CN113249345B - 抗除草剂多肽、核酸及其应用 - Google Patents

抗除草剂多肽、核酸及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了抗除草剂多肽、核酸及其应用，具体地，涉及抗除草剂基因、多肽及其在植物育种中的应用，具体地，本发明提供了一种突变的HPPD多肽，并且所述突变的HPPD多肽与亲本HPPD多肽相比，在对应于SEQ ID NO.1的第20位氨基酸发生突变。突变后的HPPD多肽对除草剂具有很强的耐受性，在提高和培育抗HPPD抑制性除草剂耐受性植物领域中具有非常广阔的应用前景。

Description

抗除草剂多肽、核酸及其应用
技术领域
本发明属于农业基因工程领域，具体涉及抗除草剂多肽、核酸及其应用，更具体地，涉及向植物赋予HPPD抑制性除草剂抗性或耐受性的新型突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)、其编码核酸以及应用。
背景技术
对羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase，HPPD，EC1.13.11.27)是生物体内酪氨酸代谢过程中重要的酶，几乎存在于所有需氧的生物体中，生物体内酪氨酸(Tyrosine)在酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)的作用下生成对羟基苯丙酮酸(p-hydroxyphenylpyruvic acid,HPPA)，在氧气的参与下HPPD能够将HPPA催化转化成尿黑酸(homogentisate，HGA)。在动物体内，HPPD的主要作用是促进酪氨酸、芳氨酸、苯丙氨酸的分解代谢。但在植物体内的作用与动物体内显著不同，尿黑酸进一步形成质体醌(plastoquinones)和生育酚(tocopherols，维生素E)(Ahrens et al.,2013)。生育酚起膜相关抗氧化剂的作用，是植物生长必须的抗氧化剂，能有效地增强植物的抗逆性。质体醌是植物进行光合作用过程中的关键辅助因子，促进植物体内类胡萝卜素等的合成。植物体中60％以上的叶绿素都结合于捕光天线复合物上，该复合物吸收太阳光能并将激发能传递给光合作用反应中心，而类胡萝卜素是反应中心的叶绿素结合蛋白和天线系统的重要组成部分，在植物光合作用中担负着光吸收辅助色素的重要功能，具有吸收和传递电子的能力，并在清除自由基方面起着重要作用。
HPPD受到抑制会导致植物细胞内的光合作用解偶联、辅助捕光色素缺乏，同时由于缺乏通常由类胡萝卜素提供的光保护作用，活性氧中间体和光氧化导致叶绿素破坏，结果造成植物光合作用组织产生白化症状，生长受到抑制，直至死亡(Beaudegnies et al.,2009)。
自20世纪90年代起被确定为除草剂靶标，HPPD是继乙酰乳酸合成酶(ALS)、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)后又一重要的除草剂作用靶标，其独特的作用机制可以有效防治多种抗性杂草。HPPD类除草剂是近年来兴起的一类热销产品，具有高效、低毒、环境相容性好以及对后茬作物安全性高等一系列优点。研究发现植物与哺乳动物HPPD氨基酸序列的同源性存在显著差异，而同为植物界或者动物界的同源性比较高(Yang et al.,2004)。这为后续开发具有更高选择性和安全性的HPPD类除草剂提供了理论指导基础。目前，按结构分类已经开发了5种以HPPD为靶标的除草剂，主要包括三酮类、吡唑酮类、异噁唑类、二酮腈类和二苯酮类。
然而，这些HPPD抑制除草剂在杀死杂草的同时也会给作物带来一定的伤害，不同农作物对不同的HPPD除草剂的耐受程度不同，也限制了HPPD除草剂的使用范围，因此获得耐受除草剂的作物尤为重要。目前的策略除了试图绕过HPPD介导的尿黑酸产生外，还包括过表达该酶从而在植物中产生大量的除草剂靶标酶，减轻除草剂的抑制作用。虽然HPPD的过表达使得植物对除草剂(如异噁氟草的二酮腈衍生物)有更好的萌发前耐受性，但该耐受性不足以抵抗萌发后的除草剂处理。
CRISPR/Cas基因编辑技术是近几年新兴的基因工程技术，其是由guideRNA介导的DNA切割技术，针对Cas的不同已经开发出多种编辑系统，包括Cas9、Cpf1、Cms1、C2c1、C2c2等。CRISPR/Cas编辑技术可以实现三种定点编辑：第一种是基因的定点敲除，Cas蛋白在靶向RNA(gRNA)的指导下识别和切割靶点，产生双链DNA断裂；断裂的DNA通常以非同源末端连接(NHEJ)来修复；在修复时容易产生移码突变以破坏这个基因。定点敲除的效率都较高。第二种是对靶标进行同源置换来更换靶标序列或者定点插入。在产生双链DNA断裂时，如果在附近存在同源修复模板，这时可能发生同源置换或定点插入。同源置换的效率较低，并随着要置换的序列的长度增长而变得更低。第三种是单碱基编辑。单碱基编辑是利用CRISPR/Cas系统将脱氨酶靶向基因组中特定的位点从而对特定碱基进行修饰的基因编辑方法。此种方法已经在水稻中成功运用。
HPPD类除草剂大规模使用的时间较短，目前关于HPPD基因自身突变产生抗性的报道极少。但结合CRISPR技术，我们可以加快抗性HPPD多肽的筛选，改进作物对HPPD抑制剂的耐受性。对于扩大除草剂使用范围、延长使用寿命具有重要意义。
发明内容
本发明目的是提供一种可提高植物对HPPD抑制性除草剂产生抗性或耐受性的突变型HPPD多肽；本发明还涉及突变型HPPD的生物学活性片段，编码所述蛋白或片段的多核苷酸及其应用。
一方面，本发明提供了一种对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的突变多肽，所述突变多肽与亲本对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第20位氨基酸发生突变。
在另一优选例中，所述的突变为氨基酸的插入、缺失或替换。
在另一优选例中，所述的突变多肽为除草剂抗性多肽。
进一步的，所述第20位氨基酸由丙氨酸(A)突变为非丙氨酸的氨基酸，所述非丙氨酸的氨基酸选自缬氨酸(V)，甘氨酸(G)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，苯丙氨酸(F)，色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，天冬氨酸(D)，天冬酰胺(N)，谷氨酸(E)，赖氨酸(K)，谷氨酰胺(Q)，甲硫氨酸(M)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，半胱氨酸(C)，脯氨酸(P)，组氨酸(H)或精氨酸(R)。
在另一优选例中，所述第20位丙氨酸(A)突变为选自下组的氨基酸：谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)。
在另一优选例中，所述第20位丙氨酸(A)突变为选自下组的氨基酸：谷氨酸(E)。
在另一优选例中，所述的突变多肽为具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽、其活性片段、或其保守性变异多肽。
在另一优选例中所述的突变多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
在另一优选例中，所述的突变型HPPD多肽进一步包括其他突变位点，所述的其他突变位点为对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第93、103、141、152、165、170、176、191、211、220、226、276、277、336、337、338、339、340、342、346、347、353、370、377、386、390、392、403、410、418、419、420、430和431位点中的一种或多种，所述的其他突变位点能够保持或增强突变多肽对HPPD抑制性除草剂的耐受性或抗性或增加突变型HPPD多肽对除草剂的适用范围。
在另一优选例中，所述的对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的其他突变位点的突变方式包括：D152N、D170N、G176C、E353K、P211L、P336L、Y339H、Y340H、R93S、A103S、H141R/K/T、A165V、V191I、R220K、G226H、L276W、P277N、P336D/L、P337A、N338D/SY、G342D、R346C/D/H/S/Y、A347V、D370N、I377C、P386T、L390I、M392L、E403G、K410I、K418P、G419F/L/V、N420S、N420T、E430G和Y431L中的一种或多种。
在另一优选例中，所述亲本HPPD多肽来源于单子叶植物和/或双子叶植物。
在另一优选例中，所述亲本HPPD多肽来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。
在另一优选例中，所述亲本HPPD多肽来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。
在另一优选例中，所述亲本HPPD多肽来源于水稻，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
在另一优选例中，所述亲本HPPD多肽的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
在另一优选例中，所述突变多肽(除草剂抗性多肽)为SEQ ID No.1所示的多肽经突变形成的。
在另一优选例中，所述的突变多肽除所述突变(如20位点)外，其余的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示的序列相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白具有除草剂耐受活性(较佳地，喹唑啉二酮类除草剂的活性)。
在另一优选例中，所述的HPPD抑制性除草剂包括三酮类、二酮腈类、异噁唑类、吡唑类、二苯酮类、喹唑啉二酮类或其组合。三酮类除草剂优选双环磺草酮、硝磺草酮、甲基磺草酮、环磺酮、特呋三酮或氟吡草酮中的一种或任意几种；所述异噁唑类除草剂优选异噁唑草酮、异噁氯草酮、异恶草酮中的一种或任意几种；所述吡唑类除草剂优选苄草唑、吡草酮、吡唑特、磺酰草吡唑或苯唑草酮中的一种或任意几种；所述的喹唑啉二酮除草剂优选喹草酮、甲基喹草酮、CN104557739A和CN110669016A中所记载的化合物。
在另一优选例中，所述的HPPD抑制性除草剂为喹唑啉二酮类，所述的喹唑啉二酮除草剂优选喹草酮、甲基喹草酮、CN104557739A和CN110669016A中所记载的化合物。
在另一优选例中，所述的突变多肽与亲本HPPD多肽相比，其最大耐受浓度，提高至少1.5倍，优选提高至少2倍，优选提高至少3倍，优选提高至少4倍，优选提高至少5倍，优选提高至少6倍，优选提高至少10倍。优选的所述HPPD抑制性除草剂为喹草酮。
