CN101619096A

CN101619096A - 一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101619096A
Application number: CN200910090408A
Authority: CN
Inventors: 朱保葛; 徐民新; 张利明; 马文平; 聂晶; 赵丽
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2010-01-06
Anticipated expiration: 2029-07-31
Also published as: CN101619096B

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明的植物耐逆性相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。实验证明，本发明的耐逆性相关蛋白及其编码基因能显著提高植株的耐逆性。本发明的耐逆相关蛋白及其编码基因可应用于培育耐逆植物品种，提高农作物产量，具有重要的经济意义和应用前景。

Description

一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白(系大豆种子脱水素突变蛋白)及其编码基因与应用。

背景技术

脱水素(dehydrin，DHN)是植物种胚发育后期富集的一类蛋白，广泛存在于裸子植物、被子植物、藻类、地衣、苔藓、蕨类植物、蓝细菌以及酵母中，属于LEA(Late embryogenesis abundant)蛋白家族的第II类成员，它首先在棉花种子成熟过程中富集而被鉴定。在干旱诱导的蛋白中，脱水素蛋白(dehydrin，DHN)是最常被诱导产生的蛋白，它也受高盐、渗透胁迫、冷冻胁迫以及ABA等诱导。

在几乎所有的植物DHN中都存在一个高度保守的K序列(EKKGIMDKIKEKLPG)和另两个保守序列，即S序列和Y序列。除了K、S、Y序列外，还存在另一个富含甘氨酸(Gly)和极性氨基酸特别是苏氨酸的序列，即Φ序列。K序列在C末端，通常含有1至11个重复序列。在玉米和豇豆DHN的研究中证明K序列可以形成两亲性质的α-螺旋结构，两亲性质的α-螺旋结构使得DHN存在于细胞膜疏水性磷脂分子与胞质溶胶之间的界面，并且DHN可以与部分变性蛋白质暴露出的疏水性界面相互作用，阻止当干旱或者冷冻胁迫时细胞失水而引起的蛋白质聚集。Φ序列通常存在于重复的K序列之间，高度极性和亲水性的Φ序列可以与细胞质或细胞核的大分子疏水表面相互作用，避免大分子的聚集。Y序列位于N端，S序列含有短的丝氨酸(Ser)重复序列，S序列与DHN的磷酸化及核定位有关。组成DNH的氨基酸残基绝大部分是极性氨基酸或是带电荷的氨基酸。研究表明，含有羟基的丝氨酸和苏氨酸可以形成氢键，在细胞失水时紧密的氢键网络可以维护蛋白质的长期稳定。

目前国内外对脱水素的耐逆功能进行了广泛的研究，在拟南芥中过量表达玉米脱水素Rab17，可以提高拟南芥在高盐浓度下的存活率并改善拟南芥的渗透调节能力，使拟南芥在高渗处理(200mM甘露醇)后可以更快地得以恢复。在酵母中表达小麦的LEA蛋白EM可以提高酵母耐高渗的能力，过量表达小麦脱水素DHN-5的拟南芥植株的对高盐胁迫表现出了更强的抵抗能力，并且在高渗处理后能够比野生型拟南芥更快恢复生长；在水稻中表达大麦的HAV1 LEA蛋白，可以提高水稻耐缺水和盐胁迫的能力。体外实验证明，菠菜的DHN可以在冷冻条件下保护酶的活性。Whitsitt et al.(1997)研究证明大豆脱水素Mat1在严重脱水的大豆幼苗胚轴中表达水平明显增高，并且Mat1的表达受脱水诱导而不受ABA诱导；Mamma et al.(2003)研究发现26/27-kDa的大豆脱水素有低温防护功能；Porcel et al.(2005)研究了大豆与丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal，AM)共生条件下大豆脱水素的表达情况，当水分供应充足时，2个大豆脱水素基因gmlea8和gmlea10都不表达，而在干旱胁迫且没有接种丛枝菌根条件下，这2个脱水素基因都高表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的植物耐逆性相关蛋白(mGmDHN1)，来源于大豆属栽培大豆(Glycine max L.)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的mGmDHN1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
标签	残基	序列	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的mGmDHN1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中mGmDHN1的编码基因可通过将序列表中序列2自5′端第1至681位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述植物耐逆性相关蛋白的编码基因(mGmDHN1)也属于本发明的保护范围。

所述蛋白的编码基因可为序列表中序列2所示的DNA分子。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护扩增所述基因的引物。

