CN109825482B - 抗除草剂基因及其在植物育种中的应用 - Google Patents

抗除草剂基因及其在植物育种中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109825482B
CN109825482B CN201811409979.2A CN201811409979A CN109825482B CN 109825482 B CN109825482 B CN 109825482B CN 201811409979 A CN201811409979 A CN 201811409979A CN 109825482 B CN109825482 B CN 109825482B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
amino acid
herbicide
herbicide resistance
hppd
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811409979.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109825482A (zh
Inventor
朱健康
V·维尔马
李峰
张美玲
李明
陈梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Original Assignee
Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS filed Critical Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Publication of CN109825482A publication Critical patent/CN109825482A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109825482B publication Critical patent/CN109825482B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
    • A01H1/122—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • A01H1/123—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11027—4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (1.13.11.27)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供了对除草剂具有高抗性的突变的HPPD多肽及其编码基因，以及其在改良植物中的应用。具体地，本发明提供了一种突变的HPPD多肽，其在野生型HPPD多肽的第282位氨基酸由精氨酸突变为丝氨酸，此外，突变的HPPD多肽还包括第349位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸；和/或第156位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸。突变后的HPPD多肽对除草剂具有很强的耐受性，在培育HPPD抑制性除草剂耐受性植物领域中具有非常广阔的应用前景。

Description

抗除草剂基因及其在植物育种中的应用
技术领域
本发明涉及植物学领域，更具体地涉及抗除草剂基因及其在植物育种中的应用。
背景技术
对羟苯基丙酮酸双氧化酶(4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase，HPPD，EC1.13.11.27)存在于各种生物体中，其是催化酪氨酸的降解产物-对羟苯基丙酮酸 (4-hydroxyphenylpyruvate，HPP)加氧生成尿黑酸(homogentisate，HGA)反应的关键 酶。在动物体内，HPPD的主要作用是促进酪氨酸、芳氨酸、苯丙氨酸的分解代谢。但在植 物体内的作用与动物体内显著不同，它是尿黑酸形成质体醌(plastoquinones)和生育酚(tocopherols，维生素E)生物合成中的关键前体物质。生育酚起到膜相关抗氧化剂的作用，是植物生长必须的抗氧化剂。质体醌首先是PSII和细胞色素b6/f复合物之间的电子载体，它使电子从光合系统II到达光合系统I，从而将光能转变为化学能。然后是参与类胡萝卜素生物合成的八氢番茄红素去饱和酶的氧化还原辅因子，而胡萝卜素则保护植物免受日光的伤害。
HPPD的抑制则会导致植物细胞内的光合作用解偶联、辅助捕光色素缺乏，同时由于 缺乏通常由类胡萝卜素提供的光保护作用，活性氧中间体和光氧化导致叶绿素破坏，结果 造成植物光合作用组织产生白化症状，生长受到抑制，直至死亡。因此，HPPD自20世纪90年代起，被确定为除草剂靶标。
HPPD抑制类除草剂已证实是非常有效的选择性除草剂，具有光谱的除草活性，既可 在芽前也可以在芽后使用，具有活性高、残留低、对哺乳动物安全和环境友好等特点。目前，按结构分已经开发出了5种以HPPD为靶标的除草剂，主要包括三酮类、吡唑酮类、异 噁唑酮类、二酮腈类和二苯酮类。这类HPPD抑制剂除草剂全球销售额自2005年后急剧增加，2010年达到8.64亿美元，2013年、2014年的全球销售额分别为13.42亿美元、13.92亿美元。在2014年世界农药排名前20强产品类型的销售额中位列13，未来市场发展潜力巨大。
这些HPPD抑制除草剂在其不加选择杀死杂草的同时也给作物带来一定的伤害，因此 获得耐受除草剂的作物尤为重要。目前的策略除了试图绕过HPPD介导的尿黑酸产生外，还 包括进行该酶的过表达从而在植物中产生大量的除草剂靶酶，减轻除草剂的抑制作用。HPPD的过表达使得植物对异噁氟草的二酮腈衍生物(DKN)有更好的萌发前耐受性，但该耐受性不足以抵抗萌发后的除草剂处理。另一种策略是对HPPD进行突变以获得相对突变前的天然HPPD对HPPD抑制剂耐受性较高的靶酶，而同时保留其催化HPPD转化为尿黑酸的作用。该策略已成功应用于两种二酮腈家族的HPPD抑制剂。
尽管本领域对HPPD抑制剂具有耐受性的植物的开发已经获得了一定的研究进展，仍 然有必要开发和改进对HPPD抑制剂的耐受性系统，特别是对属于三酮类(例如磺草酮、硝 磺草酮和环磺酮)的HPPD抑制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供对HPPD抑制剂具有高抗性的HPPD抗性基因及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的除草剂抗性多肽，所述的除草剂抗性多肽为 突变的HPPD多肽，
并且所述突变的HPPD多肽在野生型HPPD多肽的对应于SEQ ID NO.:2的第282位氨基酸 由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；
或者所述突变的HPPD多肽的本发明第八方面所述的除草剂第一抗性敏感位点为丝氨 酸(S)或苏氨酸(T)。
在另一优选例中，所述除草剂抗性多肽还包括选自下组的一个或多个突变：
在野生型HPPD多肽的对应于SEQ ID NO.:2的(a)第156位氨基酸由丙氨酸(A)突变为缬 氨酸(V)或亮氨酸(L)；和/或(b)第349位氨基酸由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)或精氨酸 (R)。
在另一优选例中，所述除草剂抗性多肽还包括选自下组的一个或多个突变：
(a)所述第二抗性敏感位点突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)；和/或
(b)所述第三抗性敏感位点突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述除草剂抗性多肽仅在野生型HPPD多肽的对应于SEQ IDNO.:2 的第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；或者
所述除草剂抗性多肽的第一抗性敏感位点为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。
在另一优选例中，所述除草剂抗性多肽在野生型HPPD多肽的对应于SEQ ID NO.:2的(i) 第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，且(ii)第349位氨基酸由谷氨 酸(E)突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)；或者
所述除草剂抗性多肽的第一除草剂抗性敏感位点为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；且第二除 草剂抗性敏感位点为赖氨酸(K)或精氨酸(R)。
在另一优选例中，所述除草剂抗性多肽在野生型HPPD多肽的对应于SEQ ID NO.:2的(i) 第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，且(ii)第156位氨基酸由丙氨 酸(A)突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)；或者
所述除草剂抗性多肽的第一抗性敏感位点为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；且第三抗性敏感 位点为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述除草剂抗性多肽在野生型HPPD多肽的对应于SEQ ID NO.:2的(i) 第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，(ii)第349位氨基酸由谷氨酸 (E)突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，且(iii)第156位氨基酸由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V) 或亮氨酸(L)；或者
所述除草剂抗性多肽的第一抗性敏感位点为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；第二抗性敏感位 点为赖氨酸(K)或精氨酸(R)；且第三抗性敏感位点为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
其中，所述除草剂抗性多肽的第一、第二和第三抗性敏感位点均为本发明第八方面所 述。
在另一优选例中，所述的除草剂抗性多肽对除草剂的耐受浓度V1与野生型HPPD多肽对 相同除草剂的耐受浓度V2相比，V1/V2≥2，较佳地V1/V2≥5，更佳地V1/V2≥10。
在另一优选例中，所述的除草剂抗性多肽为具有SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:8和/或SEQ ID NO.:10所示氨基酸序列的多肽、其活性片段、或其保守性变异多肽。
在另一优选例中，所述突变的HPPD多肽在野生型HPPD多肽的对应于SEQ ID NO.:2的第 282位氨基酸由精氨酸突变为丝氨酸。
在另一优选例中，所述突变的HPPD多肽在野生型HPPD多肽的对应于SEQ ID NO.:2的第 349位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸；和/或
所述突变的HPPD多肽在野生型HPPD多肽的对应于SEQ ID NO.:2的第156位氨基酸由丙 氨酸突变为缬氨酸。
在另一优选例中，所述的HPPD多肽来源于绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。
在另一优选例中，所述的除草剂为HPPD抑制剂，较佳地为三酮类HPPD抑制剂。
在另一优选例中，所述的三酮类HPPD抑制剂选自下组：磺草酮、硝磺草酮、环磺酮、或其组合。
在另一优选例中，所述的除草剂抗性多肽至少能够耐受浓度为10μM，较佳地50μM，更佳地100μM的除草剂。
在另一优选例中，所述的除草剂抗性多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:8和/或SEQ ID NO.:10所示氨基 酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:8和/或SEQ ID NO.:10所示氨基酸 序列经过一个或多个(如2个、3个、4个或5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有除草剂耐受性的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的衍生的多肽在对应于SEQ ID NO.:4中第282位上的氨基酸为 丝氨酸。
在另一优选例中，所述的衍生的多肽与SEQ ID NO.:4所示序列的同源性至少为60％， 较佳地至少为70％，更佳地至少为80％，最佳地至少为90％，如95％、97％、99％。
在另一优选例中，所述的衍生的多肽在对应于SEQ ID NO.:6中第282位氨基酸为丝氨酸，且第349位氨基酸为赖氨酸。
在另一优选例中，所述的衍生的多肽在对应于SEQ ID NO.:8中第282位氨基酸为丝氨酸，且第156位氨基酸为缬氨酸。
在另一优选例中，所述的衍生的多肽在对应于SEQ ID NO.:10中第282位氨基酸为丝氨酸，第349位氨基酸为赖氨酸、且第156位氨基酸为缬氨酸。
在另一优选例中，所述除草剂抗性多肽为SEQ ID NO.:2所示的野生型的HPPD多肽经突变形成的。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方 面所述的除草剂抗性多肽。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:4所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:3所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％， 最佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:4所示多肽的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:6所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:5所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:5所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％， 最佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:6所示多肽的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:8所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:7所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:7所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％， 最佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:8所示多肽的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:10所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:9所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:9所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％， 最佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:10所示多肽的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cDNA序列、RNA序列、或其组合。
在另一优选例中，所述的多核苷酸在所述除草剂抗性多肽的ORF的侧翼还额外含有选 自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。
在另一优选例中，该多核苷酸还包含与所述除草剂抗性多肽的ORF序列操作性连接的 启动子。
在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导 型启动子、或者强启动子。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核 苷酸。
在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所 述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：植物细胞、动物细胞、原核细胞、酵母细胞。
在本发明的第五方面，提供了一种除草剂抗性多肽的制备方法，所述的方法包括步骤：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达所述的除 草剂抗性多肽；
(b)分离所述的除草剂抗性多肽。
在本发明的第六方面，提供了一种改良植物的方法，所述的方法包括步骤：
(a)提供一植物细胞，利用基因工程改造所述植物细胞，从而使所述植物细胞表达本 发明第一方面中所述的除草剂抗性多肽；和
(b)将步骤(a)中的植物细胞再生成植株。
在另一优选例中，所述的步骤(a)包括步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明第一方面中所述的除草 剂抗性多肽的DNA编码序列；
(2)将植物细胞与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述除草剂抗性多肽的DNA编码序 列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；和
(3)选择已转入所述除草剂抗性多肽的DNA编码序列的植物细胞。
在另一优选例中，在步骤(a)中，利用基因编辑技术改造所述植物细胞，从而使所述 植物细胞表达本发明第一方面中所述的除草剂抗性多肽。
在另一优选例中，在步骤(a)中，利用基因编辑技术改造所述植物细胞，从而使所述 植物细胞中的HPPD在对应于SEQ ID NO.:2第282位氨基酸的保守性位点由精氨酸(R)突变为 丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。
在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括利用基因编辑技术改造所述植物细胞，使所 述植物细胞中的HPPD在对应于SEQ ID NO.:2的(i)第349位氨基酸的保守性位点由谷氨酸(E) 突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，和/或(ii)第156位氨基酸的保守性位点由丙氨酸(A)突变 为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，在步骤(a)中，利用基因编辑技术改造所述植物细胞，使所述植物 细胞中的HPPD在对应于SEQ ID NO.:2的第282位氨基酸的保守性位点由精氨酸(R)突变为丝 氨酸(S)或苏氨酸(T)，且第349位氨基酸的保守性位点由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)或精 氨酸(R)。
在另一优选例中，在步骤(a)中，利用基因编辑技术改造所述植物细胞，使所述植物 细胞中的HPPD在对应于SEQ ID NO.:2的第282位氨基酸的保守性位点由精氨酸(R)突变为丝 氨酸(S)或苏氨酸(T)，且第156位氨基酸的保守性位点由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)或亮 氨酸(L)。
在另一优选例中，在步骤(a)中，利用基因编辑技术改造所述植物细胞，使所述植物 细胞中的HPPD在对应于SEQ ID NO.:2的(i)第282位氨基酸的保守性位点由精氨酸(R)突变 为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，(ii)第349位氨基酸的保守性位点由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K) 或精氨酸(R)，且(iii)第156位氨基酸的保守性位点由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)或亮氨 酸(L)。
在另一优选例中，所述的植物为拟南芥，并且所述拟南芥细胞中HPPD(NCBI登录号： 6532701544)的第349位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。
在另一优选例中，所述拟南芥细胞中进一步地还包括第433位由谷氨酸(E)突变为赖氨 酸(K)或精氨酸(R)，和/或第214位由丝氨酸(S)突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述拟南芥细胞中HPPD的第349位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸 (S)或苏氨酸(T)，且第433位由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)。