在另一优选例中，含有突变多肽的植物相比亲本型植物对喹唑啉二酮类除草剂的最大耐受浓度至少提高了2倍，优选提高了3倍，优选提高了4倍，优选提高了5倍，优选提高了6倍，优选提高了7倍，优选提高了8倍，优选提高了10倍，优选提高了12倍，优选提高了14倍，优选提高了16倍。
在另一优选例中，所述突变型HPPD多肽赋予植物至少0.01mg/L，优选至少0.02mg/L，优选至少0.03mg/L，优选至少0.05mg/L，优选至少0.08mg/L，优选至少0.1mg/L，优选至少0.2mg/L，优选至0.5mg/L，优选至少0.8mg/L，优选至少1mg/L，优选至少2mg/L，优选至少5mg/L，优选至少10mg/L浓度的喹唑啉二酮类除草剂的耐受性。优选喹草酮、甲基喹草酮、CN104557739A和CN110669016A中所记载的化合物。
在另一优选例中，所述除草剂抗性多肽或其活性片段选自下组：
(a)具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽或其活性片段；
(b)将SEQ ID No.2所示氨基酸序或其活性片段列经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有HPPD抑制性除草剂耐受活性的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的衍生的多肽与SEQ ID No.2所示序列的同源性至少为60％，较佳地至少为70％，更佳地至少为80％，最佳地至少为90％，如95％、97％、99％。
本发明另一方面，提供一种融合蛋白，包含所述的突变多肽或其生物活性片段，以及与之融合的其它组分，例如标签肽如，组氨酸标签，例如，6×His，或者质体引导肽例如引导到叶绿体内的肽。
本发明另一方面，提供一种多核苷酸，编码所述突变多肽或其活性片段的多核苷酸。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO No.2所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO No.4所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO No.4所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥98％)，且编码SEQ ID No.2所示多肽的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cDNA序列、RNA序列、或其组合。
在另一优选例中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。
在另一优选例中，所述的多核苷酸在所述突变多肽的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。
在另一优选例中，该多核苷酸还包含与所述突变多肽的ORF序列操作性连接的启动子。
在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。
本发明另一方面，提供一种核酸构建体，含有所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。
在另一优选例中所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。
本发明另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括表达载体、穿梭载体或整合载体。
本发明另一方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述的核酸构建体或所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或动物细胞或植物细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。
在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。
在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。
在另一优选例中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。
本发明另一方面，提供一种制备所述突变多肽或其活性片段的方法，所述的方法包括步骤：
(a)在适合表达的条件下，培养包含所述突变多肽的宿主细胞，从而表达所述的突变多肽；和
(b)分离所述的突变多肽。
本发明另一方面，提供一种耐受HPPD抑制性除草剂或对HPPD抑制性除草剂具有抗性的植物细胞、植物组织、植物部分、植物，其中，所述植物细胞、植物组织、植物部分、植物含有所述的突变多肽或其多核苷酸序列。
本发明另一方面，提供一种赋予植物对HPPD抑制性除草剂产生抗性或耐受性的方法，所述方法包括在植物细胞、植物组织、植物部分或植物中引入所述HPPD突变多肽的步骤。
在另一优选例中，所述的方法中，引入HPPD突变多肽包括将HPPD突变多肽在植物细胞、植物组织、植物部分或植物中进行表达，例如，通过表达载体对所述突变多肽进行表达的，或者将所述编码突变多肽的多核苷酸整合到植物基因组上进行表达。
在另一优选例中，所述的方法中，引入突变的方法包括自然变异、物理诱变(如紫外线诱变、X射线或Y射线诱变)、化学诱变(如亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等)、生物诱变(如病毒或细菌介导的诱变)、基因编辑。
在另一优选例中，上述方法包括以下步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的突变多肽或其活性片段的DNA编码序列；
(2)将植物细胞、植物组织、植物部分与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述突变多肽或其活性片段的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；和
(3)选择已转入所述突变多肽或其活性片段的DNA编码序列的植物细胞。
在另一优选例中，所述方法中，引入HPPD突变多肽还包括将植物的内源性HPPD进行突变从而引入所述突变多肽的步骤。
在另一优选例中，所述方法中，引入HPPD突变多肽包括将植物的内源性HPPD核苷酸序列进行突变并表达从而引入所述突变多肽的步骤。
在另一优选例中，所述的方法中，引入突变的方法包括自然变异、物理诱变(如紫外线诱变、X射线或Y射线诱变)、化学诱变(如亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等)、生物诱变(如病毒或细菌介导的诱变)、基因编辑。
在另一优选例中，所述的方法包括将以下步骤：
(1)在植物细胞、植物组织、植物部分中引入含有基因编辑工具的表达载体。
(2)使基因编辑工具作用于其内源性HPPD编码序列，并使其在相应于SEQ NO：1的20位点发生突变。
(3)筛选突变的植物细胞、植物组织、植物部分
(4)分离所述的基因编辑工具。
在另一优选例中，所述的基因编辑工具包括CRISPR、TALEN和ZFN。
本发明另一方面，提供一种试剂，所述试剂可用于提高植物细胞、植物组织或植物的除草剂抗性或耐受性，所述的试剂含有本发明所述的突变多肽或编码突变多肽的核苷酸。
本发明另一方面，提供了所述突变多肽、所述多核苷酸、所述融合蛋白、所述核酸构建体或所述载体在培育(制备)对HPPD抑制性除草剂具有抗性或耐受性的植物、或制备用于培育对HPPD抑制性除草剂具有抗性或耐受性的植物的试剂或试剂盒中的用途；
本发明另一方面，提供一种鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，包括：(i)提供转化的植物细胞、植物组织，植物或其部分，其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分包含所示的多核苷酸或其变体或衍生物，其中多核苷酸编码作为选择标记使用的突变多肽，并且其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其部份可以包含另一种分离的多核苷酸部份包含；(ii)使转化的植物细胞、植物组织、植物或其部份与至少一种HPPD抑制性除草剂接触；(iii)确定植物细胞、植物组织、植物或其部分是否受抑制性除草剂影响；和(iv)鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分。
本发明另一方面提供一种在植物栽培地点控制不想要植物有效量的方法，所述方法包括：
(1)在所述的栽培地点提供包含所述的突变多肽或所述的多核苷酸或所述的核酸构建体或所述载体的植物；
(2)，将植物进行栽培，在所述的栽培地点施用有效量的HPPD抑制性除草剂。
附图说明
图1.Crispr-ABE和Crispr-CBE编辑工具结构图。
图2.转基因愈伤组织在含有0.03mg/L喹草酮的分化培养基的生长情况。
图3.分化幼苗在含有0.03mg/L喹草酮的生根培养基中的生长情况。
图4.编辑幼苗的基因测序图谱(C59->A)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，均包括在本发明范围中，限于篇幅，在此不再一一累述。
发明详述
除非本申请定义，本发明中所使用的科学术语或专业名词具有本领域技术人员所理解的含义，当本领域技术人员理解的含义与本申请所定义的含义出现矛盾时，以本申请所定义的含义为准。
如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“L87I”表示第87位的氨基酸L突变为I，以此类推。对于同一位点的多种突变类型，各类型之间以“/”隔开，例如P336D/L表示相对于SEQ ID NO.1的氨基酸序列而言，第336位的脯氨酸被天冬氨酸或亮氨酸取代。对于双重或多重突变，各突变之间以“/”隔开，例如，A347V/E353K表示相对于SEQ ID NO.1的氨基酸序列而言，第347位的丙氨酸被缬氨酸取代，第353位的谷氨酸被赖氨酸取代，以及第370位的天冬氨酸被天冬酰胺取代，全部三个突变均存在于所述具体的突变型HPPD蛋白内。
