CN113293162B

CN113293162B - 一种提高植物中维生素c含量的方法

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Publication number: CN113293162B
Application number: CN202010859050.0A
Authority: CN
Inventors: 李彦莎; 梁亚峰
Original assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-08-24
Filing date: 2020-08-24
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2040-08-24
Also published as: CN113293162A; WO2022042446A1

Abstract

本发明提供了一种提高植物中维生素C含量的方法，具体地，本发明提供了分离的第一5’‑UTR核苷酸突变体，其特征在于，所述第一5’‑UTR核苷酸突变体与第一亲本5’‑UTR核苷酸相比存在50‑80bp长度的片段的缺失，所述第一亲本5’‑UTR核苷酸的序列如SEQ ID NO.:1所示，优选的，所述缺失的片段包括SEQ ID NO.:2所示的序列，本发明将植物细胞中GGP2和/或GGP1基因组的5’端非翻译区(5’‑UTR)的核苷酸进行突变(即大片段缺失)，可提高植物中维生素C的含量。

Description

一种提高植物中维生素C含量的方法

技术领域

本发明涉及植物学领域，更具体地涉及一种提高植物中维生素C含量的方法。

背景技术

维生素C(Vitamin C/ascorbic acid，又称L-抗坏血酸)是大多数生物体内的必需物质，它不仅在调控细胞还原势方面发挥重要作用，而且还是很多重要生物学反应关键酶正常发挥作用的辅助因子。然而，人类在进化过程中失去了自身合成维生素C的能力，所以这一必需维生素的获取只能通过食物的摄入，如果维生素C摄取量不足便会引起坏血病的发生。

因此，本领域技术人员迫切需要开发能够提高植物中维生素C含量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够提高植物中维生素C含量的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的第一5’-UTR核苷酸突变体，所述第一5’-UTR核苷酸突变体与第一亲本5’-UTR核苷酸相比存在50-80bp，较佳地，60-70bp，最佳的68bp长度的片段的缺失，所述第一亲本5’-UTR核苷酸的序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述缺失的核酸片段包括SEQ ID NO.:2所示的核酸序列。

在另一优选例中，所述缺失的核酸片段为SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列的核苷酸、其片段、或其保守性变异核苷酸。

在另一优选例中，所述突变体为具有SEQ ID NO.:3所示核苷酸序列的核苷酸、其片段、或其保守性变异核苷酸。

在另一优选例中，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述的突变体除50-80bp，较佳地，60-70bp，最佳的68bp长度的片段的缺失外，其余的核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-40个，更佳地为1-30个、更佳地1-15个、更佳地1-5个)的核苷酸不相同，其中，所述的不相同包括核苷酸的取代、缺失或添加。

在另一优选例中，所述第一亲本5’-UTR为细胞基因组中与GDP-L-galactosephosphorylase 2-like蛋白(本文中又称为GGP2或者LsGGP2)(GDP-L-galactosephosphorylase 2-like蛋白的NCBI登录号为LOC111907963)表达调控相关的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述第一亲本5’-UTR位于细胞基因组中编码GGP2核甘酸序列的起始密码子的上游。

在另一有优选例中，所述细胞包括真核细胞和原核细胞。

在另一有优选例中，所述细胞来源于植物、动物或微生物。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组：菊科、禾本科、豆科、十字花科植物、或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自下组：水稻、玉米、烟草、高粱、小麦、大麦、玉米、大豆、拟南芥、马铃薯、番茄、生菜、油菜、白菜、藜麦、或其组合。

在另一优选例中，所述第一亲本5’-UTR来源于单子叶植物或双子叶植物。

在另一优选例中，所述第一亲本5’-UTR来源于选自下组的一种或多种植物：菊科、禾本科、豆科、十字花科植物。

在另一优选例中，所述第一亲本5’-UTR来源于选自下组的一种或多种植物：水稻、玉米、烟草、高粱、小麦、大麦、玉米、大豆、拟南芥、马铃薯、番茄、生菜、油菜、白菜、藜麦。

在另一优选例中，所述突变体来源于单子叶植物或双子叶植物。

在另一优选例中，所述突变体来源于选自下组的一种或多种植物：菊科、禾本科、豆科、十字花科植物。

在另一优选例中，所述突变体来源于选自下组的一种或多种植物：水稻、玉米、烟草、高粱、小麦、大麦、玉米、大豆、拟南芥、马铃薯、番茄、生菜、油菜、白菜、藜麦。

在另一优选例中，所述的第一亲本5’-UTR来源于生菜(Lactuca sativa)。

在另一优选例中，所述的突变体来源于生菜(Lactuca sativa)。

在另一优选例中，所述突变体选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:3所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥98％)的多核苷酸；

(c)与(a)-(b)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述突变体为SEQ ID NO.1所示的5’-UTR核苷酸经突变形成的。

在另一优选例中，所述突变体为DNA。

在另一优选例中，所述缺失通过基因编辑、基因敲除、基因缺失的方式实现。

在另一优选例中，所述基因编辑方式选自下组：Crispr、Cre-lox、ZFNs、TALENs、同源重组、或其组合。

本发明第二方面提供了一种突变体组合，所述突变体组合包括：

(a)第一5’-UTR核苷酸突变体，所述5’-UTR核苷酸突变体与第一亲本5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:1)相比存在50-80bp(较佳地，60-70bp，最佳地，68bp)长度的片段的缺失；

(b)第二5’-UTR核苷酸突变体，所述5’-UTR核苷酸突变体与第二亲本5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:4)相比存在80-100bp，较佳地，90-95bp，最佳的91bp长度的片段的缺失。

在另一优选例中，相对于第二亲本5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:4)，第二5’-UTR核苷酸突变体中缺失的核酸片段包括SEQ ID NO.:5所示的核酸序列。

在另一优选例中，所述缺失的核酸片段为SEQ ID NO.:5所示核苷酸序列的核苷酸、其片段、或其保守性变异核苷酸。

在另一优选例中，所述第二5’-UTR核苷酸突变体为具有SEQ ID NO.:6所示核苷酸序列的核苷酸、其片段、或其保守性变异核苷酸。

在另一优选例中，所述第二5’-UTR核苷酸突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

在另一优选例中，所述的突变体除80-100bp(较佳地，90-95bp，最佳地，91bp)长度的片段的缺失外，其余的核苷酸序列与SEQ ID NO.:4所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述第二亲本5’-UTR为细胞基因组中与GDP-L-galactosephosphorylase 2(本文中又称为GGP1或者LsGGP1)(GDP-L-galactose phosphorylase 2蛋白的NCBI登录号为LOC111899617)表达调控相关的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述第二亲本5’-UTR位于细胞基因组中编码GGP1核甘酸序列的起始密码子的上游。