在另一优选例中，所述拟南芥细胞中HPPD的第349位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸 (S)或苏氨酸(T)，且第214位由丝氨酸(S)突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述拟南芥细胞中HPPD的第349位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸 (S)或苏氨酸(T)，第433位由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，且第214位由丝氨 酸(S)突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述的植物为水稻，并且所述水稻细胞中HPPD(NCBI登录号：XP_015626163)的第346位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。
在另一优选例中，所述水稻细胞中进一步地还包括第430位由谷氨酸(E)突变为赖氨酸 (K)或精氨酸(R)，和/或第213位由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述水稻细胞中HPPD的第346位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S) 或苏氨酸(T)，且第430位由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)。
在另一优选例中，所述水稻细胞中HPPD的第346位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S) 或苏氨酸(T)，且第213位由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述水稻细胞中HPPD的第346位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S) 或苏氨酸(T)，第430位由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，且第213位由丙氨酸(A) 突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述的植物为大豆，并且所述大豆细胞中第一种HPPD(NCBI登录号： NP_001235148)的第395位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。
在另一优选例中，所述大豆细胞中进一步地还包括第479位由谷氨酸(E)突变为赖氨酸 (K)或精氨酸(R)，和/或第259位由丝氨酸(S)突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述大豆细胞中HPPD的第395位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S) 或苏氨酸，且第479位由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)。
在另一优选例中，所述大豆细胞中HPPD的第395位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S) 或苏氨酸(T)，且第259位由丝氨酸(S)突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述大豆细胞中HPPD的第395位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S) 或苏氨酸(T)，第479位由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，且第259位由丝氨酸(S) 突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述的基因编辑技术选自下组：CRISPR基因编辑体系、易错PCR、基因重组、TALEN和ZFN。
在另一优选例中，所述的基因编辑技术包括可以产生所述突变的任何技术方法。
在另一优选例中，在步骤(a)中，包括步骤：
(a1)通过同源性比对，确定待改造植物HPPD多肽对应于本发明的第八方面所述的除 草剂抗性敏感位点的待改造位点，其中所述除草剂抗性敏感位点包括第一抗性敏感位点；
(a2)利用基因工程改造所述植物细胞，从而使所述植物细胞表达的HPPD多肽的除草 剂第一抗性敏感位点为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。
在另一优选例中，所述除草剂抗性敏感位点还包括：第二抗性敏感位点和/或第三抗 性敏感位点。
在另一优选例中，所述步骤(a2)中还包括：利用基因工程改造所述植物细胞，使所述 植物细胞表达的HPPD多肽的(i)所述第二抗性敏感位点突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)；和/ 或(ii)所述第三抗性敏感位点突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述步骤(a2)中还包括：使所述植物细胞表达的HPPD多肽的第一除 草剂抗性敏感位点为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，且第二除草剂抗性敏感位点为赖氨酸(K)或 精氨酸(R)。
在另一优选例中，所述步骤(a2)中还包括：使所述植物细胞表达的HPPD多肽的第一除 草剂抗性敏感位点为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，且第二除草剂抗性敏感位点为缬氨酸(V)或 亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述步骤(a2)中还包括：使所述植物细胞表达的HPPD多肽的第一除 草剂抗性敏感位点为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，第二除草剂抗性敏感位点为赖氨酸(K)或精 氨酸(R)，且第三除草剂抗性敏感位点为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
在另一优选例中，所述方法改良植物耐受除草剂的性能。
在另一优选例中，所述的植物包括农作物、林业植物、蔬菜、瓜果、花卉、牧草(包括草坪草)；较佳地包括禾本科，豆科以及十字花科植物，更佳地包括水稻、玉米、高粱、 小麦、大豆或拟南芥。
在另一优选例中，所述的植物包括：拟南芥、水稻、小麦、玉米、高粱、番茄。
在另一优选例中，在步骤(4)之后还包括步骤：对所述植株，测试其抗除草剂的性能。
在另一优选例中，所述的植物幼苗至少能够耐受浓度为200μM，较佳地400μM，更佳地600μM的除草剂。
在另一优选例中，所述方法改良的植物在萌发先后至少能够耐受浓度为50nM，较佳地 100nM，更佳地200nM的除草剂(硝磺草酮、磺草酮、和/或环磺酮)。
在本发明的第七方面，提供了一种本发明第一方面所述的除草剂抗性多肽或其编码 基因的用途，用于培育植物抗除草剂株系、或用于制备培育植物抗除草剂株系的试剂或试 剂盒。
在本发明的第八方面，提供了一种除草剂抗性敏感位点，所述的位点选自下组：
(I)第一抗性敏感位点，对应于(i)来源于绿脓假单胞菌的野生型HPPD多肽的第282 位氨基酸、(ii)来源于拟南芥的野生型HPPD多肽的第349位氨基酸、(iii)来源于水稻的野 生型HPPD多肽的第346位氨基酸、(iv)来源于大豆的野生型HPPD多肽的第395位氨基酸、或 (v)来源于番茄的野生型HPPD多肽的第341位氨基酸；
(II)第二抗性敏感位点，对应于(i)来源于绿脓假单胞菌的野生型HPPD多肽的第349 位氨基酸、(ii)来源于拟南芥的野生型HPPD多肽的第433位氨基酸、(iii)来源于水稻的野 生型HPPD多肽的第430位氨基酸、(iv)来源于大豆的野生型HPPD多肽的第479位氨基酸、或 (v)来源于番茄的野生型HPPD多肽的第425位氨基酸；和/或
(III)第三抗性敏感位点，对应于(i)来源于绿脓假单胞菌的野生型HPPD多肽的第156位氨基酸、(ii)来源于拟南芥的野生型HPPD多肽的第214位氨基酸、(iii)来源于水稻的野生型HPPD多肽的第213位氨基酸、(iv)来源于大豆的野生型HPPD多肽的第259位氨基酸、或(v)来源于番茄的野生型HPPD多肽的第209位氨基酸。
在另一优选例中，所述的多肽具有敏感型和不敏感型，当所述位点为精氨酸(R)时， 所述的多肽为敏感型，并且所述的多肽对除草剂敏感；当所述的位点为丝氨酸(S)或苏氨 酸(T)时，所述的多肽为不敏感型，并且所述的多肽对除草剂具有抗性，
较佳地，所述的不敏感型多肽对除草剂的耐受浓度V1与敏感型多肽对相同除草剂的耐 受浓度V2相比，V1/V2≥2，较佳地V1/V2≥5，更佳地V1/V2≥10。
在另一优选例中，所述的多肽具有敏感型和不敏感型，当所述第一位抗性敏感位点 为精氨酸(R),第二位抗性敏感位点为谷氨酸(E)时，所述的多肽为敏感型，并且所述的多 肽对除草剂敏感；当所述的第一位抗性敏感位点为丝氨酸(S)或苏氨酸(T),第二位抗性敏 感位点为赖氨酸(K)或精氨酸(R)时，所述的多肽为不敏感型，并且所述的多肽对除草剂具 有抗性。
在另一优选例中，所述的多肽具有敏感型和不敏感型，当所述第一位抗性敏感位点 为精氨酸(R),第二位抗性敏感位点为丙氨酸(A)时，所述的多肽为敏感型，并且所述的多 肽对除草剂敏感；当所述第一位抗性敏感位点为丝氨酸(S)或苏氨酸(T),第二位抗性敏感 位点为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)时，所述的多肽为不敏感型，并且所述的多肽对除草剂具有 抗性。
在另一优选例中，所述的多肽具有敏感型和不敏感型，当所述第一位抗性敏感位点 为精氨酸(R),第二位抗性敏感位点为谷氨酸(E),第三位抗性敏感位点为丙氨酸(A)时，所 述的多肽为敏感型，并且所述的多肽对除草剂敏感；当所述的第一位抗性敏感位点为丝氨 酸(S)或苏氨酸(T),第二位抗性敏感位点为赖氨酸(K)或精氨酸(R),第三位抗性敏感位点 为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)时，所述的多肽为不敏感型，并且所述的多肽对除草剂具有抗性。
在另一优选例中，所述的不敏感型多肽为本发明第一方面所述的除草剂抗性多肽， 所述的敏感型多肽为野生型HPPD多肽。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体 描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
附图说明
图1显示了野生型(WT)PaHPPD和第1轮ep-PCR突变体(M1至M7)的氨基酸序列比对。
图2显示了在0、2.5、5、10和50μM的3种三酮类除草剂(图2A磺草酮、图2B环磺 酮、图2C硝磺草酮)条件下，定性定量(OD405nm)分析野生型(WT)PaHPPD、第1轮ep-PCR 突变体(M1至M7)和AtHPPD(At)的HPPD活性。
图3显示了在100μM的3种三酮类除草剂(环磺酮、硝磺草酮、磺草酮)条件下，定性定量(OD405nm)分析WT(野生型PaHPPD)和PaHPPD-M3(第1轮ep-PCR突变体)的HPPD活性。
图4显示了在0、10、50和100μM的3种三酮类除草剂(图4A环磺酮、图4B磺草酮、 图4C硝磺草酮)条件下，定性定量(OD405nm)分析野生型(WT)PaHPPD、第1轮ep-PCR突变体(PaHPPD-M3)和第1轮DNA改组突变体(DS7、DS8、DS18、DS23和DS44)的HPPD活性。
图5显示了在100μM的3种三酮类除草剂(环磺酮、硝磺草酮、磺草酮)条件下，定性定量(OD405nm)分析野生型(WT)PaHPPD、第1轮ep-PCR突变体(PaHPPD-M3)和第1轮DNA改组突变体(PaHPPD-DS18)的HPPD活性。
图6显示了在100μM的3种三酮类除草剂(环磺酮、磺草酮、硝磺草酮)条件下，定性定量(OD405nm)分析WT(野生型PaHPPD)、M3(第1轮ep-PCR突变体PaHPPD-M3)、DS18(第1 轮DNA改组突变体PaHPPD-DS18)和DS73(第2轮DNA改组突变体PaHPPD-DS73)的HPPD活性。
图7显示了WT(野生型PaHPPD)、M3(第1轮ep-PCR突变体PaHPPD-M3)、DS18(第1轮DNA 改组突变体PaHPPD-DS18)、DS73(第2轮DNA改组突变体PaHPPD-DS73)和SDM(定点突变突变 体PaHPPD-SDM)的氨基酸序列比对。
图8和图9显示了在0-60μM的三种三酮类除草剂(环磺酮、磺草酮、硝磺草酮)条件下，定性定量(OD405nm)分析WT(野生型PaHPPD)、M3(第1轮ep-PCR突变体PaHPPD-M3)、 DS18(第1轮DNA改组突变体PaHPPD-DS18)、DS73(第2轮DNA改组突变体PaHPPD-DS73)和 SDM(定点突变突变体PaHPPD-SDM)的HPPD活性。
图10显示了PaHPPD及其突变体(PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM) 与植物HPPDs的氨基酸序列的比对图。其中，缩略词含义如下：AtHPPD-拟南芥的HPPD；GmHPPD-大豆的HPPD；OsHPPD-水稻的HPPD；SlHPPD-番茄的HPPD；PaHPPD-绿脓假单胞菌的HPPD。注：黑色箭头和黑色方框同时标记的是植物HPPDs中的保守位点，其中在PaHPPD氨 基酸序列中第282处的精氨酸突变为丝氨酸(R282S)和第349处谷氨酸突变为赖氨酸(E349K)。
图11显示了用于拟南芥转化的pGWB6(35S启动子，N-GFP)过表达载体的构建图。缩略 词：Nos-P：胭脂碱合酶的启动子序列，Nos-T：胭脂碱合酶的终止子序列，HPT(潮霉素磷酸转移酶)基因作为植物中的选择标记，NPT-II(新霉素磷酸转移酶II)基因在细菌和植物中的选择标记。
图12显示了用于水稻转化的35S-pCAMBIA1305-3FLAG过表达载体的构建图。其中，HPT(潮霉素磷酸转移酶)基因作为植物中的选择标记，Poly A site：聚腺苷酸化位点，NosPoly A：胭脂碱合酶的聚腺苷酸化位点。
图13显示用于大豆(Glycine max cv.Williams 82)转化的35S-pCAMBIA1305-3FLAG 过表达载体的构建图。其中，HPT(潮霉素磷酸转移酶)基因作为植物中的选择标记，Poly A site：聚腺苷酸化位点，Nos Poly A：胭脂碱合酶的聚腺苷酸化位点。
图14显示了拟南芥萌发和萌发后对除草剂(硝磺草酮和磺草酮)的抗性。其中，图14A 显示了硝磺草酮存在时，拟南芥过表达系的萌发照片。图14B显示了磺草酮存在时，拟南 芥过表达系的萌发照片。图14C显示了硝磺草酮存在时，拟南芥过表达系的萌发后照片。图14D显示了硝磺草酮存在时，拟南芥过表达系的总叶绿素含量。图14E显示了硝磺草酮存在时，拟南芥过表达系的类胡萝卜素含量。缩略词：WT(Col0)；OE At：AtHPPD的过表达 系；OE Pa：PaHPPD的过表达系；OE M3：PaHPPD-M3过表达系。其中，AtHPPD表示来源于 拟南芥(Arabidopsis thaliana)的HPPD基因，PaHPPD表示来源于绿脓假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)的HPPD基因，PaHPPD-M3表示具有第844位C突变为A的PaHPPD 突变基因。
图15显示了盆栽拟南芥对除草剂(硝磺草酮)的抗性。缩略词：WT(Col0)；OE At：AtHPPD的过表达系；OE Pa：PaHPPD的过表达系；OE M3：PaHPPD-M3过表达系。
图16显示了除草剂(250nM硝磺草酮)处理6h后，WT(Col0)、OE At(AtHPPD过表达系)、 OE Pa(PaHPPD的过表达系)和OE M3(PaHPPD-M3过表达系)的HPPD和维生素E生物合成基因 (VTE1和VTE3)相对表达水平。
图17显示了除草剂(100nM硝磺草酮)处理拟南芥诱导的超氧化物和过氧化氢(分别 用NBT和DAB染色)的积累。其中，图17A和图17B分别显示了WT(Col0)、OE At、OE Pa、OEM3 的2周龄幼苗分别在对照培养基(不含除草剂的1/2MS培养基)和含有除草剂的培养基(含100 nM硝磺草酮的1/2MS培养基)上培养72h，然后用NBT染色。图17C和图17D分别显示了WT (Col0)、OE At、OE Pa、OE M3的2周龄幼苗分别在对照培养基(不含除草剂的1/2MS培养基) 和含有除草剂的培养基(含100nM硝磺草酮的1/2MS培养基)上培养72h，然后用DAB染色。
图18显示了盆栽水稻对除草剂(200μM硝磺草酮)的抗性。图18A显示了用200μM硝磺 草酮(0.1％吐温-20配制而成)和0.1％吐温-20(对照)处理3周后的WT和T0代OE SDM水稻株系 的照片。图18B定量分析了经0.1％吐温-20(对照)和200μM硝磺草酮(0.1％吐温-20配制而 成)喷施2周后WT和OE SDM水稻叶片总叶绿素含量。其中，缩略词含义如下：WT：野生型水 稻；OE SDM：T0代PaHPPD-SDM过表达水稻株系。
图19显示了经对照(0.1％吐温-20)和200μM硝磺草酮(用0.1％吐温-20配制而成)喷施 处理1周后的水稻叶片的氧化应激标记(超氧化物、过氧化氢和MDA含量)。图19A和图19B 分别显示了经对照(0.1％吐温-20)和200μM硝磺草酮喷施处理1周后的WT和OE SDM水稻幼苗 叶片NBT染色照片。图19C和图19D分别显示了经对照(0.1％吐温-20)和200μM硝磺草酮喷施 处理1周后的WT和OE SDM水稻幼苗叶片DAB染色照片。图19E显示了经对照(0.1％吐温-20) 和200μM硝磺草酮喷施处理1周后的WT和OE SDM水稻幼苗叶片中的脂质过氧化(MDA)含量。
图20叶片水平分析OE PaHPPD-SDM的T0代大豆植株对三酮类除草剂(硝磺草酮)的抗 性。用棉棒分别蘸取不同浓度的硝磺草酮(用0.1％的吐温20配制而成的0、1、5、10、30μM) 和对照(0.1％的吐温20)对4周龄的OE PaHPPD-SDM的T0代大豆植株(OESDM#12andOESDM #13)和WT的叶片进行涂抹，处理2周后的照片。
图21叶片水平分析OE PaHPPD-SDM的T1代大豆植株对三酮类除草剂(硝磺草酮)的抗 性。用棉棒分别蘸取20μM硝磺草酮(用0.1％的吐温20配制而成)和对照(0.1％的吐温20)对2 周龄的OE PaHPPD-SDM的T1代大豆植株、OE GmHPPD的T1代大豆植株和WT的三叶的叶片进行 均匀涂抹，处理10d后的照片。缩略词：C(control)：对照处理；T(Treatment):除草剂 处理。
图22全株水平分析T1代大豆株系对三酮类除草剂(硝磺草酮)的抗性。20μM的硝磺草酮(用0.1％吐温-20配制而成)和对照(0.1％吐温-20)分别对4周龄的OE PaHPPD-SDM的T1 代、OE GmHPPD的T1代和WT的大豆株系进行第1次喷施，1周后进行第2次喷施。图为喷施处 理2周后照片。A顶视图，B侧面图。缩略词：WT：野生型大豆威廉82；OE GmHPPD：大豆 HPPD基因超表达的大豆株系；OE SDM：PaHPPD-SDM基因超表达的大豆株系。
图23经三酮类除草剂(硝磺草酮)处理的T1代大豆株系的叶绿素含量和株高。20μM的硝磺草酮(用0.1％吐温-20配制而成)和对照(0.1％吐温-20)分别对4周龄的OE PaHPPD-SDM的T1代、OE GmHPPD的T1代和WT的大豆株系进行第1次喷施，1周后进行第2次喷 施。处理2周后进行叶绿素含量和株高测定。A叶片叶绿素a和叶绿素b的含量，B株高。 缩略词同图22。
图24不同生育酚生物合成基因在不同大豆品系(WT，OE GmHPPD和OE SDM)中的表达。 WT、OE GmHPPD和OE PaHPPD-SDM的4周龄的T1代大豆幼苗分别在处理组(含有20μM硝磺草 酮1/2MS液体培养基)和对照组(1/2MS液体培养基)中持续培养12h，然后qPCR分析分析叶片 中生育酚生物合成基因的表达量。其中，缩略词如下：WT：野生型大豆威廉82；OEGmHPPD： GmHPPD基因的超表达；OE PaHPPD-SDM：PaHPPD-SDM基因的超表达；GmHPPD基因：大豆的 HPPD基因；GmHST基因：八氢番茄茄红素转移酶基因；GmTC基因也称为VTE1：生育酚环化 酶基因；GmHPT或称VTE2，GmMPQMT甲基转移酶基因：VTE3。
图25显示了标注有PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM突变位点的 绿脓假单胞菌PaHPPD的蛋白三维结构图。
图26显示了标注有PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM突变位点的 拟南芥AtHPPD的蛋白三维结构图。
图27显示了标注有PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM突变位点的 水稻OsHPPD的蛋白三维结构图。
图28显示了本发明的实验流程图。本发明基于绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的HPPD氨基酸序列，通过PCR诱变获得PaHPPD基因突变体库，然后在E.coli 中建立高通量的抗性筛选体系，同时通过定性定量检测获得抗除草剂HPPD基因，然后超表 达抗性基因并转化植物(e.g.拟南芥、水稻、大豆和番茄等)，最后对抗HPPD除草剂植物的 有效性进行验证。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现对HPPD抑制剂具有高抗性的来源 于绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的HPPD抑制剂抗性基因PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM及其应用。具体涉及HPPD突变体PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM的核酸序列、突变位点和氨基酸序列和微生物中的稳定性抗性检测。实验表明，将该突变基因导入植物拟南芥，可以使拟南芥具有明显的HPPD抑制性除草剂抗性，其在培育HPPD抑制性除草剂耐受性植物领域中具有非常广阔的应用前景。在此基础上完成本发明。
