KR20140102637A

KR20140102637A - 비생물학적 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20140102637A
Application number: KR1020140095961A
Authority: KR
Inventors: 김우택; 김은유; 서지호; 박기열
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-28
Filing date: 2014-07-28
Publication date: 2014-08-22

Abstract

본 발명은 식물체의 AtSRP(Arabidopsis thaliana stress related protein) 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물 및 생장 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 건조, 저온 및 염 스트레스등의 비생물학적 스트레스에 대한 내성에 관여를 하며, 이를 과발현시킨 형질전환 식물체는 이들 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 탁월하여 재배지역의 기후나 환경에 구애받지 않는 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 형질전환시킬 경우 식물체의 생장능이 크게 개선되어 속성재배가 가능한 신기능 식물체 및 바이오매스로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

비생물학적 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자 및 그의 용도{Gene Implicated in Abiotic Stress Tolerance and Growth Accelerating and Use Thereof}

본 발명은 비생물학적 스트레스 내성 및 생장 촉진에 관여한는 유전자 및 이를 포함하는 식물의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물 및 생장 촉진용 조성물에 관한 것이다.

고등식물은 이동이 불가하기 때문에 그들의 일생동안 다양한 환경 요인들인 가뭄, 고염(high salt), 중금속, 냉해, 열충격 및 오존과 같은 스트레스에 직면하게 된다. 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인이 되며 이들 스트레스 중에서 수분 부족은 작물생산 감소의 주요 원인으로 여겨지는 가장 심각한 환경 요인이다. 세계적으로 물의 소비는 계속적으로 증가되어 왔으며, 깨끗한 물의 이용가능성은 인간에게 뿐만 아니라 고등식물에게 또한 중요한 문제가 될 수 있다. 단기적 또는 장기적인 물 부족에 대해 내성을 증가시키기 위해 식물은 스스로 세포적 또는 유전적 방어 메카니즘을 가동하고 있다(Shinozaki and Yamaguchi-shinozaki, 2007). 그러나 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스-관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태다. 그러므로 작물의 생산성을 증가시키기 위해 스트레스 반응 유전자들에 대한 기능 연구가 중요하다.

식물은 신호전달 네트워크를 자극하고 스트레스-반응성 유전자를 유도함으로써 불리한 환경에 대한 저항성을 강화하는 다양한 방어전략을 구축하고 있다. 본 발명자들은 애기장대(Arabidopsis thaliana)에 고무나무(Hevea brasiliensis) SRPP(small rubber particle protein)의 유사 단백질을 인코딩하는 세 개의 AtSRP(Arabidopsis thaliana stress related protein) 유전자가 탈수(dehydration)에 의해 빠르게 유도됨을 발견하였다. 천연 고무는 라텍스 관 조직의 세포질성 단백질 분액(cytosolic fraction)에서의 메발로네이트 경로(mevalonate pathway)를 통해 생산되는 cis-1,4-폴리이소프렌이다(Oh et al. 1999; Sookmark et al. 2002; Kim et al. 2004; Chow et al. 2007). 애기장대는 천연고무를 생산하지 않기 때문에, 애기장대의 건조-스트레스 유전자가 고무 생합성 유전자와 염기서열을 공유한다는 사실은 이례적이다.

*원래 라텍스 알러진(latex allergin)으로 알려진 SRPP는 고무나무(Hevea brasiliensis)의 라텍스에서 작은 고무입자에 단단히 결합된 단백질이다.

고무 나무의 수피(Bark)조직은 고무 라텍스를 채집하기 위하여 계속적으로 벗겨지며, 이는 테이핑 과정(tapping process)으로 알려져 있다. 따라서, 라텍스 관의 밀봉(plugging)은 1차 대사산물과 같은 세포질 물질의 손실을 막고 병원균의 감염을 막기 위하여 필수적이다(Wititsuwannakul et al., 2008b). 라텍스 관의 밀봉 과정에서, hevein 또는 HLL(Hevea latex lectin)은 고무입자(RP) 단백질과 반응하여 고무 라텍스 응고물을 형성한다(Gidrol et al., 1994; Wititsuwannakul et al., 2008a). 최근에, SRPP는 HLL와 결합하는 RP 당단백질로 정제되어 HLLBP(HLL-binding protein)로 명명되었다(Wititsuwannakul et al., 2008c). SRPP의 N-아세틸글루코사민 부분과 HLL 간의 상호작용은 테이핑 및 기계적 상처에 반응하여 라텍스의 응고 정도를 조절할 수 있다