在另一有优选例中，所述细胞包括真核细胞和原核细胞。

在另一有优选例中，所述细胞来源于植物、动物或微生物。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述第一、第二亲本5’-UTR各自独立的来源于单子叶植物或双子叶植物。

在另一优选例中，所述第一、第二亲本5’-UTR各自独立的来源于选自下组的一种或多种植物：菊科、禾本科、豆科、十字花科植物。

在另一优选例中，所述第一、第二亲本5’-UTR各自独立的来源于选自下组的一种或多种植物：水稻、玉米、烟草、高粱、小麦、大麦、玉米、大豆、拟南芥、马铃薯、番茄、生菜、油菜、白菜、藜麦。

在另一优选例中，所述第一、第二5’-UTR核苷酸突变体各自独立的来源于单子叶植物或双子叶植物。

在另一优选例中，所述第一、第二5’-UTR核苷酸突变体各自独立的来源于选自下组的一种或多种植物：菊科、禾本科、豆科、十字花科植物。

在另一优选例中，所述第一、第二5’-UTR核苷酸突变体各自独立的来源于选自下组的一种或多种植物：水稻、玉米、烟草、高粱、小麦、大麦、玉米、大豆、拟南芥、马铃薯、番茄、生菜、油菜、白菜、藜麦。

在另一优选例中，所述的第一、第二亲本5’-UTR各自独立的来源于生菜(Lactucasativa)。

在另一优选例中，所述的第一、第二5’-UTR核苷酸突变体各自独立的来源于生菜(Lactuca sativa)。

在另一优选例中，所述第二5’-UTR核苷酸突变体选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:6所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:6所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥98％)的多核苷酸；

(c)与(a)-(b)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述第二5’-UTR核苷酸突变体为SEQ ID NO.4所示的5’-UTR核苷酸经突变形成的。

在另一优选例中，所述突变体为DNA。

本发明第三方面提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物包括本发明第一方面所述的5’-UTR核苷酸突变体或本发明第二方面所述的突变体组合。

在另一优选例中，所述核酸构建物还包括选自下组中的一种或多种：启动子、GGP2或GGP1蛋白编码基因、增强子、终止子或标签基因。

在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。

在另一优选例中，所述启动子选自下组：UBI、UBQ、35S、Actin、SPL，CmYLCV、YAO、CDC45、rbcS、rbcL、PsGNS2、UEP1、TobRB7、Cab、6、U3、U6a、U6b、U6c、U6-1、U3b、U3d、U6-26、U6-29、H1、或其组合。在另一优选例中，所述GGP2或GGP1蛋白编码基因来源于植物或微生物。

在另一优选例中，所述GGP2或GGP1蛋白编码基因来源单子叶植物或双子叶植物。

在另一优选例中，所述的GGP2或GGP1蛋白编码基因来源于水稻、玉米、烟草、高粱、小麦、大麦、玉米、大豆、拟南芥、马铃薯、番茄、生菜、油菜、白菜、藜麦。

在另一优选例中，所述的GGP2或GGP1蛋白编码基因包括野生型和突变型基因。

本发明第四方面提供了一种用于基因编辑的核酸构建物，所述核酸构建物能够使第一亲本5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:1)突变为第一5’-UTR核苷酸突变体；和/或第二亲本5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:4)突变为第二5’-UTR核苷酸突变体，其中所述第一5’-UTR核苷酸突变体与第一亲本5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:1)相比存在50-80bp(较佳地，60-70bp，最佳地，68bp)长度的片段的缺失；所述第二5’-UTR核苷酸突变体与第二亲本5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:4)相比存在80-100bp，较佳地，90-95bp，最佳的91bp长度的片段的缺失。

在另一优选例中，所述核酸构建物包括基因编辑蛋白。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白选自下组：CRISPR、TALEN、ZFN、或其组合。

在另一优选例中，所述CRISPR蛋白选自下组：Cas9、Cas12、Cas13、或其组合。

在另一优选例中，所述核酸构建物还包括gRNA。

在另一优选例中，所述gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且gRNA能够与CRISPR蛋白形成功能性复合体。

在另一优选例中，所述gRNA选自SEQ ID NO.:7和/或SEQ ID NO.:8。

在另一优选例中，所述的基因编辑蛋白包括CRISPR基因编辑体系、易错PCR、基因重组、TALEN和ZFN所需要的基因编辑蛋白。

本发明第五方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第一方面所述的5’-UTR核苷酸突变体或本发明第二方面所述的突变体组合或本发明第三方面所述的核酸构建物或本发明第四方面所述的核酸构建物。

在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

在另一优选例中，所述的载体为植物表达载体。

在另一优选例中，所述的载体为可转染或转化植物细胞的表达载体。

在另一优选例中，所述的载体为农杆菌Ti载体。

在另一优选例中，所述的构建物整合到所述载体的T-DNA区。

在另一优选例中，所述载体是环状的或线性的。

在另一优选例中，所述的载体还包含一筛选标记表达盒。

本发明第六方面提供了一种基因工程细胞，所述的基因工程细胞含有本发明第五方面所述的载体或基因组中整合有本发明第一方面所述的突变体或本发明第二方面所述的突变体组合或本发明第三方面或本发明第四方面所述的核酸构建物。

在另一优选例中，所述细胞为真核细胞，如酵母细胞或动物细胞或植物细胞，或原核细胞，如大肠杆菌。

在另一优选例中，所述的细胞为植物细胞。

在另一优选例中，所述的细胞含有更高含量的维生素C。

在另一优选例中，所述的基因工程细胞是用选自下组的方法将本发明第一方面所述的突变体或本发明第二方面所述的突变体组合或本发明第三方面或本发明第四方面所述的核酸构建物或本发明第五方面所述的载体导入细胞的：农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(PEG)介导法。

在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述裸子植物选自下组：苏铁科(Cycadaceae)、罗汉松科(Podocarpaceae)、南洋杉科(Araucariaceae)、松科(Pinaceae)、杉科、柏科、三尖杉科、红豆杉科、麻黄科、买麻藤科、单型科、百岁兰科、或其组合。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述草本植物选自下组：菊科、茄科、禾本科植物、豆科植物、或其组合。

在另一优选例中，所述木本植物选自下组：猕猴桃科、蔷薇科、桑科、或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自下组：十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、茄科、猕猴桃科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、菊科、或其组合。在另一优选例中，所述的植物选自下组：拟南芥、水稻、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、大麦、小麦、马铃薯、番茄、油菜、生菜、白菜、藜麦、高粱或其组合。

