KR101340958B1

KR101340958B1 - 국화에서 분리된 신규 ｆ３＇ｈ 유전자 및 이를 이용한 화색 돌연변이체 선별 방법

Info

Publication number: KR101340958B1
Application number: KR1020120072862A
Authority: KR
Inventors: 강시용; 정성진; 김동섭; 김진백; 김상훈; 이긍주
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2012-07-04
Filing date: 2012-07-04
Publication date: 2013-12-13
Also published as: KR20120093118A

Abstract

본 발명은 국화(Dendranthema grandiforum; Chrysanthemum)에서 분리된 시아니딘(Cyanidin)의 생합성에 관련된 신규 유전자에 관한 것으로, 야생형 또는 화색 돌연변이체 국화로부터 분리한 신규 플라보노이드 3'-하이드록실라아제(flavonoid 3'-hydroxylase; F3'H)에 관한 것이다. 상기 분리된 신규 F3'H 유전자는 다른 다양한 식물 유래 F3'H 유전자와 서열에 차이가 있으므로, 국화의 화색에 관련된 유전자원을 제공하였고, 상기 유전자원은 새로운 국화품종의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

국화에서 분리된 신규 Ｆ３＇Ｈ 유전자 및 이를 이용한 화색 돌연변이체 선별 방법{A novel F3'H gene isolated from Dendranthema grandiforum and a method for screening flower color mutants using the same}

본 발명은 화색 돌연변이체 국화(Dendranthema grandiforum; Chrysanthemum)에서 분리된 시아니딘(Cyanidin)의 생합성에 관련된 신규 유전자에 관한 것이다.

국화(Chrysanthemum)는 꽃 시장에서 거래되는 식물들 중 장미 다음으로 두 번째로 큰 화훼 식물이므로 국화의 다양한 종류의 화색은 이용가치가 있다. 상기 국화의 3개의 주요 색소[베타레인(betalain), 카로티노이드(carotenoid), 안토시아닌(anthocyanine)]는 자연 화색을 구성한다(E. Grotewold., Annu Rev Plant Biol., 57:761-780, 2006). 안토시아닌 색소는 주로 화색 중 주황색, 빨간색, 보라색 및 파란색을 이루고, 그들의 생합성 경로는 잘 확립되어 있다(Y. Tanaka et al ., Plant Cell Tissue and Organ Cult., 80:1-24, 2005; J. B. Harborne et al ., The Handbook of Natural Flavonoids 2. London: Wiley, pp. 196-201; 1999).

방사선 돌연변이 육종이란 식물체에 방사선을 조사하여 돌연변이 빈도를 높여서, 그 중에서 유용한 변이체를 여러 세대에 걸쳐 선발 육성하는 것이다. 이는 1 ~ 2개의 주요 특성을 변화시킴으로써 식물 다양성을 개선하고, 향상된 농업적 특성을 가지는 새로운 품종 개발을 위해 사용될 수 있다(K. Sudhir et al ., Planta Med. (72):241-247, 2006). 상기 돌연변이의 발생 원인은 식물체에 방사선을 조사하면 염색체나 DNA 일부를 변화시킴으로 유전자 정보전달 신호 체계가 바뀌게 되고, 이러한 변화가 일어난 세포에서 개체가 발생하면 돌연변이체가 되기 때문이다. 상기 방사선 육종 기술은 1) 1 ~ 2개의 형질의 개량에 유리하여 기존 품종의 단점 형질을 개량할 수 있고, 2) 일년생, 영년생, 종자번식, 영양번식 등 다양한 식물, 및 종자, 삽수체, 조직배양체, 화분, 식물체 등 다양한 식물재료에 적용이 가능하며, 3) 교잡 및 유전자변형 육종기술 등과 비교하여 육종에 소요되는 시간과 경비가 적게 드는 장점이 있다. 상기 방사선 육종 기술은 유전자원이 빈약한 자생식물, 외국도입 식물 등의 품종 개발 및 육종소재의 확대에 기여할 수 있고, 상기 기술에 의한 돌연변이체는 신규 유전자의 탐색 및 유전자의 기능을 밝히는 기능유전체 연구를 위한 중요한 유전자원 소재로 활용될 수 있다.