如本文所用，术语“HPPD”是指对羟苯基丙酮酸双氧化酶(4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase，HPPD，EC 1.13.11.27)，其存在于各种生物体中，是催化酪氨酸的降解产物-对羟苯基丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvate，HPP)加氧生成尿黑酸(homogentisate，HGA)反应的关键酶。HPPD的抑制会导致植物细胞内的光合作用解偶联、辅助捕光色素缺乏，同时由于缺乏通常由类胡萝卜素提供的光保护作用，活性氧中间体和光氧化导致叶绿素破坏，结果造成植物光合作用组织产生白化症状，生长受到抑制，直至死亡。HPPD抑制类除草剂已证实是非常有效的选择性除草剂，具有广谱的除草活性，既可在芽前也可以在芽后使用，具有活性高、残留低、对哺乳动物安全和环境友好等特点。
如本文所用，术语“HPPD抑制剂”、“HPPD除草剂”“HPPD抑制性除草剂”、“HPPD抑制类除草剂”可互换使用，是指本身有除草活性的物质或者与能改变其效果的其他除草剂和/或添加剂合用的物质，其通过抑制HPPD而起作用，表现为抑制植物生长甚至使植物死亡的制剂。本身能够通过抑制HPPD而起除草作用的物质在本领域中是熟知的，包括许多类型，1)三酮类，例如，磺草酮(Sulcotrione，CAS号：99105-77-8)；硝磺草酮(Mesotrione，CAS号：104206-82-8)；氟吡草酮(bicyclopyrone，CAS号：352010-68-5)；环磺酮(tembotrione，CAS号：335104-84-2)；呋喃磺草酮(tefuryltrione，CAS号：473278-76-1)；双环磺草酮(Benzobicyclon，CAS号：156963-66-5)；2)二酮腈类，例如，2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)丙-1,3-二酮(CAS号：143701-75-1)；2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-3,4-二氯苯基)丙-1,3-二酮(CAS号：212829-55-5)；2-氰基-1-[4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙-1,3-二酮(CAS号：143659-52-3)；3)异噁唑类，例如，异噁氟草(isoxaflutole，又称异噁唑草酮，CAS号：141112-29-0)；异噁氯草酮(isoxachlortole，CAS号：141112-06-3)；异恶草酮(clomazone，CAS号：81777-89-1)；4)吡唑类，例如，苯唑草酮(topramezone，CAS号：210631-68-8)；磺酰草吡唑(pyrasulfotole，CAS号：365400-11-9)；苄草唑(pyrazoxyfen，CAS号：71561-11-0)；吡唑特(pyrazolate，CAS号：58011-68-0)；吡草酮(benzofenap，CAS号：82692-44-2)；双唑草酮(CAS号：1622908-18-2)；Tolpyralate(CAS号：1101132-67-5)；苯唑氟草酮(CAS号：1992017-55-6)；环吡氟草酮(CAS号：1855929-45-1)；三唑磺草酮(CAS号：1911613-97-2)；5)二苯酮类；6)喹唑啉二酮类，是指含有喹唑啉二酮母核结构的HPPD抑制剂类化合物，如公开号CN110669016A、CN104557739A、WO2019196904A1等专利中公开的化合物，如喹草酮(CAS号：1639426-14-4)、甲基喹草酮(CAS号)、6-(2-羟基-6-氧化环己1-烯-1)。7)其他类：lancotrione(CAS号：1486617-21-3)；fenquinotrione(CAS号：1342891-70-6)。优选地，所述除草剂是喹唑啉二酮类；优选地，所述除草剂是喹草酮、甲基喹草酮。所述的除草剂可以综合考虑所适用作物或杂草的类型，在于出苗前、出苗后、种植前和种植时控制不想要植物(如杂草)。
术语“有效量”或“有效浓度”分别意指这样的量或浓度，所述量或浓度足够杀死相似的亲本(或野生型)植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞或抑制其生长，但是所述量不杀死本发明的抗除草剂植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞或不严重抑制其生长。一般地，除草剂的有效量是农业生产系统中例行用来杀死目的杂草的量。这种量是本领域普通技术人员已知的。本发明所述的除草剂是在任何生长阶段或在种植或出苗之前直接施加至植物或施加至植物的地点时，它们显示除草活性。观察到的效果取决于待控制的植物物种、植物的生长阶段、稀释物的施加参数和喷雾液滴大小、固态组分的粒度、使用时的环境条件、所用的具体化合物、使用的具体辅助剂和载体、土壤类型等，以及施加的化学品的量。如本领域已知，可以调节这些因素和其他因素以促进非选择性或选择性除草作用。
术语“亲本核苷酸或多肽”指的是可以在自然界中被发现存在的核酸分子或多肽(蛋白质)，其包括未经人工改造的野生型核酸分子或蛋白质(多肽)，也可以包括经过人工改造但不含有本发明内容的核酸分子或蛋白质(多肽)。其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述“亲本植物”即含有亲本核苷酸或多肽的植物。所述“亲本核苷酸或多肽”可以根据本领域技术人员所熟知的技术从亲本植物中进行提取，亦可通过化学合成的方法获得。所述亲本HPPD多肽的氨基酸序列，例如SEQ ID No.1所示。
本发明所述的“耐受性”或“抗性”是指HPPD蛋白或含有蛋白的细胞、组织或植物体，在保持酶活性或生存力或植物生长情况下，所能承受除草剂的能力，一般可以用除草剂的使用量或使用浓度等参数进行表征。进一步的，本发明中“对HPPD抑制性除草剂的耐受性增强”或“对HPPD抑制性除草剂的抗性增强”的HPPD酶是指这样的HPPD酶，与亲本HPPD酶在同等条件保持其将对羟基苯丙酮酸催化转化为尿黑酸的活性下，其最大耐受浓度，表现出比亲本HPPD酶高至少1.5-10倍。“对HPPD抑制性除草剂的耐受性增强”或“对HPPD抑制性除草剂的抗性增强”的植物是指这样的植物，其对所述HPPD抑制性除草剂的耐受性或抗性与含有亲本HPPD基因的植物相比提高，其耐受浓度相比亲本植物的耐受浓度高至少2倍-16倍。本发明所述的提高“耐受性”或“抗性”的最佳程度为在同等除草剂使用量或浓度下，可以减少或抑制或杀死不想要植物但不影响含有本发明所述突变蛋白的植物的生长或生存能力。
本发明所述“赋予植物对HPPD抑制性除草剂产生抗性或耐受性”是包括针对亲本植物中没有对HPPD抑制性除草剂的抗性或耐受性，或亲本植物对HPPD抑制性除草剂有一定或较低的耐受性(在同等除草剂的浓度下)，通过向植物中引入本发明所述的突变多肽或编码突变多肽的核苷酸，从而给予没有抗性的植物一定程度的除草剂抗性或耐受性，提高具有一定或较低耐受性的植物对除草剂的耐受性。
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与亲本蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加。如本文所用，术语“除草剂抗性多肽”、“突变的HPPD多肽”、“突变型HPPD多肽”、“突变HPPD蛋白”、“突变HPPD酶”、“突变蛋白”、“突变多肽”、“本发明多肽”等可互换使用。优选地，所述突变蛋白在对应于SEQ ID No.1所示序列的第20位含有与HPPD抑制性除草剂抗性相关的核心氨基酸突变。
术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。除甘氨酸外均为L－α－氨基酸(其中脯氨酸是一种L－α－亚氨基酸)，其结构通式为(R基为可变基团)。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。
术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482，Pearson&Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444，Thompson et al.,1994,Nucleic AcidsRes 22:467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA，Genetics ComputerG roup)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(National Centerfo rBiotechnology Informationwww.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则(Altschulet al.,1990,Mol.Biol.215:403-10)，使用默认参数确定。
如本文中所使用的，术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调节元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。
在本发明中，“宿主生物”应理解为可以引入突变型HPPD蛋白编码核酸的任何单细胞或多细胞生物，包括例如细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(例如酿酒酵母)、霉菌(例如曲霉菌)，植物细胞和植物等。