本发明第七方面提供了一种提高细胞中Vc含量的方法，所述方法包括向所述细胞中引入本发明第一方面所述5’-UTR核苷酸突变体或本发明第二方面所述的突变体组合或本发明第三方面或本发明第四方面所述的核酸构建物的步骤。

在另一优选例中，所述方法包括利用基因编辑技术在细胞中引入本发明第一方面所述的突变体或本发明第二方面所述突变体组合的步骤。

在另一优选例中，所述的基因编辑技术选自下组：CRISPR基因编辑体系、易错PCR、基因重组、TALEN和ZFN。

在另一优选例中，所述基因编辑技术包括碱基编辑器。

在另一优选例中，所述的方法中，引入5’-UTR核苷酸突变体或所述突变体组合包括将5’-UTR核苷酸突变体或突变体组合在细胞中进行表达，例如，通过表达载体对所述突变体或突变体组合进行表达的，或者将所述突变体或突变体组合整合到植物基因组上进行表达或将细胞内源性5’-UTR突变后进行表达。

在另一优选例中，相对于野生型同种细胞中的VC含量，含有所述突变体的细胞中的VC含量提高了≥4倍，较佳地，≥5倍，更佳地，≥8倍。

在另一优选例中，相对于野生型同种细胞中的VC含量，含有所述突变体的细胞中的VC含量提高了4-15倍，较佳地，4-10倍，更佳地，7-10倍。

本发明第八方面提供了一种改良植物的方法，所述的方法包括步骤：

(a)提供一植物细胞、植物组织或植物部分，向所述植物细胞、植物组织、植物部分中引入本发明第一方面所述的5’-UTR核苷酸突变体或本发明第二方面所述的突变体组合或本发明第三方面或本发明第四方面所述的核酸构建物；

(b)将步骤(a)中的植物细胞、植物组织、植物部分再生成植株。

在另一优选例中，所述方法包括利用基因编辑技术在细胞中引入本发明第一方面所述突变体或本发明第二方面所述突变体组合的步骤。

在另一优选例中，所述引入指细胞中含有本发明第一方面所述突变体或本发明第二方面所述突变体组合。

在另一优选例中，所述基因编辑技术包括碱基编辑器。

在另一优选例中，所述的引入5’-UTR核苷酸突变体或突变体组合包括将所述5’-UTR核苷酸突变体或突变体组合在细胞中进行表达，例如，通过表达载体对所述突变体或突变体组合进行表达的，或者将所述突变体或突变体组合整合到植物基因组上进行表达或将细胞内源性5’-UTR突变后进行表达。

在另一优选例中，在步骤(a)中，所述方法包括以下步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的5’-UTR核苷酸突变体或突变体组合；

(2)将植物细胞、植物组织、植物部分与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述5’-UTR核苷酸突变体或突变体组合或其活性片段转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；和

(3)选择已转入所述5’-UTR核苷酸突变体或突变体组合或其活性片段的植物细胞、植物组织、植物部分。

在另一优选例中，在步骤(a)中，利用基因编辑技术改造所述植物细胞、植物组织、植物部分，从而使所述植物细胞、植物组织、植物部分中的第一5’-UTR核苷酸与第一亲本5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:1)相比存在50-80bp(较佳地，60-70bp，更佳地，68bp)长度的片段的缺失。

在另一优选例中，在步骤(a)中，利用基因编辑技术改造所述植物细胞、植物组织、植物部分，从而使所述植物细胞、植物组织、植物部分中的第一5’-UTR核苷酸与第一亲本5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:1)相比存在50-80bp(较佳地，60-70bp，更佳地，68bp)长度的片段的缺失；和

所述第二5’-UTR核苷酸突变体与第二亲本5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:4)相比存在80-100bp(较佳地，90-95bp，更佳地，91bp)长度的片段的缺失。

在另一优选例中，所述基因编辑技术包括碱基编辑器。

在另一优选例中，所述改良植物包括提高植物中维生素C的含量。

在另一优选例中，所述方法用于提高植物中维生素C含量的性能。

在另一优选例中，所述方法用于调控内源性GGP2和/或GGP1基因的表达。

在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组：菊科、十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、茄科、猕猴桃科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：拟南芥、水稻、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、大麦、小麦、马铃薯、番茄、油菜、生菜、白菜、藜麦、高粱或其组合。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：对所述植物细胞、植物组织、植物部分或植物，测试其维生素C含量增加量的性能。

在另一优选例中，所述方法改良的植物的维生素C含量的增加量(C1)与野生型的同种植物的维生素C含量的增加量(C2)相比，C1/C2≥4，较佳地C1/C2≥5，较佳地C1/C2≥7。

本发明第九方面提供了一种试剂，含有本发明第一方面所述的突变体、本发明第二方面所述的突变体组合、本发明第三方面或本发明第四方面所述的核酸构建物、本发明第五方面所述的载体、或本发明第六方面所述的基因工程细胞。

在另一优选例中，所述试剂用于提高植物细胞、植物组织或植物中的维生素C的含量。

本发明第十方面提供了一种试剂盒，包括本发明第八方面所述的试剂。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括标签或说明书。

本发明第十一方面提供了本发明第一方面所述的突变体、本发明第二方面所述的突变体组合、本发明第三方面或本发明第四方面所述的核酸构建物、本发明第五方面所述的载体、本发明第六方面所述的基因工程细胞、本发明第九方面所述的试剂、或本发明第十方面所述的试剂盒的用途，用于提高植物中的维生素C的含量，或用于制备(a)提高植物中维生素C含量的试剂或试剂盒，和/或(b)维生素C含量提高的植物。

本发明第十二方面提供了一种鉴定高含量维生素C植物的方法，包括：

(i)鉴定植物样本是否具有本发明第一方面所述的突变体或本发明第二方面所述的突变体组合或本发明第三方面所述的核酸构建物或本发明第五方面所述的载体。

在另一优选例中，在步骤(i)中，通过测序确定所述植物样本中是否具有本发明第一方面所述的突变体或本发明第二方面所述的突变体组合或本发明第三方面所述的核酸构建物或本发明第五方面所述的载体。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了Cas9编辑器，其中AtU6和35promoter为启动子，gRNA为向导RNA，NOSterminator为终止子。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现，将植物细胞中GGP2和/或GGP1基因组的5’端非翻译区(5’-UTR)的核苷酸进行突变(即大片段缺失)，可调节植物内源性GGP2和/或GGP1基因的表达，从而提高植物中维生素C的含量。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