그러나, 건조, 고염 및 냉해 등의 비생물학적 스트레스와 관련하여 SRPP의 역할은 아직까지 알려진 바가 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 가뭄, 고염 및 냉해를 비롯한 식물의 비생물학적 스트레스에 대한 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴함으로써 궁극적으로 식물의 생산성을 향상시키자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 식물체 내에서 고무나무(Hevea brasiliensis) SRPP(small rubber particle protein)의 유사 단백질을 인코딩하는 세 개의 AtSRP(Arabidopsis thaliana stress related protein) 유전자의 발현을 증가시킬 경우 상술한 비생물학적 스트레스에 대한 강화된 내성을 수득할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 식물체의 생장 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제4서열 내지 제6서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제4서열, 제5서열 및 제6서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제4서열, 제5서열 및 제6서열의 아미노산 서열은 애기장대에 존재하는 SRPP 유사 단백질들의 서열이며, 이들 단백질은 각각 AtSRP(Arabidopsis thaliana stress related protein) 1, AtSRP 2 및 AtSRP 3로 명명되었다. 하기의 실시예에서 구체적으로 보는 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 이들 단백질 또는 이들의 코딩 유전자가 다양한 비생물학적 스트레스에 의해서 그 발현이 증가하며, 이들 유전자를 과발현시킬 경우 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 증가함을 발견하였다.

본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 내성이 강화되는 비생물학적 스트레스는 건조 스트레스, 저온 스트레스 및 염 스트레스로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물체를 제공한다.

본 발명의 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업 계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol. Genet. 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.

본 명세서에서, 용어“식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 프로모터는 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end) (Bevan et al. Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-말단 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 (NOS 3' end) 서열이다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터이다.

본 명세서에서 용어“바이너리 벡터”는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101이 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다. 바람직하게는 전기천공법(electroporation)을 사용한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제4서열 내지 제6서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 생장 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 AtSRPs 유전자를 과다발현시킨 형질전환 식물은 정상조건 하에서 발아 후 동일한 시간이 흐른 뒤에 야생종보다 긴 뿌리를 가지고, 더 넓은 잎을 가지며, 또한 화서줄기(inflorescence stem)가 빨리 자라는 것을 관찰함으로써 결과적으로 야생종에 비하여 빠른 생장을 보임을 실험적으로 확인하였다. 이러한 AtSRPs 유전자의 또 다른 유용한 특성을 이용하여 식물체의 생장속도를 향상시킴으로써 속성재배가 가능한 신기능 식물체 및 바이오매스로 응용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 생장 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 이용되는 아미노산 서열, 뉴클레오타이드 서열 및 이들을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물 및 생장 촉진용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 건조, 저온 및 염 스트레스등의 비생물학적 스트레스에 대한 내성에 관여를 하며, 이를 과발현시킨 형질전환 식물체는 이들 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 탁월하여 재배지역의 기후나 환경에 구애받지 않는 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있다.