在本发明中，“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，例如：(1)粮食作物：稻属(Oryza spp.)，例如稻(Oryza sativa)、阔叶稻(Oryza latifolia)、水稻(Oryzasativa)、光稃稻(Oryza glaberrima)；小麦属(Triticumspp.)，例如普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(T.Turgidumssp.durum)；大麦属(Hordeum spp.)，例如大麦(Hordeum vulgare)、亚利桑那大麦(Hordeum arizonicum)；黑麦(Secale cereale)；燕麦属(Avena spp.)，例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avenabyzantina)、Avena fatuava r.sa tiva、杂种燕麦(Avena hy brida)；稗属(Echinochloas pp.)，例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、高粱(两色高粱(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、黑小麦、玉蜀黍或玉米、粟、稻(rice)、谷子、糜子、两色蜀黍(Sorghumbicolor)、黍子、荞麦属(Fagopyrum spp.)、黍(Panicum miliaceum)、小米(Setariaitalica)、沼生菰(Zizaniapalustris)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、稷(Panicummiliaceum)、龙爪稷(Eleusine coracana)；(2)豆类作物：大豆属(Glycine spp.)，例如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)、Soja max)、野豌豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vigna spp.)、豌豆属(Pisum spp.)、芸豆(field bean)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、蚕豆属(Vicia)、酸豆(Tamarindus indica)、兵豆(Lens culinaris)、山黧豆属(Lathyrusspp.)、扁豆属(Lablab)、蚕豆、绿豆、红豆、鹰嘴豆；(3)油料作物：花生(Arachishypogaea)、落花生属(Arachis spp)、胡麻属(Sesamum spp.)、向日葵属(Helianthusspp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Eiaeisguineensis)、美洲油棕(Elaeisoleifera))、大豆(soybean)、油菜(Brassicanapus)、芸苔、芝麻、芥菜(Brassicajuncea)、油菜籽油菜(oilseedrape)、油茶、油棕、油橄榄、蓖麻、欧洲油菜(Brassica napusL.)、卡诺拉油菜(canola)；(4)纤维作物：剑麻(Agave sisalana)、棉属(棉花、海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypiumhirsutum))、红麻、剑麻、蕉麻、亚麻(Linum usitatissimum)、黄麻、苎麻、大麻(Cannabissativa)、火麻；(5)水果类作物：枣属(Ziziphus spp.)、香瓜属(Cucumis spp.)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、葡萄属(Vitis spp.)、越桔属(Vaccinium spp.)、西洋梨(Pyruscommunis)、李属(Prunus spp.)、番石榴属(Psidium spp.)、石榴(Punicagranatum)、苹果属(Malusspp.)、西瓜(Citrulluslanatus)、柑桔属(Citrus spp.)、无花果(Ficuscarica)、金桔属(Fortunella spp.)、草莓属(Fragaria spp.)、山楂属(Crataegus spp.)、柿树属(Diospyros spp.)、红仔果(Eugeniaunifora)、枇杷(Eriobotrya japonica)、龙眼(Dimocarpus longan)、番木瓜(Carica papaya)、椰子属(Cocos spp.)、阳桃(Averrhoacarambola)、狲猴桃属(Actinidia spp.)、扁桃(Prunus amygdalus)、芭蕉属(Musa spp.)(香蕉)、鳄梨属(Persea spp.)(鳄梨(Persea americana))、番石榴(Psidiumguajava)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(油橄榄(Oleaeuropaea))、番木瓜(Caricapapaya)、椰子(Cocos nucifera)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、人心果(Manilkara zapota)、菠萝(Ananascomosus)、番荔枝属(Annona spp.)、柑桔树(柑桔属物种(Citrus spp.))、波罗蜜属(Artocarpus spp.)、荔枝(Litchi chinensis)、茶藨子属(Ribes spp.)、悬钩子属(Rubus spp.)、梨、桃、杏、梅、杨梅、柠檬、金橘、榴莲、橙、草莓(strawbe rry)、蓝莓、哈密瓜、甜瓜、椰枣、胡桃树、樱桃树；(6)根茎类作物：木薯属(Manihot spp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、芋(Colocasiaesculenta)、榨菜、洋葱、荸荠、油莎草、山药；(7)蔬菜类作物：菠菜属(Spinaciaspp.)、菜豆属(Phaseolus spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、苦瓜属(Momordica spp)、欧芹(Petroselinum crispum)、辣椒属(Capsicum spp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或蕃茄(Solanum lycopersicum))、蕃茄属(Lycopersicon spp.)(例如西红柿(Lycopersicon esculentum)、蕃茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形蕃茄(Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属(Macrotyloma spp.)、无头甘蓝(kale)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、小扁豆(lentil)、秋葵(okra)、洋葱(onion)、马铃薯(potato)、洋蓟(artichoke)、芦笋(asparagus)、西兰花(broccoli)、球芽甘蓝(Brussels sprouts)、卷心菜(cabbage)、胡萝卜(carrot)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、羽衣甘蓝(collardgreens)、西葫芦(squash)、冬瓜(Benincasa hispida)、石刁柏(Asparagus officinalis)、旱芹(Apium gra veolens)、苋属(Ama ranthus spp.)、葱属(Allium spp.)、秋葵属(Abelmoschus spp.)、苦苣(Cichorium endivia)、南瓜属(Cucurbita spp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、埃塞俄比亚芥(B.carinata)、萝卜(Rapbanus sativus)、芸苔属(Brassica)物种(例如例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁亚种(Brassica rapa ssp.)、卡诺拉油菜(canola)、油籽油菜(oilseed rape)、芜菁油菜(turnip rape)、芥菜、甘蓝、黑芥、油菜籽油菜)、孢子甘蓝、茄科植物(茄子)、甜椒、黄瓜、丝瓜、白菜、油菜、甘蓝、葫芦、韭菜、莲、藕、生菜；(8)花卉作物：小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolummajus)、美人蕉(Canna indica)、仙人掌属(Opuntia spp.)、万寿菊属(Tagetes spp.)、兰花、文殊兰、君子兰、朱顶红、玫瑰、月季、茉莉花、郁金香、樱花、牵牛花、金盏花、荷花、雏菊、康乃馨、矮牵牛花、郁金香、百合、梅花、水仙、迎春、报春、瑞香、山茶、白玉兰、紫玉兰、琼花、君子兰、海棠、牡丹、芍药、丁香、杜鹃、西洋杜鹃、含笑、紫荆、棣棠、锦带花、连翘、云南黄馨、金雀花、仙客来、蝴蝶兰、石斛、风信子、鸢尾、马蹄莲、金盏菊、百枝莲、四季海棠、吊钟海棠、竹节海棠、天竺葵；(9)药用作物：红花(Carthamus tinctorius)、薄荷属(Mentha spp.)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、番红花(Crocus sativus)、枸杞、玉竹、黄精、知母、麦冬、川贝、郁金、砂仁、何首乌、大黄、甘草、黄芪、人参、三七、五加、当归、川芎、北柴胡、曼佗罗、洋金花、薄荷、益母草、藿香、黄芩、夏枯草、除虫菊、银杏、金鸡纳树、天然橡胶树、苜蓿、胡椒；(10)原料作物：橡胶、蓖麻(Ricinuscommunis)、油桐、桑、忽布、桦、桤木、漆树；(11)牧草作物：冰草属(Agropyron spp.)、车轴草属(Trifolium spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、狼尾草属(Pennisetum sp.)、虉草(Phalaris arundinacea)、柳枝稷(Panicum virgatum)、草原草(prairiegrasses)、印度草(Indiangrass)、大须芒草(Big bluestem grass)、梯牧草(Phleum pratense)、草皮草(turf)、莎草科(高山嵩草、脚苔草(Carex pediformis)、低苔草)、苜蓿、梯牧草、紫花苜蓿、草木犀、紫云英、柽麻、田菁、红萍、水葫芦、紫穗槐、羽扇豆、三叶草、沙打旺、水浮莲、水花生、黑麦草；(12)糖料作物：甘蔗(甘蔗属物种(Saccharumspp.))、甜菜(Beta vulgaris)；(13)饮料作物：大叶茶(Camellia sinensis)、茶(CamelliaSinensis)、茶树(tea)、咖啡(咖啡属物种(Coffea spp.))、可可树(Theobroma cacao)、蛇麻花(啤酒花)；(14)草坪植物：固沙草(Ammophila arenaria)、早熟禾属(Poa spp.)(草地早熟禾(Poa pratensis)(蓝草))、剪股颖属物种(Agrostis spp.)(剪股颖、匍匐剪股颖(Agrostis palustris))、黑麦草属物种(Lolium spp.)(黑麦草)、羊茅属物种(Festucaspp.)(羊茅)、结缕草属物种(Zoysiaspp.)(结缕草(Zoysiajaponica))、狗牙根属物种(Cynodon spp.)(百慕大草、狗牙根)、侧钝叶草(Stenotaphrum secunda tum)(圣奥古斯丁草)、雀稗属物种(Paspalum spp.)(巴哈草)、假俭草(Eremochloa ophiuroides)(百足草)、地毯草属物种(Axonopus spp.)(地毯草)、指形垂穗草(Bouteloua dactyloides)(野牛草)、垂穗草属变种物种(Boutelouavar.spp.)