FAO/IAEA MVD(Mutant Varieties Database; www-infocris.iaea.org/MVD/)에 의하면, 국외의 돌연변이 육종의 개발 현황은 2007년을 기준으로, 돌연변이 육성실적 63 개국, 172 식물, 2600 여종에 달한다. 각국은 방사선 육종 전담 연구소를 운영하며, 기능유전체 연구를 위한 방사선 유전자원 대량 창출 및 Gene Bank 사업을 운영중이다. 이에 반해, 국내는 1973년 방사선농학연구소가 원자력연구소와의 통폐합 이후 연구조직의 축소에 따라 경쟁국에 비해 저조한 실적이다. 국내 방사선 육종연구는 한국원자력연구원 방사선육종연구팀을 중심으로 수행하고 있으며, 농촌진흥청 및 대학의 일부 연구자들이 단발적으로 연구하고 있는 실정이다. 그동안 국내 방사선 육종기술에 의한 개발중 대표적인 것으로는 1) 내염성, 고영양성 유용 돌연변이 벼 품종개발; 2) 유해물질 저감, 내병해충성, 내습성 콩 품종개발; 3) 무궁화 재래종 및 도입종을 개량한 신품종 개발; 4) 고부가가치의 돌연변이 난 개발; 5) 국화 및 글라디올러스 등의 화훼류, 및 버뮤다그래스 등의 자생식물의 유망 돌연변이체 개발; 및 6) 인삼 등의 특약용 작물의 유용 돌연변이체 개발; 등이 있다. 현재는 돌연변이 유전자원은행 사업 및 기능유전체 연구 기반을 구축중이며, 이온빔 및 감마파이토트론을 이용한 첨단방사선 육종기술을 개발중이다.

방사선 조사를 이용한 돌연변이 유발 기술은 보리, 쌀, 보리, 면화, 땅콩 및 콩 등의 주요 작물의 기능 향상을 위해 사용되었다. 또한, 야자, 사과, 감자, 고구마 및 파인애플 등의 보급 식물의 대량 공급을 위해 연구되었고, 국화(Chrysantheum), 알스트로에메리아(Alstroemeria), 다알리아(dahlia), 부겐빌리아(Bougainvillea), 장미(Rose), 아키메네스(Achimenes), 베고니아(Begonia), 카네이션(Carnation), 스트렙토카르프스(Streptocarpus) 및 진달래(Azalea) 등의 화훼 식물 및 일부 과일나무에서 식물의 성장, 꽃의 발달과 노화 및 과일 형성의 연구를 위해 수행되었다. 또한, 애기장대(Arabidopsis), 페튜니아(Petunia), 금어초(Antirrhinum) 및 토마토(Lycopersicon) 등에서 유전자 분석을 위해 수행되었다(B.S. Ahloowalia et al ., Euphytica 118: 167-173, 2001). 아울러, 카네이션을 이온빔으로 조사하여 색깔과 모양이 다른 카네이션 돌연변이를 유발함으로써 짧은 시간에 상업적인 품종을 개발하였다(M. Okamura et al ., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 206:574-578, 2003).