具体地，大肠杆菌DH5α中存在酪氨酸氨基转移酶，可催化酪氨酸生成对羟苯基丙酮 酸(4-HPP)，作为HPPD的底物而被利用，生成的尿黑酸(HGA)进一步氧化和聚合后产生棕色 物质。添加HPPD抑制剂则会抑制该反应，从而降低色素的产生。因此可根据色素颜色的深 浅作为HPPD活性的抑制指标。通过对该色素的一些性质和较高分辨率色素的最适条件等的 优化，发明人建立了基于96孔板的高通量抗环磺酮类除草剂基因的大肠杆菌筛选系统。通 过在E.coli DH5α中对不同来源的HPPD突变基因进行异源表达，通过检测色素在405nm 处的吸收值分析菌株E.coli DH5α-突变基因对三酮类除草剂的抗性特性(图2-图6、图8 和图9)。该系统可灵敏快速的进行定性定量检测，同时具备成本低、体积小、反应系统简 单等优点。
利用大肠杆菌色素筛选系统，本发明获得了四个新的突变HPPD酶，其均保留催化对 羟苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的活性，且对HPPD抑制剂的耐受性高于原始的未突变的 HPPD。第一种HPPD突变体PaHPPD-M3，其特征在于在绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的PaHPPD的第282处的精氨酸突变为丝氨酸(R282S)。具体涉及HPPD突变体PaHPPD-M3核酸序列、突变位点(C844A)和氨基酸序列。
第二种HPPD突变体为PaHPPD-DS18，其特征在于在绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的PaHPPD的第282处的精氨酸突变为丝氨酸(R282S)和第349处的谷氨酸突变为赖氨酸(E349K)。具体涉及HPPD突变体PaHPPD-DS18核酸序列、突变位点(C844A、G216A 和G1045A)和氨基酸序列。
第三种HPPD突变体为PaHPPD-DS73，其特征在于在绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的PaHPPD的第282处的精氨酸突变为丝氨酸(R282S)和第156处的丙氨酸突变为缬氨酸(A156V)。具体涉及HPPD突变体PaHPPD-DS73核酸序列、突变位点(C844A和C467T)和氨基酸序列。
第四种HPPD突变体为PaHPPD-SDM，其特征在于在绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的PaHPPD的第282处的精氨酸突变为丝氨酸(R282S)、第349处谷氨酸突变为赖氨酸(E349K)、第156处丙氨酸突变为缬氨酸(A156V)。具体涉及HPPD突变体PaHPPD-SDM核酸序列、突变位点(G216A、C467T、C844A、G1045A)和氨基酸序列。根据本发明的突变体PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM中的核酸序列、突变位点和氨基酸 序列。进一步提供了该突变基因在微生物水平上的抗性，其中突变体PaHPPD-M3、 PaHPPD-DS18和PaHPPD-DS73使得微生物对3种三酮类除草剂(磺草酮、硝磺草酮和环磺酮) 的耐受性均高至100μM；突变体PaHPPD-SDM使得微生物对3种三酮类除草剂(磺草酮、硝 磺草酮和环磺酮)的耐受性均高于60μM。
同时，利用植物组成型35S启动子，将基因PaHPPD-M3过表达并转化拟南芥，获得了抗HPPD抑制剂(三酮类除草剂)显著的超表达PaHPPD-M3拟南芥植株。在1/2MS培养基水平，超表达PaHPPD-M3拟南芥T3代种子萌发前对HPPD抑制剂的最大耐受浓度是125nM。T3代转基因幼苗在含有除草剂的培养基条件下，对HPPD抑制剂的最大耐受浓度是250nM。在盆栽条件下，对生长良好的拟南芥完全展开叶喷施HPPD抑制剂(硝磺草酮)，其最大耐受浓度是5μM。
经250nM三酮类除草剂处理6h后，超表达PaHPPD-M3拟南芥植株叶片的总叶绿素和类胡萝卜素的含量均显著高于WT、OE At和OE Pa；与未经除草剂处理的幼苗相比，超表达PaHPPD-M3株系中的HPPD、VTE1和VET3基因的表达显著上调，而WT、OE At和OE Pa株系中HPPD、VTE1和VET3基因的表达显著下调。
超表达PaHPPD-M3拟南芥植株在100nM硝磺草酮的1/2MS培养基上培养72h硝磺草酮) 后，取完全展开新叶分别用NBT和DAB染色，表明超表达PaHPPD-M3拟南芥植株中超氧化物 和过氧化氢的积累均明显少于WT、OE At和OE Pa。
同时，并将基因PaHPPD-SDM超表达并克隆到35S-pCAMBIA1305-3FLAG载体中，通过农 杆菌介导的水稻转基因技术，转入水稻日本晴中，获得转基因水稻T0代株系。盆栽转基因 水稻，对生长良好的幼苗喷施除草剂(200μM硝磺草酮)，处理后21d，野生型水稻叶片白化、生长受抑直至死亡，而OE PaHPPD-SDM水稻生长良好，表型接近于未处理的OE PaHPPD-SDM。处理后的OE PaHPPD-SDM叶片叶绿素含量无明显降低。
在正常生长条件下(经0.1％吐温-20对照处理)，WT和OE SDM水稻株系叶片的超氧化 物、过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量相似。而经200μM硝磺草酮(用0.1％吐温-20配制而成)喷施处理1周后，WT水稻叶片的超氧化物、H2O2和MDA含量显著高于OE SDM水稻叶片。表明，OE SDM水稻中PaHPPD-SDM的过表达防止了过氧化物、H2O2和MDA的积累，并增强了对三酮类除草剂的抗性。
利用植物组成型35S启动子，将基因PaHPPD-Gm和PaHPPD-SDM过表达并克隆到35S-pCAMBIA1305-3FLAG载体中，通过农杆菌介导的大豆转基因技术转入大豆威廉82中，并获得转基因大豆T0代和T1代株系。叶片涂抹不同浓度的硝磺草酮(用0.1％吐温-20配制而 成0、1、5、10和30μM)2周后，OE PaHPPD-SDM大豆株系的叶片在30μM硝磺草酮浓度下并未表现出漂白和受损的症状，而WT在硝磺草酮的浓度为5μM时，已表现出漂白症状，并随 浓度的增大，漂白症状越严重。
OE PaHPPD-SDM的大豆株系T1代、OE GmHPPD的大豆T1代和WT的4周龄幼苗，经20μM硝磺草酮喷施处理2次，处理2周后，发现经硝磺草酮喷施处理的OE GmHPPD和WT的叶片的叶绿素a和叶绿素b的含量以及株高与对照处理相比均显著降低，WT表现的更为明显。同时，发现经硝磺草酮喷施处理的OE PaHPPD-SDM的叶片叶绿素a和叶绿素b的含量和株高与对照相比有所降低，但其叶绿素a和叶绿素b的含量以及株高均显著高于硝磺草酮处理后的OEGmHPPD和WT。表明，OE PaHPPD-SDM大豆显著提高了其对三酮类除草剂的抗性。
因此，本发明涉及编码突变的PaHPPD-M1-7、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM 的核酸序列、突变位点、氨基酸序列，还涉及PaHPPD-SDM水稻株系和种子以及PaHPPD-SDM 大豆株系和种子。进一步提供了PaHPPD-M3和PaHPPD-SDM用于向植物赋予除草剂抗性或耐 受性、特别是对某些类别的HPPD抑制性除草剂的抗性或耐受性的方法。该突变基因将在获 得耐受HPPD抑制性除草剂植物的应用中发挥重要作用。
术语
如本文所用，术语“HPPD”是指对羟苯基丙酮酸双氧化酶(4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase，HPPD，EC 1.13.11.27)，其存在于各种生物体中，是催化酪氨酸的降解产 物-对羟苯基丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvate，HPP)加氧生成尿黑酸(homogentisate， HGA)反应的关键酶。HPPD的抑制会导致植物细胞内的光合作用解偶联、辅助捕光色素缺 乏，同时由于缺乏通常由类胡萝卜素提供的光保护作用，活性氧中间体和光氧化导致叶绿 素破坏，结果造成植物光合作用组织产生白化症状，生长受到抑制，直至死亡。HPPD抑制 类除草剂已证实是非常有效的选择性除草剂，具有广谱的除草活性，既可在芽前也可以在 芽后使用，具有活性高、残留低、对哺乳动物安全和环境友好等特点。
如本文所用，术语“HPPD抑制剂”、“HPPD抑制性除草剂”、“HPPD抑制类除草剂” 可互换使用，是指通过抑制HPPD，抑制植物生长甚至使植物死亡的制剂，优选地为三酮类HPPD抑制剂，如磺草酮、硝磺草酮、环磺酮。
如本文所用，术语“除草剂抗性多肽”、“突变的HPPD多肽”、“突变的PaHPPD多 肽”、“突变HPPD蛋白”、“突变HPPD酶”、“本发明多肽”等可互换使用，都指本发明 第一方面所述的多肽。
在另一优选例中，所述的除草剂抗性多肽为具有SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:8和/或SEQ ID NO.:10的蛋白或多肽，或其衍生的具有相同除草剂耐受性的衍生多 肽或活性片段。
如本文所用，术语“除草剂抗性”、“除草剂耐受性”可互换使用，是指对除草剂， 尤其是三酮类HPPD抑制剂，如磺草酮、硝磺草酮、环磺酮具有耐受性，本发明的除草剂抗 性多肽PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18和PaHPPD-DS73至少能够耐受浓度为10μM，较佳地50μM， 更佳地100μM的除草剂。本发明的除草剂抗性多肽PaHPPD-SDM至少能够耐受浓度为10μM， 较佳地40μM，更佳地60μM的除草剂。此外，超表达本发明除草剂抗性多肽PaHPPD-SDM 的水稻幼苗至少能够耐受浓度为200μM的除草剂，较佳地400μM，更佳地600μM的除草剂。 同时，超表达本发明除草剂抗性多肽PaHPPD-SDM的大豆幼苗至少能够耐受浓度为40μM的 除草剂，较佳地80μM，更佳地120μM的除草剂。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的除草剂抗性多肽”是指该除草剂抗性多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化该除草剂抗性多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明多肽
本发明的除草剂抗性多肽具有选自下组的一个或多个特征：
(a)在假单胞菌等细菌中该多肽以同型四聚体形式构成HPPD蛋白酶；
(b)在植物和哺乳动物该多肽都以同型二聚体的形式构成HPPD蛋白酶；
(c)该多肽PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM的一级结构均可以分 成两个结构区域，包括差异显著的N-末端区域和极为保守的C-末端区域；
(d)该多肽PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM均具有α/β折叠结构，其核心是由平行和反平行的β链组成，周围由α螺旋包围，其结构包含一个桶状的结 构域。其中铁结合位点及围绕该活性位点周围的AA没有改变，该突变位点(R282S)位于α- 螺旋上，三个突变位点其中之一(A156V)位于α-螺旋与β的连接上，另外两个位于两个相 邻的α-螺旋上，位于α-螺旋上位点的其中之一突变(E349K)可能影响其所在的α螺旋的 结构，且该螺旋充当底物进入活性中心部位的入口；另一突变(R282S)位点的突变将会很 大程度上影响底物进入活性中心部位入口的开合，导致入口变大。
来源绿脓假单胞菌的PaHPPD及其突变体PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM与植物HPPDs的氨基酸序列比对结果如图10所示，其中，黑色加粗箭头表示发生突变的不同HPPD之间的保守位点(R282S、E349K和A156V)。可以看出PaHPPD氨基酸序列中的282位点和349位点在拟南芥(对应位点为349和433)、水稻(对应位点为346和430)、大豆(对应位点为395和479)和番茄(对应位点为341和425)中均具有保守性；PaHPPD氨基酸序列中的156位点在水稻(对应位点为213)具有保守性。第282位由R突变为S(即PaHPPD-M3突变体)；第282位由R突变为S和第349位由E突变为K(即PaHPPD-DS18突变体)；第282位由R 突变为S和第156位由A突变为V(即PaHPPD-DS73突变体)；第282位由R突变为S、第349位由E 突变为K和第156位由A突变为V(即PaHPPD-SDM突变体)在作物中对除草剂的抗性具有至关 重要的作用。
标注有PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM突变位点的绿脓假单胞 菌、拟南芥和水稻的HPPD蛋白三维结构图分别如图25、26和27所示。可以看出其中的两个 突变位点均在绿脓假单胞菌、拟南芥和水稻的HPPD结构中的两个不同的α螺旋上，其中一 个突变位点(E349K)与其所在α螺旋上的氨基酸形成盐键，可能导致其所在α螺旋的改变， 并影响其所在α螺旋的结构，该螺旋充当底物进入活性中心部位的入口。另一个突变位点 (R282S)与对面的氨基酸形成盐键，突变后其链长变短，并拉动对面的氨基酸向外摆动，导致底物进入活性中心部位的入口变大。
主要物种的HPPD的核苷酸和氨基酸信息如下表A所示
表A
Figure BDA0001878258830000151
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿 主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包 括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括除草剂抗性多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、 “衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的除草剂抗性多肽相同的生物学功能或活 性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性 氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也 可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或 (iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形 成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌 序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、 衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“除草剂抗性多肽”指具有除草剂耐受性的SEQ ID NO:4序列的多 肽。该术语还包括具有与除草剂抗性多肽相同功能的、SEQ ID NO:4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或 数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域 中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C 末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括除草 剂抗性多肽的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与除草剂抗性多肽的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗除草剂抗性多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含除草剂抗性多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了除草剂抗性多肽的可溶性片段。通常，该片段具有除草剂抗性多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明还提供除草剂抗性多肽或多肽的类似物。这些类似物与除草剂抗性多肽的差 别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。 这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射 或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类 似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在 的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例 举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化 或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“除草剂抗性多肽保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似 或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表B进行氨基酸替换而 产生。
优选地，本发明多肽(包括保守性变异多肽、或衍生多肽)保留了在对应于SEQ IDNO.:2的第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，更优选地，本发明多肽保留了在对应于SEQ ID NO.:2的第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)。
表B
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
多核苷酸
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工 合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。
如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10的蛋白质，但与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10的成熟多肽的多核苷 酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多 肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽 或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非 天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本 领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更 佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可 杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂 交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％ 小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是 95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO:4所示的成熟多 肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核 苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码除草剂抗性多肽的多聚核苷酸。
重组技术和植物改良
本发明的编码除草剂抗性多肽的多核苷酸的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增 法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其 克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物) 的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细 胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或除草剂抗性多 肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的除草剂抗性多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码除草剂抗性多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸 的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总 之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征 是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含除草剂抗性多肽编码DNA序列和合适的 转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿 主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白 (GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的 宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞(如农作物和林业植物的细胞)。代表性例子有：大肠杆菌，链霉 菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞、动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会 使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启 动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生 物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用 的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方 法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物 细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得除草剂耐受性改变的植物。