(格兰马草)、马唐(Digitariasanguinalis)、香附子(Cyperusrotundus)、短叶水蜈蚣(Kyllingabrevifolia)、阿穆尔莎草(Cyperusamuricus)、加拿大飞蓬(Erigeroncanadensis)、天胡荽(Hydrocotylesibthorpioides)、鸡眼草(Kummerowiastriata)、地锦(Euphorbiahumifusa)、耕地堇菜(Violaarvensis)、白颖苔草、异穗苔草、草皮草(turf)；(15)树木作物：松属(Pinus spp.)、柳属(Salix sp.)、槭树属(Acer spp.)、木槿属(Hibiscus spp.)、桉属(Eucalyptus sp.)、银杏(Ginkgo biloba)、箣竹属(Bambusa sp.)、杨属(Populus spp.)、牧豆树属(Prosopis spp.)、栎属(Quercusspp.)、刺葵属(Phoenix spp.)、山毛榉属(Fagus spp.)、吉贝(Ceibapentandra)、樟属(Cinnamomum spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、南方芦苇(Phragmitesaustralis)、酸浆属(Physalis spp.)、山蚂蝗属(Desmodium spp.)、杨、常春藤、白杨、珊瑚树、银杏、栎类、臭椿、木荷、冬青、悬铃木、女贞、大叶黄扬、落叶松、黑荆树、马尾松、思茅松，云南松、南亚松、油松、红松、黑胡桃、柠檬、悬铃木、蒲桃、珙桐、木棉、爪哇木棉、洋紫荆、羊蹄甲、雨树、合欢、龙牙花、刺桐、广玉兰、苏铁、紫薇、针叶树、乔木、灌木；(16)坚果作物：巴西栗(Bertholletia excelsea)、栗属(Castanea spp.)、榛属(Corylus spp.)、山核桃属(Caryaspp.)、核桃属(Juglansspp.)、阿月浑子(Pistaciavera)、腰果(Anacardium)、occidentale)、澳洲坚果(全缘叶澳洲坚果(Macadamia integrifolia))、碧根果、夏威夷果、开心果、巴旦木以及产生坚果的植物；(17)其他：拟南芥、臂形草、蒺藜草、大狗尾草、牛筋草、Cadaba farinosa、藻类(algae)、Carex elata、观赏植物、大果假虎刺(Carissamacrocarpa)、菜蓟属(Cynara spp.)、野胡萝卜(Daucus carota)、薯蓣属(Dioscoreaspp.)、蔗茅属(Erianthus sp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、萱草(Hemerocallisfulva)、百脉根属(Lotus spp.)、Luzula sylvatica、紫苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属(Melilotus spp.)、黑桑(Morus nigra)、烟草属(Nicotiana spp.)、木犀榄属(Olea spp.)、鸟足豆属(Ornithopus spp.)、欧防风(Pastinaca sativa)、接骨木属(Sambucusspp.)、白芥属(Sina pis sp.)、蒲桃属(Syzygium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、Triticosecale rimpaui、香堇(Viola odorata)等。
术语“不想要的植物”理解为影响所需植物(如农作物)正常生长的、没有实用或应用价值的植物，可以包括杂草，例如双子叶和单子叶杂草。双子叶杂草包括，但不限于以下属的杂草：白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、拉拉藤Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛膝菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、三棘果属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛莨属(Ranunculus)和蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括，但不限于以下属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、穇属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高粱属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)和阿披拉草属(Apera)。所述的不想要植物还可以包括与所要栽培植物不同的其他植物，例如在水稻栽培地自然生长的部分或少量大豆等作物。
在本发明中，术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。
在本发明中，“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。
在本发明中，术语“基因编辑”技术包括CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。CRISPR技术中所指基因编辑工具包括guideRNA、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b等)。TALEN技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个TAL效应子DNA结合结构域和一个DNA切割结构域。ZFN技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个锌指DNA结合结构域与一个DNA切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。
在本发明中，术语“最大耐受浓度”是指在施用除草剂的情况下，对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)仍能基本保持其催化活性和/或不影响植物正常生长时所能承受的除草剂浓度，所述催化活性即HPPD将对羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸的活性。
本发明突变蛋白及其编码核酸
本发明公开了一种突变型HPPD蛋白或其生物活性片段，其与亲本HPPD蛋白相比，对HPPD抑制性除草剂的抗性或耐受性有所提高。特别地，本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白相比亲本HPPD蛋白，在对应于SEQ ID No.1所示序列中的第20位氨基酸发生突变。进一步的，所述的突变型HPPD多肽，还可以在对应于SEQ ID No.1所示序列中的第152、170、176、211、347、353、339和340位中的一个或多个位置处发生突变。优选地，所述的突变类型包括D152N、D170N、G176C、P211L、P336L/D、Y339H、Y340H、A347V和E353K。更进一步的本发明突变蛋白还可以包括现有技术已经公开的与SEQ ID No.1相应的其他HPPD抗性位点以及突变方式，如WO2019233349A1文本中所记载的突变位点及突变方式，现有技术所公开的与HPPD抗性相关的内容均引用在本发明中。
优选地，所述突变型HPPD蛋白的氨基酸序列进一步与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性。
本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO.1进行比对而确定的，譬如用Smith-Waterman运算法则或用CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Rapid similarity searchesofnucleic acid and protein data banks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730中所述的方法进行计算。在ClustalW2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA端隙＝-1；蛋白质/DNAGAPDIST＝4。优选采用AlignX程序(vectorNTI组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10og缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO.1进行比来确定本发明所述蛋白质内特定氨基酸的位置。例如通过序列比对，确定在玉米作物中(序列登录号NP_001105782.2)其相应于SEQ ID NO.1序列的20位为第19位，以此类推，大豆作物中(序列登录号NP_001235148.2)相应位点为第58位，在高粱(XP_002453359.1)作物中相应位点为第20位。
应理解，本发明突变蛋白中的氨基酸编号基于SEQ ID NO.1作出，当某一具体突变蛋白与SEQ ID NO.1所示序列的同源性达到80％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于SEQ ID NO.1的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的N末端或C末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似的除草剂耐受活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。
在本发明中，亲本对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白可以来源于任何植物，特别是前述单子叶或双子叶植物。现有技术文献中已经公开了一些来源的亲本(如野生型)对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白序列以及编码序列，这些现有技术文献在此引入本文作为参考。
优选地，本发明的亲本对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白来源于稻属，特别是水稻。更优选地，所述亲本对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
本发明还包括所述突变多肽(蛋白)还包括其活性片段、变体、衍生物和类似物包括以下所述的蛋白的任何取代、突变或修饰所产生的物质。