꽃의 화색 등의 시각적 변화는 색소의 양 및 구성 성분의 변화에 의한 것으로, 꽃의 구조 유전자 또는 조절 유전자의 생합성 경로의 돌연변이는 화색의 변화를 가져왔다(T. Naktsuka et al ., Plant Sci., 169:949-958, 2005). 즉, 화색 돌연변이는 안토시아닌 관련 유전자 및 조절 인자를 특정하기 위해 사용되었다(Martin C et al ., The Molecular Biology of Flowering, CAB International, Wallingford Oxford, pp. 219-255, 1991). 또는 플라보노이드 합성의 초기 단계를 억제한 돌연변이는 흰색 꽃을 나타내었으며, 후기 단계를 억제한 돌연변이는 특정 안토시아닌의 축적을 통해 다른 화색의 꽃을 나타내었다. 화색의 자연 돌연변이는 야생 유전자원으로부터 선별되었으나 최근에는 감마선 또는 화학물질 등의 인공 돌연변이가 사용되고 있다(Harten AM, Cambridge University Press , London; 1998; Datta SK et al ., Current Science, 88(1):155-158, 2005; Park IS et al ., Flower Res. J., 15(1):2-57, 2007).

또한, 이전부터 외래유전자의 도입을 통한 형질전환법(아그로박테리움, 파티클건 등)이 국화의 새로운 육종법으로 자리를 잡아가고 있다(Bush and Pueppke, Appl Environ Microbiol. 57(9):2468-2472, 1991). 형질전환 법은 특정 유용형질의 육종에 이용될 수 있는 장점이 있으므로 국화에 있어서 화색, 내병성 등과 같은 상품성 및 재배 특성 등의 개량에 효과적으로 이용될 수 있다(Courtney-Gutterson et al., Biotechnology (NY) 12(3):268-271, 1994). 대한민국 공개특허 제10-2006-0080067호에서는 새로운 국화품종의 개발을 위해, 꽃의 색을 결정하는 유전자를 아그로박테리움을 통해 국화에 도입함으로써 화색이 변화되는 국화 식물체를 생산하는 방법을 제공한 바 있다.

이에, 본 발명자들은 국화의 화색에 관련된 유전자원을 제공하고자, 국화에 방사선을 조사하여 선발된 화색 돌연변이체로부터 시아니딘(Cyanidin)의 생합성에 관련된 신규 플라보노이드 3'-하이드록실라아제(flavonoid 3'-hydroxylase; F3'H) 유전자를 분리하였다.

본 발명의 목적은 국화로부터 분리한 시아니딘(Cyanidin)의 생합성에 관련된 신규 플라보노이드 3'-하이드록실라아제(flavonoid 3'-hydroxylase; F3'H), 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 식물체를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 국화로부터 분리한 신규 플라보노이드 3'-하이드록실라아제(flavonoid 3'-hydroxylase; F3'H) 및 이의 변이체, 또는 이의 활성 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 또는 이들의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 형질전환 식물체를 제공한다.

국화(Dendranthema grandiforum; Chrysanthemum)에서 분리된 신규 F3'H 유전자는 다른 다양한 식물 유래 F3'H 유전자와 차이가 있고, 감마선을 조사하여 유발된 화색 돌연변이들에서 각기 F3'H 유전자의 차이가 있음을 확인함으로써 국화의 화색에 관련된 유전자원을 제공하였고, 상기 유전자원은 새로운 국화품종의 개발에 유용하게 이용될 수 있다. 세계 3대 화훼 중의 하나인 국화의 화색을 변화시킬 수 있게 된다면 화훼소비자의 취향을 다양한 측면에서 충족시킬 수 있어서, 화훼농가에 새로운 소득품목으로 각광받을 수 있을 것이다.

도 1은 국화의 야생형 및 화색 돌연변이체의 F3'H 유전자의 서열분석 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 F3'H 유전자가 동정된 식물의 F3'H 내의 보존 부위(conserved region)를 나타낸 도이다.
도 3은 국화에서 분리한 RNA 또는 게놈 DNA로부터 퇴화 프라이머를 이용하여 F3'H 유전자를 증폭한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 국화에서 분리한 F3'H cDNA를 다른 식물체들에서 분리한 F3'H cDNA와 상동성을 비교분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 국화에서 분리한 F3'H 아미노산 서열을 다른 식물체들에서 분리한 F3'H 아미노산 서열과 상동성을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 국화의 야생형 및 화색 돌연변이체의 F3'H 아미노산 서열의 상동성을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 국화의 야생형 및 화색 돌연변이체의 F3'H 게놈 서열의 상동성을 비교한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적인 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 플라보노이드 3'-하이드록실라아제(flavonoid 3'-hydroxylase; F3'H) 활성을 갖는 하기 a 내지 e 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 또는 이들의 활성 단편을 제공한다:

a) 서열번호 1, 10 내지 14로 기재되는 cDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

b) 서열번호 10 내지 14로 기재되는 cDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나와 엄격한 조건에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

c) 서열번호 2, 15 내지 19로 기재되는 gDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

d) 서열번호 2, 15 내지 19로 기재되는 gDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나와 엄격한 조건에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,

e) 서열번호 3, 20 내지 24로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

상기 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 또는 이들의 활성 단편은 야생형 국화(Dendranthema grandiforum; Chrysanthemum)로부터 유래한 것이다.

본 발명자들은 국화로부터 유래한 F3'H 유전자 및 이의 단백질이 신규한지 알아보기 위해, 1개의 야생형(wild type; WT) 국화와 이에 방사선을 조사하여 유발된 화색 돌연변이(Park et al ., 화훼연구 제 15권 제 1호, pp.52 ~ 57, 2007) 5개체로부터 시아니딘(Cyanidin)의 생합성에 관련된 신규 플라보노이드 3'-하이드록실라아제(flavonoid 3'-hydroxylase; F3'H)를 분리하였다(도 1 내지 도 3 참조). 상기 F3'H의 cDNA 서열(서열번호 1) 및 이의 아미노산 서열(서열번호 3)과 다른 식물 유래 F3'H의 유연관계를 blastn 및 blastp(//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여 분석한 결과, 야생형 국화 유래 F3'H의 cDNA는 각각의 식물체에서 전혀 다른 서열을 갖는 것으로 확인되었다(도 4 및 도 5 참조). 또한, ClustalW2(//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)를 이용하여 상기 야생형 국화 유래 F3'H 아미노산 서열(서열번호 3)과 5개의 화색 돌연변이체의 서열번호 10 내지 14로 기재된 F3'H cDNA가 암호화하는 아미노산 서열(서열번호 20 내지 24)을 정렬한 결과, 각 돌연변이체의 F3'H 아미노산 서열의 길이는 야생형의 것과 동일하게 508개이었으나, 몇 개의 아미노산이 변이된 것으로 나타났다(도 6 참조). 또한, 야생형 국화 유래의 gDNA 서열(서열번호 2)은 3 개의 엑손 사이에 2개의 인트론이 존재하였다. 아울러, 상기 WT 국화 유래 F3'H의 gDNA 서열(서열번호 2)과 5개의 화색 돌연변이체의 gDNA 서열(서열번호 15 내지 19)은 폴리 A 테일(polyA tail)의 3' UTR에서 서열에 차이가 있었다(도 7 참조).

이에, 본 발명의 F3'H 유전자가 기존 F3'H 유전자와 서열의 차이가 있음을 확인함으로써 국화의 화색에 관련된 유전자원을 제공하였다.

상기 "엄격한 조건하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드"란 서열번호 1, 2, 10 내지 19로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 3, 20 내지 24로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 탐침자로서 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던(southern) 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 등의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning 제 3 판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기재된 방법일 수 있다.

본원에 사용된 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중에서 임의로 선택될 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 32℃에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 서열번호 3, 20 내지 24로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편을 본 발명의 범위에 포함한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 3, 15 내지 10으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미한다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 70% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 생화학적 활성을 가진다면 본원 발명에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 또는 이들의 활성 단편을 암호화하는 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 또는 이들의 활성 단편을 암호화하는 하기 a 내지 d 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 제공한다:

c) 서열번호 2, 15 내지 19로 기재되는 gDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,

d) 서열번호 2, 15 내지 19로 기재되는 gDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나와 엄격한 조건에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드.

상기 폴리뉴클레오티드는 cDNA 또는 gDNA인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, RNA, DNA, cDNA, mRNA, gDNA 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것은 모두 가능하다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 F3'H 및 이의 변이체, 또는 이의 활성 단편을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 F3'H 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 10 내지 19로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 70% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질의 동일한 생화학적 활성을 가진다면 본원 발명에 포함된다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 서열번호 3, 20 내지 24로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 1, 2, 10 내지 19로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되나, 본 발명은 이에 제한되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 코딩할 수 있는 한, 서열번호 1, 2, 10 내지 19로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열의 염기서열과 실질적으로 동일한 다른 염기서열을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩될 수도 있다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.

상기 발현벡터는 아그로박테리움속 세균을 매개로 형질전환될 경우, Ti 플라스미드(Agrobacterium tumefaciens) 또는 Ri 플라스미드(Agrobacterium rhizogenes) 등이 사용될 수 있다. 또한, 유전자 공학 기법에 의한 클로닝을 용이하게 하기 위해서 개발된 중간 벡터, 강병원성(super-virulent) 벡터, 바이너리 벡터(binary vector) 또는 슈퍼-바이너리 벡터(super-binary vector) 등도 사용될 수 있다. 또는 고 수율로 F3'H 및 이의 변이체, 또는 이의 활성 단편을 발현시키고자 하는 경우, 식물 바이러스 벡터가 사용될 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 3계 교잡법, 일렉트로포레이션법, 일렉트로인젝션법, PEG 등의 화학적인 처리에 의한 방법 등에 의해 아그로박테리움속 세균에 도입될 수 있다.

상기 숙주세포는 아그로박테리움속 세균이면 특별히 한정되지 않지만, 아그로박테리움 튜메파시엔스[Agrobacterium tumefaciens LBA4404(Hoekema A et al., Nature 303:179~180, 1983)] 및 EHA101을 바람직하게 이용할 수 있다.

상기 형질전환체는 대한민국 공개특허 제10-2006-0080067호에서 기재한 바와 같이, 새로운 국화품종의 개발을 위해 국화에 도입함으로써 화색이 변화되는 국화 식물체를 생산하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터가 숙주세포에 형질전환된 형질전환체를 제조하는 단계;

2) 대상 식물의 식물재료를 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 상기 식물재료와 상기 단계 1)의 형질전환체를 공동배양 배지에서 공동배양하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 형질전환된 식물재료를 선발하는 단계를 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 식물체의 제조방법을 제공한다.

상기 방법은 필요에 따라,

5) 상기 선발된 식물재료를 재분화하는 단계를 추가로 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

단계 2)의 대상식물은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물의 어느 것이나 포함한다. 단자엽 식물에는, 벼, 옥수수, 대맥, 밀, 아스파라거스 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 쌍자엽 식물에는 국화, 담배, 콩, 고구마, 목화, 해바라기 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 국화이다.

단계 2)에서 식물재료는 아그로박테리움을 매개로 형질전환하기 위해 사용되는 대상 식물로부터 유래한 재료를 의미하고, 상기 대상 식물의 세포, 잎, 뿌리, 줄기, 열매, 식물조직, 미숙배, 캘러스 또는 부정배 유사 조직, 또는 완전한 식물체 등 이에 제한되지 않는 식물의 모든 태양을 포함한다. 상기 식물재료는 바람직하게는 미숙배 또는 캘러스이며, 가장 바람직하게는 미숙배이다. 본 명세서에 있어서, 식물의 세포, 조직, 완전한 식물체라는 표현은 기술분야에 있어서 일반적으로 이용되는 의미로 이용된다. 본 명세서에 있어서, 미숙배는 수분(受粉) 후의 등숙(登熟) 과정에 있는 미숙종자의 배를 말한다. 본 명세서에 있어서, 캘러스는 임의적으로 증식하는 미분화 상태의 세포덩어리를 말한다. 캘러스는 식물조직이 분화된 세포를 옥신(예컨대, 2, 4-D) 또는 사이토카이닌 등의 식물성장 조절물질을 포함하는 배지(탈분화 배지)에서 배양해서 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 돌연변이의 제조

본 발명자들은 스프레이-형태 국화(chryansthemum)인 'Argus'(2004년 충남 예산 국화 시험장에서 분양받음)에 정읍 방사선 기술연구소 내 선원 ¹³⁷Cs 감마선을 이용한 감마셀-40(Nordion, Canada)을 이용하여 실온(12±1℃)에서 흡수선량 30, 40 및 50 Gy으로 조사하여 돌연변이를 유발시켰다. 상기 돌연변이들 중 선발된 화색 돌연변이체 국화 5개체를 한국원자력연구원 내 방사선 기술연구소의 그린하우스에서 재배하였다. 상기 5개의 돌연변이는 다른 꽃 색깔, 꽃 모양 및 꽃 크기를 가졌다(Park et al ., 화훼연구 제15권 제1호, pp. 52 ~ 57, 2007). 상기 5개의 돌연변이체와 야생형(wild type; WT)을 대상으로 플라보노이드 3'-하이드록실라아제(flavonoid 3'-hydroxylase; F3'H)를 암호화하는 유전자 서열을 동정하였다(도 1).

< 실시예 2> F3'H 의 유전자의 분리 및 동정

<2-1> F3'H 의 cDNA 의 클로닝

본 발명자들은 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 상기 국화 WT 및 5개의 화색 돌연변이체로부터 전체 RNA를 분리하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응은 Takara RNA PCR Kit(AMV) Ver. 3.0(Takara, Japan)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행되었다. F3'H 유전자 서열을 획득하기 위해, 오스테오스퍼멈(Osteospermum), 거베라(Gerbera), 콩(Glycine), 이포모에아 펄프(Ipomoea purp) 및 애기장대(Arabidopsis) 등의 식물의 보존된 핵산 서열로부터, ClustalW 프로그램(//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)을 이용하여 PCR용 퇴화 프라이머쌍(degenerate primers)을 설계하였다(도 2): 서열번호 4로 기재되는 정방향 프라이머 5'-TCGGAAACCTACCGCATCTCGGC-3'; 서열번호 5로 기재되는 역방향 프라이머: 5'-TGTGGGCCATAGCCCGAGACCCA-3'. 상기 프라이머쌍을 이용하여 증폭된 약 0.5 kbp의 절편들은 RBC T&A 클로닝 키트(cloning kit) 및 HIT 형질전환용 세포(competent cell)(RBC Bioscience, Taiwan)로 서브클론(subclone)되었다.

추가로 F3'H 유전자의 3'-말단을 결정하기 위해, 3'-RACE를 Takara RNA PCR Kit(AMV) Ver. 3.0(Takara, Japan)을 이용하여 서열번호 6으로 기재된 정방향 프라이머(5'-TGTAACAGAATTGGACTTGAGCC-3') 및 올리고(oligo) dT 프라이머로 수행되어 국화 유래 DgF3'H cDNA의 약 0.9 kbp의 부분 서열이 획득되었다(도 3). 또한, 전장 cDNA 서열을 결정하기 위해 5'-RACE를 SMART™ RACE cDNA 증폭 키트(Amplification Kit; Clontech, CA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 상기 5' 말단 절편은 서열번호 7으로 기재된 역방향 프라이머(5'-GCACCTTATGGTCCAAGGTGGCG-3') 및 올리고 dT 프라이머를 이용하여 약 0.6 kbp의 부분 서열이 증폭되었다(도 3). 각 증폭 산물은 RBC T&A 클로닝 키트 및 HIT 형질전환용 세포로 서브클론되었다.

상기 각 서브클론을 시퀀싱한 후, 각 염기서열을 GENETYX-WIN Software Ver. 5.0(Genetyx, Tokyo)을 이용하여 분석한 결과, 야생형 국화로부터 분리된 전장 F3'H cDNA는 508개의 아미노산(서열번호 3)을 암호화하는 1527 bp의 ORF(서열번호 1)를 포함하였다. 상기 전장 cDNA 서열은 5' UTR가 15 bp이고 3' UTR이 polyA를 포함해서 132 bp로 확인되었다.