也可以利用基因编辑技术直接对目标植物基因组中的HPPD进行编辑，从而使植物细 胞表达本发明的除草剂抗性多肽。代表性的基因编辑技术包括CRISPR基因编辑体系、易错 PCR、基因重组、TALEN和ZFN。
CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)系统为细菌与古生菌中抵御外源病毒或质粒DNA 入侵的获得性免疫系统。该系统的核酸酶在crRNA的指导下识别并降解外源DNA。其中，II 型CRISPR/Cas系统组成简单，仅包括一个核酸酶Cas9与tracrRNA:crRNA二聚体便可完成识 别和切割功能。CRISPR/Cas9系统以其设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势迅速成 为新一代的基因组编辑技术，已被广泛应用于人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、 植物、真菌与细菌等不同物种。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的 宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进 行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超滤处理、超离心、分子筛层析(凝胶 过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些 方法的结合。
重组的除草剂抗性多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗除草剂抗性多肽 功能的化合物、多肽或其它配体。用表达的重组除草剂抗性多肽筛选多肽库可用于寻找有 价值的能刺激除草剂抗性多肽功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对除草剂抗性多肽或是其编码基因具有特异性的多克隆抗 体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且 还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的 除草剂抗性多肽基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的 产生。本发明的各类抗体可以利用除草剂抗性多肽基因产物的片段或功能区，通过常规免 疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与除草剂 抗性多肽基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因 产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多 肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗除 草剂抗性多肽的抗体可用于检测样品中的除草剂抗性多肽。
一种检测样品中是否存在除草剂抗性多肽的方法是利用除草剂抗性多肽的特异性抗 体进行检测，它包括：将样品与除草剂抗性多肽特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合 物，形成了抗体复合物就表示样品中存在除草剂抗性多肽。
本发明多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片 (又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用除草剂抗性多肽特异的引物进行RNA-聚合酶链式反应(RT-PCR)体外扩增也可检测除草剂抗性多肽的转录产物。
在本发明的一个优选例中，本发明基于绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的 HPPD氨基酸序列，通过PCR诱变获得PaHPPD基因突变体库，然后在E.coli中建立高通量的 抗性筛选体系，同时通过定性定量检测获得抗除草剂HPPD基因，然后超表达抗性基因并转 化植物(e.g.拟南芥、水稻、大豆和番茄等)，最后对抗HPPD除草剂植物的有效性进行验证。
序列表信息
本申请中涉及的序列表的信息如下表C所示，涉及的突变如下表D和表E所示。
表C
Figure BDA0001878258830000201
本申请基于野生型绿脓假单胞菌HPPD基因，通过易错PCR进行PaHPPD的随机诱变，筛 选获得第282位氨基酸由精氨酸突变为丝氨酸的M3(PaHPPD-M3)突变体。
随后，基于该M3突变体，通过对PaHPPD-M3进行第1轮DNA改组，获得第282位氨基酸由精氨酸突变为丝氨酸、且第349位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸的DS18突变体。
随后，基于M3突变体，又进行第2轮DNA改组，筛选获得第282位氨基酸由精氨酸突变 为丝氨酸、且第156位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸的PaHPPD-DS73突变体。
最后，将M3、DS18和DS73三个突变体通过定点突变组合在一起，获得第282位氨基酸 由精氨酸突变为丝氨酸、第349位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸、且第156位氨基酸由丙氨 酸突变为缬氨酸的PaHPPD-SDM突变体。
表D
Figure BDA0001878258830000202
表E
Figure BDA0001878258830000211
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的除草剂抗性多肽具有明显的除草剂耐受性，至少能够耐受浓度为100μM的除草剂。
(b)通过导入除草剂抗性多肽的编码基因，可以增强拟南芥对除草剂的抗性或耐受 性。
(c)通过导入本发明除草剂抗性多肽的编码基因PaHPPD-SDM，可以增强水稻对除草 剂的抗性或耐受性，超表达除草剂抗性多肽的水稻幼苗至少能够耐受浓度为200μM的除草 剂。
(d)通过导入本发明除草剂抗性多肽的编码基因PaHPPD-SDM，可以增强大豆对除草 剂的抗性或耐受性，超表达除草剂抗性多肽的大豆幼苗至少能够耐受浓度为40μM的除草 剂。
(e)本发明的除草剂抗性多肽可以用于培育除草剂耐受性植物新品种。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
通用材料与方法
本发明所采用的酶作用底物酪氨酸和化学试剂(如：硝酸草酮、环磺酮和磺草酮)均 购自于Sigma公司(中国大陆)；T4DNA连接酶DNA酶I、限制性内切酶DpnI和T4多核苷酸激酶购自于新英格兰生物实验室(美国)；KOD-Plus Neo DNA聚合酶购自于东洋(日本)。细菌基因组DNA提取试剂盒购自于北京百泰克生物技术有限公司(中国)。用于ep-PCR的基因形态II随机诱变试剂盒购自安捷伦科技公司(美国)。超快新型植物RNA提取试剂盒购自于北京华越洋生物科技有限公司(中国)。使用的寡核苷酸引物(表1)和测序服务均由上海杰力生物技术有限公司(中国上海)提供。
表1：本发明使用的PCR引物
Figure BDA0001878258830000221
菌株、质粒、培养基组成和培养条件
用于突变体文库构建和基因克隆的宿主菌大肠杆菌DH5α均在37℃条件下，并且含有 氨苄青霉素/羧苄青霉素(100μg/mL L)的Luria-Bertani培养基(LB培养基)中进行培养。 质粒pGEX-6P-1用作基因克隆载体。
LB培养基的配方(1L)
蛋白胨 10g
大肠杆菌提取物 5g
NaCl 10g
LBT(LB+0.1％酪氨酸)培养基的配方(1L)
20mL 5％酪氨酸(通过加入1N HCl制备)加入灭菌并冷却的LB培养基中，得到含有0.1％ 酪氨酸终浓度的LBT培养基。然后再用1N KOH调节pH。
注：用甲醇制备100μM HPPD抑制剂(硝磺草酮、环磺酮和磺草酮)的储备溶液。将抗生素(氨苄青霉素/羧苄青霉素)和HPPD抑制剂(硝磺草酮、环磺酮和磺草酮)一起加入到已灭菌并冷缺的LBT培养基中至所需的终浓度。
从绿脓假单胞菌中分离和克隆HPPD基因
使用引物GEXPaHPPD F和GEXPaHPPD R(表1)扩增来自绿脓假单胞菌的基因组DNA的 PaHPPD基因。聚合酶链式反应(PCR)的条件如下：
Figure BDA0001878258830000231
将1074bp的PCR扩增产物用BamHI和NotI克隆到pGEX-6P-1载体中，然后转化到大肠杆 菌DH5α细胞中，并通过测序验证构建体的完整性。
为了在大肠杆菌筛选系统中比较植物HPPD活性与来自绿脓假单胞菌的HPPD活性，本 发明人提取了拟南芥(Col 0)幼苗的总RNA，以cDNA为模板，通过RT-PCR扩增了AtHPPD的编 码序列。
使用PCR引物GEXAtHPPD F和GEXAtHPPD R(表1)进行PCR反应。PCR的条件如下：
Figure BDA0001878258830000232
将1438bp的PCR扩增产物用BamHI和XhoI克隆到pGEX-6P-1载体中，然后转化到大肠杆 菌DH5α细胞中，并通过测序验证构建体的完整性。
HPPD突变体的产生及其对除草剂抗性的筛选
通过使用易错PCR方法进行随机诱变
使用基因形态II随机诱变试剂盒通过易错(ep)PCR进行PaHPPD的随机诱变，将通过第 1轮ep-PCR产生的PaHPPD突变体合并并克隆到pGEX-6P-1载体中，并转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞中。然后将所有假定的突变体在含有LBT(LB+0.1％酪氨酸)培养基的96孔板中 进行培养，根据它们在酪氨酸代谢过程中产生棕色色素的深浅来评价HPPD活性的强弱。并 依据代谢产物颜色的深浅选择突变体进行测序和后续分析。
基于比色法分析大肠杆菌细胞的HPPD活性
由于大肠杆菌缺乏HPPD和尿黑酸代谢途径，因此其不能使苯丙氨酸和酪氨酸矿化。 采用大肠杆菌作为对除草剂不敏感和/或抗除草剂的PaHPPD筛选系统，基于在不同剂量 (0～100μM)HPPD抑制剂(磺草酮、硝磺草酮和环磺酮)的LBT(LB+0.1％酪氨酸)培养基上恢复色素沉着能力的不同，将通过随机突变获得的PaHPPD突变体与野生型PaHPPD和AtHPPD一起克隆到大肠杆菌细胞中进行比较和筛选。
37℃振荡过夜培养的菌液离心后，在超净工作台，用200μL的移液枪吸取200μL 上清液转移到无菌的96孔板(微孔板具有高通量的特性)中，用微量滴定板读数器在405 nm(OD405nm)的波长下对色素含量进行测定，并根据OD值的大小对HPPD活性进行评估。
DNA改组
对单个突变的PaHPPD-M3(对PaHPPD通过随机突变获得的具有1个氨基酸突变位点的 突变体PaHPPD-M3)进行DNA改组，以产生对HPPD抑制剂抗性具有明显改善的突变体。使用 特异性引物从重组质粒pGEX-6P-1-M3扩增出的PaHPPD-M3突变体基因，然后凝胶纯化。用 DNA酶I酶切1μg DNA成50-100bp的片段大约需要5min。用1.5％琼脂糖凝胶电泳纯化酶切DNA的片段，并用无引物PCR进行重组。将“无引物”PCR产物用特异性引物GEXPaHPPD F 和GEXPaHPPD R进行PCR，将PaHPPD-M3基因扩增至全长。在无引物PCR和引物PCR后，获得 一组全长M3基因突变体，并用Bam HI和Not I酶进行酶切。将分离的片段连接到原核表达 载体pGEX-6P-1中，将得到的第2代突变体文库转化到大肠杆菌中进行筛选。
然后将所有推定的突变体在微量滴定板中的LBT(LB+0.1％酪氨酸)培养基上培养， 以观察HPPD的活性，根据培养基的棕色深浅，选择活性强的HPPD克隆进行测序和分析。使 用比色测定法检测具有新氨基酸取代的突变体对除草剂的抗性。在HPPD抑制剂存在情况 下，用大肠杆菌颜色筛选系统，检测通过第1轮DNA改组产生的第2代突变体。通过HPPD抑制剂在浓度范围(0-100μM)增加的情况下，恢复棕色色素的能力来鉴定这些突变体，以 增加筛选的严格性。筛选获得PaHPPD-DS18突变体(对PaHPPD随机突变获得具有1个氨基酸 突变位点R282S的突变体PaHPPD-M3，再在PaHPPD-M3基础上进行第1轮DNA改组获得具有2 个氨基酸突变位点R282S和E349K的突变体PaHPPD-DS18)。
为了产生对HPPD抑制剂具有高抗性的更多突变体，在第1轮的DNA改组之后，又在PaHPPD-M3基础上进行了第2轮DNA改组。通过第2轮DNA改组进一步产生了更多的HPPD突变体。在浓度为100μM的HPPD抑制剂(磺草酮、硝磺草酮和环磺酮)存在情况下，根据棕色 色素沉着量的多少，筛选出具有更高活性的HPPD突变体PaHPPD-DS73。对第2轮DNA改组所 选择的突变体(PaHPPD-DS73)进行测序，并进一步分析比较其与第1代突变体(PaHPPD-M3) 和第2代突变体(PaHPPD-DS18)的活性高低。
PaHPPD-SDM的生成
为了进一步改善大肠杆菌对除草剂的抗性，将PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18和PaHPPD-DS73三个突变体通过定点突变组合在一起。为了组合来自3个突变体的所有突变，以SDMHPPD-F和SDMHPPD-R作为反向PCR突变引物(表1)，以pGEX-6P-1-DS18质粒DNA为模板进行反向PCR扩增。PCR之后，将PCR产物进行凝胶纯化并用DpnI酶切质粒DNA。然后通过在T4多核苷酸激酶和T4DNA连接酶的作用下进行PCR产物的自连接。再将自连接的PCR产物转化到大肠杆菌细胞中。通过测序分析得到的重组pGEX-6P-1SDM，具有分别来自PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18和PaHPPD-DS73的全部三个氨基酸取代。然后将这种所得的PaHPPD-SDM突变体与其亲本突变体(PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18和PaHPPD-DS73)进行比较，以了解在不同剂量的三酮类除草剂(0～60μM)存在情况下，显示它们对棕色色素的沉着能力。HPPD活性(％)的计算公式如下：
HPPD活性(％)＝(Am/Ac)×100
其中Am指在特定除草剂剂量下的吸光度的平均值，Ac指在没有除草剂时的吸光度的 平均值。
绿脓假单胞菌的PaHPPD序列分析
为了研究PaHPPD与双子叶植物和单子叶植物的HPPD同源物之间的进化关系，使用Clustal W2对PaHPPD(Pa)、其突变体PaHPPD-SDM(SDM)和各种植物的HPPDs(例如拟南芥的AtHPPD、大豆的GmHPPD、水稻的OsHPPD和番茄的SlHPPD)进行了氨基酸序列比对(图10)。
表达载体构建和植物转化
通过使用Gateway系统的双元载体pGWB6(35S启动子，N-sGFP)构建了AtHPPD、PaHPPD 及其突变体PaHPPD-M3的表达载体，过表达并转化拟南芥，将获得AtHPPD(OE At)、PaHPPD(OE Pa)及PaHPPD-M3(OE M3)的超表达拟南芥植株。用于拟南芥转化的表达载体如图11所示。
使用引物GWAtHPPD F和GWAtHPPD R，将1438bp的AtHPPD的全长编码序列克隆到pGWB6 载体(35S启动子，N-GFP)中，生成35Spro：AtHPPD(OE At)构建体。使用引物GWPaHPPDF 和GWPaHPPD R，采用类似的方法产生35Spro：PaHPPD(35S启动子，N-GFP)和35Spro：M3PaHPPD(35S启动子，N-GFP)构建体。用于DNA构建体生成的所有引物列于表1中。然后将上述构建体转化到根癌土壤杆菌菌株GV3101中，然后通过浸花法转化拟南芥。同时，基于对潮霉素的抗性选择转化成功的拟南芥株系。并将其纯合的T3代转基因拟南芥幼苗用于表型和生理分析以及分子鉴定。
使用PCR引物OsSDM F和OsSDM R(表1)以pGEX-6P-1-SDM质粒为模板，扩增获得缺少终 止密码子、片段长为1074bp的SDM基因；然后利用酶切重组的方法将SDM基因整合至35S-pCAMBIA1305-3FLAG载体上(具有BsrG I和HindIII两个限制性酶切位点)，构建 35S-pCAMBIA1305-SDMPaHPPD-3FLAG表达载体，可表达SDMPaHPPD-3FLAG融合蛋白(图12)。 最后，将35S-pCAMBIA1305-SDM-3FLAG(OE SDM)表达载体转化到根癌土壤杆菌菌株EHA105中，并转化水稻愈伤组织。转基因株系先在温室(30℃16h光照/28℃8h黑暗)中生长1 个月，然后移栽至转基因水稻田(中国上海，北纬30°、东经121°)。T0代转基因水稻幼 苗用于表型、生理学和分子表征分析。
使用PCR引物GmHPPD F和GmHPPD R(表1)，将1332bp的GmHPPD的全长编码序列克隆到 35S-pCAMBIA1305-3FLAG载体中(具有BsrGI和HindIII两个限制性酶切位点)，获得35S-pCAMBIA1305-GmHPPD-3FLAG表达载体。使用类似的方法产生 35S-pCAMBIA1305-SDMPaHPPD-3FLAG表达载体。使用引物GmSDM F和GmSDM R并以 pGEX-6P-1-SDM质粒为模板，PCR扩增获得缺少终止密码子、片段长为1074bp的SDM基因。 然后利用酶切重组的方法将SDM基因整合至35S-pCAMBIA1305-3FLAG载体上(具有BsrG I和 HindIII两个限制性酶切位点)，构建35S-pCAMBIA1305-SDMPaHPPD-3FLAG表达载体，可表 达SDMPaHPPD-3FLAG融合蛋白(图13)。最后，将表达载体 35S-pCAMBIA1305-GmHPPD-3FLAG(OE Gm)和35S-pCAMBIA1305-SDM-3FLAG(OE SDM)分别转 化到根癌土壤杆菌菌株EHA105中，并转化大豆(威廉82)的成熟子叶。接种后的材料均置于 培养温度为23±1℃、光照温度为10000lux、光照长度为16h的培养室中进行培养，使其 生长分化。T0和T1代转基因大豆幼苗用于表型、生理学和分子表征分析。
除草剂处理拟南芥的氧化应激指标的测定
氮蓝四唑(NBT)染色法测定拟南芥叶片的超氧化物的含量
将2周龄拟南芥幼苗分别在含有100nM硝磺草酮和不含有硝磺草酮的1/2MS培养基中连续培养72h，然后转移至3.5mg/mL NBT染色液(用含10mM NaN3的磷酸钾缓冲液配制 而成)中真空浸泡2min，然后置于摇床过夜。NBT染色后的植株置于乙酸∶甘油∶乙醇＝ 1∶1∶3(v/v/v)混合液中并于100℃脱色5min，然后于甘油∶乙醇＝1∶4(v/v)混合 液中保存，并用于拍照记录试验结果。
3,3-二氨基联苯胺(DAB)染色法测定拟南芥叶片的过氧化氢含量
双氧水染色剂—3,3-二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB，D5637，Sigma-Aldrich)用水溶解，并用KOH调至PH3.8，即为配制成的1.25mg/mL DAB染色液(现 用现配，避免氧化)。
将2周龄拟南芥幼苗分别在含有100nM硝磺草酮和不含有硝磺草酮的1/2MS培养基中连续培养72h，然后转移至DAB染色液中，真空浸泡2min，然后置于摇床7～8h。DAB 染色后的植株置于乙酸∶甘油∶乙醇＝1∶1∶3(v/v/v)混合液中并于100℃脱色5 min，然后于甘油∶乙醇＝1∶4(v/v)混合液中保存，并用于拍照记录试验结果。
T0代水稻对除草剂的抗性评价
用35S-pCAMBIA1305-SDM-3FLAG(OE-SDM)表达载体评价SDM过表达品系PaHPPD-SDM在 水稻中的潜能，然后将OE SDM的T0代株系与野生型水稻(WT)对除草剂耐受性响应进行比 较，以评价T0代株系对除草剂抗性。
盆栽水平分析水稻对除草剂的抗性
将转基因T0代OE SDM和WT水稻幼苗种植在含有土壤的盆中，并放置于人工气候室(30℃16h光照/28℃8h黑暗)进行生长。3周后，水稻苗达到15～20cm高度时，用200μM 硝磺草酮(用0.1％吐温-20配制而成)和0.1％吐温-20分别喷施处理OE SDM和WT水稻苗。然 后，每周均要观察其表型，并在处理1周后测定氧化应激指标、处理2周后测定叶片叶绿素 含量以及处理3周后拍照记录实验结果。
水稻叶片总叶绿素含量的测定
参考Lichtenthaler HK(1987)的方法，对经200μM硝磺草酮(用0.1％吐温-20制备而 成)喷雾处理和经对照0.1％吐温-20喷雾处理2周后的野生型和T0代OE SDM水稻幼苗的叶片 提取叶绿素，并对其含量进行测定。所有实验3次生物学重复，并取其平均值。
除草剂处理后水稻的氧化应激指标的测定