(c) 또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 형질전환시킬 경우 식물체의 생장능이 크게 개선되어 속성재배가 가능한 신기능 식물체 및 바이오매스로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 AtSRPs 가 애기장대의 다양한 조직에서 발현됨을 보여주는 그림이다. 도 1a는 AtSRPs 발현을 7 단계의 발달 단계에서 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 18s rRNA를 로딩 대조군으로 사용하였다.
WS; whole seedling, RT; root, RL; rosette leaf, ST; stem, F; Flower, SQ; sillique, SD; seed.
도 1b는 애기장대의 다양한 조직에서의 AtSRPs 발현을 실시간 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 결과는 4번의 반복된 실험의 평균±표준편차 값으로 나타내었다.
도 2는 AtSRPs가 ABA 및 비생물학적 스트레스에 의해 상향-조절됨을 보여주는 그림이다. 100 mM ABA(1.5-3시간), 건조(1.5-3시간), 냉해(4℃로 4.5-24 시간) 또는 고염(3시간 동안 300 mM NaCl)을 가한 7일령 애기장대 묘목으로부터 총 RNA를 수득하였다. AtREFPs의 유도패턴은 RT-PCR(도 2a) 또는 실시간 RT-PCR(도 2b)로 조사하였다. RAB18 및 RD29A 유전자는 각각 ABA 및 비생물학적 스트레스에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. AtACT8 전사 수준은 로딩 대조군으로 사용되었다. 데이터는 4번의 독립적인 실험의 평균±표준편차 값으로 나타내었다.
도 3은 막 결합 단백질인 AtSRP1이 렉틴 결합 특성을 가짐을 보여주는 그림이다. 도 3a는 콘카나발린 A를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통해 생화학적인 분석을 실시한 결과를 나타낸다. 도 3b는 막 결합 시험(Membrane association test) 결과를 나타낸 그림이다. 담배 트랜지언트 어세이(transient assay)를 이용하여 AtSRPs를 일시적으로 과다발현시킨 후, 전체 단백질 중 막 침전물을 1% (v/v) Triton X-100, 2 M 우레아, 1 M NaCl 또는 0.1 M Na₂CO₃에서 재부유시켰다. 부유물을 다시 125,000g에서 원심분리하여 용해된 분획(S) 및 불용성 분획(P)를 분리한 뒤, 이를 Flag 항체를 이용한 면역불롯팅으로 분석하였다. *는 AtSRP1를 나타낸다
도 4는 T3 35S:AtSRPs 형질전환 애기장대 및 녹-아웃 돌연변이의 표현형 상의 특성을 나타낸 그림이다. AtSRPs-과발현체는 야생형보다 빠르게 자랐으며, 녹-아웃 돌연변이는 반대의 표현형을 보였다. 도 4a는 광조건에서 3일간 자란 야생형, 형질전환 묘목 및 녹-아웃 돌연변이의 형태적 특성을 비교한 그림이다. 도 4b는 야생형, 형질전환 및 녹-아웃 돌연변이 묘목의 초기 뿌리에서의 성장 패턴의 차이를 나타낸 그림이다. 에러 바(Error bar)는 평균±표준편차를 나탄낸다(n = 70). 도 4c는 발아 2주 뒤 두 번째 잎의 입체적 파라미터를 나타낸 그림이다. 두 번째 잎(second leaves)은 야생형, 형질전환체 및 녹-아웃 돌연변이체에서 각각 분리하여 SCIONIMAGE 프로그램을 이용, 이미지 분석을 위해 스캔하였으며, 이들의 잎 너비 및 길이, 잎자루 길이 및 잎 면적을 계산하였다. 에러 바(Error bar)는 평균±표준편차를 나탄낸다(n = 35). 도 4d는 정상 성장조건에서 발아 28일 후 야생형, 형질전환체 및 녹-아웃 돌연변이체의 성장 형태를 보여주는 그림이다(왼쪽 패널). 오른쪽 패널은 발아 20-28일 후 야생형 및 형질전환 애기장대의 화서줄기(inflorescence stem)의 성장 패턴 차이를 보여주는 그림이다. 에러 바(Error bar)는 평균±표준편차를 나탄낸다(n = 80)
도 5는 세포주기 진행의 촉진과 연관된 35S:AtSRPs 형질전환 애기장대 빠른 성장 표현형을 나타낸 그림이다. 도 5a는 3일령 야생형, AtSRPs-과발현 형질전환체 및 녹-아웃 돌연변이체 묘목의 각각의 뿌리 끝의 세로 모습을 나타낸 그림이다. 뿌리의 단면은 프로피리듐 이오다이드(propidium iodide)로 염색하고 공초점 현미경으로 관찰하였다. 도 5b는 야생형, AtSRPs-과발현 형질전환체 및 녹-아웃 돌연변이의 두 번째 잎에서 채취한 표피세포 및 책상엽육세포(palisade mesophyll cell)를 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 그림이다. 스케일 바 = 20 μm.
도 6은 AtSRPs가 기능을 상실할 시 염에 대해 민감한 표현형을 가지게 됨을 보여주는 그림으로, 100 mM NaCl 배지에서 배양한 12일령 AtSRPs-과발현 형질전환체 및 녹-아웃 돌연변이의 유묘의 형태를 나타낸다.
도 7은 AtSRPs가 건조 방어 반응에서 양성 인자의 역할을 함을 보여주는 그림이다. 도 7a는 야생형, AtSRPs-과발현 형질전환체 및 녹-아웃 돌연변이체에 건조 스트레스를 가한 후 각각의 생존률을 나타낸 그림이다. 광조건에서 자란 25일령 야생형, 3주령 형질전환체 및 26일령 녹-아웃 돌연변이체를 물을 주지 않고 8일간 배양하였다. 이후 식물들에 물을 준 후(re-watering) 3일 뒤 생존율을 측정하였다. 8일 간의 건조 스트레스 후 정상 수분조건으로 돌아왔을 때 계속 성장하는 능력을 생존률로 간주하였다. 각각의 생존률은 다음과 같다: 야생형, 26.97% (89 개체 중 24); 35S:AtSRP1 형질전환체, 64.84% (91 개체 중 59); 35S:AtSRP2 형질전환체, 66.29% (89 개체 중 59); 35S:AtSRP3 형질전환체, 58.02% (81 개체 중 47); atsrp1 돌연변이체, 3.90% (77 개체 중 3); atsrp3 돌연변이체, 0.00% (101 개체 중 0). 도 7b는 CRWL(cut rosette water loss) 비율을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 좌엽(rosette leaves)을 광조건에서 기른 3주령 야생형, 35S:AtSRPs 형질전환 식물 및 녹-아웃 돌연변이체에서 각각 채취하고, open-lid 페트리디쉬에 올려놓은 후 상온에서 0-5시간 배양하였다. 이후, 생체 중량(fresh weight)의 감소를 측정하였으며, 수분의 손실은 채취된 잎의 최초 생체중량에 대한 백분율로 표현하였다. 에러 바(Error bar)는 평균±표준편차를 나탄낸다(n = 20). 도 7c는 야생형, 35S:AtSRPs 형질전환 식물 및 녹-아웃 돌연변이체 잎의 클로로필 a + 클로로필 b 양을 각각 나타낸 그림이다. 에러 바(Error bar)는 평균±표준편차를 나탄낸다(n = 3)
도 8은 건조 처리 전 후의 입 절편(leaf disc)의 프롤린(Proline) 함량을 조사한 결과를 나타낸 그림이다. 데이터는 각각의 독립적인 실험을 통해 얻었으며, 바는 평균±표준편차를 나타낸다(n = 3). 형질전환 식물체는 야생형에 비해 건조상황 하에서 잎의 수분을 더 효율적으로 보충한 반면, 녹-아웃 돌연변이체는 반대의 표현형을 보였다.
도 9는 AtSRP1, AtSRP2 및 AtSRP3 cDNA 클론의 모식도를 나타낸 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