术语“亲本核苷酸”指的是可以在自然界中被发现存在的核酸分子，其包括未经人工改造的野生型核酸分子，也可以包括经过人工改造但不含有本发明突变位点的核酸分子，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述“亲本植物”即含有亲本核苷酸或多肽的植物。所述“亲本核苷酸”可以根据本领域技术人员所熟知的技术从亲本植物中进行提取，亦可通过化学合成的方法获得。所述亲本5’-UTR核苷酸的序列，例如SEQ ID No.1或4所示。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。例如两个核苷酸序列的同一性可以通过以下方式确认：从美国国立生物技术信息中心(NCBI)获得的BLAST运算法则(Altschuletal.,1990,Mol.Biol.215:403-10)，使用默认参数确定。

在本发明中，“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，例如：(1)粮食作物：稻属(Oryza spp.)，例如稻(Oryza sativa)、阔叶稻(Oryza latifolia)、水稻(Oryzasativa)、光稃稻(Oryza glaberrima)；小麦属(Trit icum spp.)，例如普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(T.Turgidumssp.durum)；大麦属(Hordeum spp.)，例如大麦(Hordeum vulgare)、亚利桑那大麦(Hordeumarizonicum)；黑麦(Secale cereale)；燕麦属(Avena spp.)，例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avenabyzantina)、Avenafatuavar.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)；稗属(Echinochloaspp.)，例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、高粱(两色高粱(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、黑小麦、玉蜀黍或玉米、粟、稻(rice)、谷子、糜子、两色蜀黍(Sorghumbicolor)、黍子、荞麦属(Fagopyrum spp.)、黍(Panicum miliaceum)、小米(Setariaitalica)、沼生菰(Zizaniapalustris)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、稷(Panicummiliaceum)、龙爪稷(Eleusine coracana)；(2)豆类作物：大豆属(Glycine spp.)，例如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)、Soja max)、野豌豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vigna spp.)、豌豆属(Pisum spp.)、芸豆(field bean)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、蚕豆属(Vicia)、酸豆(Tamarindus indica)、兵豆(Lens culinaris)、山黧豆属(Lathyrusspp.)、扁豆属(Lablab)、蚕豆、绿豆、红豆、鹰嘴豆；(3)油料作物：花生(Arachishypogaea)、落花生属(Arachis spp)、胡麻属(Sesamum spp.)、向日葵属(Helianthusspp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Eiaeisguineensis)、美洲油棕(Elaeisoleifera))、大豆(soy bean)、油菜(B ra s s i ca na pu s)、芸苔、芝麻、芥菜(Brassicajuncea)、油菜籽油菜(oilseedrape)、油茶、油棕、油橄榄、蓖麻、欧洲油菜(Brassica napus L.)、卡诺拉油菜(canola)；(4)纤维作物：剑麻(Agavesisalana)、棉属(棉花、海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、红麻、剑麻、蕉麻、亚麻(Linum usitatissimum)、黄麻、苎麻、大麻(Cannabis sativa)、火麻；(5)水果类作物：枣属(Ziziphus spp.)、香瓜属(Cucumis spp.)、鸡蛋果(Passifloraedulis)、葡萄属(Vitis spp.)、越桔属(Vaccinium spp.)、西洋梨(Pyrus communis)、李属(Prunus spp.)、番石榴属(Ps id i um s p p.)、石榴(Pun i ca g ra na tum)、苹果属(Ma l us s p p.)、西瓜(C i t r u l l us la na t u s)、柑桔属(C i t r u s s pp.)、无花果(F i c u s ca r i ca)、金桔属(Fortunella s pp.)、草莓属(Fraga ria spp.)、山楂属(Cra taeg us s pp.)、柿树属(Diospyros spp.)、红仔果(Eugeniaunifora)、枇杷(Eriobotrya japonica)、龙眼(Dimocarpus longan)、番木瓜(Caricapapaya)、椰子属(Cocos spp.)、阳桃(Averrhoacarambola)、狲猴桃属(Actinidia spp.)、扁桃(Prunus amygdalus)、芭蕉属(Musa spp.)(香蕉)、鳄梨属(Persea spp.)(鳄梨(Persea americana))、番石榴(Psidium guajava)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(油橄榄(Oleaeuropaea))、番木瓜(Caricapapaya)、椰子(Cocosnucifera)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、人心果(Manilkara zapota)、菠萝(Ananas comosus)、番荔枝属(Annona spp.)、柑桔树(柑桔属物种(Citrus spp.))、波罗蜜属(Artocarpus spp.)、荔枝(Litchi chinensis)、茶藨子属(Ribes spp.)、悬钩子属(Rubus spp.)、梨、桃、杏、梅、杨梅、柠檬、金橘、榴莲、橙、草莓(strawbe rry)、蓝莓、哈密瓜、甜瓜、椰枣、胡桃树、樱桃树；(6)根茎类作物：木薯属(Manihot spp.)、甘薯(Ipomoeabatatas)、芋(Colocasia esculenta)、榨菜、洋葱、荸荠、油莎草、山药；(7)蔬菜类作物：菠菜属(Spinacia spp.)、菜豆属(Phaseolus spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、苦瓜属(Momordica spp)、欧芹(Petroselinum crispum)、辣椒属(Ca psicum s pp.)、茄属(Solanum s pp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或蕃茄(Solanum lycopersicum))、蕃茄属(Lycopersicon spp.)(例如西红柿(Lycopersiconesculentum)、蕃茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形蕃茄(Lycopersiconpyriforme))、硬皮豆属(Macrotyloma spp.)