除草剂会引起活性氧(ROS)的产生，从而导致细胞死亡。为了确定水稻的氧化状态， 收集经200μM硝磺草酮(用0.1％吐温-20制备而成)喷雾处理和经对照0.1％吐温-20喷雾处 理的野生型和T0代OE SDM水稻叶片，分别用氮蓝四唑(NBT)和3,3-二氨基联苯胺(DAB)染 色，来分析测定超氧化物(O2 -)和过氧化氢(H2O2)的积累。
氮蓝四唑(NBT)染色法测定水稻叶片超氧化物含量
除草剂处理结束时，将4周龄(正常生长3周以及除草剂喷施处理1周)的水稻叶片放于 浓度为3.5mg mL-1的氮蓝四唑(N6876，Sigma-Aldrich)染色液(含10mM NaN3的磷酸钾缓 冲液)中真空浸泡，并置于摇床上摇晃过夜。NBT染色后的植株用乙酸∶甘油∶乙醇＝1∶ 1∶3(v/v/v)混合液100℃脱色5min，然后储存于甘油∶乙醇＝1∶4(v/v)混合液 中。O2 -与NBT发生沉积作用显蓝色。
3,3-二氨基联苯胺(DAB)染色法测定水稻叶片过氧化氢含量
将双氧水染色剂—3,3-二氨基联苯胺(3,3diaminobenzidine，DAB，D5637，Sigma-Aldrich)用水溶解，并用KOH调其pH值至3.8配制成浓度为1.25mg mL-1DAB染色液(该染色液现用现配，避免氧化)。
水稻幼苗叶片在真空状态下用DAB染色液浸泡2min，然后置于摇床中摇晃7～8h。DAB染色后的植株用乙酸∶甘油∶乙醇＝1∶1∶3(v/v/v)混合液100℃脱色5min，然 后储存于甘油∶乙醇＝1∶4(v/v)混合液中。H2O2与DAB聚合呈棕色。
水稻叶片丙二醛含量测定
丙二醛(malondialdehyde，MDA)是氧化膜损伤程度的重要标志物。参考前人(Heath and Packer，1968)测定丙二醛含量的方法，略有修改。准确称取1g水稻叶片置于预冷的 研钵中，加入10mL预冷的10％三氟乙酸(Trichloroacetic acid，TCA，v/v)充分研磨。然后将研磨液转移至10mL离心管中，于4000rpm离心10min(4℃)。吸取2mL上清与等体 积0.6％2-丙二酰硫脲(2-Thiobarbituric acid，TBA，v/v)混合后，于100℃保温15min。 然后室温冷却，将冷却后的反应液，4000rpm离心10min(4℃)，取上清液用紫外分光光 度计分别在450nm、532nm和600nm波长下测定吸光度。每个样品3次重复。MDA含量的单 位为nmol g- 1FW。
叶片水平分析大豆对除草剂的抗性
将转基因T0代OE SDMHPPD和WT大豆(威廉82)幼苗种植盆中，并放置于人工气候室(27℃，14h/8h，光照/黑暗)进行生长。4周后，用棉棒蘸取0、1、5、10和30μM的硝磺 草酮(用0.1％吐温-20配制而成)以及0.1％吐温-20分别对高度达30～40cm的OE SDMHPPD(OE SDM#12和OE SDM#13)T0代和WT幼苗的叶片进行均匀涂抹处理。然后，每周进 行表型观察，并处理2周后拍照记录实验结果。
为了进一步检测转基因大豆对除草剂的抗性，用棉棒蘸取20μM的硝磺草酮(用0.1％ 吐温-20配制而成)和0.1％吐温-20分别对2周龄的WT、OE GmHPPD(OE GmHPPD#9)T1代幼苗 和OE SDMHPPD(OE SDMHPPD#12)T1代幼苗的三叶叶片进行均匀涂抹。然后，每天进行表型 观察，于处理10d后拍照记录实验结果。
全株水平分析T1代大豆对除草剂的抗性
20μM的硝磺草酮(用0.1％吐温-20配制而成)和0.1％吐温-20分别对生长于人工气候 室(27℃，14h/8h，光照/黑暗)的4周龄转基因T1代OE SDMHPPD、T1代OE GmHPPD和WT大豆进行第1次喷施，1周后进行第2次喷施。然后每天观察植株的表型，于处理2周后拍照记录实验结果。
T1代大豆的总叶绿素含量和株高的测定
野生型大豆威廉82、OE PaHPPD-SDM大豆的T1代和OE GmHPPD的T1代大豆幼苗经20μM 硝磺草酮(用0.1％吐温-20制备而成)和0.1％吐温-20分别喷雾处理2次，两次间隔1周，于其 喷雾处理2周后，参考Lichtenthaler HK(1987)的方法，对其叶片的总叶绿素进行提取， 并测定其含量。所有实验3次生物学重复，并取其平均值。
实施例1 PaHPPD-M3突变体的产生及对除草剂的抗性筛选
1.1使用易错PCR方法进行随机突变和测序
通过使用易错PCR法，得到几种推定的突变体菌落，并将其在LBT(LB+0.1％酪氨酸) 培养基上进行培养，依据其在酪氨酸代谢过程中产生棕色色素的能力，来评价HPPD的活性。
只有少数推定的突变体能够在LBT培养基上产生棕色色素，然后对具有HPPD活性的推 定突变体进行测序分析。序列分析显示选定的突变体在不同的核酸位点具有突变(表2)。 与野生型PaHPPD相比，6个(M1、M2、M3、M4、M5、M7)突变体在其多肽中显示出新的氨基酸取代，而M6仅显示碱基取代G396A但无氨基酸改变(图1)。
表2：通过随机突变(ep-PCR)获得的PaHPPD突变体
Figure BDA0001878258830000281
1.2基于大肠杆菌筛选系统对除草剂的抗性筛选
基于大肠杆菌筛选系统，在波长OD405nm下，测定不同剂量(0～50μM)三酮类除草剂存在条件下黑色素的形成量，来分析HPPD的活性。由图2A、B和C可以看出，所有选择的 大肠杆菌HPPD克隆(M1、M2、M3、M4、M5、M6和M7)和拟南芥AtHPPD，与野生型WT相比M2、 M3突变体对3种不同的除草剂(磺草酮、环磺酮和硝磺草酮)均具有明显的抗性(图2A、B 和C)。
当除草剂的浓度为10μM甚至更高剂量时，通过检测黑色素的形成量，可以看出PaHPPD-M3对三酮类除草剂表现出更强的抗性。基于此，增加除草剂的浓度至100μM，突 变体PaHPPD-M3对3种不同的除草剂(磺草酮、硝磺草酮和环磺酮)的抗性显著高于野生型 WT(图3)。与野生型WT相比，PaHPPD-M3对除草剂抗性的增加，可能由于其在PaHPPD氨基酸 序列中的第282位的精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)。
实施例2 HPPD-DS18突变体的产生及对除草剂的抗性筛选
用DNA改组系统对实施例1获得的PaHPPD-M3突变体进行改组，以产生更多的HPPD突变 体。并获得几个假定的突变体菌落。由具有活性HPPD的第2代突变体(或Ds I突变体)测序 分析揭示突变结果(表3)，发现所有这些突变体在PaHPPD-M3突变体中还有一个独特的碱基 突变或者氨基酸取代。
在三酮类除草剂(磺草酮、硝磺草酮和环磺酮)存在的情况下，将具有独特突变或者 氨基酸取代的突变体(DS7、DS8、DS18、DS23和DS44)与野生型PaHPPD和第1代突变体PaHPPD-M3进行HPPD的活性比较。
结果如图4和图5所示，第1轮DNA改组产生的所有第2代突变体与第1代突变体(PaHPPD-M3)相比，PaHPPD-DS18对3种三酮类除草剂(磺草酮、硝磺草酮和环磺酮)的抗性均高于100μM。突变体PaHPPD-DS18在PaHPPD-M3(PaHPPD突变体)序列中还有另外一个氨 基酸取代，即第349位处E(谷氨酸)被K(赖氨酸)所取代(表3)。
表3：通过DNA改组获得的PaHPPD突变体
Figure BDA0001878258830000291
实施例3 HPPD-DS73突变体的产生及对除草剂的抗性筛选
将具有活性HPPD的第2轮DNA改组突变体(PaHPPD-DS73)克隆之后，在100μM HPPD抑制剂(磺草酮、硝磺草酮和环磺酮)存在情况下，通过色素沉着量来筛选它们对除草剂抗性能力的大小。观察发现，在100μM HPPD抑制剂(磺草酮、硝磺草酮和环磺酮)存在情况 下，PaHPPD-DS73在LBT培养基中均显示(或保留)色素沉着(图6)。序列分析显示，在 PaHPPD-DS73序列中具有PaHPPD-M3突变体的保守突变和另外一个氨基酸取代，即156处的 丙氨酸被缬氨酸取代(A156V)(表E)。
在100μM三酮类除草剂(磺草酮、硝磺草酮和环磺酮)存在情况下，在405nm波长下，定性定量分析了WT、PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18和PaHPPD-DS73的HPPD活性，表明PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18和PaHPPD-DS73对除草剂抗性显著高于WT，3种突变体之间差异不显著，其对三酮类除草剂均具有强的抗性(图6)。
实施例4 PaHPPD-SDM突变体的产生及与其亲本HPPD活性比较
对来自绿脓假单胞菌的基因(PaHPPD)进行随机突变得到具有1个氨基酸突变位点的 PaHPPD-M3突变体(第282处的精氨酸突变为丝氨酸)，在PaHPPD-M3的基础上进行第1轮的 DNA改组得到具有2个氨基酸突变位点的PaHPPD-DS18突变体(第282处的精氨酸突变为丝氨 酸，第349处的谷氨酸突变为赖氨酸)，又在PaHPPD-M3突变体的基础上进行第2轮的DNA改 组，得到具有2个氨基酸突变位点的PaHPPD-DS73突变体(第156处的丙氨酸突变为缬氨酸、 第282处的精氨酸突变为丝氨酸)。最后，将PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18和PaHPPD-DS73三个 突变体通过定点突变组合在一起，形成具有3个氨基酸突变位点的PaHPPD-SDM(第156处的 丙氨酸突变为缬氨酸、第282处的精氨酸突变为丝氨酸、第349处的谷氨酸突变为赖氨酸)。
通过对WT(PaHPPD)、PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18、PaHPPD-DS73和PaHPPD-SDM的氨基酸 序列比对分析，发现PaHPPD-SDM的序列中包含了PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18和PaHPPD-DS73 的所有氨基酸突变(图7和表E)。同时，对PaHPPD-SDM与WT、PaHPPD-M3、PaHPPD-DS18和PaHPPD-DS73的HPPD活性(％)进行比较，发现在较高剂量的除草剂(尤其是环磺酮)存在条件 下(0～60μM范围内)，PaHPPD-SDM提高了对三酮类除草剂(磺草酮、硝磺草酮和环磺酮)的抗性(图8和图9)。表明，PaHPPD-SDM较PaHPPD(WT)以及3种突变体PaHPPD-M3、 PaHPPD-DS18和PaHPPD-DS73具有更强的除草剂抗性。
实施例5绿脓假单胞菌来源的PaHPPD基因的序列分析
PaHPPD(Pa)、PaHPPD-SDM(SDM)及植物来源的HPPD基因—拟南芥(AtHPPD)、大豆(GmHPPD)、水稻(OsHPPD)和番茄(SlHPPD)的氨基酸序列进行比对分析发现，PaHPPD中氨基酸置换的2个位点(R282S和E349K)在拟南芥、大豆、水稻和番茄中高度保守(图10)。表明，这2个保守的位点可以作为靶标位点，利用CRISPR基因编辑体系来创建水稻、大豆和番茄等作物的抗除草剂株系。
实施例6过表达株系OE M3拟南芥萌发前对除草剂的抗性分析
为了评价HPPD的不同过表达系对除草剂的抗性，在含有不同浓度除草剂的培养基上 进行了拟南芥种子的发芽试验。将T3代拟南芥种子和Col0(WT)种子在干燥器中进行蒸气表 面灭菌消毒(浓HCl∶NaClO＝1∶5，v/v)3h。OE At(OE At#1、OE At#2)、OE Pa(OE Pa#1、OE Pa#2)、OE M3(OE M3#1、OE M3#2)与Col0(WT)一起点种于24孔板的1/2MS培养基(0.5×MS 盐，1％蔗糖和0.8％琼脂)中，该培养基含有不同浓度(0、31.25、62.5、125、500和2000nM) 的硝磺草酮(西格玛奥德里奇，美国)和磺草酮(西格玛奥德里奇，美国)。然后，将点播种 子的板于4℃黑暗中放置3d，然后转移到22℃的生长室(16h光/8h黑暗)生长2周。每个品种每个处理3次生物学重复。2周后拍照记录试验结果。
结果如图14A和14B所示，正常生长条件(0nM除草剂)下，过表达株系T3代(OE M3、OE Pa和OE At)不同株系幼苗的表型与野生型(WT)无区别；经不同浓度的硝磺草酮处理后，发现OE M3的2个株系在高达125nM浓度下仍然可以正常生长，OE Pa的2个株系在62.5nM 浓度下可以正常生长，而OE At的2个株系和WT在较低浓度(31.25nM)下已白化死亡(图 14A)。经不同浓度的磺草酮处理后，发现OE M3的2个株系在高达125nM浓度下仍然可以正 常生长，OE Pa的2个株系在62.5nM浓度下可以正常生长，而OE At和WT在较低浓度(31.25 nM)下生长受到严重抑制，甚至白化死亡(图14B)。表明，过表达株系OE PaHPPD-M3拟南芥 株系萌发前对三酮类除草剂具有明显的抗性，其对除草剂的抗性是OE PaHPPD的2倍，是OE At和WT的4倍。
实施例7过表达株系OE M3拟南芥萌发后对除草剂的抗性分析
为了进一步确认萌发试验中取得结果的正确性，又进行了拟南芥萌发后对除草剂抗 性分析实验。将OE At、OE Pa、OE M3和WT萌发7d的拟南芥幼苗转移到含有不同浓度(0、100、250、500和1000nM)硝磺草酮的1/2MS培养基中生长1周。每个基因型5株幼苗，3 次生物学重复。1周后，拍摄照片记录除草剂处理(即漂白)的效果。
结果如图14C所示，未经除草剂处理的野生型(WT)、OE At、OE Pa和OE M3拟南芥株系之间的表型无差异。经不同浓度的硝磺草酮处理后，发现100nM时WT的子叶已白化，250nM时OE M3生长良好，而其他过表达株系(OE At和OE Pa)的子叶在此浓度下已白化。表明，OE PaHPPD-M3拟南芥株系在萌发后对三酮类除草剂具有更高的抗性。
实施例8过表达株系OE M3拟南芥叶(莲座叶)总叶绿素和类胡萝卜素的含量
采集在含有不同浓度(0、100、250、500和1000nM)硝磺草酮的1/2MS培养基上生长的， 已有2周龄植株的叶片(莲座叶)，包括OE At，OE Pa，OE M3和WT，参考LichtenthalerHK(1987) 的方法提取并测定总叶绿素和类胡萝卜素含量。所有实验3次生物学重复，并取其平均值。
结果如图14D所示，随着除草剂浓度的增大，WT、OE At、OE Pa和OE M3拟南芥叶(莲座叶)的总叶绿素和类胡萝卜素的含量均降低。其中，相同浓度除草剂条件下，OE M3的总叶绿素和类胡萝卜素的含量均显著高于WT、OE At和OE Pa。表明，OE PaHPPD-M3株系较WT、OE At和OE Pa株系对三酮类除草剂具有更强的抗性。
实施例9盆栽水平分析过表达株系OE M3拟南芥对除草剂的抗性
将WT、OE At、OE Pa、OE M3的2周龄拟南芥幼苗移栽到填充土壤的盆中(每盆12棵幼 苗)，并将其放于人工气候室(22℃、14h光照/10h黑暗，120μmol m-2s-1光强度)中生 长4周。然后，用5μM硝磺草酮溶液(0.05％吐温-20配制而成)喷施处理2次，2次处理间隔3 d，并与对照处理(不含除草剂的0.05％吐温-20)进行比较。喷施处理3次生物学重复。第1 次除草剂喷施2周后，拍照记录试验结果。
结果如图15所示，盆栽拟南芥喷施除草剂2周后，对照处理(0.05％吐温-20)的AtHPPD(OE At)、PaHPPD(OE Pa)和PaHPPD-M3(OE M3)过表达株系与WT幼苗的表型无差别，5μM硝磺草酮处理的OE M3株系与其他株系之间表型存在较大差别：WT、OE At和OE Pa 株系的表型相似，其幼苗的新生叶已完全白化，而OE M3株系生长良好，表现出显著抗性。 表明，PaHPPD-M3基因在三酮类除草剂抗性的调控中具有重要的作用。
实施例10 AtHPPD和维生素E生物合成基因在拟南芥中的表达
以WT、OE At、OE Pa和OE M3的2周龄的T3代幼苗为材料，分别设处理组和对照组，其中处理组在含有250nM硝磺草酮1/2MS液体培养基中持续培养6h。使用超快植物RNA提取试剂盒(北京华越洋生物科技有限公司，中国)提取相关材料的总RNA。使用NanoDropND1000(Thermo Scientific，USA)测量RNA样品的浓度。选择波长260/280nm和260/230nm下的吸光度比值大约在2.0左右的RNA样品。然后用cDNA合成试剂盒(转录物gDNA一步去除和cDNA合成的超级试剂盒，全式金)将总RNA(1,000ng)用于逆转录的cDNA合成。
对于定量逆转录PCR分析，在20μL反应体系中使用3.0μL cDNA作为模板，对HPPD和编码维生素E生物合成的关键酶VTE1和VTE3基因进行表达水平检测，actin作为内参基因。其中所使用的引物序列在表4中列出。在Bio-Rad CFX96实时系统上进行了3次技术重复。使用REST软件进行统计分析。
表4：本发明使用的qRT-PCR引物
Figure BDA0001878258830000311
Figure BDA0001878258830000321
图16显示的是采用qRT-PCR分析经除草剂(硝磺草酮)处理6h的拟南芥幼苗的HPPD、 VTE1(维生素E环化酶)和VTE3(2-甲基-6-植酰基-1,4-氢醌甲基转移酶)的转录丰度。与未 经硝磺草酮处理的WT、OE At、OE Pa和OE M3的2周龄的T3代幼苗相比，经除草剂处理的OE At、OE Pa和WT株系叶片的HPPD、VTE1和VTE3的表达水平均受到不同程度的抑制，OEM3 株系的HPPD基因的表达水平基本未受到抑制，而VTE1和VTE3的基因表达水平上调。表明， 经除草剂处理后的OE M3的HPPD、VTE1和VET3基因未受影响或影响较小。同时，在除草剂 处理过程中，维生素E在OE M3株系中可以持续合成，而在WT、OE At和OE Pa株系中被抑制。
实施例11过表达株系OE M3拟南芥的氧化应激标记
除草剂会引起活性氧(ROS)的产生，从而导致细胞死亡。为了明确植物的氧化状态， 采集除草剂硝磺草酮处理和对照处理植物的叶片分别用氮蓝四唑(NBT)和3,3′-二氨基联 苯胺(DAB)进行染色，用于分析超氧化物(O2 -)和过氧化氢(H2O2)的积累。
将WT、OE At、OE Pa和OE M3的2周龄T3代拟南芥幼苗转移到不同的对照(1/2MS培养基) 和处理培养基(含有100nM硝磺草酮的1/2MS培养基)中72h，然后用NBT和DAB染色以检测活 性氧的积累。
结果如图17所示，未经硝磺草酮处理的植株叶片的超氧化物和过氧化氢的积累量在 各株系间相似，而经100nM硝磺草酮处理的拟南芥，其积累量在不同株系间存在较大差别： 与WT、OE At和OE Pa相比，OE M3的超氧化物和过氧化氢的积累均明显减少。表明，除草剂诱导的ROS的产生及其导致的细胞死亡在OE M3株系中表现的不明显。也即是说，OE M3株系更有效地解决了ROS积累问题。
实施例12 T0代OE SDM水稻株系对除草剂抗性评价
盆栽水平分析OE SDM水稻对除草剂的抗性
由图18A可以看出，与对照处理0.1％吐温-20相比，经200μM硝磺草酮(0.1％吐温-20 配制而成)喷施处理21d(3周)后，WT植株的大部分叶片枯萎死亡，而OE SDM水稻株系的叶 片有非常小的可见的损伤迹象，即其在200μM硝磺草酮条件下能正常生长。表明，OE SDM水稻幼苗对三酮类除草剂的抗性达200μM并显著高于WT。
水稻叶片的总叶绿素含量
图18B显示，在控制条件下(0.1％吐温-20处理)，WT和OE SDM水稻叶片的总叶绿素含 量差异不显著。与经200μM硝磺草酮(0.1％吐温-20配制而成)处理2周后的OE SDM水稻相 比，经200μM硝磺草酮(0.1％吐温-20配制而成)处理的WT水稻叶片总叶绿素含量大大降低。 表明，OE SDM水稻株系比WT水稻具有更强的三酮类除草剂抗性。
水稻叶片的氧化应激标记
采用NBT(图19A和19B)和DAB(图19C和19D)对经对照(喷施0.1％吐温-20)和200μM硝 磺草酮(用0.1％吐温-20配制而成)处理1周后的WT和OE SDM PaHPPD水稻叶片分别进行染色， 发现对照处理的WT和OE SDM水稻叶片均没有ROS的积累，但经200μM硝磺草酮处理1周后的 WT水稻叶片中有大量的O2 -和H2O2积累，而OE SDM水稻叶片有极少的O2 -和H2O2的积累。表明， OE SDM水稻对三酮类除草剂具有更强的抗性。
水稻叶片的丙二醛(MDA)含量
图19E显示，在正常生长条件下(经0.1％吐温-20的对照处理)，WT和OE SDM水稻株系 叶片的MDA含量低且相似。而经200μM硝磺草酮(用0.1％吐温-20配制而成)喷施处理1周后 的WT水稻叶片中MDA含量显著高于OE SDM水稻叶片。表明，OE SDM水稻中PaHPPD-SDM的过 表达防止脂质过氧化，并增强对三酮类除草剂的抗性。
实施例13 T0和T1代OE SDM大豆株系对除草剂的抗性-叶片涂抹
通过叶片涂抹除草剂的方式检测并比较了OE PaHPPD-SDM的T0和T1大豆株系与野生 型大豆威廉82对除草剂的抗性。由图20和图21可以看出，野生型大豆威廉82的叶片经不同 浓度的硝磺草酮(用0.1％吐温-20配制而成0、1、5、10和30μM)处理2周后，当硝磺草酮的浓度达到5μM时，已表现出漂白症状，并随浓度的增大，漂白症状越严重。与野生型大豆 威廉82相比，OE PaHPPD-SDM大豆株系对除草剂具有高度的耐受性，即使在30μM硝磺草酮 浓度下也没有表现出漂白和损伤的症状。因此证明了PaHPPD-SDM基因对HPPD抑制剂的效 率。
实施例14 T1代OE SDM大豆株系对除草剂的抗性-全株喷施
通过全株喷施除草剂的方式检测和比较OE PaHPPD-SDM的大豆T1代株系、OEGmHPPD 的大豆T1代株系和野生型大豆威廉82对除草剂的抗性。图22显示，OE PaHPPD-SDM的T1代、 OE GmHPPD的T1代和野生型大豆威廉82的4周龄幼苗，经20μM硝磺草酮喷施2次之后，于处 理后10d的表型。发现野生型大豆威廉82和OE GmHPPD的T1代株系经硝磺草酮处理后均表 现出明显的漂白症状和生长迟缓的特点，其中野生型大豆威廉82较OE GmHPPD的T1代株系 对除草剂的敏感性表现的更加明显。而OE PaHPPD-SDM的T1代株系经硝磺草酮处理后正常 生长并未表现出任何漂白症状。表明，OE PaHPPD-SDM大豆的显著提高了其对除草剂的抗 性。
实施例15 T1代OE SDM大豆的叶绿素含量和株高-全株喷施
