KR100871592B1 - 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배니코티아나 벤타미아나（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）유래의 ＩｓｐＥ - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배 (Nicotiana benthamiana) 유래의 IspE 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 식물체 부위별 발현패턴 및 세포내 위치, 상기 유전자의 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS)을 이용하기 위한 재조합 식물 발현벡터, 상기 VIGS를 수행하기 위한 벡터가 형질전환된 TRV:IspE VIGS 개체에서 엽록체 크기 및 색소체 함량의 변화를 관찰한 내용에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 담배(Nicotiana benthamiana) 유래의 IspE 단백질은 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여한다.

니코티아나 벤타미아나, IspE, 엽록체, 미토콘드리아, VIGS

Description

엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배 니코티아나 벤타미아나（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）유래의 ＩｓｐＥ{IspE gene involved in development of chloroplast and mitochondria in plants}

도1은 MEP 경로를 나타내는 그림이고,

도2는 IspE 유전자와 연관된 시퀀스들의 정열을 나타낸 그림이고,

도3은 VIGS 구조물, TRV:IspE VIGS 개체의 표현형과 내생 유전자의 발현억제 정도를 관찰한 그림이고,

도4는 IspE 유전자의 발현을 관찰한 그림이고,

도5는 TRV 대조구와 TRV:IspE VIGS 개체의 엽록체의 수와 크기를 관찰한 그림이고,

도6은 미토콘드리아의 수와 ROS 생산을 관찰한 그림이고,

도7은 엽록체와 미토콘드리아의 초미세 구조의 분석을 나타내는 그림이고,

도8은 TRV 대조구와 TRV:IspE VIGS 개체의 잎 표피 세포를 관찰한 그림이고,

도9는 TRV:IspE VIGS 개체의 엽록소와 카로티노이드 함량 분석과 TRV:IspE VIGS 개체에서 MEP 경로에 관여하는 유전자들의 발현을 관찰한 그림이다.

본 발명은 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 유래의 IspE 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 식물체 부위별 발현패턴 및 세포내 위치, 상기 유전자의 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS)을 이용하기 위한 재조합 식물 발현벡터, 상기 VIGS를 수행하기 위한 벡터가 형질전환된 IspE VIGS개체에서 엽록체 크기 및 색소체 함량의 변화를 관찰한 내용에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 담배(Nicotiana benthamiana) 유래의 IspE 단백질은 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여한다.

이소프레노이드(Isoprenoids)는 식물의 대사산물 중 그 기능과 구조에 있어 가장 다양한 집단에 속한다. 이소프레노이드는 광합성, 호흡, 성장 조절 기능에 있어 주요한 대사산물로써 기능을 갖고 있는 반면에 다른 식물체나 꽃가루 매개자(pollinators)와 상호작용을 하거나 방어 기작의 기능으로는 보조 대사산물로써 기능을 한다. 이러한 이소프레노이드의 기능과 구조의 다양성에도 불구하고, 이소프레노이드들 모두는 다섯 개의 탄소골격을 기본으로 하는 isopentenyl diphosphate (IPP)와 이것의 이성질체인 dimethylallyl diphosphate (DMAPP)로부터 유도된다. 식물체는 세포질의 mevalonic acid (MVA) pathway와 색소체의 methylerythritol phosphate (MEP) pathway (Refs)와 같은 두 개의 경로를 통하여 IPP와 DMAPP를 생합성한다. MVA 경로는 1950년대에 효모와 동물에서 발견하였고, 그 후 다른 많은 생물체에서 연구되어 왔으나, MEP 경로에 대한 연구는 최근에 이루어졌다.

식물체의 MVA 경로로부터 sterols, brassinosteroids, sesquiterpenes와 polyterpenes이 만들어진다. 미토콘드리아 이소프레노이드는 MVA경로로부터 유도된 IPP로 만들어지는데, 이것은 세포질에서 미토콘드리아로 이동된다. MEP 경로는 isoprene, carotenoids, plastoquinones, phytol와 gebberellins와 abscisic acid와 같은 식물체 호르몬을 만들기 위해 IPP와 DMAPP를 생산한다. 애기장대는 E. coli MEP 경로의 생합성 효소들의 상동체(homologs)가 존재하고, 식물의 이러한 유전자 산물들 전부는 색소체 이소프레노이드 생합성을 위한 것으로 보이는 엽록체 타겟 신호를 가지고 있다. MEP 경로에서 첫 번째 과정은 pyruvate와 glyceraldehydes-3-phosphate이 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS)에 의하여 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate (DXP)로 전환된다.

DXP는 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (IspC 또는 DXR)에 의하여 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP)로 전환된다. MEP이 연속적으로 IPP와 DMAPP로 전환되는 것은 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase (IspD 또는 CMS), 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase (IspE 또는 CMK), 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase (IspF 또는 MCS), 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate synthase (IspG 또는 HDS)와 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase (IspH 또는 HDR) 에 의 한 것이다(도1).

MEP 경로에서 식물 상동체(homologs)의 기능이 조사되었다. DXS 유전자 (cla1)가 결핍된 돌연변이는 애기장대에서 엽록소와 카로티노이드가 손상된 알비노 현상(albino phenotype)을 보였다. DXS, IspC (DXR)와 IspD (CMS)을 암호화하는 유전자가 결핍되어 알비노 현상을 보이는 돌연변이체에 대한 연구가 진행중이다. 담배(Nicotiana benthamiana)에서는 VIGS (Page, J. E., Hause, G., Raschke, M., Gao, W., Schmidt, J., Zenk, M. H., and Kutchan, T. M. (2004) Plant Physiol. 134, 1401-1413)로, 애기장대에서는 IspD 유전자의 안티센스(antisense)의 발현으로 IspG와 IspH 유전자의 하위조절 (downregulation)에 의하여 알비노현상이 일어난다는 것이 밝혀졌다.

최근에, 엽록체 발달에 필요한 CLB4와 CLB6와 같은 엽록체 생물속생설(CHLOROPLAST BIOGENESIS) 유전자는 IspG와 IspH를 암호화하는 것으로 각각 밝혀졌다(Guti, M. L., Gillmor, C. S., Jim, L. F., Guevara-Garc, A., and Le, P. (2004) Plant Physiol. 135, 471-482; Guevara-Garc, A., San Rom, C.,Arroyo, A., Cort, M. E., Guti, M. L., and Le, P. (2005) Plant Cell 17, 628-643). IspH 결핍 돌연변이(null mutation)와 도입 유전자로 인한 내재 유전자 침묵(transgene-induced gene silencing)으로 애기장대에서 IspH 발현의 결핍에 의해 야기되는 표현형을 조사하였다(Hsieh, M. H., and Goodman, H. M. (2005) Plant Physiol. 138, 641- 653).

중요하게도, DXR, IspG와 IspH의 식물 상동체는(plant homologs)는 E. coli에서 일치하는 유전자의 결핍을 보완할 수 있는 것으로 나타났는데, 이것은 MEP 경로에서 박테리아와 식물의 효소 사이에 기능적으로 보존되어 있는 것을 의미한다(Carretero-Paulet, L., Ahumada, I., Cunillera, N., Rodr, M., Ferrer, A., Boronat, A., and Campos, N. (2002) Plant Physiol. 129, 1581-1591; Querol, J., Campos, N., Imperial, S., Boronat, A., and Rodr, M. (2002) FEBS Lett. 514, 343-346; Hsieh, M. H., and Goodman, H. M. (2005) Plant Physiol. 138, 641-653). 게다가, 4-diphosphocytidyl-2- C-methyl-D-erythritol kinase을 암호화할 것으로 예상되는 토마토의 IspE 상동체(IspE homolog)는 E. coli IspE 효소와 비슷하게 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol을 인산화하였다(L, H., Rohdich, F., Herz, S., Wungsintaweekul, J., Hecht, S., Schuhr, C. A., Fellermeier M., Sagner, S., Zenk, M. H., Bacher, A., and Eisenreich, W. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1062-1067). 그러나, 식물 세포에서 IspE 유전자의 생리적 기능은 아직 밝혀지지 않았다.

본 발명에서는 담배(Nicotiana benthamiana)에서 VIGS(virus-induced gene silencing)를 이용한 돌연변이체를 제작하여 IspE의 세포내 기능을 조사하였다. 본 발명의 IspE의 발현은 빛과 methyl jasmonate에 의해 자극되고, IspE 단백질은 엽록체로 이동한다는 사실이 밝혀졌다. IspE의 VIGS로 인한 유전자 침묵은 잎의 황색 화와 특이한 잎모양을 유발하였고, 잎세포의 과다분열을 유도하며 엽록체와 미토콘드리아의 생성이 온전하지 못함을 나타내었다. 게다가, IspE VIGS 식물체를 이용하여 MEP 경로에 관여하는 유전자들의 발현양의 변화를 알 수 있었고, 또한 엽록소와 카로티노이드 양이 심각하게 감소하는 것을 통하여 MEP 경로에서 IspE의 기능을 확인할 수 있었다. 이러한 손상된 미토콘드리아가 만들어지는 현상은 엽록체에서 만들어진 IPP가 미토콘드리아의 이소프레노이드 생합성에 기여한다는 가능성을 보여주는 것이다.

따라서, 본 발명은 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 중요한 역할을 수행하는 담배(Nicotiana benthamiana) 유래의 IspE 단백질의 기능을 제공함으로써, 기능이 강화된 품종의 개량 및 육종의 방법으로 IspE 유전자를 이용할 수 있음으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는, 서열번호2의 아미노산 서열을 가지는 담배 (Nicotiana benthamiana) 유래의 IspE 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 상동성 을 가지는 것을 특징으로 하는 IspE 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 IspE 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 IspE 단백질 코딩 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 유전자를 VIGS(Virus-Induced Gene Silencing)를 이용하여 식물체에서 침묵시킴으로써 잎의 황색화와 쭈그러진 잎모양을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 식물체로서 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담 배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 방법에 의해 식물의 잎의 황색화와 쭈그러진 잎모양을 갖는 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 방법에 의한 형질전환 식물체의 종자를 제공하는 것이다.

본 발명은 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배 니코티아나 (Nicotiana benthamiana) 유래의 IspE에 관한 것이다.

본 발명에 따른 IspE 단백질의 범위는 담배로부터 분리된 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 엽록체와 미토콘드리아의 발달에 관여하는 활성을 의미한다.

*또한, 본 발명은 상기 IspE 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 IspE 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상 기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제 4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공 법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 IspE 유전자를 식물체에서 발현시킴으로써 엽록체 와 미토콘드리아의 발달에 관여하는 방법을 제공한다.

식물체에서 IspE 유전자를 발현시키는 방법으로는 IspE 유전자를 포함하고 있는 식물체 또는 IspE 유전자를 포함하고 있지 않은 식물체 내로 IspE유전자를 도입함으로써 수행될 수 있다. 식물체 내로 IspE 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 IspE유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다. 또한, 단자엽 식물이나 목본식물체에서 IspE 유전자를 발현하기 위해서는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 식물의 엽록체와 미토콘드리아의 발달에 관여할 수 있는 식물체로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포 함하는 사료작물류가 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 엽록체와 미토콘드리아의 발달에 변화가 생성된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에 따른 엽록체와 미토콘드리아의 발달에 변화가 생성된 식물은 당업계의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다.　보다 구체적으로, 본 발명의 식물체는 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 IspE 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다.　즉, IspE 유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다.　약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 엽록체와 미토콘드리아의 발달에 변화가 생성된 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

본 발명의 목적은 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는, 서열번호2의 아미노산 서열을 가지는 담배 (Nicotiana benthamiana) 유래의 IspE 단백질을 제공 하는 것이다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 IspE 단백질을 포함한다.

본 발명은 상기의 IspE 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 IspE 단백질 코딩 유전자를 포함한다.

본 발명은 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함한다.

본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 포함한다.

본 발명은 상기의 유전자를 VIGS(Virus-Induced Gene Silencing)를 이용하여 식물체에서 침묵시킴으로써 잎의 황색화와 쭈그러진 잎모양을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법을 포함한다.

본 발명은 상기의 방법에 의해 식물의 잎의 황색화와 쭈그러진 잎모양을 갖는 식물체를 포함한다.

본 발명은 상기의 방법에 의한 형질전환 식물체의 종자를 포함한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

1. IspE의 분석

완전한 길이의 IspE cDNA는 5’-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)로 얻었다. IspE은 410개의 아미노산을 암호화하고, 분자량이 45334.66Da이다. 담배(N. benthamiana) IspE의 아미노산 시퀀스는 다른 식물체와 원핵생물의 관련 유전자와 정렬하였다(도2A). IspE는 애기장대 (accession number At2g26930)에서 유전자 하나가 존재하였다. 식물 IspE 유전자와 높은 상동성(identity)을 보이는 담배(N. benthamiana) IspE 유전자는 시아노박테리아(cyanobacteria)와 같은 원핵생물의 유전자와 높은 유사도(similarity)를 나타낸다(도2A). 식물 단백질과 박테리아 단백질간의 차이점으로 식물 단백질은 N-말단에 긴 익스텐션(extension)을 포함하는데, 이것은 엽록체 타겟 신호이다(chloroplast targeting signal). IspE 단백질은 갈락토키나아제(galactokinase), 호모세린키나아제(homoserine kinase), 메발로네이트 키나아제(mevalonate kinase)와 포스포메발로네이트 키나아제(phosphomevalonate kinase)(L, H., Rohdich, F., Herz, S., Wungsintaweekul, J., Hecht, S., Schuhr, C. A., Fellermeier M., Sagner, S., Zenk, M. H., Bacher, A., and Eisenreich, W. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1062-1067)와 같은 키나아제들로 이루어진 GHMP 페밀리의 특성과 마찬가지로 글리신이 많은 부위가 보존되어 존재한다(도2B).

2. VIGS(Virus-Induced Gene Silencing)를 이용한 IspE 전사의 억제

IspE 유전자의 침묵(silencing)을 유도하기 위하여, IspE cDNA 유전자의 각각의 절편들을 TRV에 기초한 VIGS용 벡터 pTV00에 클로닝하였고, 각각의 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움을 담배(N. benthamiana) 식물체에 침투시켰다(도 3). IspE cDNA의 535 bp를 포함하는 N-말단과 326 bp를 포함하는 C-말단을 갖는 TRV: IspE(1)와 TRV:IspE(2)을 각각 제작하였고, 1.2kb cDNA를 갖는 TRV: IspE(3)를 제작하였다(도 3A). 이러한 구조물을 가진 VIGS 개체는 잎이 노랗게 변하고 특이한 잎 모양을 나타낸 반면, 대조구는 정상적이었다(도 3B). 내생인 IspE mRNA(endogenous IspE mRNA)의 유전자 침묵(silencing)의 효과로써 IspE의 전사체 발현여부를 semiquantitative RT-PCR로 조사하였다(도 3C). IspE-A 프라이머(도 3A의 프라이머셋 참고)를 이용한 RT-PCR의 결과는 TRV:IspE(2) 개체로 감염된 노란 잎의 절편에서 PCR 생산물의 감소를 나타내었다(도 3C). 같은 프라이머로 TRV: IspE(1)과 TRV: IspE(3)개체에서 IspE의 N-말단을 포함하는 바이러스 게놈의 전사체를 탐지하였다. 유사하게도, IspE-B 프라이머(도 3A의 프라이머셋 참고)를 사용한 RT-PCR은 TRV: IspE(1)로부터 감염된 노란색 잎의 절편에서 감소된 PCR 산물이 만들어졌고, 반면에 같은 프라이머로 TRV: IspE(2)와 TRV: IspE(3)개체의 IspE의 C-말단을 포함하는 형질전환체에서는 높은 수준으로 발현되는 것이 검출되었다(도 3C).

3. IspE 발현 패턴

IspE의 조직 특이적인 발현 패턴을 조사하기 위해서, IspE 특이 프라이머를 이용하여 semiquantitative RT-PCR 분석 수행하였다. IspE의 RT-PCR 산물은 담배(N. benthamiana)의 뿌리, 줄기, 성숙한 잎, 어린 잎, 꽃눈과 활짝 핀 꽃을 포함하는 모든 조직에서 검출되었고, 꽃눈과 어린 잎과 같이 어린 조직에서 전사체의 발현 정도가 높은 것으로 나타났다(도 4A). semiquantitative RT-PCR로 IspE의 빛의 양에 따른 유전자 발현 정도를 조사하였다. 평범한 광조건(16 h light/8 h dark), 암조건, 또는 1시간 빛에 노출시킨 뒤 암조건 MS배지에서 각각 7일 동안 배양하였다. IspE mRNA 발현 정도는 암조건보다 명조건에서 키운 묘목이 더 높은 것으로 나타났다. 그러나 1시간 빛에 노출시킨 뒤 암조건에서 배양한 묘목은 명조건에서 IspE mRNA 발현 정도가 증가하는 것으로 나타났다(도 4B). 이것은 IspE의 발현은 빛에 의해 자극을 받는 것을 의미한다.

잎에서 MEP 경로에 관여하는 유전자들 중 methyl jasmonate (MJ)에 반응하여 발현되는 유전자들의 전사체양을 조사하였다(도 4C). 초식동물과 병원균에 대한 식물체의 방어기작으로 MJ(methyl jasmonate)에 의해 유도되는 방어 기작중 하나는 이소프레노이드(isoprenoids)의 생합성이다. NbPIN2와 액틴의 발현양은 대조구로 사용 하였다. IspE 전사체 발현양은 MeJA에 반응하여 조금 증가한 반면, IspD 와 IspF 발현양은 감소하였다. 다른 유전자들의 발현양에는 변화가 없었다. NbPIN2는 시간이 지남에 따라 증가하였다. 따라서 MEP 경로에 관여하는 유전자들은 MeJA에 의하여 다르게 조절 받는 것을 알 수 있다.

4. TRV:IspE 개체의 엽록체

TRV:IspE개체의 노란색 잎 절편으로부터 만들어진 원형질체를 공초점 레이저 주사현미경(confocal laser scanning microscopy)으로 조사하였다(도5A). 대조구로써, TRV개체의 원형질체를 관찰하였다. 잎살세포(mesophyll cells)로부터 만들어진 거의 모든 TRV:IspE 원형질체에서 엽록체가 급격히 감소한 것으로 나타났다. TRV:IspE 개체에서 엽록체의 평균수는 TRV 대조구의 약 19%에 이른다(도5B 왼쪽). 게다가, TRV:IspE 개체의 엽록체의 크기는 TRV 대조구(도5B 오른쪽)보다 대게 작았고, 대조구의 평균 반경의 약 40%로 측정되었다. TRV:IspE 개체에서 몇몇의 엽록체는 불규칙한 모양을 나타냈다(도5A). TRV와 TRV:IspE 개체로부터 분리된 원형질체는 DAPI로 염색하였고, 개개의 엽록체와 엽록체 핵을 관찰하기 위해 미세 슬라이드로 납작하게 만들었다(도5C). TRV 대조구는 엽록체 핵이 희미하게 염색 되었다. 엽록체 핵은 틸라코이드와 연관이 있는 스트로마에서 아주 작은 알갱이로 퍼져있고, 핵의 수와 엽록체 DNA 양은 엽록체 발달과정 중 다양하게 나타났다. TRV 대조구와 비교하여 TRV:IspE 개체의 엽록체는 덜 빽빽한, 퍼진 형상으로 DAPI 형광분석을 통해 알 수 있었고, 반면에 엽록체 크기는 훨씬 줄었다(도5C).

5. TRV:IspE 개체의 미토콘드리아

TRV 대조구와 TRV:IspE 개체의 잎의 원형질체에서 분리한 미토콘드리아는 TMRM와 MitoTracker Green FM (MG) 형광 프로브로 조사하였다(도6A,D). TMRM은 미토콘드리아의 막에 축적된 친지질 양이온(lipophilic cation)인데, 막에 존재하는 TMRM 양이 적어지면 형광이 감소한다. TRV:IspE 개체 잎에서의 원형질체의 평균 TMRM형광은 TRV 대조구의 40%에 해당한다(도6A,C). 이러한 형광의 감소는 원형질체에서의 미토콘드리아 수의 감소를 의미하거나 미토콘드리아의 막 구조가 변한 것을 의미한다. MitoTracker Green FM (MG)은 미토콘드리아 막의 상태에 상관없이 미토콘드리아에서 축적되고 미토콘드리아의 질량을 결정하는데 사용된다. TRV:IspE 개체 잎의 원형질체의 MG(MitoTracker Green FM) 형광은 대개 44%정도로 TRV 대조구보다 낮았다(도6B,E). 이것은 IspE VIGS 개체에서 미토콘드리아 수 또는/ 및 질량은 줄었다는 것을 의미한다. 엽록체의 자가형광은 TRV대조구보다 VIGS 개체에서 좀 더 낮게 나타났다(도6C).

6. 과도한 ROS 생성

ROS(Reactive oxygen species)는 정상적인 식물에서 대사과정 중 끊임없이 생산되어진다. 지나친 ROS의 생성은 식물체가 스트레스에 노출되었을 경우 미토콘드리아의 기능장애의 한 원인이다.(Green, D.R. and Reed, J.C. (1998) Science 281, 1309-1312; Lam, E., Kato, N., and Lawton, M. (2001) Nature 411, 848-853). 본 발명자는 TRV:IspE 개체에서 ROS가 생성되는지 조사하였다. TRV개체와 TRV:IspE 개체의 잎에서 원형질체를 준비하였고, H₂O₂가 있을 경우 활성화되는 녹색형광 신호를 관찰하기 위하여 H₂DCFDA(Bethke, P.C. and Jones, R.L.(2001) Plant J. 25, 19-29)로 배양하였다(도6F, G). TRV:IspE 개체의 원형질체에서 만들어지는 형광의 H₂DCFDA 축적비율은 대조구보다 훨씬 높았고, 원형질체의 크기도 줄었다. TRV:IspE 개체의 원형질체의 형광은 대조구보다 4.8배가 높았다(도6G). 이러한 과도한 ROS의 생성은 ROS 방어 시스템이 붕괴되거나 미토콘드리아의 기능장애를 의미한다.

7. 엽록체와 미토콘드리아의 초미세 구조의 분석

TRV:IspE VIGS 개체의 횡단 잎 절편(transverse leaf sections)을 투과전자현미경(Transmission electron microscopy, TEM)으로 관찰한 결과, 수와 모양이 대조구와 차이가 많이 있음을 관찰되었다(도7). 대조구 TRV개체에서, 엽육세포의 엽록체는 잘 발달된 틸라코이드 막 구조와 큰 전분 입자를 가지고 있는 것이 관찰되었다(도7A, C). 그러나, TRV:IspE 개체의 노란잎의 단면에 존재하는 엽록체 수가 심각하게 줄었고, 잎 모양 또한 특이하게 관찰되었다(도7B, D, E). 특이한 엽록체는 작고, 불규칙적인 모양이다. 게다가 틸라코이드는 비었고, 많은 낭(vesicle)모양의 구조를 보인다(도 7D, E). 몇몇의 엽록체는 퇴화된 구멍을 가지고 있다(도 7D). 몇몇의 TRV:IspE VIGS 개체의 미토콘드리아의 모양은 특이하고(도 7G, H, 대조구는 도7F), 그 특이한 미토콘드리아는 다양한 크기를 가졌으며 대게 안쪽의 크리스 티(cristae)가 비었다.

8. 잎 세포의 형태

TRV 대조구의 잎의 횡단 절편은 향축과 향축 표피층이 구별되는 전형적인 쌍떡잎식물의 잎 구조를 가진 것을 보여준다(도8A). 빽빽하게 싸인 긴 세포로 구성된 책상엽육조직층(palisade mesophyll layer)는 향축의 표피 아래에 있고, 해면엽육조직층(spongy mesophyll laye)은 둥글고, 느슨하게 싸인 세포로 구성된다. 두 개의 세포 층은 엽록체로 확실히 염색되었다(도8A).

TRV:IspE 개체의 노란 잎에서 전형적인 책상엽육조직세포와 해면엽육조직세포의 등배성 기관(dorsoventral organization)은 변함이 없었으나, 책상엽육조직층의 일부가 구별이 어려웠고, 구형의 세포를 포함하였다(도8B, D).

현저하게도, TRV:IspE 개체의 엽층(lamina)은 더 얇아지고, 각 층마다 세포수는 증가하고, 세포 크기는 감소하였다(도8B, D). 이런 결과는 TRV:IspE 개체에서 분리한 잎의 원형질체는 대조구의 원형질체보다 훨씬 더 작은 결과와 일치한다.

TRV:IspE 개체에서 줄어든 세포의 크기와 더불어 다른 뚜렷한 특징은 배축 표피의 과분열이다(도8B, D). 불균형적인 세포수 증가에 기인하여 배축 표피는 표면에서 돌출하였다(도8C). 이를 전자주사현미경(Scanning electron microscopy)으로 확인하였다(도8E-H). 세포수의 증가로 인하여 배축 표피의 불규칙한 거친 표면이 나타났고, 그것의 트리콤 수(trichome number)가 증가하였다(도8F, 대조구는 도8E). 게다가 스트로마의 크기는 다양하였다(도8H, 대조구는 도8G). 향축표피(adaxial epidermis)에서는, 세포수와 트리콤 수는 증가하였고, 세포 크기는 감소하였으나 세포의 돌출은 TRV:IspE 개체에서 관찰되지 않았다(도8J, L, 대조구는 도8I, K)

*9. TRV:IspE VIGS 개체의 엽록소와 카로티노이드 함량 분석

이소프레노이드 생합성에 있어서 IspE 침묵 효과를 알아보기 위하여 TRV:IspE VIGS 개체의 모든 엽록소와 카로티노이드 함량 측정하였다(도9A, B). TRV:IspE VIGS 개체의 노란 잎 절편의 모든 엽록소 함량은 대조구보다 3.2배 작았고, 특히 엽록소 A의 함량이 두드러지게 줄어들었다(도9A). 모든 카로티노이드 함량은 대조구의 약 28%로 감소하였다(도9B). 따라서 IspE의 결핍으로 인한 MEP 경로의 차단이 광합성 색소체의 생합성을 저해하는 것으로 밝혀졌다.

10. TRV:IspE VIGS 개체에서 MEP 경로에 관여하는 유전자의 발현

MEP 경로에 관여하는 유전자들의 전사체 발현에 있어 IspE 침묵 효과를 알아보기 위하여 TRV:IspE VIGS 개체와 TRV 대조구의 잎에서 모든 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다(도9C, 왼쪽). 대조구로써 액틴 유전자를 사용하였다. MEP 경로에 관여하는 유전자 IspD, IspF, IspG는 주로 영향을 받았고, DXS , DXR, IspH는 변함이 없었다(도9C, 오른쪽). TRV:IspE VIGS 개체에서 바이러스 염색체를 PCR로 확인한 결과 IspE 유전자가 존재하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 IspE의 결핍으로 인하여 MEP 경로가 저해되고, 특이한 중간대사산물의 축적으로 인해 부차적으로 다양한 유전자의 발현이 자극되어 발현될 수 있는 가능성을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예1: VIGS(Virus-Induced Gene Silencing)>

IspE의 다양한 cDNA 절편은 PCR로 증폭한 후 BamHI와 ApaI 사이트를 이용하여 TRV 유전체(genome)의 일부를 pTV00 벡터에 클로닝하였다. VIGS는 Ratcliff, Ahn, Cho의 방법으로 수행하였다(Ratcliff, F, Martin-Hernandez, A. M., and Baulcombe, D. C. (2001) Plant J. 25, 237-245, Ahn, J. W., Kim, M., Kim, G. T., Lim, J. H., and Pai, H. -S. (2004) Plant J. 38, 969-981, Cho, H. S., Lee, S. S., Kim, K. D., Kim, S. J., Hwang, I., Lim, J. S., Park, Y. I., and Pai, H.-S. (2004) Plant Cell 16, 2665-2682). 네 번째로 바이러스에 감염된 잎은 RT-PCR과 세포 분석에 사용하였다.

<실시예2: Reverse transcription (RT)-PCR>

담배(Nicotiana benthamiana) 에 methyl jasmonate 100 mM를 스프레이로 뿌려서 처리하고 비닐 봉투에 잘 씌어서 정해진 시간별로 채집하였다. 빛에 의한 유전자 발현의 영향을 조사하기 위해, 평범한 광조건(16 h light/8 h dark), 암조건, 또는 1 시간 빛에 노출시킨 뒤 암조건에서 7일 동안 MS배지에서 배양하였다. 식물체는 액체 질소에서 동결하고 RNA 추출을 위해서 -70℃에 저장하였다. Semiquantitative RT-PCR은 Ahn이 서술한 방법으로 바이러스에 감염된 네 번째 잎에서 분리한 5 의 모든 RNA를 가지고 수행하였다(Ahn, J. W., Kim, M., Kim, G. T., Lim, J. H., and Pai, H. -S. (2004) Plant J. 38, 969-981). IspE 전사체를 검출하기 위해서, IspE 전사체를 확인 하기 위해서 IspE-F (5'- ATGTCTACCTGTAATTTTC-3'(서열번호3) 와 5'- GAATTATCAAAAGATCC -3'(서열번호4)), IspE-N (5'-CGAGGAACAAGTAGAGAT-3'(서열번호5) 와 5'-TGCCCACAGAGC TGTTGC-3'(서열번호6)) 그리고 IspE-C 는 (5'-GAGGTTGTTCAAGATATTC-3'(서열번호7) 와 5'-GGAGAACCAACCCCTACT-3'(서열번호8))프라이머 셋을 사용하였다. MEP 기작 유전자의 발현정도를 측정하기 위해 다음 프라이머 셋을 사용하였다.DXS는 5'-GCAATCCATGCCGCTATG-3'(서열번호9)와 5'-ACCTCAAGGGGAGTGCCT-3'(서열번호10) DXR은5'- ATGGCGCTGAATTTGCTG-3'(서열번호11) 와 5'-GGCAATGTCCTTTCCT GC-3'(서열번호12) IspD는 5'-GAGCTGCGGGAGTGAAGT-3'(서열번호13) 와 5'-CAAGAGCAGCTG CTCCAA-3' (서열번호14) IspF는5'-ATCCTATGGCTATGGCGTC-3(서열번호15)와 5'-AAGTGGCG TCGAGGTTTC-3'(서열번호16) IspG는 5'-CTTCTTCCAGAAGGTACACG-3'(서열번호17) 와 5'-CT AAATCATCCCTGTGGGTA-3'(서열번호18) IspH는 5'-CAGAAGAAATTGGGAAGTTG -3'(서열번호19) 와 5'-TGCTCACTGTCAATCCAATA-3'(서열번호20)를 사용 하였으며 대조군 프라이머로는 NbPIN2 (5'-TTGACTATCGAGTTTGCCCG-3'(서열번호21)) 와 (5'-GTTGC AACCTTTCTTGCCTG-3'(서열번호22)) 와 액틴 프라이머 (5'-GCCACACTGTCCCAATT TATGA-3'(서열번호23) 와 5'-G AAGCCAAA ATAGAACCTCCAA-3'(서열번호24))를 사용하였다.

<실시예3: IspE의 세포내 위치>

IspE cDNA 절편의 세포내 위치를 알아보기 위하여 326-GFP(green fluorescent protein) 플라스미드의 KpnⅠ, HindⅢ 사이트에 클로닝하여 IspE-GFP 융합 단백질(IspE-GFP fusion proteins)을 제작하였다(Cho, H. S., Lee, S. S., Kim, K. D., Kim, S. J., Hwang, I., Lim, J. S., Park, Y. I., and Pai, H.-S. (2004) Plant Cell 16, 2665-2682). GFP 융합 구조체와 F₁ATPase-γ-RFP 융합 구조체는 polyethylene glycol-mediated transformation (REF)방법으로 애기장대 묘목으로부터 준비된 원형질체(protoplast)에 도입하였다. 융합 구조체의 발현은 형질전환 후 24시간이 지나서 confocal laser scanning microscopy을 이용하여 Cho가 서술한 방법으로 관찰하였다(. Cho, H. S., Lee, S. S., Kim, K. D., Kim, S. J., Hwang, I., Lim, J. S., Park, Y. I., and Pai, H. -S. (2004) Plant Cell 16, 2665-2682).

<실시예4: 엽록소와 카로티노이드의 농도의 측정>

바이러스에 감염된 네 번째 잎은 VIGS 식물체로부터 수집하였고, 엽록소을 추출하기 위해 80°C에서 30분동안 95%을 넣고 끓였다. 엽록소와 카로티노이드의 농도는 생체중량 단위로 Porra의 방법으로 계산하였다(Porra, R. J., Thompson, W. A., and Kriedemann, P. E. (1989) Biochim . Biophys . Acta . 975, 384-394).

<실시예5: Histochemical 분석>

조직 절단과 현미경의 사용방법은 Ahn이 서술한대로 수행하였고, VIGS 개체로부터 바이러스에 감염된 네 번째 잎을 사용하였다(Ahn, J. W., Kim, M., Kim, G. T., Lim, J. H., and Pai, H. -S. (2004) Plant J. 38, 969-981).

<실시예6: 공초점 레이저 주사현미경 (Confocal Laser Scanning Microscopy)>

미토콘드리아에 TMRM(Tetramethylrhodamine methyl ester; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 염색을 하기 위해, TMRM의 최종농도가 200 nM이 되도록 잎의 원형질체에 첨가하였다. 25^oC에서 1-2분 배양한 후에 원형질체는 현미경 슬라이드 위에 웰에 옮기고, 적색 형광 프로브를 관찰하기 위하여 BP560-615 (543 nm excitation, 560-615 nm emission) 필터를 이용하여 confocal microscopy(Carl Zeiss LSM 510)로 조사하였다. 정량적 이미지를 얻은 후, 데이터는 LSM 510 소프트웨어 (version 2.8)를 이용하여 분석하였다. 엽록체 자가형광(Chlorophyll autofluorescence)은 LP650 (excitation 488 nm, emission 650 nm) 광학필터를 이용하여 관찰하였다. Cho가 서술한 방법으로 원형질체는 MitoTracker Green FM (Molecular Probes)으로 염색하였고, 엽록체는 DAPI로 염색하였다(Cho, H. S., Lee, S. S., Kim, K. D., Kim, S. J., Hwang, I., Lim, J. S., Park, Y. I., and Pai, H.-S. (2004) Plant Cell 16, 2665-2682).

<실시예:7 생체내 H₂O₂측정>

생체내 H₂O₂측정을 위하여, VIGS 개체의 잎으로부터 분리된 원형질체는 2 mM 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H₂DCFDA, Molecular Probes)에서 30초 동안 배양한 후, 현미경 슬라이드의 웰에 옮겼고, 광학필터(488 nm excitation, 505 nm emission)를 갖는 confocal microscope(Carl Zeiss LSM 510)로 H₂O₂로 산화된 프로브의 녹색형광을 관찰하였다. 정량적인 이미지는 LSM 510 이미지분석 소프트웨어(version 2.8)을 이용하여 분석하였다.

본 발명에 따르면 담배 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 유래의 IspE 단백질은 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여할 수 있다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> IspE gene involved in development of chloroplast and mitochomdria in plants <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1230 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 1 atgtctacct gtaattttct tggtagttac cagctttaca cttgttgtaa tgttaaaaaa 60 ccacacattg gttcctttaa aaagagttct ttttctcaat cttggtcaaa aaggccaaat 120 gagtcatctt attttcacaa gaattctcaa tttggaagaa gcaattttgt tatagtgaag 180 gcttcagatt caagaactac cgaggaacaa gtagagataa catataatcc tgaagagaag 240 tttcataagt tagccgatga agtagataga gaggctgggc tttcaagact tgctcttttt 300 tcaccttgca agataaatgt tttcttgaga attacaggca agagggacga cggatatcac 360 gagttggcat ccctctttca tgttatcagt ctaggagata aaataaagtt ctcgctatca 420 ccatcgaaat caaaggatcg tttatctact aatgttgctg gagttcccct cgacgagaga 480 aatttgatca taaaggccct caatctttat aggaaaaaaa ctggaacaga caaatacttt 540 tggattcatc ttgataagaa ggtgcctact ggggctggtc ttggtggcgg gagcagtaat 600 gctgcaacag ctctgtgggc agcaaatcaa ttcagtggtt gtcttgccac 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Phe Val Ile Val Lys Ala Ser Asp Ser 50 55 60 Arg Thr Thr Glu Glu Gln Val Glu Ile Thr Tyr Asn Pro Glu Glu Lys 65 70 75 80 Phe His Lys Leu Ala Asp Glu Val Asp Arg Glu Ala Gly Leu Ser Arg 85 90 95 Leu Ala Leu Phe Ser Pro Cys Lys Ile Asn Val Phe Leu Arg Ile Thr 100 105 110 Gly Lys Arg Asp Asp Gly Tyr His Glu Leu Ala Ser Leu Phe His Val 115 120 125 Ile Ser Leu Gly Asp Lys Ile Lys Phe Ser Leu Ser Pro Ser Lys Ser 130 135 140 Lys Asp Arg Leu Ser Thr Asn Val Ala Gly Val Pro Leu Asp Glu Arg 145 150 155 160 Asn Leu Ile Ile Lys Ala Leu Asn Leu Tyr Arg Lys Lys Thr Gly Thr 165 170 175 Asp Lys Tyr Phe Trp Ile His Leu Asp Lys Lys Val Pro Thr Gly Ala 180 185 190 Gly Leu Gly Gly Gly Ser Ser Asn Ala Ala Thr Ala Leu Trp Ala Ala 195 200 205 Asn Gln Phe Ser Gly Cys Leu Ala Thr Glu Lys Glu Leu Gln Glu Trp 210 215 220 Ser Gly Glu Ile Gly Ser Asp Ile Ser Phe Phe Phe Ser His Gly Ala 225 230 235 240 Ala Tyr Cys Thr Gly Arg Gly Glu Val Val Gln Asp Ile Pro Ser Pro 245 250 255 Ile Pro Phe Asp Ile Pro Met Val Leu Ile Lys Pro Gln Gln Glu Cys 260 265 270 Ser Thr Ala Glu Val Tyr Lys Arg Phe Leu Leu Asp Gln Thr Ser Asn 275 280 285 Val Asp Pro Leu Ser Leu Leu Glu Lys Ile Lys Thr Ser Gly Ile Ser 290 295 300 Gln Asp Val Cys Val Asn Asp Leu Glu Pro Pro Ala Phe Glu Val Leu 305 310 315 320 Pro Ser Leu Lys Arg Leu Lys Gln Arg Val Ile Ala Ala Cys Arg Gly 325 330 335 Gln Tyr Asp Ala Val Phe Leu Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ile Val Gly 340 345 350 Val Gly Ser Pro Asp Pro Pro Gln Phe Val Tyr Asp Asp Glu Glu Tyr 355 360 365 Lys Asp Val Phe Leu Ser Glu Ala Ser Phe Ile Thr Arg Ala Ala Asn 370 375 380 Gln Trp Tyr Glu Glu Pro Leu Ser Ala Gly Asn Tyr Ala Asp Gln Ala 385 390 395 400 Glu Phe Ser Gly Ser Phe Asp Asn Ser 405 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgtctacct gtaattttc 19 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gaattatcaa aagatcc 17 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgaggaacaa gtagagat 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgcccacaga gctgttgc 18 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaggttgttc aagatattc 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggagaaccaa cccctact 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gcaatccatg ccgctatg 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 acctcaaggg gagtgcct 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 atggcgctga atttgctg 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggcaatgtcc tttcctgc 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gagctgcggg agtgaagt 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 caagagcagc tgctccaa 18 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 atcctatggc tatggcgtc 19 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 aagtggcgtc gaggtttc 18 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cttcttccag aaggtacacg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ctaaatcatc cctgtgggta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cagaagaaat tgggaagttg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tgctcactgt caatccaata 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ttgactatcg agtttgcccg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gttgcaacct ttcttgcctg 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gccacactgt cccaatttat ga 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gaagccaaaa tagaacctcc aa 22

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 담배(Nicotiana benthamiana) 유래의 IspE(Isoprenoid E) 단백질을 코딩하는 유전자를 VIGS(virus-induced gene silencing)용 벡터에 삽입하는 단계;

   상기 제작된 벡터로 아그로박테리움을 형질전환 시키는 단계; 및

   상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물체에 침투시키는 단계를 포함하는 잎의 황색화와 쭈그러진 잎모양을 갖는 식물체의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 식물체는 담배인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항 또는 제8항의 방법에 의해 제조된 잎의 황색화와 쭈그러진 잎모양을 갖는 식물체.
10. 삭제

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