、无头甘蓝(kale)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、小扁豆(lentil)、秋葵(okra)、洋葱(onion)、马铃薯(potato)、洋蓟(artichoke)、芦笋(asparagus)、西兰花(broccoli)、球芽甘蓝(Brussels sprouts)、卷心菜(cabbage)、胡萝卜(carrot)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、羽衣甘蓝(collardgreens)、西葫芦(squash)、冬瓜(Benincasa hispida)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、旱芹(Apium g ra veolens)、苋属(Ama ranthus s pp.)、葱属(Allium spp.)、秋葵属(Abelmoschus spp.)、苦苣(Cichorium endivia)、南瓜属(Cucurbita spp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、埃塞俄比亚芥(B.carinata)、萝卜(Rapbanus sativus)、芸苔属(Brassica)物种(例如例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁亚种(Brassica rapassp.)、卡诺拉油菜(canola)、油籽油菜(oilseed rape)、芜菁油菜(turnip rape)、芥菜、甘蓝、黑芥、油菜籽油菜)、孢子甘蓝、茄科植物(茄子)、甜椒、黄瓜、丝瓜、白菜、油菜、甘蓝、葫芦、韭菜、莲、藕、生菜；(8)花卉作物：小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolummajus)、美人蕉(Canna indica)、仙人掌属(Opuntia spp.)、万寿菊属(Tagetes spp.)、兰花、文殊兰、君子兰、朱顶红、玫瑰、月季、茉莉花、郁金香、樱花、牵牛花、金盏花、荷花、雏菊、康乃馨、矮牵牛花、郁金香、百合、梅花、水仙、迎春、报春、瑞香、山茶、白玉兰、紫玉兰、琼花、君子兰、海棠、牡丹、芍药、丁香、杜鹃、西洋杜鹃、含笑、紫荆、棣棠、锦带花、连翘、云南黄馨、金雀花、仙客来、蝴蝶兰、石斛、风信子、鸢尾、马蹄莲、金盏菊、百枝莲、四季海棠、吊钟海棠、竹节海棠、天竺葵；(9)药用作物：红花(Carthamus tinctorius)、薄荷属(Mentha spp.)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、番红花(Crocus sativus)、枸杞、玉竹、黄精、知母、麦冬、川贝、郁金、砂仁、何首乌、大黄、甘草、黄芪、人参、三七、五加、当归、川芎、北柴胡、曼佗罗、洋金花、薄荷、益母草、藿香、黄芩、夏枯草、除虫菊、银杏、金鸡纳树、天然橡胶树、苜蓿、胡椒；(10)原料作物：橡胶、蓖麻(Ricinus communis)、油桐、桑、忽布、桦、桤木、漆树；(11)牧草作物：冰草属(Agropyron spp.)、车轴草属(Trifolium spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、狼尾草属(Pennisetum sp.)、虉草(Phalaris arundinacea)、柳枝稷(Panicum virgatum)、草原草(prairiegrasses)、印度草(Indiangrass)、大须芒草(Big bluestem grass)、梯牧草(Phleum pratense)、草皮草(turf)、莎草科(高山嵩草、脚苔草(Carex pediformis)、低苔草)、苜蓿、梯牧草、紫花苜蓿、草木犀、紫云英、柽麻、田菁、红萍、水葫芦、紫穗槐、羽扇豆、三叶草、沙打旺、水浮莲、水花生、黑麦草；(12)糖料作物：甘蔗(甘蔗属物种(Saccharumspp.))、甜菜(Beta vulgaris)；(13)饮料作物：大叶茶(Camellia sinensis)、茶(CamelliaSinensis)、茶树(tea)、咖啡(咖啡属物种(Coffeaspp.))、可可树(Theobroma cacao)、蛇麻花(啤酒花)；(14)草坪植物：固沙草(Ammophilaarenaria)、早熟禾属(Poa spp.)(草地早熟禾(Poa pratensis)(蓝草))、剪股颖属物种(Agrostis spp.)(剪股颖、匍匐剪股颖(Agrostis palustris))、黑麦草属物种(Loliumspp.)(黑麦草)、羊茅属物种(Festucaspp.)(羊茅)、结缕草属物种(Zoysia spp.)(结缕草(Zoysiajaponica))、狗牙根属物种(Cynodon spp.)(百慕大草、狗牙根)、侧钝叶草(Stenotaphrum secunda tum)(圣奥古斯丁草)、雀稗属物种(Paspalum spp.)(巴哈草)、假俭草(Eremochloa ophiuroides)(百足草)、地毯草属物种(Axonopus spp.)(地毯草)、指形垂穗草(Bouteloua dactyloides)(野牛草)、垂穗草属变种物种(Boutelouavar.spp.)(格兰马草)、马唐(Digitariasanguinalis)、香附子(Cyperusrotundus)、短叶水蜈蚣(Kyllingabrevifolia)、阿穆尔莎草(Cyperusamuricus)、加拿大飞蓬(Erigeroncanadensis)、天胡荽(Hydrocotylesibthorpioides)、鸡眼草(Kummerowiastriata)、地锦(Euphorbiahumifusa)、耕地堇菜(Violaarvensis)、白颖苔草、异穗苔草、草皮草(turf)；(15)树木作物：松属(Pinus spp.)、柳属(Salix sp.)、槭树属(Acer spp.)、木槿属(Hibiscus spp.)、桉属(Eucalyptus sp.)、银杏(Ginkgo biloba)、箣竹属(Bambusa sp.)、杨属(Populus spp.)、牧豆树属(Prosopis spp.)、栎属(Quercusspp.)、刺葵属(Phoenix spp.)、山毛榉属(Fagus spp.)、吉贝(Ceibapentandra)、樟属(Cinnamomum spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、南方芦苇(Phragmitesaustralis)、酸浆属(Physalis spp.)、山蚂蝗属(Desmodium spp.)、杨、常春藤、白杨、珊瑚树、银杏、栎类、臭椿、木荷、冬青、悬铃木、女贞、大叶黄扬、落叶松、黑荆树、马尾松、思茅松，云南松、南亚松、油松、红松、黑胡桃、柠檬、悬铃木、蒲桃、珙桐、木棉、爪哇木棉、洋紫荆、羊蹄甲、雨树、合欢、龙牙花、刺桐、广玉兰、苏铁、紫薇、针叶树、乔木、灌木；(16)坚果作物：巴西栗(Bertholletia excelsea)、栗属(Castanea spp.)、榛属(Corylus spp.)、山核桃属(Caryaspp.)、核桃属(Juglansspp.)、阿月浑子(Pistaciavera)、腰果(Anacardium)、occidentale)、澳洲坚果(全缘叶澳洲坚果(Macadamia integrifolia))、碧根果、夏威夷果、开心果、巴旦木以及产生坚果的植物；(17)其他：拟南芥、臂形草、蒺藜草、大狗尾草、牛筋草、Cadaba farinosa、藻类(algae)、Carex elata、观赏植物、大果假虎刺(Carissamacrocarpa)、菜蓟属(Cynara spp.)、野胡萝卜(Daucus carota)、薯蓣属(Dioscoreaspp.)、蔗茅属(Erianthus sp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、萱草(Hemerocallisfulva)、百脉根属(Lotus spp.)、Luzula sylvatica、紫苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属(Melilotus spp.)、黑桑(Morus nigra)、烟草属(Nicotiana spp.)、木犀榄属(Oleaspp.)、鸟足豆属(Ornithopus spp.)、欧防风(Pastinaca sativa)、接骨木属(Sambucusspp.)、白芥属(Sina pis sp.)、蒲桃属(Syzygium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、Triticosecale rimpaui、香堇(Viola odorata)等。