通过全株喷施除草剂的方式检测和比较OE PaHPPD-SDM的大豆T1代株系、OEGmHPPD 的大豆T1代株系和野生型大豆威廉82对除草剂的抗性。图23A显示，OE PaHPPD-SDM的T1 代、OE GmHPPD的T1代和野生型大豆威廉82的4周龄幼苗，经20μM硝磺草酮喷施处理2次， 处理2周后，发现经硝磺草酮喷施处理的OE GmHPPD和野生型大豆威廉82的叶片的叶绿素a 和叶绿素b的含量与对照处理相比均显著降低，野生型大豆威廉82表现的更为明显。同时， 发现经硝磺草酮喷施处理的OE PaHPPD-SDM的叶片叶绿素a和叶绿素b的含量与对照相比有 所降低，但其叶绿素a和叶绿素b的含量显著高于硝磺草酮处理后的OE GmHPPD和野生型大 豆威廉82的叶绿素a和叶绿素b的含量。表明，硝磺草酮处理显著降低了OE GmHPPD和野生 型大豆威廉82的总叶绿素含量，而略微降低了OE PaHPPD-SDM的叶绿素含量。同时由图23B 可以看出，硝磺草酮处理后的大豆的株高较对照相比均有所降低，但整体上表现出OE PaHPPD-SDM＞OE GmHPPD＞野生型大豆威廉82。表明，OE PaHPPD-SDM大豆显著提高了其对 三酮类除草剂的抗性。
实施例16 qPCR分析HPPD和生育酚生物合成基因在大豆中的表达
以WT、OE GmHPPD和OE PaHPPD-SDM的4周龄的T1代幼苗为材料，分别设处理组和对照 组，其中处理组在含有20μM硝磺草酮1/2MS液体培养基中持续培养12h。使用超快植物RNA 提取试剂盒(北京华越洋生物科技有限公司，中国)提取相关材料的总RNA。使用NanoDrop ND1000(Thermo Scientific，USA)测量RNA样品的浓度。选择波长260/280nm和260/230nm 下的吸光度比值大约在2.0左右的RNA样品。然后用cDNA合成试剂盒(转录物gDNA一步去除 和cDNA合成的超级试剂盒，全式金)将总RNA(1,000ng)用于逆转录的cDNA合成。
对于定量逆转录PCR分析，在20μL反应体系中使用3.0μL cDNA作为模板，并使用基因特异性引物如qGmHPPD F和qGmHPPD R用于GmHPPD基因，qGmHST F和qGmHST R用于GmHST 基因(尿黑酸茄红素转移酶基因)，qGmHPT F和qGmHPT R用于GmHPT或VTE2基因，GmMPQMT F 和MPQMT R用于GmMPQMT甲基转移酶基因也称为VTE3，GmTC F和GmTC R用于GmTC基因也称为 VTE1(生育酚环化酶基因)。之所以选择这些VTE(1、2和3)基因是因为它们编码参与生育酚 生物合成的关键酶。本发明所使用的引物序列在表4中列出。在Bio-Rad CFX96实时系统上 进行了3次技术重复。使用REST软件进行统计分析。
图24显示了qRT-PCR方法检测经除草剂(硝磺草酮)处理幼苗的中GmHPPD基因、GmHST 基因、GmHPT或VTE2基因、GmMPQMT或VTE3、GmTC或VTE1(生育酚环化酶基因)的转录本丰度。 这些基因都是参与生育酚生物合成途径的关键基因。由图24可以看出，与对照相比，经硝 磺草酮喷施处理12h的野生型大豆威廉82显著降低了参与生育酚合成途径的GmHPPD基因、 HST基因、HPT基因、MPQMT基因和TC基因的表达。与对照相比，经硝磺草酮喷施处理12h 的OE GmHPPD大豆T1代株系中的GmHPPD和MPQMT的基因的表达量降低，而HST、HPT和TC的基 因的表达量上升。与对照相比，经硝磺草酮喷施处理12h的OE PaHPPD-SDM大豆T1代株系 中GmHPPD和HPT基因的表达量上调，HST、MPQMT和TC基因的表达量几乎没有变化。表明，在三酮类除草剂(硝磺草酮)处理条件下，OE PaHPPD-SDM(OESDM)显示出持续的生育酚生物合成，而在野生型大豆威廉82和OE GmHPPD中被抑制。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 抗除草剂基因及其在植物育种中的应用
<130> P2018-2087
<150> 2017111839837
<151> 2017-11-23
<150> 2017111819161
<151> 2017-11-23
<150> 2017111839841
<151> 2017-11-23
<150> 2017111840020
<151> 2017-11-23
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1074
<212> DNA
<213> 绿脓假单胞菌(Pesudomonas pyocyaneum)
<400> 1
atgaacgccg tggccaagat cgaacagcac aatcccatcg gtaccgacgg attcgaattc 60
gtcgagttca ccgcccccga cgccaagggc atcgagcagc tgcgccagct gttcaacatg 120
atgggcttca ccgaaaccgc caagcatcgt tccaaggaag tcttcctgtt ccagcagaac 180
gatatcaaca tcgtgctcaa cggcagccca accgggcatg tccatgaatt cgccctcaag 240
cacggcccga gcgcctgcgc catggccttc cgggtgaaga acgcttccca ggccgccgcc 300
tacgccgaat cccagggcgc caagctggtg ggcagccacg ccaacttcgg cgagctgaac 360
atcccttccc tggaaggcat cggcggttcg ctgctgtatc ttgtcgaccg ctacggcgac 420
cgcagcatct atgacgtcga cttcgagttc atcgaaggcc gcagcgccaa cgacaactcg 480
gtcggcctga cctacatcga ccacctgacc cacaacgtca agcgcggcca gatggacgtc 540
tggtccggtt tctacgagcg catcgccaac ttccgcgaga ttcgctactt cgacatcgaa 600
ggcaagctca ccggcctgtt ctcccgcgcc atgaccgcac cttgcgggaa gatccgcatc 660
ccgatcaacg agtcggccga cgatacctcg cagatcgagg aattcatccg cgaataccat 720
ggcgaaggca tccagcacat cgccctgacc accgacgaca tctatgccac cgtgcgcaag 780
ctgcgcgaca acggcgtgaa gttcatgtcg accccggaca cctactacga gaaggtcgac 840
acccgcgtcg ccgggcatgg cgagccgctc gagcaactgc gcgaactgaa cctgctgatc 900
gacggcgccc cgggcgacga cggcatcctg ctgcagatct tcaccgacac ggtgatcggc 960
ccgatcttct tcgagatcat ccagcgcaag ggcaaccagg gtttcggcga gggcaatttc 1020
aaggccctgt tcgagtccat cgaggaagac cagattcgcc gcggcgtgat ctga 1074
<210> 2
<211> 357
<212> PRT
<213> 绿脓假单胞菌(Pesudomonas pyocyaneum)
<400> 2
Met Asn Ala Val Ala Lys Ile Glu Gln His Asn Pro Ile Gly Thr Asp
1 5 10 15
Gly Phe Glu Phe Val Glu Phe Thr Ala Pro Asp Ala Lys Gly Ile Glu
20 25 30
Gln Leu Arg Gln Leu Phe Asn Met Met Gly Phe Thr Glu Thr Ala Lys
35 40 45
His Arg Ser Lys Glu Val Phe Leu Phe Gln Gln Asn Asp Ile Asn Ile
50 55 60
Val Leu Asn Gly Ser Pro Thr Gly His Val His Glu Phe Ala Leu Lys
65 70 75 80
His Gly Pro Ser Ala Cys Ala Met Ala Phe Arg Val Lys Asn Ala Ser
85 90 95
Gln Ala Ala Ala Tyr Ala Glu Ser Gln Gly Ala Lys Leu Val Gly Ser
100 105 110
His Ala Asn Phe Gly Glu Leu Asn Ile Pro Ser Leu Glu Gly Ile Gly
115 120 125
Gly Ser Leu Leu Tyr Leu Val Asp Arg Tyr Gly Asp Arg Ser Ile Tyr
130 135 140
Asp Val Asp Phe Glu Phe Ile Glu Gly Arg Ser Ala Asn Asp Asn Ser
145 150 155 160
Val Gly Leu Thr Tyr Ile Asp His Leu Thr His Asn Val Lys Arg Gly
165 170 175
Gln Met Asp Val Trp Ser Gly Phe Tyr Glu Arg Ile Ala Asn Phe Arg
180 185 190
Glu Ile Arg Tyr Phe Asp Ile Glu Gly Lys Leu Thr Gly Leu Phe Ser
195 200 205
Arg Ala Met Thr Ala Pro Cys Gly Lys Ile Arg Ile Pro Ile Asn Glu
210 215 220
Ser Ala Asp Asp Thr Ser Gln Ile Glu Glu Phe Ile Arg Glu Tyr His
225 230 235 240
Gly Glu Gly Ile Gln His Ile Ala Leu Thr Thr Asp Asp Ile Tyr Ala
245 250 255
Thr Val Arg Lys Leu Arg Asp Asn Gly Val Lys Phe Met Ser Thr Pro
260 265 270
Asp Thr Tyr Tyr Glu Lys Val Asp Thr Arg Val Ala Gly His Gly Glu
275 280 285
Pro Leu Glu Gln Leu Arg Glu Leu Asn Leu Leu Ile Asp Gly Ala Pro
290 295 300
Gly Asp Asp Gly Ile Leu Leu Gln Ile Phe Thr Asp Thr Val Ile Gly
305 310 315 320
Pro Ile Phe Phe Glu Ile Ile Gln Arg Lys Gly Asn Gln Gly Phe Gly
325 330 335
Glu Gly Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Glu Asp Gln Ile
340 345 350
Arg Arg Gly Val Ile
355
<210> 3
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaacgccg tggccaagat cgaacagcac aatcccatcg gtaccgacgg attcgaattc 60
gtcgagttca ccgcccccga cgccaagggc atcgagcagc tgcgccagct gttcaacatg 120
atgggcttca ccgaaaccgc caagcatcgt tccaaggaag tcttcctgtt ccagcagaac 180
gatatcaaca tcgtgctcaa cggcagccca accgggcatg tccatgaatt cgccctcaag 240
cacggcccga gcgcctgcgc catggccttc cgggtgaaga acgcttccca ggccgccgcc 300
tacgccgaat cccagggcgc caagctggtg ggcagccacg ccaacttcgg cgagctgaac 360
atcccttccc tggaaggcat cggcggttcg ctgctgtatc ttgtcgaccg ctacggcgac 420
cgcagcatct atgacgtcga cttcgagttc atcgaaggcc gcagcgccaa cgacaactcg 480
gtcggcctga cctacatcga ccacctgacc cacaacgtca agcgcggcca gatggacgtc 540
tggtccggtt tctacgagcg catcgccaac ttccgcgaga ttcgctactt cgacatcgaa 600
ggcaagctca ccggcctgtt ctcccgcgcc atgaccgcac cttgcgggaa gatccgcatc 660
ccgatcaacg agtcggccga cgatacctcg cagatcgagg aattcatccg cgaataccat 720
ggcgaaggca tccagcacat cgccctgacc accgacgaca tctatgccac cgtgcgcaag 780
ctgcgcgaca acggcgtgaa gttcatgtcg accccggaca cctactacga gaaggtcgac 840
accagcgtcg ccgggcatgg cgagccgctc gagcaactgc gcgaactgaa cctgctgatc 900
gacggcgccc cgggcgacga cggcatcctg ctgcagatct tcaccgacac ggtgatcggc 960
ccgatcttct tcgagatcat ccagcgcaag ggcaaccagg gtttcggcga gggcaatttc 1020
aaggccctgt tcgagtccat cgaggaagac cagattcgcc gcggcgtgat ctga 1074
<210> 4
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asn Ala Val Ala Lys Ile Glu Gln His Asn Pro Ile Gly Thr Asp
1 5 10 15
Gly Phe Glu Phe Val Glu Phe Thr Ala Pro Asp Ala Lys Gly Ile Glu
20 25 30
Gln Leu Arg Gln Leu Phe Asn Met Met Gly Phe Thr Glu Thr Ala Lys
35 40 45
His Arg Ser Lys Glu Val Phe Leu Phe Gln Gln Asn Asp Ile Asn Ile
50 55 60
Val Leu Asn Gly Ser Pro Thr Gly His Val His Glu Phe Ala Leu Lys
65 70 75 80
His Gly Pro Ser Ala Cys Ala Met Ala Phe Arg Val Lys Asn Ala Ser
85 90 95
Gln Ala Ala Ala Tyr Ala Glu Ser Gln Gly Ala Lys Leu Val Gly Ser
100 105 110
His Ala Asn Phe Gly Glu Leu Asn Ile Pro Ser Leu Glu Gly Ile Gly
115 120 125
Gly Ser Leu Leu Tyr Leu Val Asp Arg Tyr Gly Asp Arg Ser Ile Tyr
130 135 140
Asp Val Asp Phe Glu Phe Ile Glu Gly Arg Ser Ala Asn Asp Asn Ser
145 150 155 160
Val Gly Leu Thr Tyr Ile Asp His Leu Thr His Asn Val Lys Arg Gly
165 170 175
Gln Met Asp Val Trp Ser Gly Phe Tyr Glu Arg Ile Ala Asn Phe Arg
180 185 190
Glu Ile Arg Tyr Phe Asp Ile Glu Gly Lys Leu Thr Gly Leu Phe Ser
195 200 205
Arg Ala Met Thr Ala Pro Cys Gly Lys Ile Arg Ile Pro Ile Asn Glu
210 215 220
Ser Ala Asp Asp Thr Ser Gln Ile Glu Glu Phe Ile Arg Glu Tyr His
225 230 235 240
Gly Glu Gly Ile Gln His Ile Ala Leu Thr Thr Asp Asp Ile Tyr Ala
245 250 255
Thr Val Arg Lys Leu Arg Asp Asn Gly Val Lys Phe Met Ser Thr Pro
260 265 270
Asp Thr Tyr Tyr Glu Lys Val Asp Thr Ser Val Ala Gly His Gly Glu
275 280 285
Pro Leu Glu Gln Leu Arg Glu Leu Asn Leu Leu Ile Asp Gly Ala Pro
290 295 300
Gly Asp Asp Gly Ile Leu Leu Gln Ile Phe Thr Asp Thr Val Ile Gly
305 310 315 320
Pro Ile Phe Phe Glu Ile Ile Gln Arg Lys Gly Asn Gln Gly Phe Gly
325 330 335
Glu Gly Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Glu Asp Gln Ile
340 345 350
Arg Arg Gly Val Ile
355
<210> 5
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaacgccg tggccaagat cgaacagcac aatcccatcg gtaccgacgg attcgaattc 60
gtcgagttca ccgcccccga cgccaagggc atcgagcagc tgcgccagct gttcaacatg 120
atgggcttca ccgaaaccgc caagcatcgt tccaaggaag tcttcctgtt ccagcagaac 180
gatatcaaca tcgtgctcaa cggcagccca accggacatg tccatgaatt cgccctcaag 240
cacggcccga gcgcctgcgc catggccttc cgggtgaaga acgcttccca ggccgccgcc 300
tacgccgaat cccagggcgc caagctggtg ggcagccacg ccaacttcgg cgagctgaac 360
atcccttccc tggaaggcat cggcggttcg ctgctgtatc ttgtcgaccg ctacggcgac 420
cgcagcatct atgacgtcga cttcgagttc atcgaaggcc gcagcgccaa cgacaactcg 480
gtcggcctga cctacatcga ccacctgacc cacaacgtca agcgcggcca gatggacgtc 540
tggtccggtt tctacgagcg catcgccaac ttccgcgaga ttcgctactt cgacatcgaa 600
ggcaagctca ccggcctgtt ctcccgcgcc atgaccgcac cttgcgggaa gatccgcatc 660
ccgatcaacg agtcggccga cgatacctcg cagatcgagg aattcatccg cgaataccat 720
ggcgaaggca tccagcacat cgccctgacc accgacgaca tctatgccac cgtgcgcaag 780
ctgcgcgaca acggcgtgaa gttcatgtcg accccggaca cctactacga gaaggtcgac 840
accagcgtcg ccgggcatgg cgagccgctc gagcaactgc gcgaactgaa cctgctgatc 900
gacggcgccc cgggcgacga cggcatcctg ctgcagatct tcaccgacac ggtgatcggc 960
ccgatcttct tcgagatcat ccagcgcaag ggcaaccagg gtttcggcga gggcaatttc 1020
aaggccctgt tcgagtccat cgagaaagac cagattcgcc gcggcgtgat ctga 1074
<210> 6
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Asn Ala Val Ala Lys Ile Glu Gln His Asn Pro Ile Gly Thr Asp
1 5 10 15
Gly Phe Glu Phe Val Glu Phe Thr Ala Pro Asp Ala Lys Gly Ile Glu
20 25 30
Gln Leu Arg Gln Leu Phe Asn Met Met Gly Phe Thr Glu Thr Ala Lys
35 40 45
His Arg Ser Lys Glu Val Phe Leu Phe Gln Gln Asn Asp Ile Asn Ile
50 55 60
Val Leu Asn Gly Ser Pro Thr Gly His Val His Glu Phe Ala Leu Lys
65 70 75 80
