KR102182730B1

KR102182730B1 - 식물의 저온 스트레스 저항성을 증진시키는 칼슘 센서 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102182730B1
Application number: KR1020180160889A
Authority: KR
Inventors: 윤인선; 김범기; 김수연; 김둘이
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-11-24
Also published as: KR20200072844A

Abstract

본 발명은 벼에서 유래한 칼슘센서 OsCBP 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 OsCBP 단백질은 칼슘 신호전달 인산화효소를 활성화시키는 고유 특성을 가지며, 상기 OsCBP 단백질을 식물체에서 과발현시키면 스트레스 반응 관련 유전자를 빠르게 발현시켜 저온 스트레스에 대한 저항성을 증진시키므로 스트레스 내성 작물 개발에 이용할 수 있다.

Description

식물의 저온 스트레스 저항성을 증진시키는 칼슘 센서 유전자 및 이의 용도{A Calcium sensor Gene Enhancing Plant Cold Stress Tolerance and Use Thereof}

본 발명은 벼에서 유래한, 식물의 저온 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 칼슘 센서 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

현재 인구 증가에 따라 식량증산은 계속 요구되고 있으나 농수 및 농지는 점점 줄어들고 있는 실정이다. 우리나라는 온대성 기후에 속하지만 지구 기후 변화로 예기치 못한 가뭄 및 고온 등 이상 기상 현상이 빈번히 발생하고 있으며, 이에 따라 자연재해에 의한 농업 생산성 저하가 심각한 수준이다.

고등식물은 이동이 불가능하기 때문에 일생동안 다양한 환경 요인들인 한발(가뭄, 건조), 염해, 저온, 중금속 및 오존과 같은 스트레스에 직면하게 된다. 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인으로 작용하여 수확량에 큰 차이를 가져 오게 된다.

한편, 식물은 상기 스트레스에 대한 방어 기작을 가지고 있어서 생육에 부적합한 환경에 처하게 되면 형태를 조절하거나 생리적 대사과정을 조절함으로써 환경에 적응하여 생존하는 특성이 있다. 스트레스 조건을 극복하기 위해, 식물은 신속하고 효율적인 유전자 발현 프로그램을 통해 스트레스 적응 또는 내성과 연관된 수많은 유전자를 발현한다. 그러나 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스-관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태다. 그러므로 작물의 생산성을 증가시키기 위해 스트레스 반응 유전자들에 대한 기능 연구가 절실히 요구되고 있다.

칼슘 이온(Ca² ⁺)은 식물의 다양한 스트레스 반응을 매개하는 2차 전달물질로서, 세포내 칼슘 센서 단백질과 결합한 후 일련의 신호전달과정을 통해 식물의 스트레스 저항성을 유도한다는 것이 알려져 있다. 특히 저온 스트레스 자극을 받은 식물세포는 세포질의 칼슘 이온의 농도가 높아지면서 단백질 인산화기구를 활성화시키는 기작을 가지고 있다. 이러한 칼슘 신호전달 기구는 식물이 저온에 견디면서 적응하는데 매우 중요하기 때문에 새로운 칼슘 센서나 인산화효소들을 찾으려는 노력이 계속되고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 식물의 저온 스트레스에 대한 저항성을 증가시키기 위해 노력한 결과, 칼슘 신호전달 기구의 상위 조절자인 인산화효소에 결합하여 활성을 조절하는 벼 유래의 OsCBP 유전자를 발견하였고, OsCBP 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물체에서는 저온 스트레스에 반응하는 유전자들의 발현 변화가 빠르고, 저온 스트레스에 저항성을 보인다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 등록특허 제10-1412555호

본 발명의 일 목적은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 식물의 저온 스트레스 저항성 단백질 및 식물의 저온 스트레스 저항성을 증진시키는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 형질전환용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환용 재조합 벡터를 사용하여 식물의 저온 스트레스 저항성을 증가시키는 방법, 저온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 식물체의 저온 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 식물의 저온 스트레스 저항성 단백질을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 의하여 코딩되며, 벼 유래의 OsCBP(Oryza sativa calcium binding protein) 단백질을 코딩한다. 상기 OsCBP 단백질은 칼슘 이온(Ca²⁺)과 결합하고, 칼슘 신호전달 인산화효소인 OsCK1을 활성화시키는 특성이 있으므로 세포내 칼슘 신호전달에 관여할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 OsCBP 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 저온 스트레스에 대한 저항성을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어, "저온 스트레스(Cold Stress)"는 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 환경 요인 중에서 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로서 정상 생육 온도보다 낮은 온도의 환경에 노출되는 것을 의미한다. "저온 스트레스 저항성"이란 저온 환경 노출에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하 현상이 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.