在本发明中，术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。

在本发明中，术语“基因编辑”技术主要包括CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。CRISPR技术中所指基因编辑工具包括guideRNA、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b等)，Cas蛋白在guideRNA的引导下可识别并切割靶标DNA。TALEN技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个TAL效应子DNA结合结构域和一个DNA切割结构域。ZFN技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个锌指DNA结合结构域与一个DNA切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。

在本发明中，本发明的Crispr蛋白是指CRISPR系统中具有核酸酶活性的一类蛋白，其为CRISPR关联(CRISPR associated)蛋白，优选的CRISPR包括Cas9、Cas12、Cas13及保持活性的突变体，优选的，所述CRISPR蛋白为Cas9及其保持活性的突变体。本发明可使用目前已经发现的Cas9、Cas12、Cas13等多种类型的Cas蛋白。本发明中的Cas蛋白包括天然存在的蛋白或重组蛋白。另外，Cas蛋白不仅包含本申请日之前已鉴定的任何蛋白，还包含基于目前已知的知识能够确定可能具有该蛋白活性，并在本申请日之后鉴定其活性的蛋白。

在本发明中，gRNA也称为导向RNA(guide RNA)。gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且gRNA能够与Cas蛋白形成功能性复合体。gRNA的序列不特别限定，根据待编辑的靶DNA的序列而变化，并且gRNA可以是一种，也可以是多种不同类型的组合。

UTR

UTR，全称untranslated region，通常是指成熟mRNA位于编码区(CDS)上游不被翻译为蛋白质的区域，本发明所指的UTR为以DNA分子中的序列为标准描述其结构及功能。非翻译区包括5’端非翻译区和3’端非翻译区，研究认为非翻译区与基因表达调控有关。5′非翻译区从转录起始位点开始，在起始密码子的前一个核苷酸处结束，可以包含通过调控元件控制基因表达的元件，5′非翻译区的多样性会导致其基因表达的变化。

本发明所述的5’-UTR可以是包含内含子在内的基因组中的非翻译区，也可以是成熟mRNA非翻译区的编码序列(如去掉内含子)。本发明所述的5’-UTR优选是位于GGP2和/或GGP1蛋白的编码基因起始密码子上游1-250bp，优选1-200bp，优选1-100bp范围内的核苷酸序列。

本发明提供了一种分离的5’-UTR核苷酸突变体，所述5’-UTR核苷酸突变体与亲本的5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:1)相比存在50-80bp(较佳地，60-70bp，更佳地，68bp)长度的片段的缺失；

且对亲本5’-UTR核苷酸进行突变可调节植物内源性GGP2和/或GGP1基因的表达，从而提高植物中维生素C的含量。

本发明还提供了一种突变体组合，所述突变体组合包括：

(a)第一5’-UTR核苷酸突变体，所述5’-UTR核苷酸突变体与第一亲本的5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:1)相比存在50-80bp(较佳地，60-70bp，更佳地，68bp)长度的片段的缺失；

(b)第二5’-UTR核苷酸突变体，所述5’-UTR核苷酸突变体与第二亲本5’-UTR核苷酸(SEQ ID NO.:4)相比存在80-100bp(较佳地，90-95bp，更佳地，91bp)长度的片段的缺失；

且对亲本5’-UTR核苷酸进行组合突变可调节植物内源性GGP2和/或GGP1基因的表达，从而提高植物中维生素C的含量。

本领域技术人员可以理解，对于核苷酸位置采用不同方式描述不会引起对本发明内容的误解。

本发明突变体或突变体组合能够提高、增加或促进细胞中GGP2和/或GGP1蛋白的编码基因或GGP2和/或GGP1蛋白的表达水平，如促进GGP2和/或GGP1蛋白的编码基因的转录，增加mRNA的量，从而增加植物体内GGP2和/或GGP1蛋白的含量。本发明对GGP2和/或GGP1蛋白的编码基因或GGP2和/或GGP1蛋白的表达水平的改进程度可依据改进技术的不同而选择不同的参照物进行描述，如通过转基因技术获得含有本发明5’-UTR突变体的细胞，其参照物可以为不含有本发明突变体的同种野生型非转基因细胞；如通过突变内源性UTR获得含有本发明5’-UTR的细胞，其参照物可以为同种未突变的野生型细胞(即UTR来源的亲本细胞)。本领域技术人员熟知在不同的情况下选择合理的参照物。

本发明的突变体能够赋予或提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物中的维生素C的含量。通过向植物中引入本发明所述的核苷酸突变体或突变体组合，从而提高植物中的维生素C的含量。

优选地，所述的突变体如SEQ ID NO.:3或6所示。

本发明多核苷酸突变体优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。

本发明的突变体的全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得，也可通过天然或人工序列中天然或诱导的重组或突变方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到本发明的突变体。然后可将该突变体序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明的所述5’-UTR核苷酸突变还包括其活性片段、变体、衍生物和类似物，其可以通过核苷酸的任何取代、缺失、突变、添加、修饰(如甲基化、去甲基化)而产生。

本发明还包括一个或多个其他核苷酸取代衍生物的突变体，只要该突变形式不显著影响本发明5’-UTR核苷酸突变所需功能和生物活性即可。应理解，所述变体与SEQ IDNO.:3或6所示的序列相比，通常具有较高的同源性(相同性)，优选地，所述的突变体与SEQID NO.:3或6所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％或99％。

核酸构建物、表达载体、植物改良

本发明的5’-UTR核苷酸突变体不限于与其他元件组合形成核酸构建物，如与启动子序列、GGP2和/或GGP1蛋白的编码基因、增强子序列、终止子序列、标签基因、前导序列、多聚腺苷酸化序列等序列组合。所述GGP2和/或GGP1蛋白可以来源于任何物种，包括动物、植物、微生物，优选植物，特别是单子叶或双子叶植物。优选地，本发明的亲本GGP2和/或GGP1蛋白来源于菊科，尤其是生菜。

本发明所述的启动子可以是在选定宿主细胞内显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截断的和杂合的启动子，并且可能获子与宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因。作为在植物细胞或植物中表达的启动子，优选使用对羟苯基丙酮酸双氧化酶天然的启动子，或者在植物中具有活性的异源启动子。所述启动子可以是组成型表达的，或者可以是诱导型表达的。启动子的实例包括例如组蛋白启动子，水稻肌动蛋白启动子，植物病毒启动子例如花椰菜花叶病毒启动子等。

本发明还提供了一种表达载体，其中包含有编码本发明的5’-UTR核苷酸突变体或突变体组合或本发明第三方面或第四方面所述的核酸构建物。表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。载体可能是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，它的复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。或者，所述载体可能是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。此外，可使用单个载体或质粒或者一起包含待引入宿主细胞基因组之总DNA的两个或更多个载体或质粒，或者转座子。或者，所述载体也可以是对宿主细胞内源性的5’-UTR核苷酸进行基因编辑的载体。

