KR100671225B1

KR100671225B1 - 글리신-풍부 ｒｎａ-결합 단백질을 암호화하는뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 저온 또는 동결내성을 부여하는 방법

Info

Publication number: KR100671225B1
Application number: KR1020050001265A
Authority: KR
Inventors: 강훈승; 김연옥; 김진선; 김주열
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2005-01-06
Filing date: 2005-01-06
Publication date: 2007-01-19
Also published as: KR20060080973A

Abstract

본 발명은 글리신-풍부 RNA-결합 단백질 (GR-RBP)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법 및 상기 방법에 의하여 제조된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 저온 또는 동결 내성을 갖는 식물체는 저온에서도 탁월한 발아율 및 묘목 성장성을 나타내며, 동결 조건에서 우수한 생존율을 보인다.

글리신-풍부 RNA-결합 단백질, GR-RBP, 저온, 동결, 내성, 형질전환, 식물.

Description

글리신-풍부 ＲＮＡ-결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법{Method for generating Cold or Freezing Tolerance in Plants by Using Nucleotide Sequence encoding glycine-rich RNA-binding proteins}

도 1은 애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 서로 다른 기관에서 GR-RBPs의 발현 프로파일 그래프이다. 다양한 기관으로부터 분리한 총 RNA (200 ng)를 실시간 RT-PCR에서 처리하고, 다른 기관에서의 GR-RBPs 전사 수준을 1 ng 총 RNA 당 분자 복제수 (copy number)로 나타내었다. 3 회의 독립적인 실험으로부터 평균값 및 표준 오차 (오차막대)를 얻었다.

도 2는 GR-RBPs의 발현에 대한 저온 스트레스의 효과를 나타낸다. 다른 시간 동안 저온 스트레스에 노출된 애기장대에서 GR-RBPs의 전사 수준을 스트레스 처리되지 않는 대조군에 대한 상대적 발현 (폴드)으로 플롯하였다. 저온처리 (0.5, 1, 2, 4 및 6일)에 대한 3 회의 독립적인 실험으로부터 평균값 및 표준오차 (오차막대)를 얻었다( 도 2에서

는 0.5일,

는 1일,

는 2일,

는 4일,

는 6일 임).

도 3은 35S::GR-RBP2 식물체의 저온 및 동결 내성을 나타내는 그래프이다: (A) MS 배지에 파종한 야생형 (WT) 및 35S::GR-RBP2 식물체의 종자를 11℃에서 배 양하고, 표시된 일수에서 발아를 평가하였다 (Col-0: 야생형, C4, C7 및 C15: 35S::GR-RBP2 형질전환체)

(B) 24일된 야생형 및 35S::GR-RBP2 형질전환식물체를 -10℃에서 1.5 시간 동안 동결 처리하고, 정상 성장 조건에서 다시 5일 배양한 후에 생존한 식물체를 기록하였다.

(C) 동결 조건에서 야생형 및 35S::GR-RBP2 식물체의 전해질 누출. 야생형 및 35::GR-RBP2 라인으로부터 얻은 잎을 표시된 시간 동안 -10℃에서 동결처리하고 세포 손상의 정도를 전해질 누출을 측정함으로써 평가하였다. 결과는 3 개의 독립적인 실험의 평균이다.

도 4는 35S::GR-RBP7 식물체의 저온 및 동결 내성을 나타내는 그래프이다: (A) MS 배지에 파종한 야생형 (WT) 및 35S::GR-RBP7 식물체의 종자를 11℃에서 배양하고, 표시된 일수에서 발아를 평가하였다 (Col-0: 야생형, T6, T7 및 T9: 35S::GR-RBP7 형질전환체).

(B) 24일된 야생형 및 35S::GR-RBP7 형질전환식물체를 -10℃에서 4 시간 동안 동결 처리하고, 정상 성장 조건에서 다시 5일 배양한 후에 생존한 식물체를 기록하였다.

(C) 동결 조건에서 야생형 및 35S::GR-RBP7 식물체의 전해질 누출. 야생형 및 35::GR-RBP7 라인으로부터 얻은 잎을 표시된 시간 동안 -10℃에서 동결처리하고 세포 손상의 정도를 전해질 누출을 측정함으로써 평가하였다. 결과는 3 개의 독립적인 실험의 평균이다.

도 5는 35S::atRZ-1a 식물체의 저온 및 동결 내성을 나타내는 그래프이다: (A) MS 배지에 파종한 야생형 (WT) 및 35S::atRZ-1a 식물체의 종자를 11℃에서 배양하고, 표시된 일수에서 발아를 평가하였다 (Col-0: 야생형, T5, T8 및 T9: 35S::atRZ-1a 형질전환체).