可用现有的植物表达载体构建含有所述编码基因(mGmDHN1)的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用mGmDHN1构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶(如绿色荧光蛋白)或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为pCAMBIA1300Bar：mGmDHN1；所述pCAMBIA1300Bar：mGmDHN1是将所述基因导入pCAMBIA1300的多克隆位点得到的。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。

本发明提供的培育耐逆植物的方法，是将所述基因导入植物细胞中，得到耐逆植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的mGmDHN1导入植物细胞，可获耐逆性增强的转基因细胞系，将本发明所提供的mGmDHN1导入植物，可获耐逆性增强的转基因植物。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

具体来说，可将重组表达载体pCAMBIA1300Bar：mGmDHN1导入植物细胞中，得到耐逆植物。

所述耐逆植物具体可为所述耐逆植物是耐干旱和/或耐盐和/或耐高渗和/或耐低温的植物。

实验证明，本发明的耐逆性相关蛋白及其编码基因能显著提高植株的耐逆性。本发明的耐逆相关蛋白及其编码基因可应用于培育耐逆植物品种，提高农作物产量，具有重要的经济意义和应用前景。

附图说明

图1为大豆品种99-180(WT)和突变体Y-92成熟种子全蛋白的SDS-PAGE分析；M：蛋白标准分子量；箭头所示为差异条带。

图2为Y92和WT成熟种子全蛋白的双向电泳图谱；箭头所示为差异条带。

图3为利用MALDI-TOF技术获得的Y-92和WT目标蛋白的肽指纹图谱。

图4为目标蛋白A(Y-92)和目标蛋白B(WT)的MASCOT检索结果；A：目标蛋白A(Y-92)；B：目标蛋白B(WT)。

图5为mGmDHN1基因和GmDHN1基因逆境胁迫诱导表达的RT-PCR检测结果；1、3、5泳道为野生型99-180(WT)；2、4、6泳道为Y-92。1-2泳道为高盐胁迫诱导；3-4泳道为水处理对照组(ck)；5-6泳道为干旱胁迫诱导。

图6为15％PEG胁迫处理Y-92幼苗不同时间对mGmDHN1的基因表达水平的影响。

图7pCAMBIA1300Bar：mGmDHN1载体和pCAMBIA1300 Bar：GmDHN1载体的结构元件示意图；载体带有抗性标记基因Bar和3个CaMV 35S启动子。

图8为转mGmDHN1基因拟南芥的RT-PCR检测；1-2：WT；3-5：T₃代转mGmDHN1基因拟南芥。

图9为转mGmDHN1基因拟南芥的Western杂交检测结果；1：野生型；2-4：T₃代转mGmDHN1基因拟南芥。

图10为不同拟南芥株系高渗胁迫处理后的生长情况；1：野生型；2：转空载体对照；3：转mGmDHN1基因株系；4：转GmDHN1基因株系。

图11为不同拟南芥株系高盐胁迫处理后的生长情况；1，2为野生型；3，4为转mGmDHN1基因株系；5，6为转GmDHN1基因株系。

图12为不同拟南芥种子盐胁迫处理后的萌发和生长情况；1-3：野生型；4-6：转mGmDHN1基因株系。

图13为不同拟南芥低温处理后的生长情况；1，2为野生型；3，4为转mGmDHN1基因株系。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、大豆种子脱水素突变蛋白(mGmDHN1)及其编码基因的发现

以早熟大豆品种99-180(wild type，WT)的批量纯合种子为材料通过EMS(Ethyl methane sulfonate)诱变处理得到后代分离群体，从中发现一个晚熟高产突变单株，经过多代系谱法选育和鉴定，获得了优良稳定突变系Y-92。

一、大豆种子脱水素突变蛋白(mGmDHN1)及其编码基因的发现

(一)Y-92和WT成熟种子全蛋白的SDS-PAGE和双向电泳分析

提取Y-92和WT的成熟种子全蛋白，通过12.5％SDS-PAGE技术(考马斯亮蓝染色)分析Y-92和WT之间的蛋白电泳谱带差异。结果显示Y-92中一个蛋白谱带的涌动速度快于WT，如图1中箭头所示。同时运用双向电泳分析Y-92和WT全蛋白，发现二者之间一个蛋白点的位置差异与SDS-PAGE结果相似，也是Y-92蛋白点的迁移速度快于WT，如图2中箭头所示。将该差异蛋白作为目标蛋白，Y-92的目标蛋白作为目标蛋白A，WT的目标蛋白作为目标蛋白B。