载体可以是例如质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的，在本领域中众多描述。优选地，本发明中的表达载体是质粒。表达载体中也可以含有一个或多个可选择标记基因以便用于选择包含载体的宿主细胞。这种可选择的标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因，或赋予新霉素耐受性的基因，赋予对四环素或氨苄青霉素耐受性的基因等。

本发明中适用的载体包括可从商业渠道获得的质粒，例如但不限于：pCambia，pBR322(ATCC37017)，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pD10，psiX174pBluescript II KS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pKK232-8，pCM7，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，和pSVL(Pharmacia)等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明的5’-UTR核苷酸突变体序列或其与其他元件组合形成核酸构建物的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的5’-UTR核苷酸突变体序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本发明还提供了包含本发明5’-UTR核苷酸突变体、突变体组合、核酸构建物或表达载体的宿主细胞。将包含5’-UTR核苷酸突变体或突变体组合的载体引入宿主细胞中使得载体作为染色体整合体的一部分存在或如早先所述作为自我复制的染色体外载体存在，或者载体可以对宿主细胞内源性的5’-UTR进行基因编辑。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞(如农作物和林业植物的细胞)。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞、动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得维生素C含量提高的植物。

本发明还提供了一种改良植物的方法，具体包括向植物细胞、植物组织、植物部分中引入本发明5’-UTR核苷酸突变体或突变体组合或其核酸构建物或表达载体，再将所述植物细胞、植物组织、植物部分再生为植株。所述的引入方法如前文所述，包括转化含有5’-UTR核苷酸突变体或突变体组合的表达载体，也可以利用基因编辑技术直接对目标植物基因组中的GGP2和/或GGP1的5’端非翻译区(5’-UTR)进行编辑，从而调控内源性GGP2和/或GGP1基因的表达，改良植物的性状。所述的再生的方法包括组织培养、温室培养或土壤栽培等方式。所述改良植物的性状包括提高或赋予或增强植物中的维生素C的含量。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明首次发现，通过突变GGP2和/或GGP1基因组5’端非翻译区(5’-UTR)，可改变内源性GGP2和/或GGP1基因的表达，从而提高植物中维生素C的含量。

(b)本发明首次提供了一种可以提高植物中维生素C含量的5’-UTR突变体及其组合。

(c)本发明通过前期一系列筛选以及鉴定，获得了维生素C含量极显著提高(提高到原有含量的将近10倍)的生菜，极大的增加了该蔬菜的营养价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。

实施例1.突变第一5’UTR，可以显著提高生菜中的Vc含量

1、构建靶向生菜内源LsGGP2(GDP-L-galactose phosphorylase 2-like)(NCBI登录号为LOC111907963)上游uORF的编辑器

本实施例中，所述生菜的第一5’UTR的序列如SEQ ID NO.:1所示，其位于生菜内源LsGGP2基因的5’端。

在生菜内源LsGGP2上游uORF中设计gRNA(DNA序列如SEQ ID NO.:7所示)，克隆至编辑器(如图1所示)，形成靶向生菜内源LsGGP2上游5’UTR的编辑器。

2、生菜遗传转化及植株鉴定

以绿蝶生菜品种作为实验材料，把以上构建好的编辑器通过农杆菌转化，基因编辑植株。通过PCR及测序对进行鉴定，筛选到了生菜的编辑植株LS-1，所述编辑植株LsGGP2基因上游5’UTR发生了片段缺失，缺失的核酸片段如SEQ ID NO.:2所示，片段缺失后的5’UTR的序列如SEQ ID NO.:3所示。

3、亲本型植株及编辑植株LS-1中Vc含量的测量

Vc含量测量的方法如下：

a.试样制备：取样品0.1g两份，分别加入提取缓冲液1和提取缓冲液2ml和1mL，经均质混匀后，立即测定。

b.标准曲线：将标准系列工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

c.试样溶液的测定

将试样溶液注入液相色谱仪中，以保留时间定性，同时记录峰面积，根据标准曲线得到待测液中维生素C的浓度。

d.分析结果的表述

试样中维生素C含量按公式(1)计算

式中：

X——试样中维生素C的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

C——试样溶液中维生素C的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

V——被测试样总体积，单位为毫升(mL)；

m——称取试样的质量，单位为克(g)；

1000——换算系数。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留小数点后两位数字。

编辑植株的突变类型如表1所示。

表1编辑植株的突变类型

选择了LS-1的几个植株，测定了其Vc含量，如下表2所示。

表2不同生菜植株的Vc含量

生菜植株	Vc(ppm)
		WT	367.78
LS-1	2654.23
		LS-1	3366.97
LS-1	3675.04
		LS-1	2803.97

如表2所示，上述LS-1突变植株的Vc含量相对于野生型(wt)，有大幅度的提高，提高倍数在7-10倍左右，最高可以达到10倍。

4、实验结论

生菜第一5’UTR的如SEQ ID NO.:3所示的突变型，可以赋予植物高Vc含量，本发明在培育高Vc植物中具有重要应用价值。

实施例2.突变第二5’UTR，可以提高生菜中的Vc含量

本实施例中，所述生菜的第二5’UTR的序列如SEQ ID NO.:4所示，其位于生菜内源LsGGP1(GDP-L-galactose phosphorylase 2)(NCBI登录号为LOC111899617)基因的5’端。

1、构建靶向生菜内源LsGGP1上游uORF的编辑器

在生菜内源第二5’UTR中设计gRNA(DNA序列如SEQ ID NO.:8所示)，克隆至编辑器，形成靶向生菜第二5’UTR的编辑器。

2、生菜遗传转化及植株鉴定

以绿蝶生菜品种作为实验材料，把以上构建好的编辑器通过农杆菌转化，基因编辑植株。通过PCR及测序对进行鉴定，筛选到生菜的编辑植株LS-2，其中LS-2在第二5’UTR缺失连续91bp的片段，缺失片段序列如SEQ ID NO.:5所示，片段缺失后的第二5’UTR核酸序列如SEQ ID NO.:6。

3、亲本型植株及编辑植株Vc含量的测量

编辑植株的突变类型以及Vc含量如表3所示。

表3.编辑植株的突变类型以及Vc含量

结果如表3所示，如突变型第二5’UTR植株相对于亲本型来说，Vc含量有2-3倍的提高。

4、实验结论

生菜第二5’UTR的如SEQ ID NO.:6所示的突变型，可以赋予植物高Vc含量，本发明在培育高Vc植物中具有重要应用价值。

实施例3.突变型第一5’UTR和突变型第二5’UTR双突变，可以显著提高生菜中的Vc含量

1、将第一5’UTR的如SEQ ID NO.:3所示的突变型LS-1植株与第二5’UTR的如SEQID NO.:6所示的突变型进行杂交。在后代中筛选双突植株LS-4。其中LS-4同时包含如SEQID NO.:3所示的第一5’UTR突变型和如SEQ ID NO.:6所示第二5’UTR突变型。