例如，本领域技术人员还清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维构型产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不损害蛋白质的生物活性，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的突变型HPPD蛋白除了包含上述突变之外，还可以在氨基酸序列中包含一个或多个其他突变例如保守性取代。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的突变型HPPD蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。
如本领域中所熟知的，可以从蛋白质的N和/或C末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，在另一方面，本发明还涉及从突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白的N和/或C末端缺失了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的片段(比如含有本发明突变位点的氨基酸片段)，它们也在本发明的范围内，被称为生物活性片段。在本发明中，“生物活性片段”是指本发明的突变型HPPD蛋白的一部分，其保留了本发明的突变型HPPD蛋白的生物学活性、同时对HPPD抑制剂的耐受性或抗性相比于不具有所述突变的HPPD片段有所提高。例如，突变型HPPD蛋白的生物学活性片段可以是在所述蛋白质的N和/或C末端缺失了一个或多个(例如1－50个、1－25个、1－10个或1－5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸残基的部分，但其仍然保留了全长蛋白的生物学活性。
此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。
本发明还提供了一种融合蛋白，其中包含本发明的突变型HPPD蛋白或其生物活性片段，以及与之融合的其它组分。在一个优选的实施方案中，所述其它组分是质体引导肽，例如引导到叶绿体内的肽，其将突变的HPPD蛋白靶向叶绿体。在另一个实施方案中，所述其它组分是标签肽，例如6×His。在又一个实施方案中，所述其它组分是有助于提高所述突变型HPPD蛋白的溶解性的肽，例如NusA肽。
本发明还提供编码所述突变型HPPD多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。优选的所述突变型HPPD多肽如SEQ NO.2所示。本领域技术人员十分清楚，由于遗传密码的简并性，有多种不同的核酸序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同蛋白质的其他核酸序列在本领域普通技术人员的能力范围内，因此本发明涵盖因遗传密码子的简并性而编码相同氨基酸序列的核酸序列。例如，为了在目标宿主生物例如植物中实现异源基因的高表达，可以对所述基因采用宿主生物偏好的密码子进行优化，以使其更好地表达。
本发明还包括严格条件下与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％匹配度的多核苷酸。优选地，所述严谨条件可以指6M尿素、0.4％SDS、0.5×SSC的条件或与其同等的杂交条件，也可以指严谨性更高的条件，例如6M尿素、0.4％SDS、0.1×SSC或与其同等的杂交条件，或杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等。在各种条件中，温度可约为40℃以上，如需要严谨性更高的条件时，温度例如可约为50℃，进一步可约为65℃。
本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。所获得的核苷酸序列可将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到大批量有关序列。本发明突变位点亦可通过人工合成引入。
核酸构建物、载体
本发明还提供了一种核酸构建体，其中包含编码本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白的核酸序列以及与之可操作连接的一个或多个调控元件。术语“调控元件”在本发明中指的是能够调节与之可操作连接的核酸的转录和/或翻译的核酸序列。所述的调控元件包括启动子劽、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因等。
本发明所述的启动子可以是在选定宿主细胞内显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可能获自与宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因。作为在植物细胞或植物中表达的启动子，可使用对羟苯基丙酮酸双氧化酶天然的启动子，或者在植物中具有活性的异源启动子。所述启动子可以是组成型表达的，或者可以是诱导型表达的。启动子的实例包括例如组蛋白启动子，水稻肌动蛋白启动子，植物病毒启动子例如花椰菜花叶病毒启动子等。
本发明还提供了一种表达载体，其中包含有编码本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白的核酸序列以及与之可操作连接的表达调控元件。表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。载体可能是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，它的复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。或者，所述载体可能是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。此外，可使用单个载体或质粒或者一起包含待引入宿主细胞基因组之总DNA的两个或更多个载体或质粒，或者转座子。或者，所述载体也可以是对宿主细胞内源性的HPPD基因进行基因编辑的载体。
载体可以是例如质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的，在本领域中众多描述。优选地，本发明中的表达载体是质粒。表达载体可包含启动子、翻译起始的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录终止子、增强子等。表达载体中也可以含有一个或多个可选择标记基因以便用于选择包含载体的宿主细胞。这种可选择的标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因，或赋予新霉素耐受性的基因，赋予对四环素或氨苄青霉素耐受性的基因等。
本发明的载体可以包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。对于整合进入宿主细胞基因组的方面，所述载体可依靠编码多肽的多核苷酸序列或适于通过同源或非同源重组整合入基因组的载体的任何其它元件。或者，载体可包含用于指导在染色体的准确位置通过同源重组整合入宿主细胞基因组的附加的核苷酸序列。为了提高在准确位置处整合的可能性，整合元件应优选包含足够数目的核酸，譬如100至10,000个碱基对，优选400至10,000个碱基对，更优选800至10,000个碱基对，它们与相应的靶序列具有高度的同一性以提高同源重组的概率。整合元件可能是与宿主细胞基因组内靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可能是非编码的或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可能通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组内。对于自主复制而言，载体可能进一步包含能使载体在所述宿主细胞内自主复制的复制起点。复制起点可能是在细胞内发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语"复制起点"或"质粒复制子"在此定义为能使质粒或载体在体内进行复制的核苷酸序列。
可将一拷贝以上的本发明之多核苷酸插入宿主细胞中以提高基因产物的产量。可通过将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组中或者通过将可扩增的可选择标记基因与所述多核苷酸包含在一起来达到多核苷酸拷贝数目的增加，在后一情形下，包含扩增拷贝的选择标记基因以及由此而来的附加拷贝的多核苷酸的细胞可通过在适当的可选择制剂存在的条件下人工培养所述细胞进行选择。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含除草剂抗性多肽编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
本发明中适用的载体包括可从商业渠道获得的质粒，例如但不限于：pBR322(ATCC37017)，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pD10，psiX174pBluescript IIKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pKK232-8，pCM7，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，和pSVL(Pharmacia)等。
本发明还提供了包含本发明核酸序列、核酸构建体或表达载体的宿主细胞。将包含编码本发明的载体引入宿主细胞中使得载体作为染色体整合体的一部分存在或如早先所述作为自我复制的染色体外载体存在，或者载体可以对宿主细胞内源性的HPPD基因进行基因编辑。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核生物细胞和真核生物细胞。
本发明的核酸序列、核酸构建体或表达载体可以通过多种技术导入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-质粒介导的基因传递，以及钙磷酸盐转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等。
本发明还涉及产生突变型HPPD蛋白或其生物活性片段的方法。包括：(a)在有助于所述突变型HPPD蛋白或其生物活性片段或融合蛋白生产的条件下培养上述宿主细胞；和(b)分离所述突变型HPPD蛋白或其生物活性片段或融合蛋白。