(二)运用肽质量指纹质谱(MALDI-TOF)和液质联用质谱(LC-MS/MS)技术分析鉴定Y-92的目标蛋白

从双向电泳胶上分别切取目标蛋白A和目标蛋白B，先进行胶内的胰蛋白酶酶解，然后进行MALDI-TOF分析(AXIMA-CFR TM plus株式会社岛津制作所日本)，图3表示Y-92和WT的目标蛋白指纹图谱。图3显示二者目标蛋白的肽指纹图谱大部分峰值(质荷比)相近，主要差异在于目标蛋白A(Y-92)的峰值为1556.9，而目标蛋白B(WT)的峰值为1544.7，这是该肽段中所隐含的二者目标蛋白差异所在。通过蛋白数据库MASCOT检索发现，二者的检索结果基本相同(见图4)，说明来自Y-92和WT的两个目标蛋白点属于同一种蛋白(得分最高的蛋白)，即脱水素(dehydrin，缩写为DHN)。将目标蛋白A(Y-92)命名为mGmDHN1，分子量为23736.8Da。将目标蛋白B(WT)命名为GmDHN1，分子量为237314.17Da。利用液质联用质谱(LC-MS/MS)分析(ProteomeX-LTQ ThermoFinnigan美国)，结合NCBI数据库检索，分别得到mGmDHN1和GmDHN1的全部226个氨基酸。mGmDHN1的氨基酸序列见序列表的序列1。GmDHN1的氨基酸序列见序列表的序列3(序列3的序列与GenBank Accession Number：U10111的序列一致)。两者之间的差异在于自氨基末端第86位氨基酸残基，mGmDHN1为异亮氨酸(Ile)，GmDHN1为苏氨酸(Thr)。

(三)mGmDHN1和GmDHN1基因的克隆分析

根据NCBI公布的脱水素cDNA保守序列(GenBank Accession Number：U10111)设计引物，正向引物为5’-AAAA CCAACAACAACTATGG-3’，反向引物为5’-GCATGCATGATGCACGAT GC-3’。从干旱诱导的大豆(Y-92或WT的)叶片中提取总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。mGmDHN1编码基因的序列如序列表的序列2所示。GmDHN1编码基因的序列如序列表的序列4所示。两者之间的差异在于自5′末端第257位核苷酸，mGmDHN1为T，GmDHN1为C，正是该核苷酸的突变，使得GmDHN1中的苏氨酸(氨基末端第86位氨基酸残基)突变为mGmDHN1中的异亮氨酸(氨基末端第86位氨基酸残基)。

二、mGmDHN1基因的胁迫诱导表达检测

1、高盐、干旱胁迫处理

分别高盐(150mM 5hr)和干旱(不浇水至叶片萎蔫)胁迫处理大豆突变体Y-92及其野生型99-180(WT)的植株后取二者叶片提取总RNA，用水处理作为对照。进行半定量RT-PCR，引物为：5’-GGCGGATCCATGGCAAGTTATCAAAAGC-3’；5’-GGCGAATTCCTACTTGTCACTGTGTCCTC-3’。

结果见图5。结果表明：高盐和干旱诱导均能明显提高Y-92中mGmDHN1基因的转录水平，且高盐诱导的提高效果更明显；高盐和干旱对野生型99-180中GmDHN1基因转录的诱导作用不明显。

2、高渗胁迫处理

用15％PEG(4000)持续处理大豆突变体Y-92幼苗不同时间(12h，36h，3d)，以不处理为对照(0h)。提取各处理组的叶片总RNA，运用半定量RT-PCR技术分析高渗胁迫处理时间对mGmDHN1基因的表达水平的影响。RT-PCR的引物为：5’-GGCGGATCCATGGCAAGTTATCAAAAGC-3’；5’-GGCGAATTCCTACTTGTCACTGTGTCCTC-3’。

结果见图6。结果表明：mGmDHN1基因在未胁迫处理时呈现弱表达，胁迫处理12小时和36小时表达量逐渐增加，而当胁迫处理时间延长到3天时，其表达水平呈现数10倍的增加。