AtSRPs 유전자의 클로닝 및 분석

5일된 애기장대 유묘에서 총 mRNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다(Seo et al., 2008). 역전사 반응으로 합성된 cDNA 중에서 AtSRP1, AtSRP2, AtSRP3 유전자만을 특이적으로 증폭시키기 위해 PCR에 사용된 프라이머 조합은 The Arabidopsis Information Resource(TAIR, http://www.arabidopsis.org)의 데이터베이스에서 AtSRP1, AtSRP2, AtSRP3 유전자 각각의 cDNA의 염기서열을 검색한 후, 코딩 부위(CDS)의 5’쪽에는 BamHI을 태깅하고, 3’쪽에는 SacI을 태깅하여 프라이머를 제작하였다. 증폭된 각각의 AtSRPs 유전자의 cDNA는 pGEM-T Easy 벡터(Promega, http://www.promega.com)에 라이게이션시켜 클로닝한 후, 시퀀싱 반응을 통해 염기서열을 확인하였다(표 1). 확인된 염기서열은 TAIR (http://www.arabidopsis.org)에서 검색한 것과 정확히 일치하였으며, At1g67360 (AtSRP1)은 723 bp, At2g47780(AtSRP2)은 708 bp, At3g05500(AtSRP3)은 741 bp로 이루어진 CDS만을 포함하고 있었다.

AtSRPs 유전자의 발현 분석

다양한 조직에서 AtSRPs의 전사수준에서의 발현을 분석하기 위하여 RT-PCR과 real-time RT-PCR을 수행하였다 (Seo et al., 2009). 분석시 사용한 프라이머는 표1과 같다.

클로닝 및 형질전환 식물의 제작, 단백질 발현을 위한 프라이머

유전자	정방향 프라이머	역방향 프라이머
AtSRPs ORF의 클로닝, RT-PCR 및 형질전환 식물의 제조
AtSRP1	5’-gcggatccatggagacagagaagaaaaatag-3’	5’-gcgagctcctactccgaatcagacgatg-3’
AtSRP2	5’-gcggatccatggctgaagatgaaatagtagtc-3’	5’-gcgagctctcaatcagctcgacactgatc-3’
AtSRP3	5’-gcggatccatggctactcaaacggatctc-3’	5’-gcgagctctcaatcaagtggatggaactc-3’
18s rRNA	5’-gcatttgccaaggatgtttt-3’	5’-gtacaaagggcagggacgta-3’
AtACT8	5’-tactgattacctcatgaagatccttac-3'	5’-aaacgatgtctctttagtttagaagc-3'
실시간 정량적 RT-PCR 프라이머
AtSRP1	5’-tgattctctcctggtctttc-3'	5’-ttctctgtcgccttgtagat-3'
AtSRP2	5’-ttttcgtcgatcgtaagg-3'	5’-aatgctcttggtagtgtcca -3'
AtSRP3	5’-ccctgttgaggtccttaaat-3'	5’-gccacaatgggtgctat-3'

AtSRPs 단백질의 발현 및 정제

AtSRPs에 2xFlag 에피토프를 융합시켜 BL21-CodonPlus(DE3) RIL(Stratagene)에 발현시킨 후 정제하였다. 단백질은 표준 단백질로 BSA를 이용해 정량하였다 (Bradford, 1976).

