣中的表达是与噢哢类合成同时进行的。而与黄色金鱼草的花瓣相比，噢哢合成活性很弱或检测不出来的粉红色和白色的金鱼草花瓣中也许是噢哢合成酶基因的mRNA的积蓄少所以几乎看不到。这些结果表明得到的基因与噢哢类的合成有关。

实施例12.马鞭草cDNA文库的建立

从马鞭草品种花手鞠紫(三得利)的新鲜花蕾5g象先前那样纯化mRNA，建立cDNA文库。cDNA文库的建立如实施例8那样进行。得到的文库是由0.8×106噬斑形成单位(pfu)构成。

实施例13.马鞭草查耳酮异构酶cDNA的克隆

比较序列已知的来自高等植物的查耳酮异构酶的氨基酸序列，以认为是高度保守的区域的氨基酸序列Phe-Val/Ile-Lys-Phe-Thr-Ala-Ile序列(序列编号：8)、Lys-Trp-Lys-Gly-Lys-Thr/Pro序列(序列编号：9)、His-Ala-Val-Cys-Asn-Glu(序列编号：10)的逆序列为基础合成以下的引物。

CHI-F1：5’-TT(T，C)(A，G)TN AA(A，G)TT(T，C)ACN GCN AT-3’(序列编号：11)

CHI-F2：5’-AA(A，G)TGG AA(A，G)GGN AA(A，G)(A，C)C-3’(序列编号：12)

CHI-R2：5’-(A，G)TG NGC NAC(A，G)CA(A，G)TT(T，C)TC-3’(序列编号：13)

用预先合成的CHI-F1和CHI-R2、或CHI-F2和CHI-R2的引物组合于96℃反应2分钟后，反复进行如下循环30次：96℃1分钟、42℃1.5分钟、72℃3分钟，最后于72℃反应7分钟。得到的PCR产物作为模板，再次在同样条件下进行PCR，就CHI-F1和CHI-R2引物组而言扩增了大约200bp的PCR产物，CHI-F2和CHI-R2的引物组扩增了大约800，600，400以及150bp的PCR产物。

得到的PCR产物使用TA克隆试剂盒(Invitogen社)亚克隆到PCRII^TM载体中。亚克隆的DNA片段的碱基序列用DNA Sequencer model 373A(ABI公司)确定。通过CHI-F1和CHI-R2、或CHI-F2和CHI-R2引物组合得到的PCR产物的序列分别是222bp和159bp，是长度不同的同样序列。由此推测出的氨基酸序列表现出与来自其它高度植物的查耳酮异构酶有很高的同源性。

对含有花手鞠查耳酮异构酶222bp的PCRII^TM载体用EcoRI消化，以得到的大约230bp片段为模板、CHI-F1和CHI-R2为引物进行PCR。扩增的大约230bp的PCR产物为模板用PCR法于95℃反应2分钟后，反复进行如下循环25次：95℃1分钟、42℃1分钟、72℃4分钟，最后于72℃反应7分钟，用毛地黄毒苷进行标记，用作筛选时的探针。从花手鞠cDNA文库进行的筛选使用的是非放射性系统的DNA检测试剂盒(Boehringer社)，按推荐的方法进行。

如果使用同样的方法也可以得到其它植物的查耳酮异构酶的基因。

实施例14.SYP8抗原的制备

用The QIAexpressionist kit(QIAGEN社)使实施例9记载的SYP8基因在大肠杆菌中表达，纯化。由于纯化出的噢哢合成酶标准样品的分子量是40～43kDa，所以可以想象到成熟型蛋白质是N末端和C末端的肽被切除后形成的。

在此合成了应当使序列2所示氨基酸序列中第61个残基甘氨酸残基到第416个残基赖氨酸残基的区域表达的QESYP8-5’，QESYP8-3’引物。

QESYP8-5’：5’-AA GGA TCC GGC CCT ATC GCC-3’(序列14)

QESYP8-3’：5’-GGG TTC GAA GAA TTC ATC TCT G-3’(序列15)