(B) 24일된 야생형 및 35S::atRZ-1a 형질전환식물체를 -7℃에서 5시간 동안 동결 처리하고, 정상 성장 조건에서 다시 5일 배양한 후에 생존한 식물체를 기록하였다.

(C) 동결 조건에서 야생형 및 35S::atRZ-1a 식물체의 전해질 누출. 야생형 및 35::atRZ-1a 라인으로부터 얻은 잎을 표시된 시간 동안 -10℃에서 동결처리하고 세포 손상의 정도를 전해질 누출을 측정함으로써 평가하였다. 결과는 3 개의 독립적인 실험의 평균이다.

도 6은 GR-RBP 유전자를 pBI121 벡터에 삽입하여 제작한 발현벡터의 유전자 지도이다.

본 발명은 글리신-풍부 RNA 결합 단백질을 암호화는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법 및 그 형질전환체에 관한 것이다.

최근 수년 사이에, N-말단에 RNA-인식 모티프 (RRM)를 포함하고 글리신-풍부 모티프, 아르기닌-풍부 모티프, RGG-박스, 징크 핑거 모티프, K 호모로지 모티프 및 이중 가닥 RNA 결합 모티프 등과 같은 다양한 C-말단 보조 도메인 (auxiliary domains)을 포함하는 RNA-결합 단백질들이 다수 동정되었다 (Kenan et al., 1991; Fukami-Kobayashi et al., 1993; Burd 및 Dreyfuss, 1994; Alb 및 Pags, 1998). 이러한 도메인들의 특정한 배열에 기초하여 다른 단백질 패밀리들도 밝혀졌다. RNA-인식 모티프 (RRM)는 그 기능이 잘 연구된 반면, 보조 도메인의 기능은 몇 몇 경우에서만 확인되었는데, 핵산 및 다른 단백질 인자에 결합하는 것으로 제안되고 있다 (Kenan et al., 1991; Fukami-Kobayashi et al., 1993).

글리신-풍부 RNA-결합 단백질 (glycine-rich RNA-binding protien: GR-RBP)은 옥수수 (maize)에서 처음 동정되었으며 (Gmez et al., 1988), 상동성을 갖는 단백질을 암호화하는 cDNA가 다양한 식물체 종에서 확인되었다: 예를 들어, 애기장대 (van Nocker 및 Vierstra, 1993; Carpenter et al., 1994), 담배 (Hirose et al., 1993; Moriguchi et al., 1997), 보리 (Dunn et al., 1996; Molina et al., 1997), 배추 (Bergeron et al., 1993), 광옆등대풀 (Horvath 및 Olson, 1998), 및 알파파 (Ferullo et al., 1997).

식물체 GR-RBP에 있어서, RRM은 단백질의 N-말단 반을 차지하고 있으며, 모든 단백질에서 높은 서열 상동성 (60-80% 일치)을 나타낸다. C-말단 부위에는 매우 많은 수의 글리신이 존재하며 (약 70%), 단백질-단백질 상호작용에 관여할 것으 로 판단된다. 이 단백질들의 기능은 자세하게 알려지지는 않았지만, 저온, 상처, 수해, 살리실산, 아브시스산, 옥신, 바이러스 감염, UV 조사 및 중금속 등에 노출되었을 때, 이들의 mRNA 축적이 유도되므로, 스트레스에 대한 식물체의 반응에 관여할 것으로 보고되었다 (Sachetto-Martins et al., 2000 및 상기 논문의 참고문헌). 더욱이, 저온에 의하여 매우 높게 유도되며 박테리아의 저온-유도 RNA-결합 글린신-풍부 단백질 (GRPs)과 서열이 유사하여, 식물체 GR-RBPs은 저온 순응 과정 동안에 작용할 것으로 생각되어져 왔다. 하지만, 환경 스트레스에 대한 식물의 반응에서 GR-RBPs의 역할은 현재 이론적일 뿐이며, 식물체내에서 이를 명확히 뒷받침할 데이터는 아직 알려진 것이 없다.

아기장대 게놈은 196개의 RRM-포함 단백질 암호화하며, 그중 27 단백질이 글리신-풍부 및 소규모 RRM-포함 단백질로 분류된다 (Lorkovic 및 Barta, 2002). 본 발명에서 연구된 GR-RBPs는 GR-RBP 패밀리의 일원으로 N-말단에 RRM을 포함하며 C-말단에 글리신 풍부 잔기를 포함한다 (Lorkovic 및 Barta, 2002). GR-RBPs의 발현은 다양한 환경 스트레스에 의하여 조절된다는 것이 보고되었지만 (Didierjean et al., 1992; Carpenter et al., 1994; Dunn et al., 1996), 스트레스 반응에 있어서의 기능적 역할 및 중요성은 아직 많이 알려진 것이 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 다양한 스트레스 반응에서 글리신-풍부 RNA 결합 단백질 (GR-RBPs)의 역할을 규명하고자 예의 연구 노력한 결과, GR-RBPs을 암호화는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 식물체가 저온 또는 동결 내성을 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 글리신-풍부 RNA-결합 단백질 (GR-RBP)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 글리신-풍부 RNA-결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 저온 또는 동결 내성을 갖는 식물 형질전환체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물에 존재하는 글리신-풍부 RNA-결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 상향조절하는 단계를 포함하는 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 글리신-풍부 RNA-결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법을 제공한다.