实施例2、转基因植物的获得和耐逆性鉴定

第一代转基因植株为T₀代植株，T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

一、转基因植物的获得和鉴定

1、转基因拟南芥的获得

制备mGmDHN1基因的DNA片段，将DNA片段克隆到植物表达载体pCAMBIA1300(购自CAMBIA公司)的BamHI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒pCAMBIA1300Bar：mGmDHN1，重组质粒均含有3个CaMV35S启动子和筛选标记基因Bar(见图7)。用重组质粒转化农杆菌GV3101(Invitrogen公司)，再用农杆菌转化拟南芥Col-0(购自LEHLE SEEDS公司)，通过除草剂筛选、分子检测和选育鉴定，获得了多个纯合T₃代转mGmDHN1基因拟南芥株系。

制备GmDHN1基因的DNA片段，将DNA片段克隆到植物表达载体pCAMBIA1300的BamHI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒pCAMBIA1300Bar：mGmDHN1：GmDHN1，重组质粒均含有3个CaMV35S启动子和筛选标记基因Bar(见图7)。用重组质粒转化农杆菌GV3101，再用农杆菌转化拟南芥Col-0，通过除草剂筛选、分子检测和选育鉴定，获得了多个纯合T₃代转GmDHN1基因拟南芥株系，作为对照。

用pCAMBIA1300转化农杆菌GV3101，再用农杆菌转化拟南芥Col-0，通过除草剂筛选、分子检测和选育鉴定，获得了多个纯合T₃代转空载体拟南芥株系，作为对照。

2、转基因植株的鉴定

(1)RT-PCR检测

提取3个转mGmDHN1基因拟南芥T₃代株系的植株和野生型植株的叶片总RNA，运用半定量RT-PCR技术检测mGmDHN1基因在拟南芥中的异源表达情况。所用引物为：5’-GGCGGATCCATGGCAAGTTATCAAAAGC-3’；5’-GGCGAATTCCTACTTGTCACTGTGTCCTC-3’。

结果见图8。结果显示，mGmDHN1基因在检测的3个转基因株系的植株中均有明显表达，而野生型植株未检测到其表达。

(2)Western杂交检测

利用老鼠制备mGmDHN1抗体，分别从3个转mGmDHN1基因拟南芥T₃代株系的植株和野生型植株的叶片中提取并纯化全蛋白进行SDS-PAGE电泳，通过Western杂交技术检测mGmDHN1的表达情况。

结果见图9。结果表明，mGmDHN1基因在检测的3个转基因株系的植株中均有明显表达，而野生型植株未检测到其表达。

二、耐逆性鉴定

1、耐渗透性能

对转mGmDHN1基因拟南芥的T₃代株系、转GmDHN1基因拟南芥的T₃代株系、转空载体拟南芥的T₃代株系和野生型拟南芥Col-0(WT)分别进行高渗胁迫处理。每个处理中，每个株系取50株，每个处理设置3次重复试验，结果取平均值。具体处理如下：用15％PEG(4000)对植株进行高渗胁迫处理3天后浇水冲淡、洗掉PEG，恢复生长3天后观察拍照并进行存活率统计。

照片见图10。由图可见：转mGmDHN1和GmDHN1基因的拟南芥株系生长受渗透胁迫抑制程度较轻(即轻度萎焉)，其中以转mGmDHN1株系受抑制程度更轻些，去除PEG后二者植株均容易恢复生长；而转空载体株系和野生型(非转化株系)受抑制程度均较重(二者接近)，萎焉程度明显加重，死亡植株明显增多。统计结果表明，转mGmDHN1基因、转GmDHN1基因、转空载体和野生型的拟南芥株系幼苗平均死亡率分别为21.8％、24.6％、76.5％和75.8％，前二者的死亡率明显低于后二者，而以转mGmDHN1基因的拟南芥幼苗死亡率最低。结果说明，mGmDHN1和GmDHN1基因均能明显提高拟南芥植株的耐高渗能力，而以mGmDHN1基因的提高效果更好。

(2)耐盐性能

对转mGmDHN1基因拟南芥的T₃代株系、转GmDHN1基因拟南芥的T₃代株系和野生型拟南芥Col-0(WT)分别进行高盐胁迫处理。每个处理中，每个株系取50株，每个处理设置3次重复试验，结果取平均值。具体处理如下：将植株以高盐(200mM NaCI)溶液浇灌处理15天，每天观察，第16天拍照并统计存活率。

照片见图11。由图可见，转mGmDHN1和GmDHN1基因的拟南芥株系在高盐胁迫下受抑制程度均较轻，基本都能正常生长，其中以转mGmDHN1基因株系的生长更好些，而2个野生型对照株系则受害严重，其植株全部死亡。统计发现，转mGmDHN1和GmDHN1基因株系以及野生型株系的植株平均死亡率分别为10.5％、15.2％和100％。结果表明，mGmDHN1和GmDHN1基因均能提高拟南芥植株的耐盐性能，而以前者的提高效果更明显。