QESYP8-5’引物中导入了BamHI位点，QESYP8-3’引物导入了HindIII位点。进行PCR反应，反应液总量为100μl，组成如下：合成的QESYP8-5’，QESYP8-3’引物各30pmol、SYP-17基因1ng、1×克隆的pfu DNA聚合酶缓冲液(stratagene)、200μM dNTPs、克隆的pfu DNA聚合酶5单位(stratagene)。反应于94℃下保持45秒钟，然后反复进行如下循环25次：94℃45秒钟、50℃45秒钟、72℃4分钟，最后于72℃反应保持10分钟。使用TA克隆试剂盒(Invitogen社)将得到的PCR产物亚克隆到pCR2.1·TOPO^TM载体中，作成质粒pCR·QESYP8。pCR·QESYP8用BamHI，HindIII处理，将得到的大约1kb的DNA片段连接到经同样的BamHI，HindIII处理的pQE30载体(QIAGEN社)，构建成质粒pQESYP8。用pQESYP8转化大肠杆菌M15[pRep4]。大肠杆菌内的SYP8蛋白的表达和纯化依据制造者推荐的方法进行。得到的纯化蛋白经SDS-PAGE分析，确认有少量的共存的杂蛋白，再象以下那样进一步纯化。将蛋白溶液用Centriprep10(Amicon公司)浓缩至大约1ml，用蒸馏水透析，制成冷冻干燥样品。进行SDS处理后，用Biophoresis(Atoh社、4.5％浓缩胶、10％分离胶、15mA、按0.8ml分级)分离共存的杂蛋白。得到的最终纯化样品用Ultra Free 10(Millepore社)浓缩，同时置换成含有0.1％CHAPS的PBS缓冲液(1升中溶解了8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24gKH₂PO₄、用盐酸将pH调至7.4)。最终纯化的样品的蛋白浓度是1.0mg/ml。

实施例15.SYP8抗体柱的制备

实施例14中制备的SYP8抗原(1.0mg/ml)分为4次，各0.2mg，免疫两只兔子。初次免疫使用Freund完全佐剂。追加免疫时使用不完全佐剂。追加免疫是在初次免疫的第14天、第42天、第56天。方法按照《新生物化学实验讲座》12卷记载的方法。初次免疫后的第52天、66天、70天采血，得到的血液于37℃保持30分钟后，于4℃下静置过夜。去除凝集的血饼，得到抗血清。抗血清用0.85％NaCl稀释2倍后，加入一半量的冰冷却的Freegen(Hoechst日本社)，激烈搅拌后，1500转离心5分钟，脱脂、上清作为抗血清使用。

对脱脂的抗SYP8抗血清进行等量的0.15M NaCl溶液稀释，加入硫酸铵，使其饱和度达到33％，于8000rpm下进行30分钟离心分离。得到的沉淀对缓冲液A(0.05M Tris-HCl，pH8.6、0.15M NaCl)透析。透析内液上Hi Trap ProteinA柱(1ml)，纯化IgG级分。将透析后的样品加到经缓冲液A平衡过的Hi Trap ProteinA柱上，用缓冲液A洗净柱子后，依次用缓冲液B(0.05M柠檬酸缓冲液、pH5.3、0.15NaCl)、缓冲液C(0.05M醋酸缓冲液、pH4.3、0.15M NaCl)、缓冲液D(0.05M甘氨酸缓冲液、pH2.3、0.15NaCl)洗脱。利用紫外吸收法和免疫点印迹法确认IgG处于缓冲液C、缓冲液D两个级分中，将这两个级分混合，作为IgG级分。这些蛋白质的总量大约是70mg。得到的IgG级分对0.1M NaHCO₃、0.5M NaCl透析后，用Centricon 10(Amicon公司)浓缩至大约2mg/ml。

4.5g CNBr活化的Sepharose 4B悬浮于45ml的1mM HCl中，使用布氏漏斗用500ml的1mM HCl洗净。将洗净的树脂缓慢地加入到浓缩的IgG溶液中，于4℃下振荡过夜，使IgG固定化。通过布氏漏斗抽滤回收树脂，然后再悬浮于30ml、pH8.5的0.2M Tris-HCl缓冲液中，于4℃下振荡两夜，使树脂上残存的活性基团钝化。然后依次用pH5.0的0.2M醋酸缓冲液、pH8.5的Tris-HCl、以及pH7.8的0.01M磷酸钾缓冲液、0.2M NaCl洗树脂。作为对照抗Band A IgG、抗β-半乳糖苷酶IgG也分别进行同样处理，固定于Sepharose4B上。该固定化的Sepharose4B用作实施例16的IgG-Sepharose4B悬浊液(抗SYP8、抗Band A、抗β-半乳糖苷酶)。另外每单位重量树脂的反应IgG重量，3种抗体都大致设定成一样。固定化收率是90～100％。