본 발명의 다른 양상은 식물의 저온 스트레스 저항성을 증진시키는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, "형질전환(transformation)"은 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsCBP 유전자 도입에 의해 형질전환된 식물의 저온 스트레스 저항성이 증가된 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 단편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내에 재도입된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 식물 및 식물세포를 형질전환시키기 위한 방법, 재조합 벡터 및 조성물은 당 업계의 숙련자에게 잘 알려져 있으며(TRENDS in Plant Science, Vol. 7, No. 5, May 2002, pp. 193-195), 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 사용된 용어, "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 식물세포에서 단백질을 발현할 수 있는 pCAMBIA1300 벡터일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, "식물"은 전체 식물, 식물 기관 (예를 들어 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자 및 식물 세포와 그의 자손을 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 식물류는 일반적으로 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물 모두를 포함하여 형질전환 기술에 대하여 유순한 고등 식물류만큼 광범위하다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 벼 유래의 OsCBP 단백질은 벼의 칼슘 신호전달 인산화효소인 OsCK1과 결합하여 인산화시키며, 또한 애기장대에서 과발현되는 경우 저온 신호전달 마커 유전자로 알려진 kin2 유전자의 발현을 촉진하므로 저온 스트레스 저항성 증진 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 식물의 저온 스트레스 저항성을 증가시키는 방법 및 저온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, "형질전환 식물체"는 서열번호 1로 표시되는 유전자를 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 식물세포, 식물체 자체를 포함하며, 형질전환으로 인하여 저온 스트레스 저항성이 증가된 식물체를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 형질전환 식물체는 저온 스트레스를 받는 경우 이에 대한 스트레스 반응 관련 유전자, 예를 들어 애기장대에서는 kin2 유전자를 빠르게 발현시켜 저온 스트레스에 대비할 수 있고, 결과적으로 저온 스트레스에 대한 생존율이 높아진다.

본 발명에서, 상기 식물체는 예를 들어 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드 클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는, 식물체의 저온 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다. 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 재조합 벡터에 삽입된 형태로 조성물에 함유될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 벼 유래의 OsCBP 단백질을 식물체에서 과발현시키면 저온 스트레스에 대한 식물체의 저항성을 증진시킬 수 있다.

도 1에서 A는 효모 이중-중합 시스템(yeast two hybrid)에 사용한 OsCK1-활성 도메인(activation domain, AD) 융합 단백질의 구조를 보여주고, B는 BD-OsCBP 융합 단백질과 AD-OsCK1 융합 단백질을 효모에 도입한 후 배양한 결과를 보여주며, C는 상기 융합 단백질들을 도입한 효모에서 베타-갈락토시데이즈 활성을 측정한 결과를 나타낸다(N, 음성 대조군; F, pAD-OsCK1F 융합 단백질; N, pAD-OsCK1N 융합 단백질; C, pAD-OsCK1C 융합 단백질 도입; 및 PC, 양성 대조군(pGAL4)).
도 2에서 A는 GST-OsCBP 융합 단백질의 구조를 보여주고(회색 박스는 EF 핸드 모티프), B는 대장균에서 GST-OsCBP 융합 단백질의 발현을 확인한 결과이며(P, 펠렛(pellet); S, 상등액(Supernatant); PT, 통과액(pass through); W, 세척액(washing); 및 E1~E4, 용출액(Elution)), C는 GST-OsCBP 융합 단백질을 사용하여 ⁴⁵Ca 오버레이(ovelay) 실험을 수행한 결과를 나타낸다(M, 사이즈 마커; 1, GST-AtCBL3; 2, GST-OsCBP; 3, GST).
도 3은 양파 표피세포에서 일시적으로 발현시킨 OsCBP-GFP 융합 단백질의 세포내 위치를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 OsCBP 단백질이 OsCK 인산화효소의 활성에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 OsCBP 단백질을 과발현하는 식물체 제작에 사용한 pCAMBIA1300-OsCBP 벡터의 개략적인 구조를 나타낸다.
도 6은 pCAMBIA1300-OsCBP 벡터를 도입한 애기장대에서 OsCBP 유전자의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다(Col0, 야생형 애기장대; 3B 및 4A, OsCBP 형질전환 애기장대).
도 7은 pCAMBIA1300-OsCBP 벡터를 도입한 애기장대에서 저온 스트레스에 의한 kin2 유전자 발현 변화(A) 및 내냉성(B 및 C)을 확인한 결과를 나타낸다 (Col0, 야생형 애기장대; 3B 및 4A, OsCBP 형질전환 애기장대).