AtSRPs의 렉틴 결합 특성 측정

AtSRPs이 렉틴에 결합하는 특성을 갖는지 조사하기 위해, 대장균에서 2xFlag-AtSRPs를 발현시켜 정제한 단백질과, 담배에 일시적으로 35S:2XFlag-AtSRPs를 과다발현시킨 단백질을 이용하였다. 두 단백질을 콘카나발린 A 결합 실험을 제조사의 방법에 따라 수행하였다(Con A Sepharose 4B-GE-71707700AG; GE Healthcare Life Sciences). 그 반응물을 Flag 항체를 이용하여 면역블롯팅을 하였다. 그 결과, 담배 시스템을 이용한 35S:2XFlag-AtSRPs 레인 만이 밴드가 확인됨으로써 식물 시스템에서 글리코실화(glycosylation)가 일어난 AtSRP1만이 렉틴에 결합함을 의미하며, AtSRP1이 글라이코단백질임을 알 수 있었다(도 3a).

AtSRPs의 막 결합 특성 측정

AtSRPs이 막에 결합되어있는지를 알아보기 위해, 담배에 일시적으로 35S:2xFlag-AtSRPs를 과다발현시킨 단백질을 추출하여 사용하였다. 그 후 Kim and Bassham을 참조하여 막 결합 실험을 수행하였고(Kim and Bassham, 2011), 그 반응물을 Flag 항체를 이용하여 면역블롯팅을 하였다. 그 결과, 막 침전물에 0.1 M Na₂CO₃를 처리한 처리구에서, 침전물에서 보다 상층액 밴드가 더 진해져 있는 것을 볼 수 있었다(도 3b). 이는 AtSRP1 단백질이 막에 결합되어 있다가 Na₂CO₃에 의해 그 결합이 약해서 상층액으로 용출된 것으로서, 이를 통해 AtSRPs 단백질은 막 결합단백질임을 알 수 있었다.

AtSRPs이 과다발현된 형질전환체 제작 및 녹-아웃 돌연변이 동정

AtSRPs를 애기장대에 과다 발현시키기 위해 AtSRPs의 cDNA를 pBI121 운반 벡터(binary vector)에 재조합하였다. 사용한 프라이머는 표 1과 같다. 이를 식물에서 발현시키기 위해 아그로박테리움 튜메파시엔스에 형질전환시켰고, 애기장대 형질전환은 플로랄 딥(floral dip) 방법으로 수행했다(Joo et al., 2004). 종자는 0.5 X MS, 25 mg/l 카나마이신 배지에서 독립적인 형질전환 개체를 선별하였다. atsrp1과 atsrp3는 T-DNA 삽입 line을 ABRC(www.arabidopsis.org)에서 주문(atsrp1 : GABI_3095G05, atsrp3 : WiscDSLOXHS192)하여 사용하였다. atsrp2는 RNAi 방법을 이용한 녹-다운 라인을 제작하여 전사수준에서의 발현이 낮아진 개체를 선발하여 사용하였다(Lee and Kim, 2010).

AtSRPs이 과다발현된 형질전환체의 표현형 심층분석 결과

0.5 x MS(비타민 B5포함)와 1% 수크로오즈(sucrose), 0.8% 아가(select agar; Life Technology, Rockvile, MD, USA)를 포함한 배지의 pH를 5.7로 맞추어 제조한 후, 야생종과 과다발현체의 종자 표면을 소독하여 심었으며 22도의 빛 조건에서 키웠다. 라디클이 나오는 것을 억제 후 5일째 될 때까지 날짜별로 관찰하였다. 뿌리 생장을 관찰하기 위해 종자를 심은지 5일째 될 때까지 관찰하였다. 뿌리가 생장하는 동안에 배양접시 바깥쪽에서 뿌리 정단부를 마킹해 놓은 다음 ScionImage software(Scion Corp., Frederic, MD, USA)를 이용하여 뿌리의 길이를 측정하였다. 잎의 크기를 관찰하기 위해서 멸균된 흙에 종자를 심어, 12일째 되었을 때 야생종과 과다발현체와 녹-아웃 개체들에서 각각 자엽부터 세 번째 잎까지 따서 그 크기를 비교하였다. 또한 두 번째 잎은 ScionImage software(Scion Corp., Frederic, MD, USA)를 이용하여 엽장, 엽폭, 엽병의 길이를 측정하였다.