글리신-풍부 RNA-결합 단백질 (glycin-rich RNA-binding protien: GR-RBP)은 옥수수 (maize)에서 처음 동정되었으며 (Gmez et al., 1988), 상동성을 갖는 단백질을 암호화하는 cDNA가 다양한 식물 종, 예를 들어, 애기장대, 담배, 보리, 배추, 광옆등대풀 및 알파파에서 확인되었다.

본 발명에서 글리신-풍부 RNA 결합 단백질은 RNA 인식 모티프 (RRM)로 알려진 도메인을 포함한다. RRM은 RNA 결합 단백질에 존재하는 보존된 서열로서 RRM은 2 개의 짧은 보존된 서열인 RNP1 (옥타머) 및 RNP2 (헥사머)를 포함한다 (Lorkovic, Z.J. 및 Barta, A. (2002)).

본 발명의 글리신-풍부 RNA 결합 단백질은 바람직하게는 N-말단에 RRM을 포함하며 C-말단 부위에 다수의 글리신이 존재한다.

아기장대에서 보고된 글리신-풍부 RNA 결합 단백질로는 GR-RBP1 내지 GR-RBP8 및 atRZ-1 등이 있다 (Lorkovic 및 Barta, 2002).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 글리신-풍부 RNA-결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 식물에서 유래된 서열이며, 바람직하게는 애기장대, 옥수수, 담배, 보리, 배추, 광옆등대풀 또는 알파파에서 유래된 서열이고 보다 바람직하게는 애기장대에서 유래된 서열이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 글리신-풍부 RNA 결합 단백질을 암호화는 뉴클레오타이드 서열은 글리신-풍부 RNA-결합 단백질1 (GR-RBP1: 서열목록 제 1 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질2 (GR-RBP2: 서열목록 제 2 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질3 (GR-RBP3: 서열목록 제 3 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질4 (GR-RBP4: 서열목록 제 4 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질5 (GR-RBP5: 서열목록 제 5 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질6 (GR-RBP6: 서열목록 제 6 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질7 (GR-RBP7: 서열목록 제 7 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질8 (GR-RBP8: 서열목록 제 8 서열), atRZ-1a (서열목록 제 9 서열), atRZ-1b (서열목록 제 10 서열) 또는 atRZ-1c (서열목록 제 11 서열)를 암호화는 뉴클레오타이드 서열이다 (Gene bank accession number: GR-RBP1, At2g16260; GR-RBP2, At4g13850; GR-RBP3, At5g61030; GR-RBP4, At3g23830; GR-RBP5, At1g74230; GR-RBP6, At1g18630; GR-RBP7, At2g21660; GR-RBP8, At4g39260; atRZ-1a, At3g26420; atRZ-1b, At1g60650; atRZ-1c, At5g04280). 보다 바람직하게는 글리신-풍부 RNA-결합 단백질2 (GR-RBP2), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질7 (GR-RBP7) 또는 atRZ-1a를 암호화는 뉴클레오타이드 서열이다.

본 발명의 글리신-풍부 RNA-결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터는 원핵 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

본 발명에서 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 (또는 식물 세포)을 숙주로 하여 구축된다.

본 발명에 이용되는 벡터는 기본적으로 (a) 식물 세포 내에서 작용하는 복제 원점; (b) 식물 세포 내에서 전사를 촉진할 수 있는 프로모터; (c) 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (d) 식물 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열을 포함한다.

본 발명에 있어서, 용어 "프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열"에서 용어 "기능적으로 연결된"은 유전자의 발현이 프로모터에 의해 조절되는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 용어 "폴리아데닐 시그널 서열"은 진핵세포에서 생성되는 mRNA의 3'의 폴리아데닐레이션을 조절하는 서열이다.

본 발명의 벡터에서 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, Adeno 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터에서 이용될 수 있는 프로모터는 예컨대, 1' 프로모터, 2' 프로모터 또는 노팔린 합성효소 (nos), 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터), 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토 메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터) 또는 식물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예:콜리플라우어 모자이크 바이러스 35S 프로모터)가 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바람직하게는 콜리플라우어 모자이크 바이러스 35S 프로모터이다.