His Gly Pro Ser Ala Cys Ala Met Ala Phe Arg Val Lys Asn Ala Ser
85 90 95
Gln Ala Ala Ala Tyr Ala Glu Ser Gln Gly Ala Lys Leu Val Gly Ser
100 105 110
His Ala Asn Phe Gly Glu Leu Asn Ile Pro Ser Leu Glu Gly Ile Gly
115 120 125
Gly Ser Leu Leu Tyr Leu Val Asp Arg Tyr Gly Asp Arg Ser Ile Tyr
130 135 140
Asp Val Asp Phe Glu Phe Ile Glu Gly Arg Ser Ala Asn Asp Asn Ser
145 150 155 160
Val Gly Leu Thr Tyr Ile Asp His Leu Thr His Asn Val Lys Arg Gly
165 170 175
Gln Met Asp Val Trp Ser Gly Phe Tyr Glu Arg Ile Ala Asn Phe Arg
180 185 190
Glu Ile Arg Tyr Phe Asp Ile Glu Gly Lys Leu Thr Gly Leu Phe Ser
195 200 205
Arg Ala Met Thr Ala Pro Cys Gly Lys Ile Arg Ile Pro Ile Asn Glu
210 215 220
Ser Ala Asp Asp Thr Ser Gln Ile Glu Glu Phe Ile Arg Glu Tyr His
225 230 235 240
Gly Glu Gly Ile Gln His Ile Ala Leu Thr Thr Asp Asp Ile Tyr Ala
245 250 255
Thr Val Arg Lys Leu Arg Asp Asn Gly Val Lys Phe Met Ser Thr Pro
260 265 270
Asp Thr Tyr Tyr Glu Lys Val Asp Thr Ser Val Ala Gly His Gly Glu
275 280 285
Pro Leu Glu Gln Leu Arg Glu Leu Asn Leu Leu Ile Asp Gly Ala Pro
290 295 300
Gly Asp Asp Gly Ile Leu Leu Gln Ile Phe Thr Asp Thr Val Ile Gly
305 310 315 320
Pro Ile Phe Phe Glu Ile Ile Gln Arg Lys Gly Asn Gln Gly Phe Gly
325 330 335
Glu Gly Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Glu Asp Gln Ile
340 345 350
Arg Arg Gly Val Ile
355
<210> 7
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaacgccg tggccaagat cgaacagcac aatcccatcg gtaccgacgg attcgaattc 60
gtcgagttca ccgcccccga cgccaagggc atcgagcagc tgcgccagct gttcaacatg 120
atgggcttca ccgaaaccgc caagcatcgt tccaaggaag tcttcctgtt ccagcagaac 180
gatatcaaca tcgtgctcaa cggcagccca accgggcatg tccatgaatt cgccctcaag 240
cacggcccga gcgcctgcgc catggccttc cgggtgaaga acgcttccca ggccgccgcc 300
tacgccgaat cccagggcgc caagctggtg ggcagccacg ccaacttcgg cgagctgaac 360
atcccttccc tggaaggcat cggcggttcg ctgctgtatc ttgtcgaccg ctacggcgac 420
cgcagcatct atgacgtcga cttcgagttc atcgaaggcc gcagcgtcaa cgacaactcg 480
gtcggcctga cctacatcga ccacctgacc cacaacgtca agcgcggcca gatggacgtc 540
tggtccggtt tctacgagcg catcgccaac ttccgcgaga ttcgctactt cgacatcgaa 600
ggcaagctca ccggcctgtt ctcccgcgcc atgaccgcac cttgcgggaa gatccgcatc 660
ccgatcaacg agtcggccga cgatacctcg cagatcgagg aattcatccg cgaataccat 720
ggcgaaggca tccagcacat cgccctgacc accgacgaca tctatgccac cgtgcgcaag 780
ctgcgcgaca acggcgtgaa gttcatgtcg accccggaca cctactacga gaaggtcgac 840
accagcgtcg ccgggcatgg cgagccgctc gagcaactgc gcgaactgaa cctgctgatc 900
gacggcgccc cgggcgacga cggcatcctg ctgcagatct tcaccgacac ggtgatcggc 960
ccgatcttct tcgagatcat ccagcgcaag ggcaaccagg gtttcggcga gggcaatttc 1020
aaggccctgt tcgagtccat cgaggaagac cagattcgcc gcggcgtgat ctga 1074
<210> 8
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Asn Ala Val Ala Lys Ile Glu Gln His Asn Pro Ile Gly Thr Asp
1 5 10 15
Gly Phe Glu Phe Val Glu Phe Thr Ala Pro Asp Ala Lys Gly Ile Glu
20 25 30
Gln Leu Arg Gln Leu Phe Asn Met Met Gly Phe Thr Glu Thr Ala Lys
35 40 45
His Arg Ser Lys Glu Val Phe Leu Phe Gln Gln Asn Asp Ile Asn Ile
50 55 60
Val Leu Asn Gly Ser Pro Thr Gly His Val His Glu Phe Ala Leu Lys
65 70 75 80
His Gly Pro Ser Ala Cys Ala Met Ala Phe Arg Val Lys Asn Ala Ser
85 90 95
Gln Ala Ala Ala Tyr Ala Glu Ser Gln Gly Ala Lys Leu Val Gly Ser
100 105 110
His Ala Asn Phe Gly Glu Leu Asn Ile Pro Ser Leu Glu Gly Ile Gly
115 120 125
Gly Ser Leu Leu Tyr Leu Val Asp Arg Tyr Gly Asp Arg Ser Ile Tyr
130 135 140
Asp Val Asp Phe Glu Phe Ile Glu Gly Arg Ser Val Asn Asp Asn Ser
145 150 155 160
Val Gly Leu Thr Tyr Ile Asp His Leu Thr His Asn Val Lys Arg Gly
165 170 175
Gln Met Asp Val Trp Ser Gly Phe Tyr Glu Arg Ile Ala Asn Phe Arg
180 185 190
Glu Ile Arg Tyr Phe Asp Ile Glu Gly Lys Leu Thr Gly Leu Phe Ser
195 200 205
Arg Ala Met Thr Ala Pro Cys Gly Lys Ile Arg Ile Pro Ile Asn Glu
210 215 220
Ser Ala Asp Asp Thr Ser Gln Ile Glu Glu Phe Ile Arg Glu Tyr His
225 230 235 240
Gly Glu Gly Ile Gln His Ile Ala Leu Thr Thr Asp Asp Ile Tyr Ala
245 250 255
Thr Val Arg Lys Leu Arg Asp Asn Gly Val Lys Phe Met Ser Thr Pro
260 265 270
Asp Thr Tyr Tyr Glu Lys Val Asp Thr Ser Val Ala Gly His Gly Glu
275 280 285
Pro Leu Glu Gln Leu Arg Glu Leu Asn Leu Leu Ile Asp Gly Ala Pro
290 295 300
Gly Asp Asp Gly Ile Leu Leu Gln Ile Phe Thr Asp Thr Val Ile Gly
305 310 315 320
Pro Ile Phe Phe Glu Ile Ile Gln Arg Lys Gly Asn Gln Gly Phe Gly
325 330 335
Glu Gly Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Glu Asp Gln Ile
340 345 350
Arg Arg Gly Val Ile
355
<210> 9
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgaacgccg tggccaagat cgaacagcac aatcccatcg gtaccgacgg attcgaattc 60
gtcgagttca ccgcccccga cgccaagggc atcgagcagc tgcgccagct gttcaacatg 120
atgggcttca ccgaaaccgc caagcatcgt tccaaggaag tcttcctgtt ccagcagaac 180
gatatcaaca tcgtgctcaa cggcagccca accggacatg tccatgaatt cgccctcaag 240
cacggcccga gcgcctgcgc catggccttc cgggtgaaga acgcttccca ggccgccgcc 300
tacgccgaat cccagggcgc caagctggtg ggcagccacg ccaacttcgg cgagctgaac 360
atcccttccc tggaaggcat cggcggttcg ctgctgtatc ttgtcgaccg ctacggcgac 420
cgcagcatct atgacgtcga cttcgagttc atcgaaggcc gcagcgtcaa cgacaactcg 480
gtcggcctga cctacatcga ccacctgacc cacaacgtca agcgcggcca gatggacgtc 540
tggtccggtt tctacgagcg catcgccaac ttccgcgaga ttcgctactt cgacatcgaa 600
ggcaagctca ccggcctgtt ctcccgcgcc atgaccgcac cttgcgggaa gatccgcatc 660
ccgatcaacg agtcggccga cgatacctcg cagatcgagg aattcatccg cgaataccat 720
ggcgaaggca tccagcacat cgccctgacc accgacgaca tctatgccac cgtgcgcaag 780
ctgcgcgaca acggcgtgaa gttcatgtcg accccggaca cctactacga gaaggtcgac 840
accagcgtcg ccgggcatgg cgagccgctc gagcaactgc gcgaactgaa cctgctgatc 900
gacggcgccc cgggcgacga cggcatcctg ctgcagatct tcaccgacac ggtgatcggc 960
ccgatcttct tcgagatcat ccagcgcaag ggcaaccagg gtttcggcga gggcaatttc 1020
aaggccctgt tcgagtccat cgagaaagac cagattcgcc gcggcgtgat ctga 1074
<210> 10
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Asn Ala Val Ala Lys Ile Glu Gln His Asn Pro Ile Gly Thr Asp
1 5 10 15
Gly Phe Glu Phe Val Glu Phe Thr Ala Pro Asp Ala Lys Gly Ile Glu
20 25 30
Gln Leu Arg Gln Leu Phe Asn Met Met Gly Phe Thr Glu Thr Ala Lys
35 40 45
His Arg Ser Lys Glu Val Phe Leu Phe Gln Gln Asn Asp Ile Asn Ile
50 55 60
Val Leu Asn Gly Ser Pro Thr Gly His Val His Glu Phe Ala Leu Lys
65 70 75 80
His Gly Pro Ser Ala Cys Ala Met Ala Phe Arg Val Lys Asn Ala Ser
85 90 95
Gln Ala Ala Ala Tyr Ala Glu Ser Gln Gly Ala Lys Leu Val Gly Ser
100 105 110
His Ala Asn Phe Gly Glu Leu Asn Ile Pro Ser Leu Glu Gly Ile Gly
115 120 125
Gly Ser Leu Leu Tyr Leu Val Asp Arg Tyr Gly Asp Arg Ser Ile Tyr
130 135 140
Asp Val Asp Phe Glu Phe Ile Glu Gly Arg Ser Val Asn Asp Asn Ser
145 150 155 160
Val Gly Leu Thr Tyr Ile Asp His Leu Thr His Asn Val Lys Arg Gly
165 170 175
Gln Met Asp Val Trp Ser Gly Phe Tyr Glu Arg Ile Ala Asn Phe Arg
180 185 190
Glu Ile Arg Tyr Phe Asp Ile Glu Gly Lys Leu Thr Gly Leu Phe Ser
195 200 205
Arg Ala Met Thr Ala Pro Cys Gly Lys Ile Arg Ile Pro Ile Asn Glu
210 215 220
Ser Ala Asp Asp Thr Ser Gln Ile Glu Glu Phe Ile Arg Glu Tyr His
225 230 235 240
Gly Glu Gly Ile Gln His Ile Ala Leu Thr Thr Asp Asp Ile Tyr Ala
245 250 255
Thr Val Arg Lys Leu Arg Asp Asn Gly Val Lys Phe Met Ser Thr Pro
260 265 270
Asp Thr Tyr Tyr Glu Lys Val Asp Thr Ser Val Ala Gly His Gly Glu
275 280 285
Pro Leu Glu Gln Leu Arg Glu Leu Asn Leu Leu Ile Asp Gly Ala Pro
290 295 300
Gly Asp Asp Gly Ile Leu Leu Gln Ile Phe Thr Asp Thr Val Ile Gly
305 310 315 320
Pro Ile Phe Phe Glu Ile Ile Gln Arg Lys Gly Asn Gln Gly Phe Gly
325 330 335
Glu Gly Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Lys Asp Gln Ile
340 345 350
Arg Arg Gly Val Ile
355
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tatggatcca tgaacgccgt ggccaagatc 30
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcgcggccgc tcagatcacg ccgcggcgaa t 31
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tatggatcct atgtgtctat cgttagcttc tacagctc 38
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctatctcgag ggttcttctt cttgttcatc cca 33
<210> 15
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gggacaagtt tgtacaaaaa agcaggcttc atgtgtctat cgttagcttc tacag 55
<210> 16
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggaccactt tgtacaagaa agctgggtcg gttcttcttc ttgttcatcc ca 52
<210> 17
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gggacaagtt tgtacaaaaa agcaggcttc atgaacgccg tggccaagat cgaac 55
<210> 18
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcagatcacg ccgcggcgaa t 51
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggccgcagcg tcaacgacaa c 21
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttcgatgaac tcgaagtcga cgtcatag 28
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttgtacaatg aacgccgtgg ccaagatc 28
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctcaagcttg atcacgccgc ggcgaatctg gt 32
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcctgcagat gcccatgtac actccatcac t 31
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctcaagcttc gcggttcttt tagcttccaa ag 32
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttgtacaatg aacgccgtgg ccaagatc 28
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctcaagcttg atcacgccgc ggcgaatctg gt 32
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggtcgtacta ctggtattgt gct 23
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgacaatttc acgctcagct 20
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcggtttaaa ttcagcggtc ctg 23
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tccgtgcact ggctcgttaa tc 22
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgtccgaagg gttccaagct ac 22
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cacagtttcc gcatagtcag tacg 24
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aagatcgtcg agggagatgc tg 22
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tccggccagt actcaatgct tc 22
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atcttgactg agcgtggtta ttcc 24
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gctggtcctg gctgtctcc 19