꽃대가 올라오는 시기를 관찰하기 위해 야생종과 과다발현체의 종자를 멸균된 흙에 심고 22℃의 계속된 빛조건의 배양실에서 키웠다. 심은지 19일째부터 꽃대가 올라온 후의 키를 측정하였다. 그 결과, 야생종과 AtSRPs의 과다발현체는 발아력에는 차이가 없으나, 뿌리의 생장, 잎의 크기, 키를 비교했을 때, AtSRPs의 과다발현체가 모든 실험에서 빨리 자라는 것을 확인할 수 있었다. 이는, AtSRPs가 식물의 생장에 있어서 양성 조절자로 작용한다는 것을 입증한다(도 4a 내지 4d).

현미경을 이용한 표현형 심층분석

5일령 야생형 및 형질전환 애기장대 잎을 클로랄 하이드레이트 용액에서 보고된 방법(Kwon et al. 2009)으로 세척하였다. 잎의 세포층은 명시야 현미경(BX51 형광현미경, Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 뿌리의 종단면 관찰을 위하여, 5일령 뿌리를 프로피디움 아이오다이드로 염색하고 Seo et al. (2008)의 방법으로 공초점 현미경을 이용하여 상을 얻었다(도 5).

고염 스트레스를 가해준 후의 야생종과 형질전환 애기장대 식물의 생존률 측정

정상 조건에서 자란 5일된 야생종 및 35S:AtSRPs 형질전환 식물과 각 녹-아웃 개체들을 100mM의 NaCl이 포함된 고염 배지에서 7일간 키웠다. 그 후 각 개체들의 뿌리의 길이를 검사하였다. 그 결과, 각 녹-아웃 개체들은 고염 스트레스에 훨씬 민감한 표현형을 가짐을 알 수 있어, AtSRP1s가 고염 스트레스 반응에 있어 양성 조절자임을 증명하였다(도 6).

건조 스트레스를 가해준 후의 야생종과 형질전환 애기장대 식물의 생존률 측정

정상 조건에서 자란 3주된 야생종 및 35S:AtSRPs 형질전환 식물과 녹-아웃 개체에 8일간 물을 주지 않은 건조스트레스를 가했다. 이후 식물들에 다시 물을 주고 3일 후 표현형을 검사하였다. 생존률은 건조 스트레스 후 정상조건으로 돌아왔을 때 성장을 재개하는 능력으로 정의하였다(Cho et al. 2008). 각각의 생존률은 다음과 같다(도 7a):

야생형, 26.97% (89 개체 중 24); 35S:AtSRP1 형질전환체, 64.84% (91 개체 중 59); 35S:AtSRP2 형질전환체, 66.29% (89 개체 중 59); 35S:AtSRP3 형질전환체, 58.02% (81 개체 중 47); atsrp1 돌연변이체, 3.90% (77 개체 중 3); atsrp3 돌연변이체, 0.00% (101 개체 중 0). 또한 시간의 경과에 따른 수분 함량도 형질전환체는 야생형 및 녹-아웃 돌연변이체에 비해 훨씬 덜 감소하였음을 확인하였다(도 7b).