또한, 상기 야생형 국화 유래 F3'H cDNA 서열(서열번호 1) 및 이의 아미노산 서열(서열번호 3)과 다른 식물 유래 F3'H의 유연관계를 blastn 및 blastp(//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여 분석한 결과, 야생형 국화 유래의 F3'H는 각각의 식물체에서 전혀 다른 서열을 갖는 것으로 확인되었다(도 4 및 도 5).

아울러, 상기 야생형 국화 유래 F3'H 아미노산 서열(서열번호 3)과 5개의 화색 돌연변이체의 서열번호 10 내지 14로 기재된 F3'H cDNA가 암호화하는 아미노산 서열(서열번호 20 내지 24)은 ClustalW2(//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)를 이용하여 정렬한 결과, 각 돌연변이체의 F3'H 아미노산 서열의 길이는 야생형의 것과 동일하게 508개이었으나, 몇 개의 아미노산이 변이된 것으로 나타났다(도 6).

<2-2> F3'H 의 gDNA 의 클로닝

본 발명자들은 상기 국화 야생형 및 5개의 화색 돌연변이체로부터 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide; CTAB) 방법을 이용하여 게놈(Genomic) DNA를 분리하였다. 구체적으로, 우선, 상기 서열번호 1로 기재되는 전장 F3'H cDNA 유래 프라이머쌍인, 서열번호 8로 기재되는 정방향 프라이머(5'-ATGAACATTTTACCTTTCGTATT-3') 및 서열번호 9로 기재되는 역방향 프라이머(5'-CCCACGTATATGAAAGCATTTAA-3')를 고안하였다. 이후, 상기 프라이머쌍을 이용하여 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 하기 조건으로 PCR을 수행하였다: 5분 동안 94℃에서 초기 변성 후, 증폭(30초 동안 94℃, 30초 동안 56℃ 및 1분 30초 동안 72℃)의 35 사이클(cycle). 각 증폭 산물은 RBC T&A 벡터로 클로닝하였다.

상기 각 서브클론을 시퀀싱한 후, 각 염기서열을 GENETYX-WIN Software Ver. 5.0을 이용하여 분석한 결과, 국화 WT의 gDNA 서열(서열번호 2)은 3 개의 엑손 사이에 2개의 인트론이 존재하였다.

상기 WT 국화 유래 F3'H gDNA 서열(서열번호 2)과 5개의 화색 돌연변이체의 gDNA 서열(서열번호 15 내지 19)은 ClustalW2를 이용하여 정렬한 결과, 폴리 A 테일(polyA tail)의 3' UTR에서 서열에 차이가 있었다(도 7).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

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1) 플라보노이드 3'-하이드록실라아제(flavonoid 3'-hydroxylase; F3'H) 활성을 갖는, 서열번호 15 내지 19로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리뉴클레오티를 포함하는 재조합 벡터가 아그로박테리움에 형질전환된 형질전환체를 제조하는 단계;
2) 국화(Dendranthema grandiforum Chrysanthemum)의 식물재료를 제조하는 단계;
3) 단계 2)의 상기 식물재료와 상기 단계 1)의 형질전환체를 공동배양 배지에서 공동배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 형질전환된 식물재료를 선발하는 단계를 포함하는 국화의 화색 돌연변이체 제조방법.
제 7항에 있어서,
5) 상기 선발된 식물재료를 재분화하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 국화의 화색 돌연변이체 제조방법.
제 7항에 있어서, 단계 2)의 식물재료는 상기 국화의 세포, 잎, 뿌리, 줄기, 열매, 식물조직, 미숙배, 캘러스 및 완전한 식물체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 국화의 화색 돌연변이체 제조방법.
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