2、亲本型植株及编辑植株Vc含量的测量

编辑植株的突变类型以及Vc含量如表4所示。

表4.编辑植株的突变类型以及Vc含量

4、实验结论

如表4所示,如SEQ ID NO.:6所示的突变型第二5’UTR可以进一步提高突变型第一5’UTR带来的高Vc含量，与野生型相比，有更显著的提高。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 一种提高植物中维生素C含量的方法

<130> P2020-1143

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 492

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

attcattcgc atcatcaatc tcattcaaag tttcaaacaa atcaccctct tcccctttgc 60

tgattgacct actgctgccg gataatcgtc atcgaattag gagaaacaga gtctaccctt 120

ggggttgcct gctagagagg aacgggttgg ggtaaaaccc tggaacgaca agttgcagac 180

atcacggcta tacacggagc aacgcggcca ctcgttcatg tccgatcagt acggcggaag 240

ggttcaataa ctattgagag caacccttcg acgcacggcg gacgtggcgc tttgccttcc 300

gaaggcggta gcccatccga ccttctcttc ctcgccggcg gtggttcatc ctccttccta 360

ttcctcgtag cttagggtat attaggtcta gacttatacg catatatccc atacctgtta 420

ttatcgttta attttcaaga tctgctttct tcatcgctcg tatccgttta atcaaccaac 480

caatcgaaga ac 492

<210> 2

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

gttgcagaca tcacggctat acacggagca acgcggccac tcgttcatgt ccgatcagta 60

cggcggaa 68

<210> 3

<211> 424

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

attcattcgc atcatcaatc tcattcaaag tttcaaacaa atcaccctct tcccctttgc 60

tgattgacct actgctgccg gataatcgtc atcgaattag gagaaacaga gtctaccctt 120

ggggttgcct gctagagagg aacgggttgg ggtaaaaccc tggaacgaca agggttcaat 180

aactattgag agcaaccctt cgacgcacgg cggacgtggc gctttgcctt ccgaaggcgg 240

tagcccatcc gaccttctct tcctcgccgg cggtggttca tcctccttcc tattcctcgt 300

agcttagggt atattaggtc tagacttata cgcatatatc ccatacctgt tattatcgtt 360

taattttcaa gatctgcttt cttcatcgct cgtatccgtt taatcaacca accaatcgaa 420

gaac 424

<210> 4

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

aagccactca aacactcctc tcgtcacggc cgaacctcag ccatagaaac tcctcggaca 60

accttcaaca gttcaactgg cgttatccgg cataatccct atataatcta atctccttcc 120

cacccattca atcccatccc caactccaac aattgtctcc tgtgtctacg attctctctt 180

ccggctttct aattcactcc ttggtaacac agagaattgt cgtgttgggg taaaacccgg 240

gatcatcaag ttgtagacac cacggctata cacggagcac agcggccact tgcacatgcc 300

caatcagtac gagggaaggg agctataact attgagagta acccttctac gcacggcgga 360

cgtggggctt tgccttctga aggcggcagt ccctctgacc tcctcttcct cgccggcggt 420

ggtttttact ccttcttcgt tcccatcgta gcctaggtgc attttattta gttttggggt 480

ttttcgtata tacatatata cacaattcgt atcaagatct gtttgcttgc cttgcgtccc 540

aattaatcga agaag 555

<210> 5

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

acagagaatt gtcgtgttgg ggtaaaaccc gggatcatca agttgtagac accacggcta 60

tacacggagc acagcggcca cttgcacatg c 91

<210> 6

<211> 464

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

aagccactca aacactcctc tcgtcacggc cgaacctcag ccatagaaac tcctcggaca 60

accttcaaca gttcaactgg cgttatccgg cataatccct atataatcta atctccttcc 120

cacccattca atcccatccc caactccaac aattgtctcc tgtgtctacg attctctctt 180

ccggctttct aattcactcc ttggtaaccc aatcagtacg agggaaggga gctataacta 240

ttgagagtaa cccttctacg cacggcggac gtggggcttt gccttctgaa ggcggcagtc 300

cctctgacct cctcttcctc gccggcggtg gtttttactc cttcttcgtt cccatcgtag 360

cctaggtgca ttttatttag ttttggggtt tttcgtatat acatatatac acaattcgta 420

tcaagatctg tttgcttgcc ttgcgtccca attaatcgaa gaag 464

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

acgacaagtt gcagacatca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

ctgtgctccg tgtatagccg 20

Claims

1.一种提高细胞中Vc含量的方法，其特征在于，所述方法包括向所述细胞中引入5’-UTR核苷酸突变体的步骤；

所述5’-UTR核苷酸突变体与亲本5’-UTR核苷酸相比存在片段缺失，所述亲本5’-UTR核苷酸的序列如SEQ ID NO.:1所示，所述缺失的片段如SEQ ID NO.:2所示；

所述引入5’-UTR核苷酸突变体包括利用基因编辑技术将细胞内源性5’-UTR突变引入所述5’-UTR核苷酸突变体的步骤；

所述细胞为生菜细胞。

2.一种改良植物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(a)提供一植物细胞、植物组织或植物部分，向所述植物细胞、植物组织、植物部分中引入5’-UTR核苷酸突变体；

(b)将步骤(a)中的植物细胞、植物组织、植物部分再生成植株；

所述引入5’-UTR核苷酸突变体包括利用基因编辑技术将植物内源性5’-UTR突变引入所述5’-UTR核苷酸突变体的步骤；

所述改良植物为提高植物中的维生素C的含量；

所述植物为生菜。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述5’-UTR核苷酸突变体的序列如SEQID NO.:3所示。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术选自下组：CRISPR基因编辑、易错PCR、基因重组、TALEN和ZFN。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CRISPR基因编辑的基因编辑工具包括guide RNA、Cas蛋白。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述引入5’-UTR核苷酸突变体包括利用用于基因编辑的核酸构建物将内源性5’-UTR突变引入所述5’-UTR核苷酸突变体的步骤，所述用于基因编辑的核酸构建物包括基因编辑蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因编辑蛋白为CRISPR蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CRISPR蛋白选自下组：Cas9、Cas12、Cas13或其组合。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述核酸构建物还包括gRNA。