본 발명에서 상기 외래 단백질을 인코딩 하는 구조 유전자 서열은 글리신-풍부 RNA 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다.

본 발명의 벡터에서 바람직한 폴리아데닐 시그널 서열은 아크로박테리움의 플라즈미드 종양-유발 (Ti) 유전자들 예컨대, 노팔린 신타아제 (NOS) 유전자, 식물 유전자들 예컨대, 7s 콩 저장 단백질 유전자 및 RuBP 카복실라제 유전자의 완두콩 E9 스몰 서브유닛의 폴리아데닐 시그널, SV40 polA 서열 및 BGH polA 서열 등이 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 진핵 세포용 발현 벡터는 당업계에 공지된 다양한 벡터로부터 선택할 수 있다. 예를 들어, pBI121, pSG5, pEGFP, YIp5, YCpl9, 아데노바이러스-유래 벡터, 폴리오바이러스-유래 벡터 및 소 파필로마 바이러스-유래 벡터가 있다.

본 발명에 이용되는 발현 벡터는 T7-Tag, S-Tag, His-Tag, HSV-Tag, pelB/ompT, KSI, Trx-Tag, GST-Tag, Nus-Tag, Dsb-Tag 및 CBD-Tag 등 다양한 태그를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 이용되는 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 한편, 상기 벡터는 추가적으로 리포터 물질 (루시퍼라아제, β-글루쿠로니다아제 등)을 인코딩 하는 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 바람직한 벡터는 pBI121 벡터이며, 도 6은 pBI121 벡터의 바람직한 구현예이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터로 식물을 형질전환하는 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

상기 형질전환된 숙주를 선별하는 단계는 상술한 선택표지에 의해 발현되는 표현형 (phenotype)을 이용하여, 용이하게 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 선택표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전 환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 식물의 형질전환은 아그로박테리움을 매개로하는 방법을 사용하며, 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스로 실시한다 (Depicker et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York, 1983). 아그로박테리움을 매개로하는 방법을 사용는 경우에는 바람직하게는 바이너리 (binary) 벡터 시스템을 이용한다 (An et al., Binary vectors. In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York, 1986). 상기한 바이너리 벡터는 예컨대, pBin19, pRD400, pRD320 등이 있다.

본 발명의 벡터를 내재하고 있는 아그로박테리움에 의한 식물 세포의 감염은 당 업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예컨대. 진공 인필트레이션 방법 등이 있다.

본 발명의 글리신-풍부 RNA 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 형질전환된 식물은 탁월한 저온 또는 동결 내성을 갖는다.

본 명세서에서 저온 내성이라 함은 2℃ 내지 17℃의 온도, 보다 바람직하게는 4-11℃의 온도에서 저온 스트레스를 받은 식물이 정상 성장온도에서와 같은 생리적 활성 (예를 들어, 발아 또는 묘목 성장)을 나타내는 것을 의미한다.

본 명세서에서 동결 내성이라 함은 -15℃ 내지 0℃의 온도, 바람직하게는 -12℃ 내지 -3℃, 보다 바람직하게는 -10℃ 내지 -5℃에서 동결 스트레스를 받은 식물이 일반 식물에 비하여 높은 생존율을 나타내거나 동결에 의한 세포의 손상이 방지 또는 개선되는 활성을 나타내는 것을 의미한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 글리신-풍부 RNA 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 형질전환된 식물은 저온 스트레스 하에서 형질전환되지 않은 식물과 비교하여 탁월한 발아율 및 묘목 성장성을 보인다. 또한, 동결 스트레스 하에서 형질전환되지 않은 식물과 비교하여 탁월한 생존율 및 세포로부터의 전해질 누출이 낮은 특성을 보여준다.

본 발명의 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법은 본 발명의 글리신-풍부 RNA-결합 단백질을 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키고 글리신-풍부 RNA-결합 단백질를 발현시켜 달성할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 글리신-풍부 RNA 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 저온 또는 동결 내성을 갖는 식물의 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 형질전환체는 글리신-풍부 RNA 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되기 때문에, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 식물은 식용작물 (벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 귀리, 수수 및 고구마), 채소작물 (애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근), 특용작물 ( 차, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채), 과수 (사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나), 화훼 (잔디, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립 및 정원수) 및 목초.사료작물 (라이그라스, 레드클로버, 오차드 그리스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스) 등이나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 식물에 존재하는 글리신-풍부 RNA 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 상향조절하는 단계를 포함하는 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명의 글리신-풍부 RNA 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하는 것이므로, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따르면, 식물에 존재하는 글리신-풍부 RNA-결합 단백질은 그 발현 정도에 의하여 식물의 저온 또는 동결 내성에 영향을 미친다.