实施例16.免疫沉降实验

向一定量的酶液分别加入牛血清白蛋白水溶液(终浓度0.1％)和实施例15制备的IgG-Sepharose4B悬浊液(抗SYP8、抗Band A、抗β-半乳糖苷酶；树脂相∶液相＝2∶1V/V)各0、200、500、815μl，然后用pH7.8的0.01M磷酸钾缓冲液、0.2M NaCl将总量补足1ml。将混合液于4℃振荡24小时，13000rpm离心20分钟，然后用上清测定噢哢合成酶活性。

噢哢合成酶活性的测定是向上清加终浓度0.1％CHAPS、5mM H₂O₂、pH5.4的0.1M柠檬酸缓冲液，总量为395μl，于30℃保持15分钟后，加THC(是用乙醇溶解使之A366＝600)5μl开始反应。于30℃反应60分钟后，加入100μl 10％TFA、90％乙腈停止反应。象实施例3所叙述的那样用HPLC通过分析反应液测定活性。

如图6所示那样，在使用抗SYP8-IgG-Sepharose4B时，上清中的酶活性随抗SYP8-IgG-Sepharose4B的添加量的增加而降低。作为对照加抗BandA-IgG-Sepharose4B、抗β-半乳糖苷酶-IgG-Sepharose4B时，噢哢合成酶活性无变化。用0.01M磷酸钾缓冲液、0.2M NaCl洗净作为沉淀回收的树脂测定噢哢合成酶活性时，只是对抗SYP8-IgG-Sepharose4B看到强的噢哢合成活性。

上清经SDS-PAGE、蛋白质印迹法分析时就象图7所示那样，噢哢合成酶的信号随抗SYP8-IgG-Sepharose4B的添加量的增加而降低。而作为对照在使用抗BandA-IgG-Sepharose4B的同样实验中，噢哢合成酶基因的信号与抗bandA-IgG-Sepharose4B的添加量无关，是一定的。

从这些结果确认SYP8基因是编码噢哢合成酶的基因。如图7所示随着抗SYP8-IgG-Sepharose4B的添加量的增加，检测出了大约80kDa的信号，由于该信号随着在实验中树脂保留时间增长而增大，所以认为该信号是由从Sepharose4B脱离下来的IgG引起的。

实施例17.

就象实施例10所叙述的那样，在氨基酸水平上，噢哢合成酶表现出与多酚氧化酶有弱的同源性，具有同源性的主要区域是对铜的结合区域。由此可以想象到噢哢合成酶也是铜酶，所以对金鱼草素合成酶进行了原子吸光光谱分析。使用的测定装置是岛津AA-670F，测定的模式是燃烧室测定，在324.8nm的波长下进行。

使用1000ppm的铜标准液(和光纯药)被浓硝酸稀释1000倍的稀释液作成校正曲线(校正范围：0～9ppb)。在原子吸收光谱分析中，有时共存的有机物质会妨碍测定，所以在本测定之前，用蘑菇酪氨酸酶(含铜离子的酶)也在含有0.1％CHAPS的醋酸缓冲液中事先确认铜原子吸收光谱测定是可能的。然后将金鱼草素合成酶纯品(200μl)对含有0.1％CHAPS的醋酸缓冲液(pH6.0)充分透析。通过SDS-PAGE分析几个已知量的标准蛋白，得到的银染色的带的浓度用图象扫描仪数值化，作成由带的浓度求蛋白质量的校正曲线。在同一条件下将一部分金鱼草素合成酶用SDS-PAGE分析，其银染色的带的浓度用图象扫描仪数值化，然后从已作成的校正曲线估计蛋白质浓度。100μl样品中加入0.5μl浓硝酸(1.38N)，测定结果表明可以检测出铜，由此可知该酶是个铜酶。