在本发明的生产方法中，用本领域众所周知的方法将所述细胞培养于适于所述多肽产生的营养培养基上。若所述多肽被分泌入营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。若所述多肽不分泌到培养基中，则可从细胞裂解物中回收它。
可用本领域已知特异于所述多肽的方法检测该多肽。这些检测方法可包括使用特异抗体、形成酶产物或酶底物的消失。
产生的多肽可用本领域已知的方法回收。例如，可以通过离心收获细胞，用物理的或化学的方法使之破碎，并保留得到的粗提取液以进一步纯化。可以用任何方便的方法裂解表达本发明的突变型HPPD蛋白或其生物活性片段或融合蛋白的转化宿主细胞，包括冻融循环、超声波、机械破碎或使用细胞溶解剂。这些方法是本领域技术人员熟知的。可以从转化宿主细胞的培养物中回收和纯化本发明的突变型HPPD蛋白或其生物活性片段，采用的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲合层析、羟磷灰石层析和植物血凝素层析等等。
本发明还涉及一种制备对HPPD抑制型除草剂具有耐受性或抗性的宿主生物特别是植物细胞、植物组织、植物部分或植物的方法，其中包括用包含本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白或其生物活性片段的编码核酸序列、包含所述核酸序列的核酸构建体或表达载体对所述宿主生物进行转化，合适的载体和选择标记是本领域技术人员所熟知的。宿主细胞例如植物细胞的转化方法是现有技术中已知的，包括例如原生质体转化、融合、注射、电穿孔、PEG介导的转化、离子轰击、病毒转化、农杆菌介导的转化、电穿孔或轰击等。现有技术中描述了一系列这样的转化方法，例如EP1186666中描述了大豆转化的技术，WO 92/09696中描述了单子叶植物特别是水稻转化的合适技术等。还可以有利地用根癌农杆菌或发根农杆菌培养植物外植体，以将DNA转移进植物细胞。然后可以在合适的培养基中从感染的植物材料部分(如叶碎片、茎节段、根以及原生质体或悬浮培养的细胞)再生完整植物，所述培养基可以含有用于选择的抗生素或杀虫剂。转化细胞以通常的方式在植物中生长，它们可以形成生殖细胞并将转化的性状传递到子代植物。这样的植物能以正常方式培养并与具有相同转化遗传因子或其他遗传因子的植物杂交。得到的杂合个体具有相应的表型特性。
本发明还提供了一种提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物的HPPD抑制性除草剂耐受性或抗性的方法，其中包括用包含本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白的编码核酸序列的核酸分子转化所述植物或其部分，并使之表达。所述核酸分子可以作为染色体外实体存在而进行表达，或者可以整合到植物细胞的基因组中实现表达，特别是通过同源重组整合到植物细胞的内源基因位置处实现表达。
发明还提供了一种提高植物或其部分的HPPD抑制性除草剂耐受性或抗性的方法，其中包括将表达本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白的植物与另一植物杂交，以及筛选具有提高的HPPD抑制性除草剂抗性或耐受性的植物或其部分。
本发明还提供了一种提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物中的HPPD抑制性除草剂耐受性或抗性的方法，其中包括对所述植物细胞、植物组织、植物部分或植物的内源性HPPD蛋白进行基因编辑，以实现在其中表达本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白。
本发明进一步涉及通过上述方法获得的植物细胞、植物组织、植物部分和植物，及其后代。优选地，可以将转化了本发明多核苷酸的植物细胞、植物组织或植物部分再生为整个植株。本发明包括细胞培养物，包括组织细胞培养物、液体培养物和固体平板培养物。由本发明植物所产生和/或用于再生本发明植物的种子也包括在本发明范围内。其他植物组织和部分也包括在本发明中。本发明同样包括产生含有本发明核酸分子的植物或细胞的方法。产生这类植物的一种优选方法为通过种植本发明的种子。以这种方式转化的植物可以获得对多种具有不同作用模式的除草剂的抗性。
本发明还提供了一种在植物栽培地控制不想要植物有效量的方法，其中包括对包含本发明的植物或种子的栽培地施用控制不想要植物有效量的一种或多种HPPD抑制性除草剂。
在本发明中，术语“栽培地”包括栽培本发明植物的场地例如土壤，也包括例如植物种子、植物苗以及长成的植物。术语“控制不想要植物有效量”指的是除草剂的量足以影响不想要植物，如杂草，的生长或发育，例如阻止或抑制不想要植物的生长或发育，或者杀灭所述不想要植物。有利地，所述控制不想要植物有效量不会显著影响本发明植物种子、植物苗或植物的生长和/或发育。本领域技术人员可以通过常规实验确定这样的控制不想要植物有效量。
本发明提供了一种通过使用突变型HPPD鉴定喹唑啉二酮类HPPD除草剂的使用方法，所述的突变型HPPD具有SEQ ID NO.2所示的多肽或活性片段。所述的方法包括以下步骤：提供一种突变型HPPD多肽，或表达突变型HPPD多肽的细胞或植物(测试组)；向突变型HPPD多肽，或表达突变型HPPD多肽的细胞或植物及亲本(如野生型)蛋白、细胞或植物的对照组施加所述测试化合物；测定测试组及对照组的活性或生长或生存力；选择与测试组相比引起对照组活性或生长或生存力减少的测试化合物。
本发明的主要优点：
1、本发明筛选出了一种对喹唑啉二酮类除草剂具有较高抗性的HPPD突变多肽。
2、含有本发明突变型HPPD多肽的植物相比亲本植物其对喹唑啉二酮类除草剂的耐受性提高了至少2-16倍。赋予植物对喹唑啉二酮类除草剂的耐受浓度至少0.01mg/L-至少10mg/L的耐受浓度。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实验例1基因编辑载体构建及抗除草剂突变位点的筛选
1.1载体库构建
(1)载体选择选择经过植物优化的编辑效率较高的Crispr-ABE和Crispr-CBE载体(见图1)，以NG作为识别位置的PAM结构域，在HPPD基因上饱和设计sgRNA(包括UTR和exon区域)。共设计sgRNA位点1007个，分别构建到Crispr-ABE和Crispr-CBE载体上。
(2)酶切载体100μL酶切体系：用ddH2O(补足至100μL)、Vector(4μg)、CutSmart(10μL)、BsaI-HF(4μL)混合，然后再快速离心一下即可。
反应条件：
(3)使用胶回收法，电泳：琼脂糖浓度：0.8％；电泳电压：80V；电泳时间：1.5h
切胶回收称重并标记，按0.1g胶重：100μL比例加入Binding Buffer。期间每一次上柱量为700μL，2000rcf，30s离心，弃废液，如此反复，最后一次溶胶液离心为10000rcf，1min，弃废液，加入300μL Binding Buffer，13000rcf，1min离心，弃废液。用已加入无水乙醇的SPW Wash Buffer洗3遍。晾干柱子，加入55℃预热的ddH2O 40μL，13000rcf，1min离心，再加一次ddH2O 40μL，13000rcf，1min离心。混匀洗脱液，测浓度。
(4)引物退火
将人工合成的DNA寡核苷酸双链退火，具体如下：
将每条DNA寡核苷酸用1×Taq buffer稀释到10μM，上下游引物各吸取5μL混合退火。退火后，放冰上或者-20℃保存。
(5)T4连接载体
使用单独连接的方法，5μL连接体系，根据引物对数配制连接Mix，分装后加入退火产物。T4 DNA连接酶体系25℃连接30min。
5μL连接体系：
反应条件：
(6)乙醇沉淀载体库
一个96孔板上所有连接产物(96个)吸取混合至一个1.5mL离心管(已灭菌)中。加入1倍体积(480μL)氯仿(即三氯乙烷)，上下充分颠倒混匀。4℃，13000rmp，10min离心。吸取上层(水层)移于新的1.5mL离心管中，加入2倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放30min及以上。4℃，13000rmp，15min，倒出乙醇，吸出剩余溶液。真空干燥，30℃，约15min。12000rmp，1min离心，加入20μL ddH2O充分溶解。
(7)转E.coli(电转/化转)
本方法使用电转，方法如下：
电极杯：ddH2O洗后，用75％乙醇浸泡20分钟，无水乙醇浸泡20分钟，吹干，冰上预冷；用1.5mL离心管分装LB，28℃预热；将感受态细胞在冰上溶化5min；取10μL连接产物加入100μL大肠杆菌电转感受态混匀。吸取混合液于电极杯中，混匀，电击；将预热的LB 700μL倒入电极杯内，将菌体冲洗到2ml管内。用75％乙醇浸泡将菌液在37℃下200rpm摇培1h；将菌液全部涂布于含有筛选抗性的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
(8)提取质粒
取10mL LB抗性培养液倒入菌板中，浸泡5min。用涂布器(已高压灭菌)将每个培养皿中全部菌落画圈状划下，使其溶于培养基中。轻轻晃动菌液，缓慢倾斜菌板，将菌液转移至50mL离心管中。再取5mL LB抗性培养液加入菌板，清洗一次，收集剩余菌液，将其移入放有对应的50mL离心管中。37℃200rpm培养2h。提取质粒，获得最终基因编辑载体库。
(9)转农杆菌(电转)
电极杯：ddH2O洗后，用75％乙醇浸泡20分钟，无水乙醇浸泡20分钟，通风橱内吹干，冰上预冷；用1.5mL离心管分装YEP，28℃预热；将感受态细胞在冰上溶化5min；吸取1μl质粒与感受态细胞混匀；吸取混合液于电极杯中，混匀，电击；将预热的LB 700μL倒入电极杯内，将菌体冲洗到2ml管内。洗净电极杯并用75％乙醇浸泡；将菌液在28℃下200rpm摇培1.5～2h；将菌液吸取500μL涂布于含有筛选抗性的YEP平板上，倒置培养2d。
取LB抗性培养液倒入菌板中，使培养液没过菌斑。用涂布器将每个培养皿中全部菌落画圈状划下，使其溶于培基中。轻轻晃动菌液，缓慢倾斜菌板，将菌液转移至已加入400mL的1L锥形瓶中，补足至500mL LB抗性培养液。28℃ 200rpm过夜培养。
1.2、遗传转化及基因编辑检测
(1)诱导水稻秀水134愈伤组织：剥取水稻种子，无菌水清洗种子，直至洗后的水变清澈，70％酒精消毒30秒，之后5％次氯酸钠置于水平摇床摇晃培养20分，次氯酸钠消毒后无菌水清洗5次，置于无菌吸水纸，风干种子表面水分，接种于诱导培养基上在28℃下培养愈伤。
(2)未转化愈伤对除草剂的适应浓度筛选：选取继代培养14天，直径为2-3mm的秀水134愈伤组织，将愈伤组织放入含有喹草酮的筛选培养基，不同浓度下愈伤生长状态良好。约14天后，将愈伤转移到含有喹草酮的分化培养基上，发现培养基中含有0.01mg/L的喹草酮时，可以使大部分的愈伤不能转化为绿点，0.03mg/L的喹草酮浓度时，几乎看不到绿点产生。将绿色芽点放入加入相同浓度除草剂的生根培养基中，0.03mg/L的喹草酮浓度得不到任何成苗植株。具体筛选浓度及结果参见如下表1.