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 벼의 칼슘 신호전달 인산화효소와 결합하는 칼슘센서 단백질 클로닝

저온 처리에 의해 벼(Oryza sativa)에서 발현이 증가하는 칼슘 신호전달 인산화효소인 OsCK1(Oryza sativa Calcium regulated protein Kinase 1; 등록특허 제10-0614418호)을 조절하는 칼슘 센서 단백질을 찾기 위하여, 애기장대의 칼슘 센서 단백질(calcineurin B like protein)과 상동성이 높은 유전자 클론 97AS2244를 벼 유래 cDNA 라이브러리에서 선발하고, 이를 OsCBP(Oryza sativa calcium binding protein; 서열번호 1 및 2)로 명명하였다.

이후, 활성 도메인(activation domain, AD)-OsCK1 융합 단백질, GAL4 DNA 결합 도메인(binding domain, BD)-OsCBP 융합 단백질을 발현하는 재조합 벡터를 각각 제작하고(도 1의 A), 상기 재조합 벡터를 효모 YRG2에 도입하여 SD-LT(standard minal medium with Leu and Trp) 또는 SD-LTH(SD with Leu, Trp and His) 배지에서 배양하였다.

배양 후 효모의 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 활성을 측정한 결과, OsCBP 단백질이 OsCK1 단백질과 상호작용하는 것을 확인하였다(도 1의 C). 특히, OsCK1 단백질의 C-말단 영역(315~449)을 포함하는 융합 단백질을 도입한 효모에서 베타-갈락토시데이즈 활성이 높게 나타나는 것을 확인하여 OsCBP 단백질이 OsCK1 단백질의 C-말단 영역(315~449)과 결합하는 것을 알 수 있었다(도 1의 C).

실시예 2: OsCBP 단백질의 특성 확인

2-1. OsCBP 단백질의 칼슘 결합 활성 확인

OsCBP 단백질의 아미노산 서열을 확인한 결과 칼슘과 결합하는 것으로 알려진 EF 핸드 모티프(hand motif)가 4개 존재하는 것을 알 수 있었다(도 2의 A에서 회색 박스). OsCBP 단백질이 칼슘과 결합하는지 분석하기 위하여 ⁴⁵Ca 오버레이(ovelay) 실험을 수행하였다. 구체적으로 OsCBP의 N-말단에 GST(glutathione S-transferase)가 융합된 GST-OsCBP 단백질을 발현시키고(도 2의 B), SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하여 단백질을 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 옮겼다. 이후 PVDF 막을 ⁴⁵CaCl₂를 포함하는 이미다졸 완충액(imidazole buffer)에 20분 동안 담그고, 67% 에탄올로 닦아준 후 이미지 분석기(Image analyzer)로 확인하였다.

그 결과, OsCBP 단백질이 칼슘 이온과 결합하는 활성이 있는 것을 확인하였다(도 2의 C에서 레인 2). 도 2의 C에서 레인 1 및 3은 각각 GST-애기장대(Arabidopsis thaliana)의 칼슘 센서 단백질(GST-AtCBL3) 및 GST이다.

2-2. OsCBP 단백질의 세포내 위치 확인

OsCBP 단백질의 세포내 위치를 확인하기 위하여 OsCBP 단백질의 C 말단에 GFP가 융합된 벡터를 제작하고, 유전자총을 사용하여 양파 표피세포에 도입하였다. 이후 세포내 형광을 분석하여 OsCBP-GFP 단백질의 세포내 위치를 확인한 결과, OsCBP 단백질이 세포막 및 세포내 소포(vesicle) 막에 위치하고 있는 것을 알 수 있었다(도 3).

2-3. OsCBP 단백질에 의한 OsCK1 인산화효소의 활성 증가 확인

OsCBP 단백질이 OsCK1의 인산화효소 활성에 미치는 영향을 GST-OsCK1 재조합 단백질을 사용하여 확인하였다. GST-OsCK1 단백질과 OsCBP 단백질을 γ-³²P-ATP(l μCi), MBP(myelin basic protein; 기질, 1 ㎍) 및 MnCl₂(10 mM)을 포함하는 완충용액(트리스 버퍼 10 mM, pH 7.5)에 첨가하여 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 SDS-PAGE로 분리하여 이미지 분석기(Bas 2500)로 인산화 밴드를 분석하였다.