实施例18.关于酪氨酸酶的噢哢合成活性

将酪氨酸酶(Sigma公司目录no.T7755；0.04mg/ml，10μl)、0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.5，335μl)、9％CHAPS(20μl)、milli-Q水(20μl)混合后，于30℃温育30分钟，然后加入四羟基查耳酮(THC，4.3mM在乙醇中，15μl)，立刻搅拌，使其于30℃下反应30分钟。反应后向反应液加入停止液(含有90％乙腈的10％三氟乙酸水溶液)100μl停止反应，象实施例3那样进行HPLC分析。对照用水取代酪氨酸酶。

在加酪氨酸酶组，底物THC大约在15.9分钟洗脱出，作为反应产物的金鱼草素大约在12.5分钟洗脱出。而用水取代酪氨酸酶组，底物THC大约在16分钟时被洗脱出，没有洗脱出金鱼草素。

用五羟基查耳酮(PHC)取代THC作为底物，用0.116M柠檬酸钠缓冲液(pH5.4)作为缓冲液，在与上面相同的条件下使其反应。对照也是用水取代酪氨酸酶。

在加酪氨酸酶组，底物PHC大约在14.7分钟洗脱出，作为反应产物的金鱼草素大约在12.5分钟洗脱出。而用水取代酪氨酸酶组，底物PHC大约在14.6分钟时被洗脱出，没有洗脱出金鱼草素。

由此可以判明酪氨酸酶也有合成噢哢的活性。

产业上利用的可能性

就象以上叙述的那样，在本发明中，最初测定了由四羟基查耳酮合成一种噢哢-金鱼草素的反应，然后分离纯化催化该反应的金鱼草素合成酶，确定其氨基酸序列，克隆其基因。这里作为酶源使用了金鱼草，也可以从含有噢哢的其它植物用同样的方法纯化合成噢哢类的酶，获得其基因。

由于催化同样反应的酶的基因相互间的碱基序列相同，可进行杂交，所以可以以从金鱼草得到的cDNA为基础获得其它来源的合成噢哢类的酶的基因。

另外由多酚氧化酶也可以得到编码具有以查耳酮为底物合成噢哢类活性蛋白质的基因。

将目的基因导入植物现在已广泛地进行，利用本发明以前不带有黄色花的植物品种有可能培育出黄色花的品种。而带有黄色花的植物品种也可以改变其花的色调。

序列表

<110>SUNTORY LIMITED三得利株式会社

<120>编码具有合成噢哢类活性的蛋白质的基因

<130>G837

<150>JP 10-107296

<151>1998-04-17

<160>15

<210>1

<211>1951

<212>DNA

<213>Antirrhinum majus金鱼草

<220>

<221>CDS

<222>(96)...(1781)