따라서, 진핵 세포에서의 유전자 발현 메커니즘을 참조하여, 유전공학적 방법으로 식물에 존재하는 글리신-풍부 RNA-결합 단백질의 유전자의 발현을 조절하는 조절부위 (예: 프로모터, 인핸서 또는 서프레서)서열을 조작하거나 또는 발현 관련 전사인자들의 활성조작 등을 통하여 단백질 발현의 상향조절을 함으로써 식물의 저온 또는 동결 내성을 개선할 수 있다. 진핵 세포에서의 유전자 발현 메커니즘에 대하여는 Benjamin Lewin (2000), genes VII, Oxford university press; Buchanan, Gruissem, Jones (2000), Biochemistry 및 Molecular Biology of Plants, American Society of Plant Biologists 등을 참조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 글리신-풍부 RNA 결합 단백질은 RNA 인식 모티프 (RRM)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 글리신-풍부 RNA 결합 단백질은 바람직하게는 N-말단에 RRM을 포함하며 C-말단 부위에 다수의 글리신이 존재한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

Ⅰ: 식물 재료 및 스트레스 처리

본 발명에서 사용된 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 야생형 및 형질전환된 식물은 Col-0 에코형이었다.

종자를 질석, 이탄 및 펄라이트의 2:1:1 혼합물에 파종하였다. 습적 (stratification)을 위하여 암조건에서 3일 동안 4℃에서 배양한 후 정상적인 성장 조건에서 배양하였다. 식물체를 100 μEm^-2s^-1에서 장일 조건 (16 시간 명조건/8 시간 암조건 주기) 하에서 23℃에서 배양하였다. 주 1회 물을 주었다. 뿌리, 잎, 줄기, 꽃 및 장각 (silique)을 포함하는 조직 샘플을 발아 4 주후 토양에서 자란 식물체에서 채취하였다.

애기장대를 MS 배지 (Murashige 및 Skoog 1962)에서 23℃에서 배양하였다.

저온 처리를 위하여, 포트에 있는 식물체를 16 시간 광조건에서 1 내지 6일 동안 4℃에서 배양하였다. 샘플을 표시한 시간 주기에서 수집하고, 즉시 액체 질소에서 동결하였으며, RNA 추출 및 차후 분석에 사용하였다. 모든 실험은 최소한 3 회 반복하였다.

Ⅱ: RNA 추출 및 역전사 PCR

총 RNA를 동결된 샘플로부터 추출하였으며, Plant Rneasy 추출 키트 (Qiagen, USA)를 사용하였다. RNA의 농도를 분광광도계로 정확히 정량하고, 5 ㎍의 총 RNA를 1.2% 포르알데하이드 아가로스 겔에서 분리하여 농도를 측정하고 RNA의 온전성 (integrity)을 조사하였다. 0.5 내지 1 ㎍의 총 RNA를 RT-PCR 시스템에서 유전자 특이 프라이머들과 함께 사용하였다. ACTIN을 사용하는 대조반응을 위하여, 정방향 프라이머 (5'-CTCCGTGTTGCTCCTGAGGAACATC-3') 및 역방향 프라이머 (5'-acctcaggacaacggaatcgctc-3')를 사용하였다. RNA 전사물 (transcript)을 20 내지 25 PCR 주기로 증폭하였다.

Ⅲ: 정량적 실시간 (real-time) RT-PCR

다양한 스트레스-처리 샘플에서 GR-RBPs의 전사 수준을 Rotor-Gene 2000 실시간 열적 사이클링 시스템 (Corbett Research)에서 결정하였으며, QuantiTect SYBR Green RT-PCR 키트 (Qiagen)를 사용하였다 (Kim et al., 2003). 실시간 RT-PCR을 위한 PCR 프라이머 세트를 GeneRunner 프로그램을 사용하여 디자인하였으며, PCR 산물은 길이가 약 120-bp되고 어떠한 프라이머도 어떠한 다른 유전자와 70%이상의 상동성을 갖지 않도록 하였다.

총 RNA 샘플에 존재하는 GR-RBP 유전자의 복제수를 측정하기 위하여, 참조 매트릭스로서 GR-RBRs를 포함하는 5배 희석 범위의 pGEM-T Easy 플라스미드 (Promega)를 RNA 샘플과 동일한 조건에서 검사하였다. 상기 희석 범위에서 존재하는 유전자의 수를 DNA의 크기 및 질량에 기초하여 결정하고 이를 기준으로 하여 총 RNA 샘플에 존재하는 GR-RBR 유전의 복제수를 계산하였다.