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gacaggccaa cgatattcat aga 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ctatgccaca ttgattcctc att 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tttcaggcgt tggttactca tac 23
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tctaactatg cacgtatgca cctt 24
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ggcttcaatt ctctggtttc a 21
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ctgacaaagg cagcaccat 19
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gtttattcca aaagggtgtg ct 22
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gcggttgtag agatcagca 19
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
atggaagcca agctctgg 18
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ctacaggcca ggcggttt 18

Claims (44)

1.一种分离的除草剂抗性多肽，其特征在于，所述的除草剂抗性多肽为突变的HPPD多肽，且所述突变的HPPD多肽在SEQ ID NO.:2所示的野生型HPPD多肽的第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)，其中，所述的野生型HPPD多肽来源于绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述除草剂抗性多肽还包括选自下组的一个或多个突变：
在SEQ ID NO.:2所示的野生型HPPD多肽的(a)第156位氨基酸由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)；和/或(b)第349位氨基酸由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述除草剂抗性多肽在SEQ ID NO.:2所示的野生型HPPD多肽的(i)第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)，且(ii)第349位氨基酸由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)。
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述除草剂抗性多肽在SEQ ID NO.:2所示的野生型HPPD多肽的(i)第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)，且(ii)第156位氨基酸由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)。
5.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述除草剂抗性多肽在SEQ ID NO.:2所示的野生型HPPD多肽的(i)第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)，(ii)第349位氨基酸由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，且(iii)第156位氨基酸由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)。
6.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述除草剂抗性多肽在SEQ ID NO.:2所示的野生型HPPD多肽的(i)第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)，且(ii)第80位氨基酸由赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)。
7.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述除草剂抗性多肽在SEQ ID NO.:2所示的野生型HPPD多肽的(i)第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)，且(ii)第355位氨基酸由甘氨酸(G)突变为丙氨酸(A)。
8.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的除草剂抗性多肽对除草剂的耐受浓度V1与野生型HPPD多肽对相同除草剂的耐受浓度V2相比，V1/V2≥2。
9.如权利要求8所述的多肽，其特征在于，对除草剂的耐受浓度V1/V2≥5。
10.如权利要求8所述的多肽，其特征在于，对除草剂的耐受浓度V1/V2≥10。
11.如权利要求1所述的除草剂抗性多肽，其特征在于，所述的除草剂抗性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:8和/或SEQ ID NO.:10 所示。
12.如权利要求1所述的除草剂抗性多肽，其特征在于，所述的除草剂为HPPD抑制剂。
13.如权利要求1所述的除草剂抗性多肽，其特征在于，所述的除草剂为三酮类HPPD抑制剂。
14.如权利要求13所述的除草剂抗性多肽，其特征在于，所述的三酮类HPPD抑制剂选自下组：磺草酮、硝磺草酮、环磺酮、或其组合。
15.如权利要求1所述的除草剂抗性多肽，其特征在于，所述的除草剂抗性多肽至少能够耐受浓度为10μM。
16.如权利要求15所述的除草剂抗性多肽，其特征在于，所述的除草剂抗性多肽耐受浓度为50μM。
17.如权利要求15所述的除草剂抗性多肽，其特征在于，所述的除草剂抗性多肽耐受浓度为100μM。
18.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的除草剂抗性多肽。
19.如权利要求18所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:4所示多肽的多核苷酸；和
(b)序列如SEQ ID NO.:3所示的多核苷酸。
20.如权利要求18所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:6所示多肽的多核苷酸；和
(b)序列如SEQ ID NO.:5所示的多核苷酸。
21.如权利要求18所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:8所示多肽的多核苷酸；和
(b)序列如SEQ ID NO.:7所示的多核苷酸。
22.如权利要求18所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:10所示多肽的多核苷酸；和
(b)序列如SEQ ID NO.:9所示的多核苷酸。
23.如权利要求18所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸在所述除草剂抗性多肽的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、标签序列、或其组合。
24.如权利要求18所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸还包含与所述除草剂抗性多肽的ORF序列操作性连接的启动子。
25.如权利要求24所述的多核苷酸，其特征在于，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。
26.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求18所述的多核苷酸。
27.如权利要求26所述的载体，其特征在于，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
28.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求26的载体或基因组中整合有权利要求18所述的多核苷酸；
并且，所述的宿主细胞选自下组：原核细胞、酵母细胞。
29.如权利要求28所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为农杆菌。
30.一种除草剂抗性多肽的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求28的宿主细胞，从而表达所述的除草剂抗性多肽；
(b)分离所述的除草剂抗性多肽。
31.如权利要求30的方法，其特征在于，在步骤(a)中，利用基因编辑技术改造所述细胞，从而使所述细胞表达权利要求1中所述的除草剂抗性多肽。
32.一种改良植物的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(a)提供一植物细胞，利用基因工程改造所述植物细胞，从而使所述植物细胞表达权利要求1中所述的除草剂抗性多肽；和
(b)将步骤(a)中的植物细胞再生成植株。
33.如权利要求32的方法，其特征在于，所述的步骤(a)包括步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求1所述的除草剂抗性多肽的DNA编码序列；
(2)将植物细胞与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述除草剂抗性多肽的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；和
(3)选择已转入所述除草剂抗性多肽的DNA编码序列的植物细胞。
34.如权利要求32的方法，其特征在于，所述方法改良植物耐受除草剂的性能。
35.如权利要求32的方法，其特征在于，所述的植物包括农作物、林业植物、蔬菜、瓜果、花卉、牧草。
36.如权利要求35的方法，其特征在于，所述的植物包括禾本科，豆科以及十字花科植物。
37.如权利要求35的方法，其特征在于，所述的植物包括水稻、玉米、高粱、小麦、大豆或拟南芥。
38.如权利要求32的方法，其特征在于，在步骤(b)之后还包括步骤：对所述植株，测试其抗除草剂的性能。
39.如权利要求38的方法，其特征在于，所述的植物幼苗至少能够耐受浓度为200μM的除草剂。
40.如权利要求38的方法，其特征在于，所述改良的植物在萌发先后至少能够耐受浓度为50nM的除草剂。
41.如权利要求40的方法，其特征在于，所述改良的植物在萌发先后至少能够耐受浓度为100nM的除草剂。
42.如权利要求38的方法，其特征在于，所述的抗除草剂包括硝磺草酮、磺草酮、和/或环磺酮。
43.一种权利要求1所述的除草剂抗性多肽或其编码基因的用途，用于培育植物抗除草剂株系、或用于制备培育植物抗除草剂株系的试剂或试剂盒。
44.一种分离的除草剂抗性多肽，其特征在于，所述的除草剂抗性多肽为突变的HPPD多肽，且所述除草剂抗性多肽在SEQ ID NO.:2所示的野生型HPPD多肽的基础上进行突变，所述突变为(i)第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)；或者
所述突变为(i)第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)，和(ii)第156位氨基酸由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)；或者
所述突变为i)第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)，和(ii)第349位氨基酸由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)；或者
所述突变为(i)第282位氨基酸由精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)，(ii)第349位氨基酸由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和(iii)第156位氨基酸由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
CN201811409979.2A 2017-11-23 2018-11-23 抗除草剂基因及其在植物育种中的应用 Active CN109825482B (zh)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2017111839841 2017-11-23
CN2017111819161 2017-11-23
CN201711183984 2017-11-23
CN2017111840020 2017-11-23
CN201711184002 2017-11-23
CN201711183983 2017-11-23
CN2017111839837 2017-11-23
CN201711181916 2017-11-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109825482A CN109825482A (zh) 2019-05-31
CN109825482B true CN109825482B (zh) 2021-06-22

Family

ID=66631364

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811409979.2A Active CN109825482B (zh) 2017-11-23 2018-11-23 抗除草剂基因及其在植物育种中的应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11952582B2 (zh)
CN (1) CN109825482B (zh)
WO (1) WO2019101179A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113249345B (zh) * 2020-02-07 2024-05-03 山东舜丰生物科技有限公司 抗除草剂多肽、核酸及其应用
CN116590249A (zh) * 2021-03-31 2023-08-15 四川天豫兴禾生物科技有限公司 具有三酮类除草剂抗性的hir突变体及其在植物育种中的应用
CN113151314B (zh) * 2021-05-10 2022-10-14 安徽省农业科学院水稻研究所 一种植物ACCase突变型基因及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6245968B1 (en) * 1997-11-07 2001-06-12 Aventis Cropscience S.A. Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
CA2749524C (en) * 2009-01-22 2021-07-06 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
CN102906252A (zh) 2009-12-23 2013-01-30 拜尔知识产权有限公司 对hppd抑制剂型除草剂耐受的植物
EA037938B1 (ru) * 2012-09-14 2021-06-09 Басф Агрикалчерал Солюшнс Сид Юс Ллк Варианты hppd и способы применения
CA2903311A1 (en) * 2013-04-30 2014-11-06 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides tolerance to herbicides,such as benzamide herbicides

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lee DG等 .登录号：CP000438.1.《GenBank》.2014,第263577-265481，4704698-4705771位. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019101179A1 (zh) 2019-05-31
US20210024949A1 (en) 2021-01-28
US11952582B2 (en) 2024-04-09
CN109825482A (zh) 2019-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020281034B2 (en) Methods and compositions for herbicide tolerance in plants
CN107119060A (zh) 草甘膦抗性植物和相关方法
BRPI0712249B1 (pt) molécula de ácido nucléico que codifica dicamba monooxigenase, construção de dna compreendendo a mesma, métodos para produzir uma planta tolerante ao dicamba, controlar o crescimento de planta daninha e produzir alimento, suprimento ou um produto industrial
WO2004062351A2 (en) Gene encoding resistance to acetolactate synthase-inhibiting herbicides
CN109825482B (zh) 抗除草剂基因及其在植物育种中的应用
JP7181528B2 (ja) ２－オキソグルタル酸依存的に４－ｈｐｐｄ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたｈｓｌタンパク質の製造方法
US7199284B2 (en) Chlorophyllases
UA115768C2 (uk) Спосіб підвищення стійкості рослини до абіотичного стресу
CA2276612A1 (en) Polynucleotides encoding choline monooxygenase and plants transformed therewith
CN112639086B (zh) 抗除草剂基因、多肽及其在植物育种中的应用
JPWO2007034953A1 (ja) アシフルオルフェンに対する耐性を付与する活性を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及びその遺伝子
AU2016317094A1 (en) Increasing plant oil content by altering a negative regulator of acetyl-CoA carboxylase
JP2019524137A (ja) 内生菌における代謝産物の生産
FR2800092A1 (fr) Gene chimere codant pour un facteur de transcription myb30 et expression dans les plantes
CN111560055B (zh) 水稻基因OsLAT3在调节敌草快的吸收累积中的应用
JP2007202425A (ja) 植物体の着色制御遺伝子、およびその利用
KR20020023471A (ko) 성장률이 향상된 유전자전환 식물 및 식물 세포와 이에관련된 방법
JP2012024103A (ja) 植物体の着色制御遺伝子、およびその利用
CN113789313B (zh) 紫薇耐盐基因LiCIPK24及其应用
Paulsmeyer Genetic factors involved with increased anthocyanin production in maize
CN113122566A (zh) Hak基因在调控植物性状中的作用
CN116606358A (zh) GmTLP8蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用
CN113846117A (zh) 一种增强植物香味的方法
JP2006187203A (ja) クロロフィル生合成に関与する新規ビニル基還元酵素およびその利用
WO2003091441A1 (en) Sfr2 protein encoding gene

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200508

Address after: 200031 building 4, No. 300 Fenglin Road, Xuhui District, Shanghai

Applicant after: Center for excellence and innovation in molecular plant science, Chinese Academy of Sciences

Address before: 200031 Yueyang Road, Shanghai, No. 319, No.

Applicant before: SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant