ES2260905T3 - Gen que codifica una proteina con actividad de sintesis de aurona. - Google Patents
Gen que codifica una proteina con actividad de sintesis de aurona.Info
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Abstract
La invención se refiere a una proteína que tiene una actividad de aurona-sintasa relativa a las flores de colores de antirrhinum majus, etc., a un gen, en particular, el cDNA que codifica al mismo y al empleo de éste. Mediante transferencia de este gen a una planta que carece de chalcone isomerasa, etc., y la expresión de ésta en él, la flor de la planta puede volverse amarilla.
Description
Gen que codifica una proteína con actividad de
síntesis de aurona.
El presente invento se refiere a genes que
codifican proteínas que tienen una actividad que permite sintetizar
auronas al usar chalconas como sustratos, y a su utilización. Más
específicamente, el presente invento se refiere a genes que
codifican polifenoloxidasas que tienen una actividad que permite
sintetizar auronas al usar chalconas como sustratos, y a su
utilización. Más específicamente, el presente invento se refiere,
por ejemplo, a genes que codifican proteínas derivadas de bocas de
dragón que tienen una actividad que permite sintetizar auronas al
usar chalconas como sustratos.
Los colores naranja, rojo, violeta y azul de las
flores son esencialmente proporcionados por flavonoides a los que
se hace referencia como antocianinas. Aunque el amarillo es
principalmente proporcionado por compuestos distintos de los
flavonoides, tales como carotenoides, betalaínas, etc., el color
amarillo de ciertas plantas es proporcionado por flavonoides. Por
ejemplo, se sabe que compuestos clasificados como auronas están
presentes en los pétalos de ciertas variedades de boca de dragón
(Antirrhinum), Limonium, campanilla del género
Ipomoea, dalia, flor de papel (Helichrysum
bracteatum), aguaturma (Helianthus tuberosus) y
Cosmos (Saito: BIO HORTI 1, 49-57,
1.990).
Ejemplos conocidos de auronas incluyen
4',6-dihidroxiaurona,
4,4',6-trihidroxiaurona, aureusidina, sulfretina y
bracteatina, estando la aureusidina y la bracteatina contenidas en
la boca de dragón, la aureusidina contenida en Limonium, la
aureusidina contenida en la campanilla del género Ipomoea, la
sulfretina contenida en la dalia, la bracteatina contenida en la
flor de papel, y la sulfretina contenida en la aguaturma.
Además, se sabe que están contenidas auronas en
la planta de la familia Compositae que incluye los géneros
Coreopsis, Helianthus, Tithonia, Zinnia y Viguiera; la
familia Ericaceae que incluye el género Vaccinium; la
familia Cyperaceae que incluye el género Cyperus; la
familia Leguminosae que incluye los géneros Acacia,
Pterocarpus y Soja; y la familia Rubiaceae que
incluye el género Mussaenda ("The Flavonoids", compilado
por J. B. Harbone, 1.988, Chapman & Hall,
340-342).
La ruta sintética de las antocianinas ha sido
ampliamente investigada, y, con respecto a la biosíntesis de
auronas, se ha sugerido, basándose en su estructura, que la
4',6-dihidroxiaurona es sintetizada a partir de
2',4,4'-trihidroxichalcona y se ha propuesto que
está implicada peroxidasa en esa reacción (Rathmel y Bendall,
Biochem. J. 127, 125-132, 1.972). Sin embargo, no
hay ejemplos relativos a la medición definitiva de la reacción de
biosíntesis de auronas usando extractos de pétalos y otras partes de
plantas, y no hay informes que aclaren de qué manera tiene lugar la
reacción en los pétalos de las plantas. Además, tampoco hay informes
relativos a la purificación de enzimas implicadas en la síntesis de
auronas.
Por lo tanto, los inventores del presente
invento han intentado aclarar el mecanismo de la biosíntesis de
auronas para proporcionar un medio para controlar el color de las
plantas, y particularmente de sus flores.
Los inventores del presente invento
establecieron un método de ensayo para medir la reacción mediante la
cual se sintetizan auronas a partir de chalconas, usando un extracto
crudo de pétalos de boca de dragón que contienen auronas. Las
auronas producidas en este momento no son la
4',6-dihidroxiaurona considerada en la técnica
anterior, sino, más bien, aureusidina, y esta reacción que puede ser
ahora medida no se conocía previamente. Además, una enzima
(aureusidina sintasa) que permite sintetizar auronas (aureusidina)
al usar, como sustratos, chalconas procedentes de los pétalos de
bocas de dragón fue purificada por electroforesis hasta una sola
banda, usando el método de ensayo. Se identificaron las propiedades
bioquímicas de esta enzima usando este patrón puro. Además, también
se determinaron las secuencias parciales de aminoácidos de esta
enzima. Se obtuvo un gen para esta aurona sintasa, que permite
sintetizar auronas al usar chalconas como sustratos, a partir de un
banco de cDNA preparado a partir del pétalo de boca de dragón,
basándose en las secuencias parciales de aminoácidos anteriormente
descritas.
Adviértase que los ejemplos conocidos de
chalconas incluyen, pero no se limitan a, tetrahidroxichalcona,
pentahidroxichalcona, buteína y
2',4,4'-trihidroxichalcona.
Por otra parte, el gen resultante presenta
homología en la región ligante de cobre, que es el centro activo de
la polifenol oxidasa. Por lo tanto, se quiso confirmar si la
tirosinasa, que es conocida como una clase de las polifenol
oxidasas, presenta actividad para sintetizar auronas a partir de
chalconas o no, y, como resultado, también se mostró claramente que
la tirosinasa presenta actividad para sintetizar auronas.
Por consiguiente, el presente invento
proporciona genes como los definidos en las reivindicaciones, que
codifican proteínas que tienen actividad para sintetizar auronas al
usar chalconas como sustratos. Los genes pueden codificar polifenol
oxidasa. Además, proporciona un gen que codifica una proteína que
tiene actividad para sintetizar auronas al usar chalconas como
sustratos y que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEQ.ID NO. 2. El presente invento también proporciona un vector que
contiene el gen anteriormente mencionado.
Además, el presente invento proporciona un
huésped transformado mediante el vector anteriormente mencionado.
Este huésped puede ser un microorganismo, células vegetales o
células animales, o puede ser una planta.
El presente invento también proporciona un
procedimiento para la producción de una aurona sintasa, tal como
aureusidina sintasa, caracterizado por cultivar las células
anteriormente mencionadas o cultivar la planta anteriormente
mencionada. Puede recuperarse la enzima formada o puede hacerse que
actúe para regular el matiz cromático en una planta. En este caso,
se sintetizan auronas por enzima formada en la planta, y estas
auronas regulan luego el color de la planta, tal como el de sus
pétalos.
Por lo tanto, el presente invento también
proporciona un método para regular el color de las flores de las
plantas, caracterizado por introducir en una planta o en células
vegetales un gen para una enzima, tal como aureusidina sintasa, que
tiene actividad para sintetizar auronas al usar chalconas como
sustratos, para que se exprese el gen anteriormente mencionado, y
por hacer que se sinteticen auronas en una planta mediante la
enzima formada. El presente invento también proporciona una planta
en que se regula el color de las flores de esta manera.
El presente invento también proporciona un
método para sintetizar auronas, caracterizado por permitir que la
proteína enzimática anteriormente mencionada actúe sobre chalconas
que sirven como pigmento sustrato.
El presente invento también proporciona una
proteína enzimática codificada por el gen anteriormente
mencionado.
La Figura 1 muestra las fórmulas estructurales
de auronas y chalconas.
La Figura 2 muestra la ruta biosintética de
auronas.
La Figura 3 muestra los resultados de un
análisis Northern en cada órgano de la boca de dragón amarilla
usando SYP8-17.
La Figura 4 muestra los resultados de un
análisis Northern en cada fase de desarrollo de los pétalos de boca
de dragón amarilla usando SYP8-17:
Fase 1 del pétalo: longitud del pétalo en
capullo de hasta 1 cm.
Fase 2 del pétalo: longitud del pétalo en
capullo de 1 a 1,5 cm.
Fase 3 del pétalo: longitud del pétalo en
capullo de 1,5 a 2,0 cm.
Fase 4 del pétalo: longitud del pétalo en
capullo de 2,0 a 2,5 cm.
Fase 5 del pétalo: longitud del pétalo en
capullo de 2,5 a 3,0 cm.
Fase 6 del pétalo: pétalo abierto de 3,0 cm o
más.
La Figura 5 muestra los resultados de un
análisis Northern sobre pétalos de bocas de dragón amarillas, rosas
y blancas usando SYP8-17.
La Figura 6 es un gráfico que muestra un modo de
inhibición de la actividad aurona sintasa al añadir un anticuerpo
contra aurona sintasa SYP-8
(anti-SYP-8) y otros anticuerpos de
referencia (anti-banda A y
anti-\beta-galactosidasa).
La Figura 7 muestra la proteína SYP8 que queda
en el sobrenadante después de la adición de IgG
anti-SYP8-Sepharose 4B.
En primer lugar, se purifica la aureusidina
sintasa mediante diversos métodos cromatográficos a partir de los
pétalos de boca de dragón amarilla. A continuación, se analizan las
secuencias parciales de aminoácidos de la aureusidina sintasa de
acuerdo con un método convencional, para preparar oligonucleótidos
sintéticos que codifiquen estas secuencias de aminoácidos.
Por otra parte, se prepara poliA+RNA a partir de
los mismos pétalos de boca de dragón y se prepara un banco de CDNA
de acuerdo con un método convencional.
Se lleva a cabo una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain
reaction) usando los nucleótidos sintéticos anteriormente
mencionados y usando cDNA de pétalos de boca de dragón amarilla como
molde para conseguir un fragmento de DNA específico para la
aureusidina sintasa. Este fragmento de DNA es subclonado en un
vector para preparar un plásmido.
El banco de cDNA anteriormente mencionado es
explorado usando un DNA insertado, contenido en el plásmido
anteriormente mencionado, para obtener un clon. El plásmido
procedente de este clon es luego aislado, lo que va seguido de la
determinación de la secuencia de nucleótidos.
La proteína que tiene la actividad enzimática
tiene una región esencial para la actividad enzimática y una región
no esencial para la actividad enzimática. Se sabe que la actividad
enzimática se mantiene incluso si la región no esencial es
modificada mediante la supresión (deleción) o adición de uno o más
aminoácidos y/o la sustitución por otros aminoácidos. De esta
manera, el presente invento incluye no sólo una proteína que tiene
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID NO. 2 sino
también proteínas, como las definidas en las reivindicaciones, que
tienen una secuencia de aminoácidos modificada por supresión o
adición de uno o más aminoácidos y/o por una o más sustituciones
por otros aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEQ ID NO. 2 mientras se mantiene la actividad para sintetizar
auronas al usar chalconas como sustratos, así como genes que
codifican las proteínas.
Además, se conocen casos en que una proteína que
tiene una actividad enzimática idéntica puede tener una diferente
secuencia de aminoácidos a causa de una variación alélica. Además,
también se sabe que enzimas que tienen una actividad enzimática
idéntica o equivalente están distribuidas por numerosas especies y
que estas enzimas tienen un elevado grado de homología en cuanto a
sus secuencias de aminoácidos. Por hibridación con un gen del
presente invento, pueden seleccionarse genes que codifiquen estas
proteínas. De esta manera, el presente invento también incluye un
gen como el definido en las reivindicaciones que se hibrida con un
ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la
SEQ ID NO. 1 bajo unas condiciones rigurosas, y que codifica una
proteína que tiene la actividad para sintetizar auronas al usar
chalconas como sustratos, y una proteína codificada por el gen.
El gen que se hibrida con el ácido nucleico que
tiene la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO. 1, y
que codifica una proteína que tiene actividad enzimática para
sintetizar auronas al usar chalconas como sustratos, puede ser una
forma, artificialmente modificada o presente en la naturaleza, de un
gen que codifica la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID
NO. 2. Los ejemplos de genes presentes en la naturaleza incluyen
cDNA o DNA genómico obtenido de plantas que tienen aurona sintasa,
tales como boca de dragón, Limonium, campanilla del género
Ipomoea, dalia, flor de papel y aguaturma. Las condiciones de
rigor para la hibridación son SSC 0,2x a 50ºC.
Es bien sabido que hay muchos casos en que una
proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con un elevado grado
de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos nativa de
una proteína que tiene actividad enzimática, tiene una actividad
enzimática que es similar a la de la proteína nativa. Por lo tanto,
el presente invento también incluye proteínas que tienen actividad
para sintetizar auronas al usar chalconas como sustratos y que
tienen una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 55% o
más, preferiblemente 60% o más, preferiblemente 70% o más, más
preferiblemente 80% o más y, particularmente, preferiblemente 90% o
más, con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ
ID NO. 2, y un gen que codifica esa proteína.
También es sabido que enzimas que tienen una
actividad enzimática equivalente pueden tener epítopos comunes en
muchos casos. Por lo tanto, el presente invento también incluye las
diferentes proteínas anteriormente mencionadas que tienen actividad
para sintetizar auronas, y particularmente las proteínas que tienen
una actividad que permite sintetizar auronas al usar chalconas como
sustratos, y que además se unen específicamente a un anticuerpo
contra la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEQ ID NO. 2, y un gen que codifica esa proteína.
En el presente invento, un gen que codifica la
proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ
ID NO. 2 puede ser obtenido de boca de dragón como cDNA o DNA
genómico. En los Ejemplos 8 a 10 se describe específicamente un
método para la clonación de cDNA. Con objeto de obtener un DNA
genómico, se prepara un banco de DNA genómico a partir de boca de
dragón de acuerdo con un método convencional y luego se explora el
banco de acuerdo con un método convencional mediante el cDNA o su
fragmento.
En el presente invento, un gen que codifica una
proteína que tiene una secuencia de aminoácidos modificada con
respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 puede ser
preparado modificando la secuencia de nucleótidos de DNA, tal como
el cDNA que codifica la proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 2, de acuerdo con un método
convencional para manipular el gen mediante mutagénesis dirigida al
sitio, PCR, etc.
Se obtienen genes presentes en la naturaleza,
que se hibridan con el ácido nucleico que tiene la secuencia de
nucleótidos descrita en la SEQ ID NO. 1 y que codifica una enzima
que tiene actividad para sintetizar auronas al usar chalconas como
sustratos, preparando, de acuerdo con un método convencional, un
banco de cDNA o un banco de DNA genómico a partir de una planta que
tiene capacidad para producir una proteína que tiene actividad
aurona sintasa y explorando luego el banco al usar como sonda, por
ejemplo, el cDNA o su fragmento que tiene la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO. 1. Las condiciones
anteriormente mencionadas pueden ser utilizadas para la hibridación
en este momento.
Además, la aurona sintasa obtenida de boca de
dragón es una clase de polifenol oxidasa y, por lo tanto, los
inventores del presente invento, considerando que otras polifenol
oxidasas también tienen actividad para sintetizar auronas a partir
de chalconas, examinaron si una enzima vendida comercialmente como
tirosinasa, una polifenol oxidasa procedente de Neurospora,
presentaba actividad relativa a la síntesis de auronas o no. Como
resultado, se determinó que la tirosinasa presenta actividad
relativa a la síntesis de auronas. En consecuencia, las enzimas que
tienen actividad polifenol oxidasa tienen claramente actividad para
sintetizar auronas al usar chalconas como sustratos.
Aunque la función fisiológica de las enzimas que
tienen actividad polifenol oxidasa no está aún clara, son
esencialmente clasificadas en tres tipos, que son: catecol oxidasa
(enzima nº 1.10.3.1), lacasa (enzima nº 1.10.3.2) y tirosinasa
(enzima nº 1.14.18.1), y son clasificadas con diferentes números de
enzima de acuerdo con su especificidad de sustrato. Son enzimas de
cobre en las que el cobre está presente en el centro de la reacción
enzimática, y se piensa que las grandes estructuras dimensionales de
las proteínas, etc., son una causa de la especificidad de
sustrato.
De esta manera, puesto que una región conservada
que corresponde a la región ligante de cobre está presente en la
polifenol oxidasa, puede obtenerse el gen de la polifenol oxidasa de
acuerdo con un método establecido, tal como una PCR con un cebador
basado en la secuencia de aminoácidos de esta región (Plant
Physiol., volumen 107, páginas 1.083-1.089, 1.995;
Plant Physiol., volumen 109, páginas 525-531,
1.995), y, a partir del gen obtenido del modo anteriormente
descrito, puede obtenerse un gen que codifique una proteína que
tenga actividad para sintetizar auronas.
El presente invento también proporciona un
procedimiento para la producción de las anteriormente mencionadas
proteínas que tienen actividad para sintetizar auronas al usar
chalconas como sustratos. Este método se caracteriza por introducir
en un huésped un vector que contiene un DNA que codifica la proteína
anteriormente mencionada, cultivar o desarrollar dicho huésped, y
recoger la proteína anteriormente mencionada cuando se desee. El
huésped puede ser células o plantas huésped u otros organismos. Los
ejemplos de células huésped incluyen células procarióticas, y
particularmente células bacterianas tales como las de Escherichia
coli y del género Bacillus, incluyendo las especies
Bacillus subtilis y Bacillus brevis, y eucariontes
inferiores, incluyendo hongos tales como levaduras como las del
género Saccharomyces, tal como la especie Saccharomyces
cerevisiae, y mohos como los del género Aspergillus,
tales como las especies Aspergillus oryzae y Aspergillus
niger.
Además, los ejemplos de huéspedes de células
eucarióticas superiores incluyen células de insectos, tales como
células de gusano de seda, células de animales, tales como células
CHO, y células humanas cultivadas, tales como células HeLa.
El gen descrito en el presente invento puede
también expresarse en organismos tales como animales y plantas. Más
adelante se proporciona una descripción detallada de la expresión en
plantas.
Un vector, y particularmente un vector de
expresión, que contiene DNA del presente invento contiene una región
para control de la expresión, y esta región para control de la
expresión depende de las células huésped. Por ejemplo, para el
promotor de unos vectores de expresión bacterianos puede usarse el
promotor trc, el promotor tac, el promotor lac o el promotor T7. Los
ejemplos de promotores de un vector de expresión de levadura que
pueden ser usados incluyen promotores de genes de enzimas
glicolíticas, tales como el promotor de la glicerolaldehído
3-fosfato deshidrogenasa y el promotor de
galactoquinasa. Además, pueden usarse promotores de virus como
promotores de vectores de expresión de células animales.
Los medios convencionales usados para aislar y
purificar proteínas, tales como cromatografía en fase líquida y
cromatografía de afinidad, pueden ser utilizados para recuperar de
un cultivo una proteína que tiene actividad para sintetizar auronas
al usar chalconas como sustratos. La cromatografía de afinidad puede
ser llevada a cabo usando la unión especifica a un anticuerpo, por
ejemplo, un antisuero o un anticuerpo monoclonal, contra la proteína
que tiene actividad aurona sintasa del presente invento.
Puede producirse un antisuero (anticuerpo
policlonal) contra la proteína que tiene actividad aurona sintasa,
descrita en el presente invento, al inmunizar un animal, tal como un
conejo, con la proteína descrita en el presente invento, tal como
la proteína obtenida en el Ejemplo 4, junto con un agente adyuvante,
y obtener suero del animal. Puede producirse un anticuerpo
monoclonal al inmunizar un animal, tal como un ratón, con, por
ejemplo, una proteína descrita en el presente invento de acuerdo con
un método convencional y fusionar los linfocitos B, tales como
células esplénicas, obtenidos del ratón con células de mieloma de
ratón para obtener un hibridoma, y cultivar luego ese
hibridoma.
Basándose en el nivel actual de la tecnología,
si el cDNA puede ser puesto bajo el control de un promotor
constitutivo o inducible y ser introducido en una planta, tal como
una petunia, rosa, clavel, crisantemo, Torenia, verbena,
gerbera, tabaco, fresa, aguaturma, genciana, gladiolo o tulipán,
usando Agrobacterium, una pistola de partículas o
electroporación, el gen de la aurona sintasa puede expresarse en un
pétalo y otras partes.
Se prevé que en los pétalos en que se expresa
aurona sintasa se sinteticen auronas, las cuales causan el color
amarillo de los pétalos. Las plantas obtenidas de esta forma son
capaces de proporcionar nuevos colores de flores que no existen en
variedades convencionales. Además, algunas de las especies vegetales
que tienen color amarillo contienen carotenoides (crisantemos y
rosas) o betalaína (cactus), pero los matices de estos colores
amarillos son diferentes de los debidos a auronas. Por lo tanto, el
presente invento es también útil para ampliar el espectro de matices
cromáticos de especies vegetales que ya tienen color amarillo.
Ciertas bocas de dragón que tienen flores
amarillas son deficientes en actividad chalcona isomerasa y tienen
aurona sintasa. Puesto que la chalcona isomerasa actúa
competitivamente con la aurona sintasa, se forma naringenina a
partir de tetrahidroxichalcona en presencia de chalcona isomerasa,
y, finalmente, aquélla se convierte en antocianina y flavona. Por lo
tanto, cuando se producen auronas por expresión del gen de la aurona
sintasa en plantas, es preferible que la planta sea deficiente en
chalcona isomerasa.
En general, es posible suprimir artificialmente
la actividad de genes de plantas y, en particular, hay numerosos
ejemplos conocidos de supresión de genes implicados en la síntesis
de flavonoides. Se utilizan un método antisentido y un método de
cosupresión para suprimir artificialmente la expresión génica, y se
ha hallado que es posible suprimir genes implicados en la síntesis
de flavonoides mediante cualquiera de estos métodos [van der Krol
et al., Nature (1.988) 333, 866-869; Napoli
et al., Plant Cell (1.990) 2, 279-289].
También es posible suprimir la expresión del gen de la chalcona
isomerasa de la misma forma.
El gen de la chalcona isomerasa ya ha sido
obtenido de especies vegetales, tales como petunia, alfalfa, boca
de dragón, manzana, alubia y uva [Holton et al., Plant Cell
(1.995) 7, 1.071-1.083]. La comparación de las
secuencias de aminoácidos de estas chalcona isomerasas revela que la
secuencia está bien conservada entre las especies. Hay muchos
ejemplos relativos a que genes implicados en la síntesis de
flavonoides pueden ser fácilmente clonados al usar como sonda un gen
correspondiente procedente de otra planta. Alternativamente, la
clonación puede ser llevada también a cabo por PCR usando una región
conservada de genes conocidos o secuencias de aminoácidos comparadas
entre sí. De esta manera, el gen de la chalcona isomerasa puede ser
fácilmente obtenido de cualquier especie vegetal (Gutterson, Hort.
Sci., volumen 30, páginas 964-966, 1.995).
Además, pueden esperarse unos efectos similares
al suprimir la expresión génica de la
flavanona-3-hidroxidasa o la
dihidroflavonol-4-reductasa. Puesto
que estos genes de enzimas han sido también obtenidos de numerosas
especies vegetales (Gong et al., Plant Mol. Biol. 35, páginas
915-927, 1.997), pueden obtenerse de cualquier
especie vegetal usando un método similar al del caso de la chalcona
isomerasa.
Por lo tanto, con objeto de generar una cierta
especie vegetal que tenga flores amarillas proporcionadas por
auronas, el gen de la aurona sintasa debería expresarse en los
pétalos. Preferiblemente, el gen de la aurora sintasa debería
expresarse mientras se suprime la expresión del gen de la chalcona
isomerasa. En este caso, los promotores utilizados para regular la
expresión de estos genes pueden ser promotores constitucionales o
promotores específicos de pétalos. Más preferiblemente, estas
técnicas permiten obtener flores con un color amarillo estable en
combinación con la introducción de un gen de glicosiltransferasa que
añade un azúcar a la aurona. Éstas técnicas son posibles con el
nivel actual de la tecnología.
Además, se sabe que, en la dalia y la boca de
dragón, el color de las flores se vuelve marrón cuando están
presentes tanto antocianinas como auronas. Es posible generar flores
marrones al introducir aurona sintasa en una planta que produce
antocianinas en sus flores. Dichas flores son también
industrialmente importantes como un nuevo color de flores.
Lo siguiente proporciona una descripción
detallada del invento a través de sus Ejemplos.
Se añadieron 20 ml de hidróxido potásico al 50%
(volumen/peso) a 4 g de naringenina y se disolvieron estos
completamente. Tras ser mantenida a 100ºC durante 90 segundos, la
disolución fue inmediatamente diluida y enfriada con 300 ml de agua
helada para detener la reacción. A continuación, se añadió ácido
clorhídrico 6 N a esta disolución en una vitrina de extracción
forzada, para reducir el pH a 3 o menos y que se formara un
precipitado. El precipitado amarillo resultante fue separado de la
disolución por filtración y fue disuelto en una cantidad mínima de
etanol, lo que fue seguido casi al mismo tiempo de la adición de 400
ml de agua fría mientras se enfriaba sobre hielo. Tras ser dejado
reposar durante la noche, el precipitado obtenido por centrifugación
a 8.000 rpm durante 30 minutos fue resuspendido en agua y fue
liofilizado. Después de la liofilización, el peso de la
tetrahidroxichalcona (THC) cruda era 2,7 g.
Se disolvió la THC cruda en una mínima cantidad
de metanol y se purificó la THC por cromatografía líquida de alta
eficacia en fase inversa. La THC fue desarrollada usando el sistema
Shimakyuu YMC D-ODS-5
S-5 12OA (2,0 cm x 25 cm) con un caudal de 4,5
ml/min de una disolución acuosa de acetonitrilo al 40%
(volumen/volumen) y ácido trifluoroacético (TFA; del inglés,
trifluoroacetic acid) al 0,03%
(volumen/volumen). La THC resultó eluida aproximadamente a los 25
minutos, mientras que la naringenina resultó eluida aproximadamente
a los 29 minutos. Las fracciones de THC fueron recogidas y
liofilizadas. Se repitió la cromatografía una vez bajo las mismas
condiciones para obtener THC purificada.
290 g de los pétalos de la variedad cultivada
Butterfly Yellow de boca de dragón fueron machacados en nitrógeno
líquido y fueron empapados durante la noche en 2 litros de
acetonitrilo al 50% que contenía TFA al 0,1%. Después de una
filtración a través de diatomita y la concentración del producto de
filtración bajo presión reducida, el concentrado fue purificado con
HP-20. La fracción de pigmento amarillo fue
concentrada y fue aplicada a una cromatografía de alta eficacia en
fase líquida (HPLC; del inglés, high performance
liquid chromatography) para separación. Usando agua
como disolución A y TFA al 0,1% en acetonitrilo al 50% como
disolución B, se llevó a cabo la cromatografía usando el sistema
Shimakyuu YMC D-ODS-5
S-5 120A (2,0 cm x 25 cm) bajo un gradiente lineal
de concentraciones de 120 minutos, de B al 20% a B al 60%. Como
resultado, la
bracteatina-6-glucosido fue eluida a
los 40 minutos, la
aureusidina-6-glucosido fue eluida a
los 53 minutos y la
tetrahidroxichalcona-4-glucosido fue
eluida a los 100 minutos. La
aureusidina-6-glucosido resultante
fue hidrolizada con \beta-glucosidasa para obtener
aureusidina.
Se inició la reacción añadiendo 5 \mul de THC,
que tenía una absorbancia de 462 a 366 nm en etanol, a 50 \mul de
tampón de acetato sódico 1 M (pH de 5,0) y 350 \mul de disolución
de enzima cruda, diluida con agua. Después de dejar la reacción
durante 1 hora a 30ºC y añadir 100 \mul de una disolución acuosa
de acetonitrilo al 90% (volumen/volumen) que contenía TFA al 1%
(volumen/volumen) para detener la reacción, se midió la actividad
por HPLC. En cada operación de purificación, descritas más adelante
en el Ejemplo 4, se sometió la disolución de enzima cruda a
medición.
Se utilizó la columna YMC J'Sphere ODS M80 (4,6
x 150 mm) y se ajustó el caudal a 0,7 ml/min. Utilizando una
disolución acuosa de TFA al 0,1% como disolvente A, y una disolución
acuosa de acetonitrilo al 90% que contenía TFA al 0,1% como
disolvente B, se inyectó una muestra en la columna, después de lo
cual, la relación de A:B fue mantenida en 7:3 durante los 3 primeros
minutos y fue luego cambiada a 6:4 mediante un gradiente lineal de
concentraciones durante los 10 minutos siguientes. Esta
concentración fue mantenida durante 5 minutos. Después de cambiar la
relación de A:B a 7:3 durante el minuto siguiente, se mantuvo esta
concentración durante 5 minutos. El sustrato THC fue eluido
aproximadamente a los 20,9 minutos bajo estas condiciones. Un
compuesto eluido aproximadamente a los 8,8 minutos fue detectado
como un producto de reacción. Este compuesto era aureusidina, como
se describe más adelante.
Mediante esta reacción se determinó que se
formaba aureusidina a partir de THC.
La purificación de la enzima fue llevada a cabo
utilizando, como material de partida, 32.175 g de capullos de boca
de dragón en los que asomaban pétalos blancos entre el cáliz y
flores que habían comenzado a colorearse de amarillo. Se añadieron
2.400 ml de tampón A enfriado (acetato sódico 0,01 M, pH de 5,0) y
120 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) por aproximadamente 600 g
de flores y se realizó luego una trituración durante un periodo de 1
a 1,5 minutos con una mezcladora giratoria.
Se centrifugaron a 8.000 rpm y 4ºC, durante 15
minutos, los extractos de las flores trituradas y se disolvió
sulfato amónico hasta un 60% de saturación en el sobrenadante
resultante. Después de una agitación para disolución, se dejó
reposar la disolución. El precipitado recogido por centrifugación a
8.000 rpm y 4ºC durante 15 minutos fue suspendido en una cantidad
mínima de tampón A y fue dializado frente a tampón A. El producto de
diálisis fue centrifugado a 8.000 rpm y 4ºC durante 15 minutos, y el
sobrenadante resultante fue utilizado como concentrado de la
fracción de sulfato amónico. El concentrado de la fracción de
sulfato amónico fue guardado congelado a -20ºC hasta la
cromatografía en SP-Sephadex C50.
El concentrado de la fracción de sulfato amónico
resultante fue sometido tres veces al siguiente procedimiento. Se
midió la conductividad eléctrica del concentrado de la fracción de
sulfato amónico después de la diálisis y se diluyó el concentrado
con agua desionizada fría, según era necesario, hasta que la
conductividad eléctrica llegó a ser de 0,8 a 1 mS a 4ºC. El
concentrado de la fracción de sulfato amónico fue aplicado a una
columna de SP-Sephadex C50 (6 cm x 25,5 cm;
aproximadamente 0,7 litros) que había sido equilibrada a fondo con
tampón B (tampón A que contenía THC en diferentes concentraciones
\muM). Después de la aplicación, la columna fue lavada a fondo con
tampón B. La elución fue llevada a cabo en fracciones de 23 ml
mientras se lavaba la columna aplicando un gradiente lineal de
concentraciones entre tampón B (2,0 litros) y tampón B que contenía
NaCl 0,6 M (2,0 litros). Las fracciones activas (aproximadamente
1.200 ml) fueron recogidas, esterilizadas por filtración y guardadas
a 4ºC hasta la cromatografía en ConA-Sepharose.
La cromatografía en
ConA-Sepharose fue llevada a cabo dos veces, para la
fracción A (que contenía 374.000 U en 1.100 ml) y la fracción B
(que contenía 831.000 U en 2.900 ml). Se disolvieron MnCl_{2} y
CaCl_{2} en la fracción A hasta 1 mM de cada uno y se realizó la
aplicación a una columna de ConA-Sepharose (2 cm x
12 cm; aproximadamente 40 ml) que había sido equilibrada con tampón
C (tampón B que contenía MnCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1 mM y NaCl
0,5 M). Después de la aplicación, la columna fue lavada con
aproximadamente 0,3 litros de tampón C. La fracción de paso y la
fracción de lavado (300 ml) contenían, cada una, 50.000 U de
actividad, respectivamente, antes de la aplicación (13% cada una de
la actividad original).
Después del lavado, se llevó a cabo la elución
en fracciones de 4 ml mientras se lavaba la columna aplicando un
gradiente lineal de concentraciones entre tampón C (250 ml) y tampón
C que contenía
metil-\alpha-D-glucosido
0,2 M y
metil-\alpha-D-manopiranosido
0,2 M (250 ml) para recoger las fracciones activas (78 ml en total).
La fracción activa fue dializada a fondo frente a tampón D [tampón
de fosfato potásico 5 mM (pH de 5,0), CaCl_{2} 0,3 mM y THC de 3 a
6 \muM]. Se combinó la fracción de lavado con la fracción B
restante y se llevó a cabo el segundo ciclo de
cromatografía.
cromatografía.
Se disolvieron MnCl_{2} y CaCl_{2} en la
restante fracción B activa hasta 1 mM de cada uno y se realizó la
aplicación a una columna de ConA-Sepharose (3,6 cm x
12 cm; aproximadamente 120 ml) que había sido equilibrada con tampón
C. Después de la aplicación, la columna fue lavada con
aproximadamente 0,3 litros de tampón C. La fracción de paso y la
fracción de lavado (300 ml) contenían poca actividad. Después del
lavado, se llevó a cabo la elución en fracciones de 8 ml mientras se
lavaba la columna aplicando un gradiente lineal de concentraciones
entre tampón C (350 ml) y tampón C que contenía
metil-\alpha-D-glucosido
0,2 M y
metil-\alpha-D-manopiranosido
0,2 M (350 ml) para recoger las fracciones activas (150 ml en
total). Después de dializar a fondo la fracción activa frente a
tampón D, se combinó el producto de diálisis con la muestra previa
para obtener una fracción activa (250 ml en total).
El producto de diálisis (250 ml) fue aplicado a
una columna Gigapite (Biochemical Industries; 2 cm x 16 cm; columna
abierta de 50 ml) que había sido equilibrada con tampón D. Después
de la aplicación de la muestra, la columna fue lavada con tampón D
(250 ml). Se llevó a cabo la elución en fracciones de 4 ml mientras
se lavaba la columna aplicando un gradiente lineal de
concentraciones entre tampón D (200 ml) y tampón de fosfato potásico
0,5 M (pH de 5,0; 200 ml) para recoger las fracciones activas (120
ml en total).
Se disolvió
3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato
(CHAPS) en la fracción activa hasta una concentración final de
0,1%, lo que fue seguido de ultrafiltración usando una película
Amicon PM10 para concentrar hasta 18 ml. El siguiente procedimiento
fue llevado a cabo seis veces sobre la fracción activa
concentrada.
Una columna HiLoad 16/60 Superdex 75 pg enfriada
fue equilibrada con tampón B que contenía CHAPS al 0,07% y NaCl
0,15 M, realizándose la elución con un caudal de 0,5 ml/min para
obtener fracciones de 2 ml, usando un sistema de cromatografía
líquida de resolución rápida (FPLC; del inglés, fast
performance liquid chromatography). Se
recogieron las fracciones activas (63 ml en total).
La fracción activa resultante fue dializada a
fondo a 4ºC frente a tampón E (tampón B que contenía CHAPS al
0,07%). El siguiente procedimiento cromatográfico fue llevado dos
veces a cabo utilizando un sistema de FPLC. Una columna de
SP-Sepharose FF (1 x 16 cm) enfriada fue equilibrada
con tampón E. Después de la aplicación de la muestra a la columna,
se usó tampón E como disolución A y se usó tampón E que contenía
NaCl 0,7 M como disolución B. Se lavó la columna durante los 30
primeros minutos con disolución A al 95% y disolución B al 5% y
luego se aplicó un gradiente lineal de concentraciones hasta
disolución A al 55% y disolución B al 45% durante los 120 minutos
siguientes, lo que fue seguido de elución durante los 10 minutos
siguientes bajo las mismas condiciones. La elución fue llevada a
cabo en fracciones de 1,0 ml, con un caudal de 0,5 ml/min. Las
fracciones activas (27,8 ml en total) fueron recogidas y fueron
guardadas a 4ºC después de una esterilización por filtración.
22 ml de la fracción activa fueron
adicionalmente purificados mediante FPLC en Gigapite (1 x 14 cm). Se
dializaron 22 ml de muestra durante la noche a 4ºC frente a tampón
de fosfato potásico 0,005 M (pH de 5,0) que contenía CHAPS al 0,07%,
se llevó a cabo la FPLC bajo las condiciones siguientes y se observó
la correlación entre actividad y comportamiento de bandas proteicas.
La FPLC fue llevada a cabo mientras se enfriaban la columna y el
tampón, usando tampón de fosfato potásico 0,005 M (pH de 5,0) que
contenía CHAPS al 0,07% y CaCl_{2} 0,3 mM como disolución A, y
tampón de fosfato potásico 0,5 M (pH de 5,0) que contenía CHAPS al
0,07% como disolución B.
Después de lavar la columna durante 30 minutos
con disolución A al 100% y un caudal de 0,5 ml/min, se aplicó un
gradiente lineal de concentraciones hasta disolución A al 95% y
disolución B al 5% durante los 6 segundos siguientes y luego hasta
disolución A al 20% y disolución B al 80% durante los siguientes 149
minutos y 54 segundos, lo que fue seguido de elución bajo las
mismas condiciones durante los 155 minutos siguientes en fracciones
de
1,0 ml.
1,0 ml.
Las fracciones que contenían una proteína de 40
kDa, que demostró la mejor correlación con la función de actividad
basándose en los resultados de cromatografía y medición de
actividad, fueron recogidas y fueron usadas en un análisis de
estructura primaria.
El fraccionamiento fue llevado a cabo con un
sistema Superdex 200 Smart usando 50 \mul de muestra. El siguiente
procedimiento fue llevado a cabo a 4ºC usando acetato sódico 0,01 M
(pH de 5,0) que contenía CHAPS al 0,07% y NaCl 0,15 M como
disolvente. Se llevó a cabo una cromatografía de filtración en gel
por fraccionamiento en partes alícuotas de 40,0 \mul usando un
caudal de 40,0 \mul/min. Sobre la muestra se llevaron a cabo la
medición de actividad y una electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecilsulfato sódico
(SDS-PAGE; del inglés, sodium
dodecylsulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis). La actividad enzimática resultó eluida en
las proximidades de un peso molecular de 43 kDa y, entre las
proteínas contenidas en la muestra, el comportamiento de la proteína
de 40 kDa se correlacionaba muy estrechamente con la función de
actividad.
Se dializaron 250 \mul de muestra durante la
noche a 4ºC frente a acetato sódico 0,01 M (pH de 5,0) y se
disolvió sulfato amónico hasta una concentración final de 2 M. La
FPLC en alquil-Sepharose HR5/5 fue llevada a cabo a
temperatura ambiental. Utilizando acetato sódico 0,01 M (pH de 5,0)
que contenía (NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M como disolución A,
y acetato sódico 0,01 M (pH de 5,0) como disolución B, se lavó la
columna con disolución A al 100% durante los primeros 10 minutos, se
aplicó un gradiente lineal de concentraciones hasta disolución B al
100% durante los siguientes 50 minutos y se llevó a cabo la elución
durante los siguientes 5 minutos bajo las mismas condiciones en
fracciones de 0,5 ml.
Se concentraron 400 \mul de cada fracción
hasta 40 \mul con Ultra-Free C3GC (peso molecular
fraccionado: 10.000; Millipore), y se analizaron 10 \mul del
concentrado por SDS-PAGE y se midió su actividad.
Entre las proteínas contenidas en la muestra, la mejor correlación
se observó entre la función de actividad y el comportamiento de la
proteína de 40 kDa.
Se dializaron 300 \mul de muestra durante la
noche a 4ºC frente a tampón de fosfato potásico 0,005 M (pH de 5,0)
que contenía CHAPS al 0,07%. La FPLC en Gigapite HR5/5 fue llevada a
cabo a temperatura ambiental bajo las condiciones siguientes.
Utilizando tampón de fosfato potásico 0,005 M
(pH de 5,0) que contenía CHAPS al 0,07% y CaCl_{2} 0,3 mM como
disolución A, y tampón de fosfato potásico 0,5 M (pH de 5,0) que
contenía CHAPS al 0,07% como disolución B, se lavó la columna con
disolución A al 100% durante los primeros 5 minutos, y se aplicó un
gradiente lineal de concentraciones hasta disolución A al 80% y
disolución B al 20% durante los siguientes 6 segundos y luego hasta
disolución A al 20% y disolución B al 80% durante los siguientes 44
minutos y 54 segundos, después de lo cual se eluyeron fracciones de
0,5 ml. Luego se llevaron a cabo la medición de actividad y una
electroforesis SDS-PAGE. Entre las proteínas
contenidas en la muestra, la mejor correlación se observó entre el
comportamiento de la proteína de 40 kDa y la función de
actividad.
Como resultado de llevarse a cabo la
cromatografía en columna con el sistema Superdex 200 Smart, la FPLC
en alquil-Sepharose y la FPLC en Gigapite, se
demostró una estrecha correlación entre el comportamiento de la
banda de proteína de aproximadamente 40 kDa y la función de
actividad.
Se confirmó que la aurona sintasa purificada
convierte tanto THC como pentahidroxichalcona en aureusidina.
Mediante un análisis por HPLC se confirmó que el producto resultante
era aureusidina.
Se determinó que el peso molecular de esta
enzima era 40 kDa mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS y 43 kDa mediante electroforesis
en gel usando Superdex 200. Estos datos revelaron que la aurona
sintasa es un monómero. La actividad enzimática resultó inhibida en
un 90% o más en presencia de ión cobre monovalente, ión cobre
bivalente, ión hierro bivalente e ión hierro trivalente, 1 mM.
Además, la unión a ConA-Sepharose sugería la
posibilidad de que la enzima contuviera azúcar. Además, la actividad
aumentaba algo cuando se añadía peróxido de hidrógeno.
Cuando la enzima reaccionó con THC como
sustrato, se formó un producto del que se esperaba que fuera
aureusidina, y se determinó su estructura recogiendo una gran
cantidad de este producto. Se mezclaron 20 ml de tampón de acetato
sódico 1 M (pH de 5,0) que contenía peróxido de hidrógeno 10 mM, 20
ml de disolución de enzima, 58 ml de agua y 10 mg (0,5 ml) de THC y
se mantuvo la mezcla durante 3,5 horas a 30ºC. Después de la
reacción, la mezcla de reacción fue absorbida en
Sep-Pak C18 y fue eluida con metanol. Tras ser
concentrada con un evaporador, fue purificada mediante separación
por HPLC usando una columna YMC
D-ODS-5 S-5 120A
(2,5 x 25 cm). La elución fue llevada a cabo con un caudal de 4,5
ml/min usando una disolución acuosa de acetonitrilo al 40% que
contenía TFA al 0,03%. El pico que resultaba eluido a
aproximadamente 17 minutos fue recogido y secado para obtener
aproximadamente 4,9 mg de producto. La determinación de la
estructura del compuesto por resonancia magnética nuclear de ^{1}H
y espectrometría de masas reveló que era aureusidina.
Aproximadamente 1 nanomol de la aurona sintasa
resultante, a la que se había añadido SDS hasta una concentración
final de 2%, fue sometido a una electroforesis preparativa
(Biophoresis, Atoh) bajo condiciones no reductoras con objeto de
recuperar un polipéptido que tenía un peso molecular de 41.000.
Cuando este polipéptido fue separado mediante HPLC en fase inversa
usando una columna C4 (Develosil
300C4-HG-5), se detectó un único
pico, lo que confirma que la aurona sintasa recuperada es pura.
Este polipéptido fue sometido a digestión por
lisilendopeptidasa AP1. El tampón para la reacción era
Tris-HCl 40 mM (pH de 9,5) que contenía Tween 20 al
0,01% y urea 2 M. El producto de digestión fue purificado por HPLC
en fase inversa usando una columna Bakerbond ODS (4,6 mm x 25 cm).
Es decir, se utilizó una disolución acuosa de ácido trifluoroacético
al 0,05% como disolución A y se utilizó acetonitrilo al 80% que
contenía ácido trifluoroacético al 0,05% como disolución B, y se
aplicó un gradiente lineal de concentraciones hasta disolución A al
90% y disolución B al 10% durante los primeros 5 minutos y luego
hasta disolución B al 100% durante los siguientes 80 minutos para
separar los péptidos.
Las secuencias de los péptidos purificados
fueron determinadas con un secuenciador peptídico utilizando un
método para fase de vapor. A continuación se muestran las secuencias
determinadas.
- P5: (K)KLGYVYQDVEIP (SEQ ID NO. 3)
- P8: (K)IVYRQMVSSAK (SEQ ID NO. 4)
- P11: (K)TPQLFFGRPYRRGDQEF (SEQ ID NO. 5)
- P4-5: (K)IIDFELPXPSTTMRVRRAAHLVDDAYIXK (SEQ ID NO. 6).
Se construyó un banco de cDNA de pétalos de boca
de dragón de acuerdo con el método descrito a continuación. Se
obtuvo RNA de 5 g de pétalos frescos, recogidos inmediatamente antes
de la floración de las bocas de dragón amarillas, utilizando
tiocianato de guanidina/cloruro de cesio del modo descrito con
detalle en Methods in Molecular Biology, volumen 2 (Humana Press
Inc., 1.984), por R. McGookin et al., lo que fue seguido de
la purificación de poliA+RNA usando Oligodex dT30 (Roche Japan).
Luego se preparó un banco de cDNA con este PoliA+RNA y
\lambdaZAPII (Stratagene) como un vector, usando un sistema de
síntesis de cDNA y el sistema de vector Uni-XR
(Stratagene), del modo recomendado por Stratagene. El banco
resultante estaba compuesto de 1,6 x 10^{5} unidades formadoras de
placa (pfu; del inglés, plaque-forming
units).
La sustracción es uno de los métodos para
adquirir un gen específicamente expresado en cierto tejido en cierto
momento, y aquí se llevó a cabo usando el sistema de sustracción de
cDNA PCR-Select™ (Clontech) del modo recomendado.
Como comprobador se usó cDNA procedente de pétalos de boca de dragón
amarilla, mientras que, como conductor, se usó mRNA procedente de
pétalos de boca de dragón rosa. Los fragmentos de DNA finalmente
multiplicados por PCR fueron subclonados en el vector PCRII™ usando
un sistema de clonación TA (Invitrogen), lo que fue seguido de la
determinación de sus respectivas secuencias de nucleótidos.
\newpage
Entre éstas, en la SEQ ID NO. 7 se muestra la
secuencia de aminoácidos que se espera que sea codificada por un
gen denominado SYP8.
En esta secuencia de aminoácidos, la secuencia
que consiste en 25 aminoácidos desde el extremo N y la secuencia que
consiste en 4 aminoácidos desde el extremo C coincidían con las
secuencias P5, P8 y P11 obtenidas en el Ejemplo 7. Es decir, se
halló que este fragmento génico codifica aurona sintasa.
El banco de cDNA de boca de dragón previamente
descrito fue explorado usando el fragmento de DNA SYP8. La
exploración del banco fue llevada a cabo usando un sistema de
detección de DNA no radiactivo (Boehringer). Como resultado de la
exploración de aproximadamente 200.000 placas, se obtuvo un gran
número de señales positivas. Se seleccionaron aleatoriamente 20 de
estas placas, se aislaron placas puras mediante una exploración
secundaria y se determinó la secuencia de nucleótidos del clon más
largo de entre éstas, SYP8-17.
La secuencia de nucleótidos fue determinada con
un cebador oligonucleotídico sintetizado, usando el secuenciador de
DNA Modelo 373A (ABI). En la SEQ ID NO. 1 se muestran esta secuencia
de nucleótidos y su secuencia de aminoácidos deducida. Cuando se
llevó a cabo una búsqueda en base de datos para esta secuencia de
aminoácidos, se demostró que este gen presentaba una baja homología
con el gen de polifenoloxidasa (Asociación de GenBank nº L29451,
D45385, Z11702) y se halló que era un nuevo gen. Además, la región
principal que presentaba homología con polifenoloxidasa era una
región ligante de cobre, que es el centro activo de la
polifenoloxidasa.
Órganos y pétalos de boca de dragón amarilla en
cada fase de desarrollo fueron usados para análisis Northern usando
SYP8-17 como sonda. Además, también se llevó a cabo
un análisis Northern usando los pétalos de bocas de dragón
amarillas, rosas y blancas. El método fue de acuerdo con
"Molecular Cloning" (Sambrook et al., Cold Spring
Harbour Laboratory Press, 1.989). Los resultados se muestran en las
Figuras 3, 4 y 5. El gen de aurona sintasa se expresaba
especialmente en los pétalos y, además, la expresión en los pétalos
tiene lugar paralelamente a la biosíntesis de auronas. Además, en
los pétalos rosas y blancos de bocas de dragón en que la acumulación
de mRNA del gen de aurona sintasa era pequeña o no se observaba en
absoluto, la actividad de síntesis de auronas era muy débil o no
detectable en comparación con la actividad en los pétalos amarillos
de bocas de dragón. Estos resultados sugieren que el gen resultante
está implicado en la síntesis de auronas.
Se purificó mRNA a partir de 5 g de capullos de
flores frescas de verbena de variedad Hanatemari Violet (Suntory) de
la manera previamente descrita, lo que fue seguido de la preparación
de un banco de cDNA del modo descrito en el Ejemplo 8. El banco
resultante estaba compuesto de 0,8 x 10^{6} unidades formadoras de
placa (pfu).
Se sintetizaron los cebadores siguientes
basándose en las secuencias de aminoácidos
Phe-Val/Ile-Lys-Phe-Thr-Ala-Ile
(SEQ ID NO. 8),
Lys-Trp-Lys-Gly-Lys-Thr/Pro
(SEQ ID NO. 9) y una secuencia inversa de una secuencia de
aminoácidos,
His-Ala-Val-Cys-Asn-Glu
(SEQ ID NO. 10). Estas secuencias de aminoácidos son secuencias bien
conservadas en comparación con las conocidas secuencias de
aminoácidos de chalcona isomerasa procedente de plantas
superiores.
- CHI-F1: 5'-TT(T,C) (A,G)TN AA(A,G) TT(T,C), ACN GCN AT-3' (SEQ ID NO. 11)
- CHI-F2: 5'-AA(A,G) TGG AA(A,G) GGN AA(A,G) (A,C)C-3' (SEQ ID NO. 12)
- CHI-R2: 5'-(A,G)TG NGC NAC (A,G)CA (A,G)TT (T,C)TC-3' (SEQ ID NO. 13)
Utilizando una combinación de los cebadores
previamente sintetizados, CHI-F1 y
CHI-R2, o CHI-F2 y
CHI-R2, después de llevarse a cabo una reacción de
2 minutos a 96ºC, se repitió 30 veces la reacción de 1 minuto a
96ºC, 1,5 minutos a 42ºC y 3 minutos a 72ºC, y finalmente se llevó a
cabo una reacción de 7 minutos a 72ºC. Cuando se llevó de nuevo a
cabo la PCR bajo las mismas condiciones usando el producto de PCR
resultante como molde, se multiplicó un producto de PCR de
aproximadamente 200 pares de bases (bp; del inglés, base
pair) con la combinación de los cebadores
CHI-F1 y CHI-R2, mientras que se
multiplicaron productos de PCR de aproximadamente 800, 600, 400 y
150 bp con la combinación de los cebadores CHI-F2 y
CHI-R2.
Los productos de PCR resultantes fueron
subclonados en el vector PCRII™ usando un sistema de clonación TA
(Invitrogen). Las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de DNA
subclonados fueron determinadas usando el secuenciador de DNA
Modelo 373A (ABI). Cada uno de los productos de PCR obtenidos con
cada combinación de los cebadores CHI-F1 y
CHI-R2 y los cebadores CHI-F2 y
CHI-R2 tenía una secuencia común con diferentes
longitudes de 222 bp y 159 bp. Las deducidas secuencias de
aminoácidos de estos productos presentaban un elevado grado de
homología con la chalcona isomerasa procedente de otras plantas
superiores.
Se llevó la PCR a cabo utilizando los cebadores
CHI-F1 y CHI-R2 y un fragmento de
aproximadamente 230 bp obtenido al someter a digestión el vector
PCRII™ que contiene 222 bp de chalcona isomerasa de Hanatemari como
molde. Después de llevarse a cabo una reacción PCR durante 2 minutos
a 95ºC usando el producto de PCR multiplicado de aproximadamente 230
bp como molde, se repitió 25 veces la reacción de 1 minuto a 95ºC, 1
minuto a 42ºC y 4 minutos a 72ºC, y finalmente se llevó a cabo una
reacción de 7 minutos a 72ºC, después de lo cual se marcó con
digoxigenina y se usó como sonda para exploración. La exploración
del banco de cDNA de Hanatemari fue llevada a cabo mediante el
método recomendado con un sistema de detección de DNA no radiactivo
(Boehringer).
Utilizando un método similar, también pueden
obtenerse los genes de chalcona isomerasa de otras plantas.
Se hizo expresar el gen SYP8, descrito en el
Ejemplo 9, en E. coli usando el sistema QIA Expressionist
(QIAGEN) y se purificó un producto de expresión. Puesto que el peso
molecular de la preparación purificada de aurona sintasa es de 40 a
43 kDa, se pronosticó que los péptidos del extremo N y el extremo C
estaban truncados en la proteína madura.
Por lo tanto, se sintetizaron los cebadores
QESYP8-5' y QESYP8-3' con objeto de
que se expresara la región del 61º resto de glicocola al 416º resto
de lisina de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO.
2.
- QESPY8-5': 5'-AA GAA TCC GGC CCT ATC GCC-3' (SEQ ID NO. 14)
- QESPY8-3': 5'-GGG TTC GAA GAA TTC ATC TCT G-3' (SEQ ID NO. 15)
Se introdujo un sitio BamHI en el cebador
QESYP8-5' y se introdujo un sitio HindIII en el
cebador QESYP8-3'. Se llevó a cabo una reacción PCR
usando una mezcla de reacción de 100 \mul en total que comprendía
30 picomoles de cada uno de los cebadores sintetizados
QESYP8-5' y QESYP8-3', 1 ng del gen
SYP8-17, tampón 1x para DNA polimerasa pfu clonada
(Stratagene), dNTPs 200 \muM y 5 unidades de DNA polimerasa pfu
clonada (Stratagene). Tras mantenimiento a 94ºC durante 45 segundos,
se llevó a cabo la reacción con 25 ciclos que consistían en 45
segundos a 94ºC, 45 segundos a 50ºC y 4 minutos a 72ºC, después de
lo cual la mezcla de reacción fue finalmente mantenida a 72ºC
durante 10 minutos. El producto de PCR resultante fue subclonado en
el vector pCR2.1 TOPO™ usando un sistema de clonación TA
(Invitrogen) para obtener el plásmido pCR QESYP8. Se trató pCR
QESYP8 con BamHI e HindIII, y se ligó un fragmento de DNA resultante
de aproximadamente 1 kb a un vector pQE30 (QIAGEN) que había sido
similarmente tratado con BamHI e HindIII, con objeto de construir el
plásmido pQESYP8. Se transformó E. coli M15 [pRep4] con
pQESYP8. La expresión de la proteína SYP8 en E. coli y su
purificación se llevaron a cabo de acuerdo con el método recomendado
por los fabricantes. Puesto que se observó que la proteína
purificada resultante tenía una pequeña cantidad de impureza
proteica de acuerdo con un análisis por SDS-PAGE, se
purificó adicionalmente la proteína del modo descrito a
continuación. La disolución de proteína fue concentrada hasta
aproximadamente 1 ml usando Centriprep 10 (Amicon), dializada frente
a agua y liofilizada. Después de un tratamiento con SDS, la impureza
proteica fue separada usando Biophoresis (Atoh, gel de concentración
al 4,5%, gel de separación al 10%, 15 mA, fracciones de 0,8 ml).
Simultáneamente a la concentración usando Ultra-Free
10 (Millipore), se transfirió la preparación purificada final a
disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés,
phosphate buffered saline) (preparada al
disolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na_{2}HPO_{4} y
0,24 g de KH_{2}PO_{4} en 1 litro y ajustar el pH a 7,4 con
ácido clorhídrico) que contenía CHAPS al 0,1%. La concentración de
proteína en la preparación finalmente purificada era 1,0 mg/ml.
Se inmunizaron dos conejos cuatro veces con 0,2
mg, cada uno, del antígeno SYP8 (1,0 mg/ml) preparado en el Ejemplo
14. La inmunización inicial se llevó a cabo utilizando adyuvante
completo de Freund. Las inmunizaciones adicionales se llevaron a
cabo utilizando adyuvante incompleto de Freund. Las inmunizaciones
adicionales se llevaron a cabo los días 14, 42 y 56 después de la
inmunización inicial. El método estuvo de acuerdo con el volumen 12
de Shin Seikagaku Jikken Koza. Se recogieron muestras de sangre los
días 52, 66 y 70 después de la inmunización inicial, y, una vez
mantenida la sangre resultante durante 30 minutos a 37ºC, fue dejada
reposar inalteradamente durante la noche a 4ºC. Se separó el coágulo
para obtener una antisuero. Después de diluir el antisuero al doble
con NaCl al 0,85%, se añadió medio volumen de Freegen enfriado
(Hoechst Japan) y, después de una agitación enérgica, se centrifugó
la mezcla durante 5 minutos a 1.500 rpm para separar la grasa, tras
lo cual el sobrenadante resultante fue utilizado como antisuero.
El antisuero anti-SYP8
desengrasado (aproximadamente 45 ml) fue diluido con un volumen
igual de una disolución 0,15 M de NaCl, lo que fue seguido de la
adición de sulfato amónico hasta un 33% de saturación y de
centrifugación durante 30 minutos a 8.000 rpm. El precipitado fue
dializado frente a tampón A (Tris-HCl 0,05 M, pH de
8,6, NaCl 0,15 M). El producto de diálisis fue aplicado a una
columna HiTrap-proteína A (1 ml) para purificar una
fracción de IgG. Es decir, la muestra dializada fue aplicada a una
columna HiTrap-proteína A equilibrada con tampón A
y, después de lavar la columna con tampón A, la muestra dializada
fue sometida sucesivamente a elución usando tampón B (tampón de
citrato 0,05 M, pH de 5,3, NaCl 0,15 M), tampón C (tampón de acetato
0,05 M, pH de 4,3, NaCl 0,15 M) y tampón D (tampón de glicocola 0,05
M, pH de 2,3, NaCl 0,15 M). Se confirmó que estaba presente IgG en
las fracciones tanto de tampón C como de tampón D, de acuerdo con la
absorción ultravioleta y la inmunotransferencia en forma de mancha,
y se mezclaron estas fracciones para formar una fracción de IgG. La
cantidad de proteína de la fracción era aproximadamente 70 mg. La
fracción de IgG resultante fue dializada frente a NaHCO_{3} 0,1 M
y NaCl 0,5 M, después de lo cual fue concentrada hasta
aproximadamente 2 mg/ml con Centricon 10
(Amicon).
(Amicon).
4,5 g de Sepharose 4B activada con CNBr fueron
suspendidos en 45 ml de HCl 1 mM y fueron lavados con 500 ml de HCl
1 mM sobre un embudo Buchner. La resina lavada fue añadida casi a la
vez a la disolución concentrada de IgG, y fue suspendida y sacudida
durante la noche a 4ºC para inmovilizar la IgG. La resina fue
recogida por filtración con aspiración sobre un embudo Buchner y
fue resuspendida en 30 ml de tampón de Tris-HCl 0,2
M (pH de 8,5), y la suspensión fue sacudida durante dos noches a 4ºC
con objeto de inactivar los grupos activos residuales de la resina.
A continuación, la resina fue lavada sucesivamente con tampón de
acetato 0,2 M (pH de 5,0), tampón de Tris-HCl (pH de
8,5), tampón de fosfato potásico 0,01 M (pH de 7,8) y NaCl 0,2 M.
Como testigo, se inmovilizaron respectivamente IgG
anti-banda A e IgG
anti-\beta-galactosidasa en
Sepharose 4B de la misma manera. Esta Sepharose 4B fue usada como
suspensión de IgG-Sepharose 4B
(anti-SYP8, anti-banda A,
anti-\beta-galactosidasa) en el
Ejemplo 16. Además, se ajustó el peso de IgG hecha reaccionar, por
unidad de peso de resina, para que fuera aproximadamente el mismo
para los tres tipos. El rendimiento de inmovilización fue de 90 a
100%.
Se añadieron 0, 200, 500 y 815 \mul tanto de
disolución acuosa de albúmina sérica bovina (concentración final de
0,1%) como de la suspensión de IgG-Sepharose 4B
preparada en el Ejemplo 15 (anti-SYP8,
anti-banda A,
anti-\beta-galactosidasa; fase de
resina: fase líquida = 2:1, volumen/volumen) a una cantidad de
disolución de enzima y luego se llevó la mezcla hasta un volumen
final de 1 ml con tampón de fosfato potásico 0,01 M (pH de 7,8) y
NaCl 0,2 M. Tras sacudir la mezcla durante 24 horas a 4ºC y
centrifugar durante 20 minutos a 13.000 rpm, se midió la actividad
aurona sintasa del sobrenadante.
Es decir, se midió la actividad aurona sintasa
añadiendo CHAPS que tenía una concentración final de 0,1%,
H_{2}O_{2} 5 mM y tampón de citrato 0,1 M al sobrenadante para
hacer el pH igual a 5,4, llevando el volumen total a 395 \mul y
dejando la mezcla durante 15 minutos a 30ºC, lo que fue seguido de
la adición de 5 \mul de THC (disuelto con etanol de modo que A366
= 600) para iniciar la reacción. Después de permitir la reacción
durante 60 minutos a 30ºC, se añadieron 100 \mul de TFA al 10% y
acetonitrilo al 90% para detener la reacción. Luego se midió la
actividad analizando la mezcla de reacción por HPLC, como se
describió en el Ejemplo 3.
Como se muestra en la Figura 6, cuando se usó
IgG anti-SYP8-Sepharose 4B, la
actividad enzimática en el sobrenadante disminuía dependientemente
de la cantidad de IgG
anti-SYP8-Sepharose 4B añadida. No
hubo cambio en la actividad aurona sintasa en el caso de añadir IgG
anti-banda A-Sepharose 4B o IgG
anti-\beta-galactosidasa-Sepharose
4B como testigo. Además, la resina recogida como precipitado fue
lavada con tampón de fosfato potásico 0,01 M y NaCl 0,2 M, lo que
fue seguido de la medición de la actividad aurona sintasa. Como
resultado, sólo se observó actividad aurona sintasa con IgG
anti-SYP8-Sepharose 4B.
Cuando el sobrenadante fue analizado por
SDS-PAGE y transferencia Western, la señal de aurona
sintasa disminuía dependientemente de la cantidad de IgG
anti-SYP8-Sepharose 4B, como se
muestra en la Figura 7. Por otra parte, en un experimento similar en
que se usaba IgG anti-banda
A-Sepharose 4B como testigo, la señal del gen de
aurona sintasa era constante independientemente de la cantidad de
IgG anti-banda A-Sepharose 4B
añadida.
De acuerdo con estos resultados, se confirmó que
el gen SYP8 codifica aurona sintasa. Adviértase que se detectó una
señal de aproximadamente 80 kDa, dependiente de la cantidad de IgG
anti-SYP8-Sepharose 4B añadida en la
Figura 7. Puesto que esta señal aumenta con el tiempo de
conservación de la resina hasta el experimento, se piensa que esta
señal ha procedido de IgG liberada de la resina de Sepharose 4B.
Como se describió en el Ejemplo 10, la aurona
sintasa presenta una débil homología con la polifenol oxidasa a
nivel de aminoácidos, y la principal región que posee esa homología
es la región que se une al cobre. En consecuencia, puesto que se
espera que la aurona sintasa sea también una enzima de cobre, se
llevó a cabo un análisis de la aureusidina sintasa por absorción
atómica. Se usó el equipo Shimazu AA-6700F como
sistema de medida, y la medición fue llevada a cabo en el modo de
medición en horno a una longitud de onda de 324,8 nm.
Se preparó una curva de calibración (intervalo
de calibración: 0 a 9 ppb) usando una disolución patrón de cobre de
1.000 ppm (Wako Pure Chemical Industries) diluida a 1/1.000 con
ácido sulfúrico concentrado. Puesto que otras sustancias orgánicas
presentes pueden dificultar la medición en el caso del análisis por
absorción atómica, se confirmó de antemano que la medición de la
absorción atómica del cobre era posible incluso en tampón de ácido
acético que contenía CHAPS al 0,1% usando tirosinasa de champiñón
(enzima que contiene ión cobre) antes de la medición. A
continuación, se dializó a fondo aureusidina sintasa pura (200
\mul) frente a tampón de ácido acético (pH de 6,0) que contenía
CHAPS al 0,1%. Se analizaron cantidades conocidas de varias
proteínas patrón mediante SDS-PAGE, se cuantificó la
oscuridad de las bandas de color plateado resultantes con un escáner
de imágenes y se preparó una curva de calibración para determinar la
cantidad de proteína a partir de la oscuridad de las bandas. Se
aplicó una porción de la aureusidina sintasa pura a la
SDS-PAGE bajo las mismas condiciones, se cuantificó
su banda de color plateado con un escáner de imágenes y se calculó
la concentración de proteína a partir de la curva de calibración
previamente preparada. El cobre fue detectado añadiendo 0,5 \mul
de ácido sulfúrico concentrado (1,38 N) a 100 \mul de aureusidina
sintasa pura y midiendo. En consecuencia, se mostró claramente que
esta enzima es una enzima de
cobre.
cobre.
Después de mezclar tirosinasa (Sigma, número de
catálogo: T7755; 0,04 mg/ml, 10 \mul), tampón de fosfato sódico
0,1 M (pH de 6,5, 335 \mul), CHAPS al 9% (20 \mul) y agua
milli-Q (20 \mul), se incubó la mezcla durante 10
minutos a 30ºC, lo que fue seguido de la adición de
tetrahidroxichalcona (THC, 4,3 mM en etanol, 15 \mul), agitación
inmediata y dejación de la reacción durante 30 minutos a 30ºC.
Después de la reacción, se añadieron 100 \mul de disolución de
detención de reacción (disolución de trifluoroacetato al 10% que
contiene acetonitrilo al 90%) a la mezcla de reacción para detener
la reacción, lo que fue seguido de un análisis por HPLC. El análisis
fue llevado a cabo de una manera igual a la descrita en el Ejemplo
3. Se utilizó agua en lugar de tirosinasa como
testigo.
testigo.
En el caso de la adición de tirosinasa, el
sustrato THC resultó eluido en aproximadamente 15,9 minutos mientras
que el producto de reacción aureusidina resultó eluido en
aproximadamente 12,5 minutos. Por otra parte, en el caso de la
adición de agua en lugar de tirosinasa, el sustrato THC resultó
eluido en aproximadamente 16 minutos mientras que la aureusidina no
resultó eluida.
Además, se llevó a cabo la reacción bajo las
mismas condiciones utilizando pentahidroxichalcona (PHC) en lugar de
THC como sustrato y utilizando tampón de
fosfato-citrato sódico 0,116 M (pH de 5,4) como
tampón. Similarmente, se utilizó agua en lugar de tirosinasa como
testigo.
En el caso de la adición de tirosinasa, el
sustrato PHC resultó eluido en aproximadamente 14,7 minutos mientras
que el producto de reacción aureusidina resultó eluido en
aproximadamente 12,5 minutos. Por otra parte, en el caso de la
adición de agua en lugar de tirosinasa, aunque el sustrato PHC
resultó eluido en aproximadamente 14,6 minutos, la aureusidina no
resultó eluida.
De esta manera, se mostró claramente que también
la tirosinasa presenta actividad para sintetizar aurona.
Como ha sido descrito anteriormente, de acuerdo
con el presente invento, se observó por vez primera una reacción en
que se sintetiza aureusidina, una clase de aurona, a partir de
tetrahidroxichalcona, se aisló y purificó la aureusidina sintasa que
cataliza esta reacción, se determinó su secuencia de aminoácidos y
se clonó su gen. Aunque aquí se haya usado boca de dragón como
fuente de enzimas, enzimas que sintetizan auronas pueden purificarse
de otras plantas que contienen auronas utilizando un método similar
y pueden obtenerse sus genes.
Alternativamente, puesto que se sabe que genes
que codifican enzimas que catalizan la misma reacción tienen
secuencias de nucleótidos mutuamente homólogas y se hibridan,
basándose en el cDNA obtenido de boca de dragón se puede obtener de
otra fuente un gen que codifique una enzima que sintetice
auronas.
Además, a partir de polifenol oxidasa puede
obtenerse también un gen que codifique una proteína que tenga
acividad para sintetizar auronas al usar chalconas como
sustratos.
Actualmente se conoce bien la introducción de un
gen diana en una planta, y el presente invento hace posible que
especies vegetales que no poseen inherentemente flores amarillas
creen flores amarillas. Además, también es posible cambiar el matiz
cromático de especies vegetales que tienen flores amarillas.
<110> SUNTORY LIMITED
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Gen que codifica una proteína que
tiene actividad para sintetizar auronas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> G837
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10-107296
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1.998-04-17
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1.951
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Antirrhinum majus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (96)...(1.781)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína que tiene actividad para sintetizar
auronas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 562
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Antirrhinum majus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de una
proteína que tiene actividad para sintetizar auronas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Antirrhinum majus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de aminoácidos de
una proteína que tiene actividad para sintetizar auronas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Leu Gly Tyr Val Tyr Gln Asp Val Glu
Ile Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
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<212> PRT
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<213> Antirrhinum majus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de aminoácidos de
una proteína que tiene actividad para sintetizar auronas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ile Val Tyr Arg Gln Met Val Ser Ser Ala
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Antirrhinum majus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de aminoácidos de
una proteína que tiene actividad para sintetizar auronas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Thr Pro Gln Leu Phe Phe Gly Arg Pro Tyr
Arg Arg Gly Asp Gln}
\sac{Glu Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Antirrhinum majus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> UNSURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> UNSURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de aminoácidos de
una proteína que tiene actividad para sintetizar auronas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ile Ile Asp Phe Glu Leu Pro Xaa Pro Ser
Thr Thr Met Arg Val}
\sac{Arg Arg Ala Ala His Leu Val Asp Asp Ala
Tyr Ile Xaa Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Antirrhinum majus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de aminoácidos de
una proteína que tiene actividad para sintetizar auronas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Val o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\sa{Phe Xaa Lys Phe Thr Ala Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Thr o Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\sa{Lys Trp Lys Gly Lys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
\vskip0.400000\baselineskip
<222>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
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Claims (16)
1. Un gen que:
(a) codifica una proteína que tiene actividad
para sintetizar auronas al usar chalconas como sustratos, y es capaz
de hibridarse bajo condiciones rigurosas con un ácido nucleico que
tiene la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO. 1, en
que dichas condiciones rigurosas son tampón SSC 0,2x a 50ºC; o
(b) codifica una proteína que tiene actividad
para sintetizar auronas al usar chalconas como sustratos, proteína
codificada que tiene una homología de secuencia de al menos 55% con
respecto a la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO.
2.
2. Un gen como el expuesto en la reivindicación
1, en el que el nivel de homología de secuencia es al menos
70%.
3. Un gen como el expuesto en la reivindicación
2, en el que el nivel de homología de secuencia es al menos
80%.
4. Un gen como el expuesto en la reivindicación
3, en el que el nivel de homología de secuencia es al menos
90%.
5. Un gen como el expuesto en la reivindicación
4, en el que la proteína tiene la secuencia de aminoácidos descrita
en la SEQ ID NO. 2.
6. Un vector que comprende un gen como el
expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Un huésped transformado por un vector como el
expuesto en la reivindicación 6, huésped que es distinto de un ser
humano.
8. Un huésped como el expuesto en la
reivindicación 7, en que dicho huésped es un microorganismo o una
célula animal.
9. Un huésped como el expuesto en la
reivindicación 7, en que dicho huésped es una célula vegetal o una
planta.
10. Una proteína codificada por un gen como el
expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
11. Un procedimiento para la producción de una
proteína que tiene actividad para sintetizar auronas al usar
chalconas como sustratos, caracterizado por cultivar o
desarrollar un huésped como el expuesto en la reivindicación 7 y
recoger o purificar dicha proteína de dicho huésped.
12. Un procedimiento para recoger o purificar
una proteína que tiene actividad para sintetizar auronas al usar
chalconas como sustratos, caracterizado por utilizar la unión
específica de un anticuerpo a una proteína como la expuesta en la
reivindicación 10.
13. Un procedimiento para sintetizar auronas,
caracterizado porque se deja que una proteína como la
expuesta en la reivindicación 10 actúe sobre chalconas.
14. Un procedimiento para que se sinteticen
auronas en una planta, caracterizado por transformar una
planta o células vegetales con un gen como el expuesto en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 5, dejar que se exprese dicho gen y
dejar que se use la proteína formada para que se sinteticen auronas
en una planta.
15. Una planta transgénica en que el color de
las flores es regulado por la presencia, como transgén, de un gen
como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o su
progenie o un tejido que tiene las mismas propiedades.
16. Una planta como la expuesta en la
reivindicación 15, en que el color de las flores es regulado a
amarillo, o su progenie o un tejido que tiene las mismas
propiedades.
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