Ⅳ: 벡터 제작 및 애기장대의 형질전환

과발현 컨스트럭트를 제작하기 위하여, GR-RBPs cDNA의 코딩 부위를 PCR (polymerase chain reaction)로 제조하였으며, pGEM-T Easy 벡터로 리게이션하였다. 벡터를 XbaI-BamHI 이중 가수분해로 가수분해하고, 동일한 제한효소에 의하여 가수분해되어 선형화된 pBI121 벡터로 상기에서 얻어진 DNA를 서브클론하였다.

모든 DNA 조작은 표준적인 방법 (Sambrook et al., 1989)에 따랐으며, GR- RBP 코딩 부위, 프로모터 부위 및 접합 (junction) 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 애기장대의 형질전환은 진공 인필트레이션 방법 (Bechtold 및 Pelletier, 1998)에 따랐으며, 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101을 사용하였다. 종자를 수확하고 카나마이신 선택 배지 (50 ㎍㎖^-1)에 접종하여 형질전환된 식물체를 동정하였다. 3:1 분리 비율 (segregation ratio)로 형질전환된 라인을 추가적으로 선택한 후, T₃ 또는 T₄ 동질접합체 (homozygous) 라인을 표현형 조사에 사용하였다.

Ⅴ: 스트레스 조건 하에서 발아 및 묘목 성장 분석

동일한 환경 조건에서 배양한 개개의 식물체로부터 동일자에 수확한 종자를 발아 분석에 사용하였다. 발아 분석은 40-50개의 종자를 3 벌씩 사용하여 실시하였다. 종자를 3% 수크로오스를 포함하는 MS 배지에 뿌리고 상기 플레이트를 암조건에서 3 일 동안 4℃에서 배양한 후 정상 성장 조건에서 배양하였다. 발아에 대한 저온 스트레스의 효과를 측정하기 위하여, 상기 MS 플레이트를 백광 (white light) 하에서 11-16℃로 유지되는 배양기에서 배양하였다. 종자 껍질에서 세근 (radicle)이 나오면 종자는 발아한 것으로 판단되었다. 식물체의 묘목 성장에 대한 다양한 스트레스의 효과를 시험하기 위하여, 종자를 3일 동안 정상 MS 배지에서 완전히 발아시키고, MS 플레이트를 수직 방향으로 배양하고 뿌리 성장을 매일 조사하였다.

Ⅵ: 동결 내성 (Freezing Tolerance) 시험

동결 내성을 시험하기 위하여 24일 된 야생형 및 35S::GR-RBP 식물체를 사용하였다. 식물체를 1일 동안 4℃에서 배양하고 일련의 온도 처리를 실시하였다: 1일 동안 -1℃ 및 1.5일 동안 -5℃. 동결 처리 후, 식물체를 즉시, 암조건 하에서 1일 동안 4℃에서 배양하고, 그 다음 정상 조건의 성장 챔버에서 배양하였다. 정상 성장 조건으로 이동시키고 5일 후에 식물체의 손상 정도를 측정하였다.

Ⅶ: 전해질 누출 시험

전해질 누출 백분율을 애기장대의 동결손상 정도를 평가하기 위하여 측정하였다. 잎 2 장을 각각의 식물체에서 절단하고 주의하여 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 놓고 적당한 시간 동안 -10℃에서 배양하였다. 표시된 시간 동안 배양한 후, 2 ㎖의 증류수를 튜브에 첨가하였다. 튜브를 실온에서 3 시간 동안 부드럽게 교반하고 전해질 함량을 전도도계 (Cole-Parmer Instrument Co.)로 측정하였다. 용액 및 잎을 멸균 (autoclave)한 후, 전해질 함량을 다시 측정하였다. 멸균 전 및 후의 전해질 함량 비율을 동결 처리 후 막의 손상 정도에 대한 척도로 사용하였다.

결과

Ⅰ: 애기장대에서 GR-RBP 발현에 대한 저온 스트레스의 효과

애기장대의 다른 기관에서 GR-RBPs 전사 수준을 실시간 RT-PCR로 분석하였다. 도 1은 다른 기관에서 GR-RBP의 전사 수준을 보여주며 전사수준은 총 RNA의 나노그램당 복제수로 나타내었다. GR-RBP는 줄기, 잎, 뿌리, 꽃 및 장각을 포함하여 모든 기관에서 총 RNA 나노그램당 3,000-22,000 copy의 고수준으로 도처에서 발현되었다.

GR-RBP의 전사 수준에 대한 저온 스트레스 효과를 시험하기 위하여, 애기장대를 저온 처리하고 실시간 PT-PCR로 GR-RBP의 발현 수준을 조사하였다.