表1未转化水稻愈伤组织对除草剂的适应浓度筛选
+加号越多，表示状态越好，三个为最大值。
(3)农杆菌侵染水稻愈伤：在每一批转化中，选取继代培养14天，直径为2-3mm的秀水134愈伤组织约2000个，将愈伤组织收集到三角瓶中；将已用侵染液重悬浮的农杆菌菌液倒入含有愈伤组织的三角瓶中，置于28℃、200转/分摇床中侵染20分；侵染完毕，倒掉菌液，将愈伤组织放置于无菌滤纸上风干20min左右，置于共同培养基平板上共同培养，平板上铺有一张AAM(添加乙酰丁香酮AS)液体培养基浸湿的无菌滤纸；侵染3天后，清洗去除农杆菌(先用无菌水洗5遍，再用500mg/L的头孢抗生素清洗20分钟)，置于40mg/L潮霉素筛选培养基上筛选培养。
(4)抗性愈伤的筛选、分化和生根：将共培养后的愈伤组织移至筛选培养基进行第一轮筛选(2周)；第一轮筛选完毕后将新长出的愈伤移至筛选培养基(含40mg/L潮霉素)进行第二轮筛选(2周)；筛选完成后，挑取生长状态良好的黄白色愈伤组织进行分化，分化培养基中添加0.03mg/L喹草酮和40mg/L潮霉素进行除草剂抗性筛选，3～4周后可以获得1cm左右的幼苗(见图2)；将分化出的幼苗移至生根培养基(添加有0.03mg/L喹草酮和20mg/L潮霉素)进行生根培养；将生根完成的幼苗进行炼苗处理后，移至装有土壤的花盆中置温室进行培养。
(5)检测编辑类型：选择生根培养基中长出的绿色幼苗的叶片(见图3)，以CTAB法提取基因组DNA。以引物HPPD-F:CGTCCGCAACCACTAGACTT(SEQ ID NO.:5)和HPPD-R：TTCTGCGCCTAATCGATGCT(SEQ ID NO.:6)。扩增产物以1％琼脂糖电泳检测后，进行sanger测序。
1.3实验结果
通过测序发现,在不同的绿色幼苗中分别发现以下突变：在SEQ ID NO.3所示的第59位C替换为A(见图4)，导致第20位氨基酸由丙氨酸(A)替换为E(谷氨酸)。在SEQ ID NO.3所示第454位置G替换为A，导致第152位氨基酸由天冬氨酸(D)替换为天冬酰胺(N)。在SEQID NO.3所示第508位置G替换为A，导致第170位氨基酸由天冬氨酸(D)替换为天冬酰胺(N)。在SEQ ID NO.3所示第526位置G替换为T，导致第176位氨基酸由甘氨酸(G)替换为半胱氨酸(C)。
1.4实验结论
水稻HPPD第20、152、170、176位点中任一氨基酸的改变可以提高OsHPPD对除草剂，尤其是喹唑啉二酮类除草剂的耐受性，从而赋予植物对除草剂的抗性。本发明在培育抗HPPD抑制性除草剂作物中具有重要应用价值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 山东舜丰生物科技有限公司
<120> 抗除草剂多肽、核酸及其应用
<130> P2020-0163
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 446
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
Met Pro Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ala Thr Thr Gly Ala Val Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Gly Glu Asn Ala Gly Phe Arg Leu Val Gly His Arg
20 25 30
Arg Phe Val Arg Ala Asn Pro Arg Ser Asp Arg Phe Gln Ala Leu Ala
35 40 45
Phe His His Val Glu Leu Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly
50 55 60
Arg Phe Ala Phe Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu
65 70 75 80
Ser Thr Gly Asn Ser Ala His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Ala Ser
85 90 95
Val Ala Phe Leu Phe Thr Ala Pro Tyr Gly Gly Asp His Gly Val Gly
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Thr Thr Ala Ser Ile Pro Ser Phe Ser Pro Gly Ala
115 120 125
Ala Arg Arg Phe Ala Ala Asp His Gly Leu Ala Val His Ala Val Ala
130 135 140
Leu Arg Val Ala Asp Ala Ala Asp Ala Phe Arg Ala Ser Val Ala Ala
145 150 155 160
Gly Ala Arg Pro Ala Phe Gln Pro Ala Asp Leu Gly Gly Gly Phe Gly
165 170 175
Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser
180 185 190
His Pro Asp Gly Ala Asp Ala Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Gly Val
195 200 205
Ser Asn Pro Gly Ala Val Asp Tyr Gly Leu Arg Arg Phe Asp His Val
210 215 220
Val Gly Asn Val Pro Glu Leu Ala Pro Val Ala Ala Tyr Ile Ser Gly
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Phe Thr Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly
245 250 255
Thr Ala Glu Ser Gly Leu Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ala Glu
260 265 270
Thr Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg
275 280 285
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290 295 300
His Ile Ala Leu Ala Ser Asp Asp Val Leu Gly Thr Leu Arg Glu Met
305 310 315 320
Arg Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Glu Phe Leu Ala Pro Pro Pro
325 330 335
Pro Asn Tyr Tyr Asp Gly Val Arg Arg Arg Ala Gly Asp Val Leu Ser
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355 360 365
Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp
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385 390 395 400
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Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Glu Tyr Glu
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Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gln Ala Pro Thr Val Gln Gly Ser
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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ttcaccgccc cctacggcgg cgaccacggc gtcggcgcgg acgcggccac caccgcctcc 360
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Claims (17)

1.一种对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的突变多肽，所述突变多肽与亲本对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第20位氨基酸发生突变，所述第20位氨基酸突变为谷氨酸（E），所述对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)突变多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的突变多肽，其特征在于，所述亲本HPPD来源于水稻。
3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-2任一所述的突变多肽。
4.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体含有权利要求3所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。
5.根据权利要求4所述的核酸构建体，其特征在于，所述调控元件选自下组中的一种或任意几种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、标记基因。
6.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有权利要求4-5任一所述的核酸构建体或权利要求6所述的载体或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸；所述宿主细胞为非动物和植物细胞。
8.一种制备权利要求1-2任一所述突变多肽的方法，所述的方法包括步骤：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，从而表达所述的突变多肽；和
(b)分离所述的突变多肽。
9.一种赋予植物对HPPD抑制性除草剂产生抗性或耐受性的方法，所述方法包括在植物细胞、植物组织、植物部分或植物中引入权利要求1-2任一所述突变多肽的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-2任一所述的突变多肽在植物细胞、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述表达包括通过表达载体对所述突变多肽进行表达的步骤，或者包括将所述编码突变多肽的多核苷酸整合到植物基因组上进行表达的步骤。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括将植物的内源性HPPD进行突变从而引入所述突变多肽的步骤。
13.根据权利要求9-12任一所述的方法，其特征在于，所述HPPD抑制性除草剂选自三酮类、二酮腈类、异噁唑类、吡唑类、二苯酮类、喹唑啉二酮类或其组合。
14.权利要求1-2任一所述的突变多肽、权利要求3所述的多核苷酸、权利要求4-5所述的核酸构建体或权利要求6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞在制备对HPPD抑制性除草剂具有抗性或耐受性的植物中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述HPPD抑制性除草剂选自三酮类、异噁唑类、二酮腈类、吡唑类、喹唑啉二酮类除草剂或其组合。
16.一种鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，包括：（i）提供转化的植物细胞、植物组织，植物或其部分，其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分包含如权利要求3所述的多核苷酸，其中多核苷酸编码作为选择标记使用的突变型HPPD多肽；（ii）使转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分与至少一种HPPD抑制性除草剂接触；（iii）确定植物细胞、植物组织、植物或其部分是否受HPPD抑制性除草剂影响；和（iv）鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分。
17.一种在植物栽培地点控制不想要的植物的方法，所述方法包括：
（1）提供包含权利要求1-2任一所述的突变多肽或权利要求3所述的多核苷酸或权利要求4-5所述的核酸构建体的植物，或者提供由权利要求9-12所述的方法得到的植物；
（2）将步骤（1）的植物进行栽培，并向所述栽培地点施用HPPD抑制性除草剂。
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