<223>编码具有噢哢合成活性的蛋白质的核苷酸序列

<400>1

aaattacatt gcttcctttg tcccaccttc caccaccaat atatacaact tcctcagcta 60

gttgtttatt atcaatcaaa taaaattatt tccca atg ttc aaa aat cct aat 113

Met Phe Lys Asn Pro Asn

1 5

atc cgc tat cac aaa cta tct tcc aaa tcc aat gac aac gat caa gaa 161

Ile Arg Tyr His Lys Leu Ser Ser Lys Ser Asn Asp Asn Asp Gln Glu

10 15 20

tcc tcc cat cgt tgt aag cac att cta tta ttt ata ata acc tta ttc 209

Ser Ser His Arg Cys Lys His Ile Leu Leu Phe Ile Ile Thr Leu Phe

25 30 35

cta ctt ata gtt ggc ctg tac atc gcc aac tct ctc gcc tat gcc cgg 257

Leu Leu Ile Val Gly Leu Tyr Ile Ala Asn Ser Leu Ala Tyr Ala Arg

40 45 50

ttt gcc tcg acc tca acc ggc cct atc gcc gcc cct gat gtc acc aaa 305

Phe Ala Ser Thr Ser Thr Gly Pro Ile Ala Ala Pro Asp Val Thr Lys

55 60 65 70

tgt ggt cag cca gac ttg cca cct ggc aca gcc cca ata aac tgt tgt 353

Cys Gly Gln Pro Asp Leu Pro Pro Gly Thr Ala Pro Ile Asn Cys Cys

75 80 85

ccc cca atc ccc gct aaa atc atc gat ttc gag cta cca cct ccc tcc 401

Pro Pro Ile Pro Ala Lys Ile Ile Asp Phe Glu Leu Pro Pro Pro Ser

90 95 100

act acc atg agg gtt cgc cgt gcg gct cat tta gtt gat gat gca tac 449

Thr Thr Met Arg Val Arg Arg Ala Ala His Leu Val Asp Asp Ala Tyr

105 110 115

att gcc aaa ttc aag aaa gcc gtt gag ctt atg cga gct cta cct gag 497

Ile Ala Lys Phe Lys Lys Ala Val Glu Leu Met Arg Ala Leu Pro Glu

120 125 130

gat gac cct cgt agc ttc aag caa caa gct aac gtc cat tgc gct tac 545

Asp Asp Pro Arg Ser Phe Lys Gln Gln Ala Asn Val His Cys Ala Tyr

135 140 145 150

tgc gcg ggg gcg tat aat caa gcc ggt ttc aca aac cta aag ctc caa 593

Cys Ala Gly Ala Tyr Asn Gln Ala Gly Phe Thr Asn Leu Lys Leu Gln

155 160 165

atc cac cga tct tgg ctt ttt ttc ccg ttc cat aga tat tat atc tac 641

Ile His Arg Ser Trp Leu Phe Phe Pro Phe His Arg Tyr Tyr Ile Tyr

170 175 180

ttt ttt gaa aga ata ttg gga aaa cta atc aat gat aca act ttt gct 689

Phe Phe Glu Arg Ile Leu Gly Lys Leu Ile Asn Asp Thr Thr Phe Ala

185 190 195

ctc cca ttt tgg aac tat gat tca cct ggt gga atg aca atc cca tca 737

Leu Pro Phe Trp Asn Tyr Asp Ser Pro Gly Gly Met Thr Ile Pro Ser

200 205 210

atg ttt att gat act aat tct tcg ctg tac gat agt tta cgg gac agt 785

Met Phe Ile Asp Thr Asn Ser Ser Leu Tyr Asp Ser Leu Arg Asp Ser

215 220 225 230

aat cat cag cca cca acc atc gta gac ttg aac tac gcc ttt tct gat 833

Asn His Gln Pro Pro Thr Ile Val Asp Leu Asn Tyr Ala Phe Ser Asp

235 240 245

tcc gac aat acc act act cct gaa gag caa atg att ata aac ctt aaa 881

Ser Asp Asn Thr Thr Thr Pro Glu Glu Gln Met Ile Ile Asn Leu Lys

250 255 260

att gtg tac aga caa atg gtg tcg agc gct aag act cca cag ctt ttc 929

Ile Val Tyr Arg Gln Met Val Ser Ser Ala Lys Thr Pro Gln Leu Phe

265 270 275

ttc ggc cgc cca tac cga cgt ggg gac caa gag ttt ccc ggg gtg ggg 977

Phe Gly Arg Pro Tyr Arg Arg Gly Asp Gln Glu Phe Pro Gly Val Gly

280 285 290

tcg att gag tta gtc cct cat ggc atg ata cat tta tgg acc ggt tct 1025

Ser Ile Glu Leu Val Pro His Gly Met Ile His Leu Trp Thr Gly Ser

295 300 305 310

gag aac acg ccc tat ggc gag aac atg ggg gct ttc tac tca acg gct 1073

Glu Asn Thr Pro Tyr Gly Glu Asn Met Gly Ala Phe Tyr Ser Thr Ala

315 320 325

aga gac ccg ata ttt ttt gct cat cat tcg aac gtc gat aga atg tgg 1121

Arg Asp Pro Ile Phe Phe Ala His His Ser Asn Val Asp Arg Met Trp

330 335 340

tcc ata tgg aag acc cta gga ggg ccg cgg agg acg gac tta aca gat 1169

Ser Ile Trp Lys Thr Leu Gly Gly Pro Arg Arg Thr Asp Leu Thr Asp

345 350 355

cca gat ttt ctt gat gcg tct ttc gtt ttt tat gac gaa aac gca gag 1217

Pro Asp Phe Leu Asp Ala Ser Phe Val Phe Tyr Asp Glu Asn Ala Glu

360 365 370

atg gtt cgg gtc aag gtt cgg gat tgc tta gat gaa aag aaa cta ggg 1265

Met Val Arg Val Lys Val Arg Asp Cys Leu Asp Glu Lys Lys Leu Gly

375 380 385 390

tac gtt tat caa gat gtg gag att ccg tgg ctc aac act cgt cca aca 1313

Tyr Val Tyr Gln Asp Val Glu Ile Pro Trp Leu Asn Thr Arg Pro Thr

395 400 405

cca aaa gtt tct ccg tct cta ctt aag aaa ttt cat aga aca aac act 1361

Pro Lys Val Ser Pro Ser Leu Leu Lys Lys Phe His Arg Thr Asn Thr

410 415 420

gcc aat ccg aga caa gtt ttt cct gcg ata ctt gac aga gtc tta aaa 1409

Ala Asn Pro Arg Gln Val Phe Pro Ala Ile Leu Asp Arg Val Leu Lys

425 430 435

gtt atc gtg acg agg ccg aag aaa act aga agt agg aaa gaa aag gac 1457

Val Ile Val Thr Arg Pro Lys Lys Thr Arg Ser Arg Lys Glu Lys Asp

440 445 450

gag tta gaa gag att tta gtg att gaa ggg att gaa ctg gaa aga gac 1505

Glu Leu Glu Glu Ile Leu Val Ile Glu Gly Ile Glu Leu Glu Arg Asp

455 460 465 470

cac ggg cac gta aaa ttc gac gtt tat att aat gct gac gaa gat gac 1553

His Gly His Val Lys Phe Asp Val Tyr Ile Asn Ala Asp Glu Asp Asp

475 480 485

ctt gcg gtg att tcg ccg gag aat gct gag ttc gcc ggg agt ttc gtg 1601

Leu Ala Val Ile Ser Pro Glu Asn Ala Glu Phe Ala Gly Ser Phe Val

490 495 500

agt ctg tgg cac aaa cct ata aag ggg aag agg aca aag acg cag tta 1649

Ser Leu Trp His Lys Pro Ile Lys Gly Lys Arg Thr Lys Thr Gln Leu

505 510 515

tta aca ttg tcg att tgt gat att ttg gag gat ttg gat gct gac gaa 1697

Leu Thr Leu Ser Ile Cys Asp Ile Leu Glu Asp Leu Asp Ala Asp Glu

520 525 530

gat gat tat gtg ttg gtc act ttg gtt ccg aga aac gcc gga gat gcg 1745

Asp Asp Tyr Val Leu Val Thr Leu Val Pro Arg Asn Ala Gly Asp Ala

535 540 545 550

atc aag att cat aat gtc aag att gag ctt gat ggc taataaattc 1791

Ile Lys Ile His Asn Val Lys Ile Glu Leu Asp Gly

555 560 562

tattgatttc ttctcaacct acagttgatc atttaccgat tgattattcc aataaaagta 1851

tctcatgtac caatatcgat cgtattaatc gtaatacttt cagattttta tttatttaaa 1911

agcagttgta taaatggtga aataaggatt actttttgag 1951

<210>2

<211>562

<212>PRT

<213>Antirrhinum majus金鱼草

<220>

<223>具有噢哢合成活性的蛋白质的氨基酸序列

<400>2

Met Phe Lys Asn Pro Asn Ile Arg Tyr His Lys Leu Ser Ser Lys Ser

1 5 10 15

Asn Asp Asn Asp Gln Glu Ser Ser His Arg Cys Lys His Ile Leu Leu

20 25 30

Phe Ile Ile Thr Leu Phe Leu Leu Ile Val Gly Leu Tyr Ile Ala Asn

35 40 45

Ser Leu Ala Tyr Ala Arg Phe Ala Ser Thr Ser Thr Gly Pro Ile Ala

50 55 60

Ala Pro Asp Val Thr Lys Cys Gly Gln Pro Asp Leu Pro Pro Gly Thr

65 70 75 80

Ala Pro Ile Asn Cys Cys Pro Pro Ile Pro Ala Lys Ile Ile Asp Phe

85 90 95

Glu Leu Pro Pro Pro Ser Thr Thr Met Arg Val Arg Arg Ala Ala His

100 105 110

Leu Val Asp Asp Ala Tyr Ile Ala Lys Phe Lys Lys Ala Val Glu Leu

115 120 125

Met Arg Ala Leu Pro Glu Asp Asp Pro Arg Ser Phe Lys Gln Gln Ala

130 135 140

Asn Val His Cys Ala Tyr Cys Ala Gly Ala Tyr Asn Gln Ala Gly Phe

145 150 155 160

Thr Asn Leu Lys Leu Gln Ile His Arg Ser Trp Leu Phe Phe Pro Phe

165 170 175

His Arg Tyr Tyr Ile Tyr Phe Phe Glu Arg Ile Leu Gly Lys Leu Ile

180 185 190

Asn Asp Thr Thr Phe Ala Leu Pro Phe Trp Asn Tyr Asp Ser Pro Gly

195 200 205

Gly Met Thr Ile Pro Ser Met Phe Ile Asp Thr Asn Ser Ser Leu Tyr

210 215 220

Asp Ser Leu Arg Asp Ser Asn His Gln Pro Pro Thr Ile Val Asp Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ala Phe Ser Asp Ser Asp Asn Thr Thr Thr Pro Glu Glu Gln

245 250 255

Met Ile Ile Asn Leu Lys Ile Val Tyr Arg Gln Met Val Ser Ser Ala

260 265 270

Lys Thr Pro Gln Leu Phe Phe Gly Arg Pro Tyr Arg Arg Gly Asp Gln

275 280 285

Glu Phe Pro Gly Val Gly Ser Ile Glu Leu Val Pro His Gly Met Ile

290 295 300

His Leu Trp Thr Gly Ser Glu Asn Thr Pro Tyr Gly Glu Asn Met Gly

305 310 315 320

Ala Phe Tyr Ser Thr Ala Arg Asp Pro Ile Phe Phe Ala His His Ser

325 330 335

Asn Val Asp Arg Met Trp Ser Ile Trp Lys Thr Leu Gly Gly Pro Arg

340 345 350

Arg Thr Asp Leu Thr Asp Pro Asp Phe Leu Asp Ala Ser Phe Val Phe

355 360 365

Tyr Asp Glu Asn Ala Glu Met Val Arg Val Lys Val Arg Asp Cys Leu

370 375 380

Asp Glu Lys Lys Leu Gly Tyr Val Tyr Gln Asp Val Glu Ile Pro Trp

385 390 395 400

Leu Asn Thr Arg Pro Thr Pro Lys Val Ser Pro Ser Leu Leu Lys Lys

405 410 415

Phe His Arg Thr Asn Thr Ala Asn Pro Arg Gln Val Phe Pro Ala Ile

420 425 430

Leu Asp Arg Val Leu Lys Val Ile Val Thr Arg Pro Lys Lys Thr Arg

435 440 445

Ser Arg Lys Glu Lys Asp Glu Leu Glu Glu Ile Leu Val Ile Glu Gly

450 455 460

Ile Glu Leu Glu Arg Asp His Gly His Val Lys Phe Asp Val Tyr Ile

465 470 475 480

Asn Ala Asp Glu Asp Asp Leu Ala Val Ile Ser Pro Glu Asn Ala Glu

485 490 495

Phe Ala Gly Ser Phe Val Ser Leu Trp His Lys Pro Ile Lys Gly Lys

500 505 510

Arg Thr Lys Thr Gln Leu Leu Thr Leu Ser Ile Cys Asp Ile Leu Glu

515 520 525

Asp Leu Asp Ala Asp Glu Asp Asp Tyr Val Leu Val Thr Leu Val Pro

530 535 540

Arg Asn Ala Gly Asp Ala Ile Lys Ile His Asn Val Lys Ile Glu Leu

545 550 555 560

Asp Gly

562

<210>3

<211>13

<212>PRT

<213>Antirrhinum majus金鱼草

<220>

<223>具有噢哢合成活性的蛋白质的部分氨基酸序列

<400>3

Lys Lys Leu Gly Tyr Val Tyr Gln Asp Val Glu Ile Pro

5 10

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>Antirrhinum majus

<220>

<223>Partial amino acid sequence of a protein having auro

ne synthesizing activity

<400>4

Lys Ile Val Tyr Arg Gln Met Val Ser Ser Ala Lys

5 10

<210>5

<211>18

<212>PRT

<213>Antirrhinum majus金鱼草

<220>

<223>具有噢哢合成活性的蛋白质的部分氨基酸序列

<400>5

Lys Thr Pro Gln Leu Phe Phe Gly Arg Pro Tyr Arg Arg Gly Asp Gln

5 10 15

Glu Phe

<210>6

<211>30

<212>PRT

<213>Antirrhinum majus金鱼草

<220>

<221>不确定

<222>(9)

<220>

<221>不确定

<222>(29)

<223>具有噢哢合成活性的蛋白质的部分氨基酸序列

<400>6

Lys Ile Ile Asp Phe Glu Leu Pro Xaa Pro Ser Thr Thr Met Arg Val

5 10 15

Arg Arg Ala Ala His Leu Val Asp Asp Ala Tyr Ile Xaa Lys

20 25 30

<210>7

<211>125

<212>PRT

<213>Antirrhinum majus金鱼草

<220>

<223>具有噢哢合成活性的蛋白质的部分氨基酸序列

<400>7

Arg Gln Met Val Ser Ser Ala Lys Thr Pro Gln Leu Phe Phe Gly Arg

5 10 15

Pro Tyr Arg Arg Gly Asp Gln Glu Phe Pro Gly Val Gly Ser Ile Glu

20 25 30

Leu Val Pro His Gly Met Ile His Leu Trp Thr Gly Ser Glu Asn Thr

35 40 45

Pro Tyr Gly Glu Asn Met Gly Ala Phe Tyr Ser Thr Ala Arg Asp Pro

50 55 60

Ile Phe Phe Ala His His Ser Asn Val Asp Arg Met Trp Ser Ile Trp

65 70 75 80

Lys Thr Leu Gly Gly Pro Arg Arg Thr Asp Leu Thr Asp Pro Asp Phe

85 90 95

Leu Asp Ala Ser Phe Val Phe Cys Asp Glu Asn Ala Glu Met Val Arg

100 105 110

Val Lys Val Arg Asp Cys Leu Asp Gly Lys Lys Leu Gly

115 120 125

<210>8

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<221>

<222>(2)

<223>Xaa是Val或Ile

<400>8

Phe Xaa Lys Phe Thr Ala Ile

5

<210>9

<211>6

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<221>

<222>(6)

<223>Xaa是Thr或Pro

<400>9

Lys Trp Lys Gly Lys Xaa

5

<210>10

<211>6

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<221>

<222>

<223>

<400>10

His Ala Val Cys Asn Glu

5

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<221>

<222>

<223>引物

<400>11

ttyrtnaart tyacngcnat 20

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<221>

<222>

<223>引物

<400>12

aartggaarg gnaarmc 17

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<221>

<222>

<223>引物

<400>13

rtgngcnacr carttytc 18

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<221>

<222>

<223>引物

<400>14

aaggatccgg ccctatcgcc 20

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<221>

<222>

<223>引物

<400>15

gggttcgaag aattcatctc tg 22

Claims

1.编码具有合成噢哢类活性的蛋白质的基因，其中所述蛋白质具有序列

2.记载的氨基酸序列。

2.权利要求1记载的基因，其具有序列1记载的碱基序列。

3.含有权利要求1或2记载的基因的载体。

4.利用权利要求3记载的载体转化的宿主。

5.权利要求4记载的宿主，其中宿主是微生物或动物细胞。

6.权利要求4记载的宿主，其中宿主是微生物细胞。

7.具有序列2记载的氨基酸序列的蛋白质。

8.能够与权利要求7记载的蛋白质的抗体特异结合，而且具有以查耳酮为底物合成噢哢类活性的蛋白质。

9.蛋白质的制造方法，其特征是培养或培育权利要求4记载的宿主，然后从该宿主提取或纯化具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的蛋白质。

10.具有以查耳酮类为底物合成噢哢活性的蛋白质的提取或纯化方法，其特征是利用与权利要求7或8记载的蛋白质的抗体特异结合。

11.噢哢的合成方法，其特征是利用权利要求7或8记载的蛋白质作用于查耳酮类。

12.于植物体内合成噢哢类的方法，其特征是以权利要求1或2记载的基因转化植物或植物细胞，使该基因表达，然后通过生成的蛋白质在植物体内合成噢哢类。

13.导入权利要求1或2记载的基因的植物细胞或组织。

14.花色被调节成黄色的权利要求13记载的植物细胞或组织。