건조 스트레스를 가해준 후의 야생종과 형질전환 애기장대 식물의 클로로필 및 프롤린 함량 측정

건조 스트레스를 가해준 야생형 및 AtSRPs-과발현 잎에서 Bae et al. (2009)의 방법에 의해 80% 아세톤을 이용하여 클로로필을 추출하였다. 남은 잎 추출물을 105℃에서 16시간 동안 건조시키고 건조 추출물의 무게를 측정하였다(Welti et al. 2002). 잎의 프롤린 함량을 Claussen (2005)의 방법에 의해 측정하였다. 측정 결과, 형질전환 식물체는 야생형에 비해 클로로필 및 프롤린 함량이 높음을 확인하여 건조상황 하에서 잎의 수분을 더 효율적으로 보충할 수 있음을 알 수 있는 반면, 녹-아웃 돌연변이체는 반대의 표현형을 보였다(도 8).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-Academic Coopreaton Foundation Yonsei University <120> Gene Implicated in Abiotic Stress Tolerance and Growth Accelerating and Use Thereof <130> PN120347 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 723 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggagacag agaagaaaaa tagcaaggag gtagcgctaa aacacctagc gttcgtgaga 60 attgcaacga tccatattct ggcttccgtc tcaaatctct acgaatacgc taaacaaaac 120 tccggtcctc tcaaatccgc cgtggaaaag gtcgaaggag ccgtcaccac cgtcgtcacc 180 cctgtctatc agaaattcaa agatgttcct gattctctcc tggtctttct agatcacaag 240 gtgggtgaag tttcgtacaa gtttgatgag catgctcctc caatggctaa gaaagtggtg 300 aatcaagcac atgtattgat ctacaaggcg acagagaaag ctcaaagctt tgtgaaagag 360 gctcgtaccg gtggtcccaa agctgcgttt aactatgctg caactgagta caagtttttc 420 gttgtgacca actcggttaa agtctgggct aaacttaacc agtataaacc aatccatgca 480 atgggtgaca aagctttgcc tgtggctgca cacttttcca gtcggtacaa cgatttggtg 540 actgatatga ctaatatggg ttactctttg gttggttatc ttccgttggt tcctgttgat 600 gacattgtta aggcttatga aaaggaagat gcaaggagaa agaaaggagg ggatacggct 660 ggaaagaaag gagagactac tgatgcggct gatggtgata aatcatcgtc tgattcggag 720 tag 723 <210> 2 <211> 708 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 atggctgaag atgaaatagt agtcgaagaa gagcaatcac agccacagga gattactcca 60 gttccaccat cttcttcgtc ttcgccttcg ttagtggtgg aagacgacga tgagatgaag 120 ctcaagcact tggaattcat tcaagtcgcg gcggtttact tcgccgcctg tttctcgacc 180 ctctacgagt tggctaaaga caacgctggt ccactcaaac tcggcgtcga gaacattgaa 240 gattgcgttc gaaccgtgct tgctccatta tacgaaaaat tccacgacgt tcctttcaag 300 cttctccttt tcgtcgatcg taaggtggac gatgtgttct tcgatgttga gacatatgtt 360 ccgtcattgg tgaagcaagc ttctagccaa gcgctcacgg tggccacgga ggtgcagcgc 420 accggcgttg tggacactac caagagcatt gcaagaagcg tccgggacaa gtacgagcca 480 gcggcagagt attacgcagc gacgctgtgg cgtttactga atcaactgcc gttgttccct 540 gaagttgcgc atttagtgat ccccacggcg ttttactggt cagagaagta caacgatgcg 600 gttcgttacg ttggcgacag agactacttt ggggcagagt atctacccat gattcctatt 660 gagaagatct ctgatatttt ggaacaagat cagtgtcgag ctgattga 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Glu Thr Glu Lys Lys Asn Ser Lys Glu Val Ala Leu Lys His Leu 1 5 10 15 Ala Phe Val Arg Ile Ala Thr Ile His Ile Leu Ala Ser Val Ser Asn 20 25 30 Leu Tyr Glu Tyr Ala Lys Gln Asn Ser Gly Pro Leu Lys Ser Ala Val 35 40 45 Glu Lys Val Glu Gly Ala Val Thr Thr Val Val Thr Pro Val Tyr Gln 50 55 60 Lys Phe Lys Asp Val Pro Asp Ser Leu Leu Val Phe Leu Asp His Lys 65 70 75 80 Val Gly Glu Val Ser Tyr Lys Phe Asp Glu His Ala Pro Pro Met Ala 85 90 95 Lys Lys Val Val Asn Gln Ala His Val Leu Ile Tyr Lys Ala Thr Glu 100 105 110 Lys Ala Gln Ser Phe Val Lys Glu Ala Arg Thr Gly Gly Pro Lys Ala 115 120 125 Ala Phe Asn Tyr Ala Ala Thr Glu Tyr Lys Phe Phe Val Val Thr Asn 130 135 140 Ser Val Lys Val Trp Ala Lys Leu Asn Gln Tyr Lys Pro Ile His Ala 145 150 155 160 Met Gly Asp Lys Ala Leu Pro Val Ala Ala His Phe Ser Ser Arg Tyr 165 170 175 Asn Asp Leu Val Thr Asp Met Thr Asn Met Gly Tyr Ser Leu Val Gly 180 185 190 Tyr Leu Pro Leu Val Pro Val Asp Asp Ile Val Lys Ala Tyr Glu Lys 195 200 205 Glu Asp Ala Arg Arg Lys Lys Gly Gly Asp Thr Ala Gly Lys Lys Gly 210 215 220 Glu Thr Thr Asp Ala Ala Asp Gly Asp Lys Ser Ser Ser Asp Ser Glu 225 230 235 240 <210> 5 <211> 235 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 5 Met Ala Glu Asp Glu Ile Val Val Glu Glu Glu Gln Ser Gln Pro Gln 1 5 10 15 Glu Ile Thr Pro Val Pro Pro Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Leu Val 20 25 30 Val Glu Asp Asp Asp Glu Met Lys Leu Lys His Leu Glu Phe Ile Gln 35 40 45 Val Ala Ala Val Tyr Phe Ala Ala Cys Phe Ser Thr Leu Tyr Glu Leu 50 55 60 Ala Lys Asp Asn Ala Gly Pro Leu Lys Leu Gly Val Glu Asn Ile Glu 65 70 75 80 Asp Cys Val Arg Thr Val Leu Ala Pro Leu Tyr Glu Lys Phe His Asp 85 90 95 Val Pro Phe Lys Leu Leu Leu Phe Val Asp Arg Lys Val Asp Asp Val 100 105 110 Phe Phe Asp Val Glu Thr Tyr Val Pro Ser Leu Val Lys Gln Ala Ser 115 120 125 Ser Gln Ala Leu Thr Val Ala Thr Glu Val Gln Arg Thr Gly Val Val 130 135 140 Asp Thr Thr Lys Ser Ile Ala Arg Ser Val Arg Asp Lys Tyr Glu Pro 145 150 155 160 Ala Ala Glu Tyr Tyr Ala Ala Thr Leu Trp Arg Leu Leu Asn Gln Leu 165 170 175 Pro Leu Phe Pro Glu Val Ala His Leu Val Ile Pro Thr Ala Phe Tyr 180 185 190 Trp Ser Glu Lys Tyr Asn Asp Ala Val Arg Tyr Val Gly Asp Arg Asp 195 200 205 Tyr Phe Gly Ala Glu Tyr Leu Pro Met Ile Pro Ile Glu Lys Ile Ser 210 215 220 Asp Ile Leu Glu Gln Asp Gln Cys Arg Ala Asp 225 230 235 <210> 6 <211> 246 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 6 Met Ala Thr Gln Thr Asp Leu Ala Gln Pro Lys Leu Asp Met Thr Lys 1 5 10 15 Glu Glu Lys Glu Arg Leu Lys Tyr Leu Gln Phe Val Gln Ala Ala Ala 20 25 30 Val Glu Ala Leu Leu Arg Phe Ala Leu Ile Tyr Ala Lys Ala Lys Asp 35 40 45 Lys Ser Gly Pro Leu Lys Pro Gly Val Glu Ser Val Glu Gly Ala Val 50 55 60 Lys Thr Val Val Gly Pro Val Tyr Glu Lys Tyr His Asp Val Pro Val 65 70 75 80 Glu Val Leu Lys Tyr Met Asp Gln Lys Val Asp Met Ser Val Thr Glu 85 90 95 Leu Asp Arg Arg Val Pro Pro Val Val Lys Gln Val Ser Ala Gln Ala 100 105 110 Ile Ser Ala Ala Gln Ile Ala Pro Ile Val Ala Arg Ala Leu Ala Ser 115 120 125 Glu Val Arg Arg Ala Gly Val Val Glu Thr Ala Ser Gly Met Ala Lys 130 135 140 Ser Val Tyr Ser Lys Tyr Glu Pro Ala Ala Lys Glu Leu Tyr Ala Asn 145 150 155 160 Tyr Glu Pro Lys Ala Glu Gln Cys Ala Val Ser Ala Trp Lys Lys Leu 165 170 175 Asn Gln Leu Pro Leu Phe Pro Arg Leu Ala Gln Val Ala Val Pro Thr 180 185 190 Ala Ala Phe Cys Ser Glu Lys Tyr Asn Asp Thr Val Val Lys Ala Ala 195 200 205 Glu Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Tyr Met Pro Leu Val Pro Thr Glu 210 215 220 Arg Ile Ser Lys Ile Phe Ala Glu Glu Lys Ala Glu Thr Glu Pro Leu 225 230 235 240 Glu Phe His Pro Leu Asp 245

Claims

서열목록 제5서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 건조 스트레스 또는 저온 스트레스 내성 증진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제5서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 건조 스트레스 또는 저온 스트레스 내성 증진용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항의 조성물로 형질전환된 건조 스트레스 또는 저온 스트레스 내성이 증진된 식물세포.
제 1 항 또는 제 2 항의 조성물로 형질전환된 건조 스트레스 또는 저온 스트레스 내성이 증진된 식물체.
(a) 제 1 항 또는 제 2 항의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 또는 저온 스트레스 내성 증진용 조성물.