此外，将转mGmDHN1基因拟南芥的T₃代株系和野生型拟南芥Col-0(WT)的种子分别在含有125mM NaCl的1/2MS培养基上萌发10天后转到不含NaCl的蛭石中恢复生长12天，统计萌发率、观察小苗与根系状况并拍照。每个处理中，每个株系取50粒种子，每个处理设置3次重复试验，结果取平均值。

照片见图12。结果表明：在盐胁迫条件下，转mGmDHN1基因拟南芥种子的萌发率达到62％，而野生型拟南芥种子的萌发率只有10％；转mGmDHN1基因拟南芥小苗的根系长度为野生型拟南芥小苗的根系长度的2倍以上；转mGmDHN1基因拟南芥小苗的叶片颜色比野生型拟南芥小苗更深、更绿；说明转mGmDHN1基因植株对盐胁迫的耐受性明显高于野生型植株。

(3)耐低温性能

对转mGmDHN1基因拟南芥的T₃代株系和野生型拟南芥Col-0(WT)分别进行低温胁迫处理。每个处理中，每个株系取50株，每个处理设置3次重复试验，结果取平均值。具体处理如下：在小塑料花盆中分别种植植株，在-6℃低温下连续处理24小时后转移至28℃下正常培养5天，然后观察拍照并统计存活率。

结果见图13。由图可见：转mGmDHN1基因拟南芥恢复良好、植株生长正常、叶片绿色；野生型拟南芥不少叶片被冻死而无法恢复。转mGmDHN1基因拟南芥植株的平均死亡率为6.90％，野生型拟南芥的死亡率为56.68％。结果表明：转mGmDHN1基因拟南芥表现出较强的低温耐受性，可见mGmDHN1能够显著增强植株的耐低温能力。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用

<130>CGGNARY92443

<160>4

<210>1

<211>226

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max L.)

<400>1

Met Ala Ser Tyr Gln Lys His Tyr Asp Asp Gln Gly Arg Lys Val Asp

1 5 10 15

Glu Tyr Gly Asn Val Glu Lys Gln Thr Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Val

20 25 30

His Ala Ala Ser Val Thr Tyr Val Ala Thr Arg Thr Ala Ala Gly Gly

35 40 45

Tyr Ser Asp Asp Ile Asn Lys Gln His Asp Thr Thr Asn Ala Tyr Gly

50 55 60

Val Asp Thr Gly Arg Gln His Ser Ser Gly Gly Tyr Asp Gly Asp Thr

65 70 75 80

Asn Lys His His Gly Ile Thr Gly Gly Tyr Asn Asp Asp Thr Asn Arg

85 90 95

His His Gly Thr Thr Gly Val Tyr Gly Ile Asp Thr Asp Arg Gln Gln

100 105 110

His Gly Thr Thr Gly Gly Tyr Ala Gly Asp Thr Gly Arg Gln His Gly

115 120 125

Asn Ile Gly Gly Pro Tyr Tyr Gly Thr Asn Thr Ala Asp Thr Gly Thr

130 135 140

Gly Pro Arg Ser Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Gly Gly Thr Gly

145 150 155 160

Gly Thr Asp Tyr Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Gly Ser Gly Thr

165 170 175

Gly Tyr Gly Val Asn Thr Gly Gly Ala H s Thr Glu Ala Gly Tyr Arg

180 185 190

Lys Glu His Arg Gln His Asp Gln Ser His Gly Asp Gln Asn Glu Lys

195 200 205

Lys Gly Ile Met Asp Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly His Ser

210 215 220

Asp Lys

225

<210>2

<211>681

<212>DNA

<213>大豆属栽培大豆(Glycine max L.)

<400>2

atggcaagtt atcaaaagca ctacgatgat cagggtcgca aggttgacga gtatggcaac 60

gttgagaagc aaaccgacga atacggcaac cctgttcatg ctgctagtgt cacctatgta 120

gccaccagaa ctgctgctgg tggttacagt gatgacatta ataagcaaca tgataccacc 180

aatgcctacg gcgtagacac tggtagacag cattctagtg gtggctacga tggtgacact 240

aataaacatc atggaattac tggtggctat aatgatgaca ccaatagaca tcatggaact 300

accggtgtct atggtataga caccgatagg caacaacatg ggactactgg tggctatgcc 360

ggtgacactg gtaggcaaca tgggaacatc ggtggccctt actatggaac caacaccgca 420

gacaccggta ctggtcccag aagtggaacc acgggcggca ccggttatgg aggcactggt 480

ggcactgatt atggaacaac tggtggcact ggttatggaa gtggaactgg gtatggagtc 540

aacactgggg gtgcgcacac tgaagcagga tataggaagg aacatcgtca gcatgaccaa 600

tctcatggtg atcagaacga gaagaaaggg attatggaca agattaagga gaagcttcct 660

ggaggacaca gtgacaagta g 681

<210>3

<211>226

<212>PRT

<213>大豆属栽培大豆(Glycine max L.)

<400>3

Met Ala Ser Tyr Gln Lys His Tyr Asp Asp Gln Gly Arg Lys Val Asp

1 5 10 15

Glu Tyr Gly Asn Val Glu Lys Gln Thr Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Val

20 25 30

His Ala Ala Ser Val Thr Tyr Val Ala Thr Arg Thr Ala Ala Gly Gly

35 40 45

Tyr Ser Asp Asp Ile Asn Lys Gln His Asp Thr Thr Asn Ala Tyr Gly

50 55 60

Val Asp Thr Gly Arg Gln His Ser Ser Gly Gly Tyr Asp Gly Asp Thr

65 70 75 80

Asn Lys His His Gly Thr Thr Gly Gly Tyr Asn Asp Asp Thr Asn Arg

85 90 95

His His Gly Thr Thr Gly Val Tyr Gly Ile Asp Thr Asp Arg Gln Gln

100 105 110

His Gly Thr Thr Gly Gly Tyr Ala Gly Asp Thr Gly Arg Gln His Gly

115 120 125

Asn Ile Gly Gly Pro Tyr Tyr Gly Thr Asn Thr Ala Asp Thr Gly Thr

130 135 140

Gly Pro Arg Ser Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Gly Gly Thr Gly

145 150 155 160

Gly Thr Asp Tyr Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Gly Ser Gly Thr

165 170 175

Gly Tyr Gly Val Asn Thr Gly Gly Ala His Thr Glu Ala Gly Tyr Arg

180 185 190

Lys Glu His Arg Gln His Asp Gln Ser His Gly Asp Gln Asn Glu Lys

195 200 205

Lys Gly Ile Met Asp Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly His Ser

210 215 220

Asp Lys

225

<210>4

<211>681

<212>DNA

<213>大豆属栽培大豆(Glycine max L.)

<400>4

atggcaagtt atcaaaagca ctacgatgat cagggtcgca aggttgacga gtatggcaac 60

gttgagaagc aaaccgacga atacggcaac cctgttcatg ctgctagtgt cacctatgta 120

gccaccagaa ctgctgctgg tggttacagt gatgacatta ataagcaaca tgataccacc 180

aatgcctacg gcgtagacac tggtagacag cattctagtg gtggctacga tggtgacact 240

aataaacatc atggaactac tggtggctat aatgatgaca ccaatagaca tcatggaact 300

accggtgtct atggtataga caccgatagg caacaacatg ggactactgg tggctatgcc 360

ggtgacactg gtaggcaaca tgggaacatc ggtggccctt actatggaac caacaccgca 420

gacaccggta ctggtcccag aagtggaacc acgggcggca ccggttatgg aggcactggt 480

ggcactgatt atggaacaac tggtggcact ggttatggaa gtggaactgg gtatggagtc 540

aacactgggg gtgcgcacac tgaagcagga tataggaagg aacatcgtca gcatgaccaa 600

tctcatggtg atcagaacga gaagaaaggg attatggaca agattaagga gaagcttcct 660

ggaggacaca gtgacaagta g 681

Claims

1、一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2、权利要求1所述蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为序列表中序列2所示的DNA分子。

4、含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pCAMBIA1300Bar：mGmDHN1；所述pCAMBIA1300Bar：mGmDHN1是将权利要求2或3所述基因导入pCAMBIA1300的多克隆位点得到的。

6、含有权利要求2或3所述基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。

7、扩增权利要求2或3所述基因的引物。

8、一种培育耐逆植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入植物中，得到耐逆植物。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入植物细胞中。

10、根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述耐逆植物是耐干旱和/或耐盐和/或耐高渗和/或耐低温的植物。