본 실험은 최소 3 회 반복되었으며, 별도의 포트에서 성장한 식물체의 조직을 사용하였고, 히스토그램은 서로 다른 RNA 제조물로 수행된 별도의 실험의 평균값을 나타낸다. 도 2에서 보는 바와 같이, GR-RBP의 축적에 상당한 변동이 발생하였다. 저온 처리는 GR-RBP의 발현을 상향 조절하였으며, 전사 수준이 저온 처리 후 1 일 및 4 일 후에 각각 5 배 및 7 배 증가하였다. 모든 스트레스-처리 식물체에서 ACTIN의 전사 수준의 상당한 변화는 관찰되지 않았다. 스트레스 반응 마커 RD29A의 발현은 저온 처리에 의하여 18 배 증가하였으며, 이는 본 발명의 실험 조건 및 실시간 RT-PCR 분석이 스트레스-처리 샘플에서 전사 수준의 변화를 판단하는 데 유효하다는 것을 보여준다.

Ⅱ: 저온 스트레스 하에서 GR-RBR-과발현 형질전환 식물체의 종자 발아 및 묘목 성장

저온 스트레스에 의하여 GR-RBPs의 발현이 상향 조절된다는 것은 GR-RBPs가 저온 스트레스에 대한 식물체의 반응에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 저온 스트레스에 대한 식물체의 반응에서 GR-RBPs의 기능적 역할을 조사하기 위하여, 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (35S::GR-RBPs)의 조절 하에서 GR-RBPs를 과발현하는 형질전환 애기장대를 제작하고 형질전환된 애기장대에서 GR-RBPs의 과발현을 RT-PCR 분석으로 확인하였다 (결과 미첨부). 8-10의 독립적인 형질전환체 라인 중에서 각각의 GR-RBP에 대하여 3 개의 형질전환체 라인을 선택하고 추가적인 분석에 사용하였다. 정상 성장 온도에서 35S::GR-RBP 식물체의 발아 및 성장은 야생형과 동일하였다 (결과 미첨부). 야생형 및 35S::GR-RBP 식물체의 종자를 저온 (11℃)에서 배양하면, 야생형 및 형질전환체의 발아 비율 및 묘목 성장에 상당히 변화가 있었다. 35S::GR-RBP 형질전화 식물체는 상당히 빠르게 발아하였고, 저온에서 야생형 식물체 보다 우수하게 성장하였다. 이런 결과는 GR-RBPs 저온에서 발아 및 묘목 성장에 양성 조절자로 작용함을 시사한다.

Ⅲ: 35S::GR-RBP 형질전환체의 동결 내성

GR-RBPs를 과발현하는 형질전환 애기장대는 저온에서 상승된 종자 발아 및 묘목 성장을 보여주므로, 본 발명자들은 GR-RBPs가 애기장대의 동결 내성을 향상하는 데 기여하는 가를 평가하고자 하였다. 24 일 자란 야생형 및 35S::GR-RBP 식물체를 1-4 시간 동안 5 내지 -10℃에서 동결처리하고, 다시 식물체를 정상 성장 조건에서 5일 배양한 후 식물체의 생존율을 기록하였다. 도 3-5에 나타난 바와 같이, 동결 스트레스 제거 후 야생형 식물체는 10%가 생존하였으며, 35S::GR-RBP 식물체는 70-80% 생존하였다. 본 실험은 3회 반복하였으며, 각각의 독립적인 실험에서 성장률에 약간의 차이가 있었으나, 유사한 결과를 관찰하였다.

야생형 식물체와 비교하여 35S::GR-RBP 식물체의 증가된 동결 내성에 대하여, 동결에 의하여 유도되는 막 손상에 기인하는 식물체의 세포 손상을 비교함으로써 다시 한번 평가하였으며, 상기 막 손상의 정도는 채취한 잎의 전해질 누출을 측정하여 판단하였다. 각각의 식물로부터 잎 2장을 잘라내고 적절한 기간 동안 -10℃에서 배양하였다. 도 3-5에서 보는 바와 같이, 야생형 및 35S::GR-RBPs 식물체에서 채취한 잎의 전해질 누출은 약 20%이었으며, -10℃에서 1-5 시간 동안 일정하게 유지되었다. -10℃에서 추가적으로 배양하는 동안, 야생형 잎의 전해질 누출은 7 시간째에 55% 그리고 9 시간째에 80%로 급속하게 증가하였다. 대조적으로, 35::GR-RBPs 식물체의 전해질 누출은 야생형에 비하여 매우 낮았으며, 이는 35S::GR-RBPs 식물체가 야생형보다 동결에 보다 내성이 있다는 것을 시사하였다.