그 결과, GST-OsCBP 단백질에 의하여 OsCK1의 자가인산화 활성 및 MBP 기질의 인산화 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, GST-OsCBP 단백질은 OsCK1 외에도 CIPK(Calcineurin B-like protein(CBL)-interacting protein kinase) 계열 인산화효소인 OsCK2 단백질의 인산화 활성을 증가시켰으며, OsCBP 단백질이 OsCK 인산화효소에 의해 인산화되는 특성이 있음을 알 수 있었다(도 4).

본 실험 결과를 통하여 OsCBP 단백질은 최소 2종이상의 OsCK 인산화효소를 활성화시키는 동시에 서로 다른 OsCK에 의해 인산화되어 여러 가지 기능을 수행할 가능성이 높음을 알 수 있다.

실시예 3: OsCBP 과발현 식물체 제작

3-1. OsCBP 식물발현 벡터 제작

OsCBP 유전자 서열을 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 증폭하고, 증폭 산물을 먼저 pGEM-T 벡터에 클로닝한 후 pKSII 벡터의 EcoRI/XbaI 제한효소 위치에 도입하였다. 이후 식물세포 발현벡터인 pCAMBIA1300 벡터의 SacI/KpnI 제한효소 위치에 다시 클로닝하여 OsCBP 과발현 벡터인 pCAMBIA1300-OsCBP 벡터를 제작하였다(도 5).

OsCBP-F: 5'-GAA TTC ATG TTG CAG TGT CTG GAG GGG-3' (서열번호 3)

OsCBP-R: 5'-CCC GGG TCT AGA TTT CAA GTA TCG TCG AG-3' (서열번호 4)

3-2. OsCBP 발현벡터가 도입된 애기장대 제작

상기 3-1에서 제작한 pCAMBIA1300-OsCBP 벡터가 도입된 아그로박테리움 GV3101을 야생형 애기장대(Col0) 식물체에 화기접종하고, 이후 생성된 종자를 하이그로마이신(15 ㎍/L)이 포함된 배지에서 발아시켜 형질전환체를 선발하고, 온실에서 생육시켰다. 생육시킨 OsCBP 형질전환 애기장대의 잎에서 각각 RNA를 분리하고 P³²로 표지된 OsCBP 유전자 프로브를 사용하여 노던 블롯(northern blot)을 수행하였다.

그 결과, 대조군인 야생형 애기장대(Col0)와 비교하여 형질전환 애기장대(3B 및 4A)에서 OsCBP 유전자가 발현되고 있음을 확인할 수 있었다(도 6).

3-3. OsCBP 발현벡터가 도입된 애기장대의 내냉성 분석

애기장대의 kin2 유전자는 저온 스트레스 및 앱시스산(abscisic acid, ABA)에 의하여 유도되는 대표적인 저온 신호전달 마커 유전자로 알려져 있다. 따라서 OsCBP 유전자가 과발현된 애기장대에서 저온 스트레스 처리에 의한 kin2 유전자의 발현 양상을 비교하였다.

MS0(Murashige and Skoog medium)-agar 배지를 사용하여 25℃ 배양실에서 애기장대를 2주 동안 키운 후 4℃ 배양기로 옮겨 6시간 및 24시간 동안 저온을 처리하였다. 이후 애기장대 식물체에서 총 RNA를 추출하여 전기영동한 후 하이본드(hybond) N⁺ 나일론막에 이동시켰다. 서열번호 5 및 6의 프라이머를 사용하여 애기장대에서 kin2 유전자 단편(184 bp)을 증폭하고, 증폭 산물을 ³²P로 방사성 표지한 후 노던 블롯의 프로브로 사용하여 상기 하이본드 N⁺ 나일론막과 혼성화반응을 수행하였다.

kin2-1 프라이머: 5'-ATG TCA GCG ACC AAC AAG-3' (서열번호 5)

kin2-2 프라이머: 5'-TCG CTA CTT GTT CAG GCC-3' (서열번호 6)

그 결과, 대조군인 야생형 애기장대(Col0)와 비교하여 형질전환 애기장대(3B 및 4A)에서는 kin2 유전자 발현 수준이 더 높거나 좀 더 빠른 시간 내에 kin2 유전자 발현이 유도되는 것을 알 수 있었다(도 7의 A). 이 결과는 OsCBP 유전자 발현이 저온 등 스트레스 신호전달에 영향을 주었을 가능성을 시사한다.

또한, 25℃ 생육실의 토양에서 3주 동안 키운 애기장대를 4℃에서 12시간 동안 전처리하여 적응시킨 후 -6℃로 옮겨 6시간 동안 저온 스트레스를 주었다. 애기장대를 다시 4℃에서 12시간 동안 적응시킨 후 25℃ 생육실로 옮겨 7일간 키운 뒤 생존률을 조사하였다. 그 결과, 야생형(Col0)에 비해 형질전환 애기장대(3B 및 4A)의 생존률이 더 높은 것을 확인하였다(도 7의 B).