토의

다양한 식물 GR-RBP 유전자들이 보고되고 있지만, 이들이 관여하는 생물학적 현상 및 환경 스트레스에 대한 식물체의 반응에서 이들의 작용에 대하여는 거의 알려진 것이 없다. 본 발명은 애기장대에서 GR-RBPs가 저온 및 동결 조건 하에서 아기장대의 발아 및 묘목 성장에 기능적인 역할을 수행한다 것을 명백하게 보여준다. 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 장각을 포함하여 모든 기관에서 GR-RBPs가 발현되는 것은 표적 RNAs의 생성 및 대사에 근본적이면서 중요한 역할을 수행한다는 것을 시사한다.

GR-RBPs의 발현은 저온 처리에 의하여 매우 증가하였다 (도 2). 저온 스트레스에 의한 이와 같은 GR-RBPs의 상향 조절은 저온 스트레스 조건 하에서 GR-RBPs가 애기장대에서 매우 중요한 기능적 작용을 한다는 것을 나타낸다. 저온 스트레스 하에서, GR-RBPs의 발현 패턴에 따라 35S::GR-RBPs 형질전환 식물체의 발아 및 묘목 성장이 변화한다는 것을 주목하여야 한다. 저온 스트레스에 의하여 상향 조절되는 GR-RBPs의 과발현은 저온 하에서 애기장대의 발아 및 묘목 성장을 상승시켰으며 (도 3-5), 이는 GR-RBPs가 저온 하에서 양성 조절자로서 역할을 한다는 것을 의미한다. 더욱이, 35S::GR-RBP 식물체가 야생형 식물체에 비하여 매우 상승된 동결 내성을 나타낸다 (도 3-5)는 것은 GR-RBP가 저온 스트레스 하에서 양성 조절자로서 역할을 하는 것을 보다 더 명확히 뒷받침한다.

본 명세서에 기재된 실험적 증거자료는 GR-RBPs가 저온 스트레스 발생시에 애기장대의 발아 및 묘목 성장에 매우 중요한 역할을 하다는 것을 보여주며, 이는 GR-RBPs를 암호화는 유전자 패밀리가 다양한 스트레스 조건에서, 특히 저온 순응 과정 동안에 식물체의 반응에 관여할 것이라는 제안 (Sachetto-Martins et al., 2000 및 상기 논문의 참고문헌)을 뒷받침한다.

결론적으로, 본 발명은 저온 스트레스에 대한 식물의 반응에서 GR-RBPs의 기능적 역할을 최초로 명확히 개시하였다. GR-RBP-과발현 형질전환 식물체와 야생형의 표현형의 비교는 GR-RBPs가 저온 스트레스 하에서 발아 및 묘목 성장 그리고, 애기장대의 동결 내성에 결정적인 역할을 한다는 것을 명확히 보여준다. GR-RBP가 저온 및 동결 스트레스 하에서 양성 조절자로 작용한다는 사실은 스트레스 반응에서 GR-RBP의 기능적 역할을 조사하는 방향을 제시한다.

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이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명은 글리신-풍부 RNA-결합 단백질 (GR-RBP)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법 및 상기 방법에 의하여 제조된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 저온 또는 동결 내성을 갖는 식물체는 저온에서도 탁월한 발아율 및 묘목 성장성을 나타내며, 동결 조건에서 우수한 생존율을 보인다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

글리신-풍부 RNA-결합 단백질 (GR-RBP)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 글리신-풍부 RNA-결합 단백질은 RNA 인식 모티프 (RRM)를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 글리신-풍부 RNA 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 식물에서 유래하는 것을 특징으로 하는 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 글리신-풍부 RNA-결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 애기장대에서 유래하는 것을 특징으로 하는 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 글리신-풍부 RNA 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 글리신-풍부 RNA-결합 단백질1 (GR-RBP1: 서열목록 제 1 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질2 (GR-RBP2: 서열목록 제 2 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질3 (GR-RBP3: 서열목록 제 3 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질4 (GR-RBP4: 서열목록 제 4 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질5 (GR-RBP5: 서열목록 제 5 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질6 (GR-RBP6: 서열목록 제 6 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질7 (GR-RBP7: 서열목록 제 7 서열), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질8 (GR-RBP8: 서열목록 제 8 서열), atRZ-1a (서열목록 제 9 서열), atRZ-1b (서열목록 제 10 서열) 또는 atRZ-1c (서열목록 제 11 서열)를 암호화는 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 글리신-풍부 RNA 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 글리신-풍부 RNA-결합 단백질2 (GR-RBP2), 글리신-풍부 RNA-결합 단백질7 (GR-RBP7) 또는 atRZ-1a를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법.
글리신-풍부 RNA-결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 저온 또는 동결 내성을 갖는 식물 형질전환체.
식물에 존재하는 글리신-풍부 RNA-결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 상향조절시키는 단계를 포함하는 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 글리신-풍부 RNA-결합 단백질은 RNA 인식 모티프 (RRM)를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물에 저온 또는 동결 내성을 부여하는 방법.