지금까지의 실험 결과를 통하여 OsCBP 유전자의 발현 수준을 높임으로써 식물의 저온 스트레스 저항성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 전술한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 나타나 있으며, 이와 동등한 범위 내에 있는 모든 변경 또는 변형된 형태는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> A Calcium sensor Gene Enhancing Plant Cold Stress Tolerance and Use Thereof <130> P18R12C1435 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 678 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgttgcagt gtctggaggg ggtgaagcag ctctgcggcg tgctactcaa gtgctgcgac 60 ctcgacctca agcagcccaa ggggctcgag gatcccgaaa tcctcgccag ggagaccgtc 120 tttagtgtga gcgaggttga ggcgttgtat gagctgttca agaagatcag cagcgcggtg 180 atcgatgacg gactgatcaa caaggaggag tttcagttgg cgctgttcaa gaccaacaag 240 aaggagagtt tatttgctga ccgtgtattt gatttgttcg atacaaaaca caatggtatt 300 ttaggattcg aagaatttgc ccgtgcgctc tcagtatttc atccaaatgc acctctcgac 360 gagaaaattg acttttcttt ccagctatat gacctcaagc aacaagggtt cattgaaaga 420 caagaggtta agcaaatggt tgttgcaaca cttgctgagt cgggaatgaa tctttcggat 480 gaagtcatag agagcatcat tgataagaca tttgaggagg ccgacacaaa acatgatggg 540 aaaattgata aagaagaatg gcgcaatcta gttctcagac atccttcttt actgaaaaac 600 atgacactcc aatatctcaa ggacatcaca actacatttc caagctttgt cttccattct 660 caagtcgacg atacttga 678 <210> 2 <211> 225 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Leu Gln Cys Leu Glu Gly Val Lys Gln Leu Cys Gly Val Leu Leu 1 5 10 15 Lys Cys Cys Asp Leu Asp Leu Lys Gln Pro Lys Gly Leu Glu Asp Pro 20 25 30 Glu Ile Leu Ala Arg Glu Thr Val Phe Ser Val Ser Glu Val Glu Ala 35 40 45 Leu Tyr Glu Leu Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ala Val Ile Asp Asp Gly 50 55 60 Leu Ile Asn Lys Glu Glu Phe Gln Leu Ala Leu Phe Lys Thr Asn Lys 65 70 75 80 Lys Glu Ser Leu Phe Ala Asp Arg Val Phe Asp Leu Phe Asp Thr Lys 85 90 95 His Asn Gly Ile Leu Gly Phe Glu Glu Phe Ala Arg Ala Leu Ser Val 100 105 110 Phe His Pro Asn Ala Pro Leu Asp Glu Lys Ile Asp Phe Ser Phe Gln 115 120 125 Leu Tyr Asp Leu Lys Gln Gln Gly Phe Ile Glu Arg Gln Glu Val Lys 130 135 140 Gln Met Val Val Ala Thr Leu Ala Glu Ser Gly Met Asn Leu Ser Asp 145 150 155 160 Glu Val Ile Glu Ser Ile Ile Asp Lys Thr Phe Glu Glu Ala Asp Thr 165 170 175 Lys His Asp Gly Lys Ile Asp Lys Glu Glu Trp Arg Asn Leu Val Leu 180 185 190 Arg His Pro Ser Leu Leu Lys Asn Met Thr Leu Gln Tyr Leu Lys Asp 195 200 205 Ile Thr Thr Thr Phe Pro Ser Phe Val Phe His Ser Gln Val Asp Asp 210 215 220 Thr 225 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsCBP-F primer <400> 3 gaattcatgt tgcagtgtct ggagggg 27 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsCBP-R primer <400> 4 cccgggtcta gatttcaagt atcgtcgag 29 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kin2-1 primer <400> 5 atgtcagcga ccaacaag 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kin2-2 primer <400> 6 tcgctacttg ttcaggcc 18

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서열번호 2의 아미노산을 코딩하는 유전자 염기서열을 포함하는 형질전환용 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 과발현시키는 단계를 포함하는, 식물의 저온 스트레스 저항성을 증가시키는 방법.
서열번호 2의 아미노산을 코딩하는 유전자 염기서열을 포함하는 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된, 저온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
서열번호 2의 아미노산을 코딩하는 유전자 염기서열을 포함하는, 식물체의 저온 스트레스 저항성 증진용 조성물.