CN102618516B

CN102618516B - 耐低磷环境基因及其应用

Info

Publication number: CN102618516B
Application number: CN201110033017.3A
Authority: CN
Inventors: 黄继荣; 程玉祥
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2031-01-31
Also published as: CN102618516A

Abstract

本发明涉及一种耐低磷环境基因及其应用。找到一种对于提高植物耐低磷环境的能力有用的基因——甘油磷酸二酯酶基因。所述基因可极好地应用于植物品种的改良，提高植物对于逆境(低磷环境)的抵抗力。本发明为运用转基因等分子育种技术培育耐低磷生长环境及磷高效循环利用的农作物新品种，提供非常有价值的基因资源。

Description

耐低磷环境基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种耐低磷环境基因及其应用。

背景技术

农业上大量地施磷肥虽能暂时满足植物生长对磷的需要，但增加生产成本，加剧磷矿资源的耗竭，还造成水体富营养化和生态环境的污染。

磷是植物生长与发育所必需的营养元素之一。它是细胞内磷脂、核酸等重要物质的组分，以蛋白质磷酸化和去磷酸化的方式调节生命活动，参加糖、蛋白质和脂类多种代谢过程，在植物的生命活动中具有重要的生物学功能。土壤中磷的总量丰富，但易被矿物和有机物所固定，大部分以植物不能直接利用的形式存在，使得缺磷成为限制植物生长的主要因素之一。农业上大量地施磷肥能暂时满足植物生长对磷的需要，但增加生产成本，加剧磷矿资源的耗竭，还造成水体富营养化和生态环境的污染。在长期的进化过程中，植物自身形成了一系列适应低磷环境的方式。可见，探明植物适应低磷环境的分子机制、挖掘植物耐低磷生长环境的功能基因，对改良现有农作物品种的磷营养性状，具有重要科学及实践应用意义。

因此，本领域需要鉴定和分离对抗低磷环境的基因，并深入研究其抗逆境机制，更重要地是切实地将之应用于生产实践。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐低磷环境基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种甘油磷酸二酯酶(GDPD1)或其编码基因的用途，用于提高植物耐低磷环境能力。

在另一优选例中，所述甘油磷酸二酯酶还用于促进低磷生长环境下植物体内磷的循环利用。

在另一优选例中，所述甘油磷酸二酯酶是：

(a)如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蛋白；或

(b)将SEQ ID NO：3所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物耐低磷环境能力功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述的甘油磷酸二酯酶(GDPD1)来源于十字花科植物。

在另一优选例中，所述的甘油磷酸二酯酶(GDPD1)来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

在本发明的另一方面，提供一种提高植物耐低磷环境能力或促进低磷生长环境下植物体内磷的循环利用的方法，所述方法包括：提高植物中甘油磷酸二酯酶的表达或活性。

在另一优选例中，所述的方法包括：将甘油磷酸二酯酶的编码基因转入植物中。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有甘油磷酸二酯酶的编码基因；

(ii)将植物细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述甘油磷酸二酯酶的编码基因转入植物。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了甘油磷酸二酯酶的编码基因的植物细胞、组织、器官；以及

(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物。

在本发明的另一方面，提供一种耐低磷环境的植物，其是由前述方法制备获得的转基因植物。

在本发明的另一方面，提供一种甘油磷酸二酯酶或其编码基因的用途，用作鉴定植物的耐低磷环境能力的分子标记物。

在本发明的另一方面，提供一种受低磷环境诱导的启动子，所述的启动子选自下组：

(1)如SEQ ID NO：1中第1-605位所示的核苷酸序列的多核苷酸；

(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有诱导目的基因在低磷环境下表达的功能的多核苷酸；或

(3)与(1)限定的多核苷酸序列具有90％以上(优选95％以上，更优选98％以上，最优选99％以上)相同性且具有诱导目的基因在低磷环境下表达的功能的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供所述的启动子的用途，所述的启动子用于诱导目的基因在低磷环境下表达。

在本发明的另一方面，提供一种构建物，所述的构建物含有所述的受低磷环境诱导的启动子。

在另一优选例中，所述构建物中，受低磷环境诱导的启动子的下游含有至少一个多克隆位点(如酶切位点)，其与所述的受低磷环境诱导的启动子可操作性连接，用于插入目的基因。

在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。

在另一优选例中，所述的构建物含有以下可操作性连接的元件：所述的启动子；和目的基因。

在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。

在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。

在另一优选例中，所述的目的基因可编码具有特定功能的蛋白。

在另一优选例中，所述的目的基因位于所述启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp(优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。

在本发明的另一方面，提供一种诱导目的基因在低磷环境下表达的方法，所述的方法包括：将构建物转化植物，所述的构建物含有所述的受低磷环境诱导的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因。

在另一优选例中，所述方法包括：

(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有所述的受低磷环境诱导的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；

(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(c)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织、器官；以及

(d)将步骤(c)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、AtGDPD1的组织表达特性。

(a)Northern blot分析根、茎、叶、花、果实组织中AtGDPD1的转录表达；

(b)pAtGDPD1::GUS植株中GUS组织化学染色。

图2、低磷营养环境诱导AtGDPD1基因表达。

(a)Northern blot分析低磷营养环境下AtGDPD1转录表达；

(b)低磷营养环境下pAtGDPD1::GUS植株GUS组织化学染色。

图3、低磷营养环境下AtGDPD1突变体atgdpd1-1的表型。

(a)AtGDPD1突变体atgdpd1-1的T-DNA插入分析；

(b)Southern blot分析突变体atgdpd1-1中T-DNA插入的数量；

(c)Semi-RT-PCR分析突变体atgdpd1-1和野生型(WT)中AtGDPD1-6基因表达变化；

(d)缺磷营养环境下突变体atgdpd1-1和野生型(WT)的主根长比较；

(e)缺磷营养环境下突变体atgdpd1-1和野生型(WT)的鲜重比较。

图4、不同浓度的磷生长环境下突变体atgdpd1-1和野生型(WT)植物体内无机磷含量分析。

图5、缺磷生长环境下过量表达转基因植株OE-AtGDPD1和野生型(WT)主根长度的差异。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，找到一种对于调节植物抗逆境能力(提高植物耐低磷环境的能力)有用的基因——甘油磷酸二酯酶(GlycerophosphoDiesterPhosphoDiesterase，GDPD)基因。本发明的基因可极好地应用于植物品种的改良，提高植物对于逆境(低磷环境)的抵抗力。本发明为运用转基因等分子育种技术培育耐低磷生长环境及磷高效循环利用的农作物新品种，提供非常有价值的基因资源。

本发明中，对于适用于本发明的植物(或作物)没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：十字花科、禾本科、蔷薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科芸薹属的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥属植物，禾本科的水稻，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科芸薹属或鼠耳芥属(如拟南芥)的植物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的甘油磷酸二酯酶”、“分离的GDPD1蛋白”或“分离的GDPD1多肽”是指GDPD1蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化GDPD1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，所述的“低磷环境”是指一种环境(较佳地为土壤环境)，其中磷的含量低于50μM；较佳地低于30μM；更佳地低于15μM；更佳的低于10μM。

本发明的多肽(蛋白)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括GDPD1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的GDPD1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“GDPD1蛋白”指具有提高植物耐低磷环境能力的SEQID NO：3序列的多肽。该术语还包括具有提高植物耐低磷环境能力的、SEQ IDNO：3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或减少一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括GDPD1蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与GDPD1蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗GDPD1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含GDPD1蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了GDPD1蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有GDPD1蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供GDPD1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然GDPD1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“GDPD1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明GDPD1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：3序列的蛋白，但与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80％以上，较好至少90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码GDPD1蛋白的多聚核苷酸。

本发明的GDPD1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或GDPD1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的GDPD1蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码GDPD1蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，GDPD1蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含GDPD1蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的GDPD1蛋白有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗GDPD1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组GDPD1蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激GDPD1蛋白功能的多肽分子。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用GDPD1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测GDPD1蛋白的转录产物。

本发明还涉及一种改良作物的方法，该方法包括提高所述植物中GDPD1基因的表达或蛋白活性。从而使得所述植物具有更优良的抗逆境(特别是对抗低磷环境)能力。

增加GDPD1基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过转入携带GDPD1编码基因的表达构建物使植株过表达GDPD1；或可通过用强启动子驱动从而增强GDPD1基因的表达；或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该GDPD1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。

作为本发明的一种优选方式，获得GDPD1高表达的植株的方法如下：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有GDPD1蛋白的DNA编码序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该GDPD1蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述GDPD1蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；和

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。

本发明还包括GDPD1蛋白或其编码基因的激动剂。由于GDPD1的激动剂可调节GDPD1的活性或表达，因此，所述的GDPD1的激动剂也可通过对GDPD1的影响来提高植物的抗逆境能力(特别是对抗低磷环境)，从而达到性状改良的目的。

所述的GDPD1的激动剂是指任何可提高GDPD1的活性、维持GDPD1的稳定性、促进GDPD1表达、延长GDPD1有效作用时间、或促进GDPD1的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于提高植物的抗逆境(低磷环境)能力有用的物质。

启动子及其应用

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

如本文所用，所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

本发明提供一种启动子，所述的启动子选自下组：

(1)具有SEQ ID NO：1中第1-605位所示的核苷酸序列的多核苷酸；或

(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有诱导目的基因在低磷环境下表达的功能的多核苷酸。

在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80％以上，较好至少90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有诱导目的基因在低磷环境下表达的功能。

多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与SEQ ID NO：1中第1-605位所示的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少60％，更佳地至少70％，更佳地至少80％，更佳地至少85％，更佳地至少90％(例如95％、96％、97％、98％、或99％)相同性的多核苷酸。

本发明的启动子是诱导目的基因在逆境(低磷环境)下表达的。在本发明的实例中，本发明人发现，在本发明的启动子的指导下，可以使GDPD1或GUS基因特异地在低磷环境下表达。

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(优选结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白。

本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加表达量，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。

此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。

任何一种前述的启动子和目的基因序列可被包含在构建物中，更具体地如重组载体中。

所述的重组载体一般包括可操作性连接的(通常从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。

通常，所述的目的基因位于所述受逆境(低磷环境)诱导的启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp(优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。

重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够在适当的环境下表达蛋白质。

在本发明的一个实施方式中，找到了一种来源于拟南芥的GDPD1基因，称为AtGDPD1。AtGDPD1基因表达强烈地被低磷生长环境所诱导，在低磷生长环境下AtGDPD1具有促进植物体内磷循环再利用的功能。

AtGDPD1是一个低磷生长环境响应的、参与磷脂代谢关键酶。低磷环境下植物膜脂的主要成分发生重塑，以非磷脂如：DGDG替代磷脂，磷脂被降解释放磷素，它是植物适应低磷生长环境一种重要方式。AtGDPD1促进低磷生长环境下植物体内磷的循环利用。

AtGDPD1表达受低磷营养生长环境诱导。Northern blot分析表明，AtGDPD1基因表达强烈地被低磷营养生长环境所诱导，并且随着低磷生长环境胁迫时间延长，AtGDPD1基因表达也逐渐增加。这暗示AtGDPD1参与植物适应低磷营养环境的生长。另外，AtGDPD1基因启动子活性也明显地受低磷环境所诱导，与野生型相比，幼苗的整个组织，无论在地上部分还是根中，GUS的表达水平都呈现明显地增加。这进一步显示AtGDPD1参与植物适应低磷营养环境的生长。

本发明人筛选得到AtGDPD1基因一个Null突变体atgdpd1-1，用这个材料本发明人分析atgdpd1-1突变体与低磷营养环境相关的表型。在正常的培养条件下atgdpd1-1突变体与野生型相比，其表型如：主根的长、鲜重均无显著性差异。然而，在缺磷的生长环境下，atgdpd1-1突变体的主根长显著地短于野生型；atgdpd1-1突变体的鲜重也明显地低于野生型。这表明低磷生长环境逆境对atgdpd1-1突变体的影响比野生型更大，同时也显示AtGDPD1基因对植物适应低磷环境逆境具有重要的功能。

低磷环境下植物膜脂的主要成分发生重塑，以非磷脂如：DGDG替代磷脂，它是植物适应低磷环境一种重要方式。为了了解AtGDPD1对植物适应低磷环境逆境的分子机制，通过质谱定性及定量分析表明，在无磷生长环境下野生型和atgdpd1-1突变体的根及叶中的磷脂PC、PG、PE、PS、PI、PA含量比磷营养充足的生长环境下都明显地减少，而非磷脂如糖苷脂DGDG、MGDG则显著地增加。这也证明植物磷脂的分解代谢是其适应缺磷生长环境重要生理机制。在缺磷生长环境下野生型和atgdpd1-1突变体的根及叶中的磷脂PC、PG、PE、PS、PI、PA及非磷脂如糖苷脂DGDG、MGDG则均无显著地差异，然而atgdpd1-1突变体的根、叶中的无机磷(Pi)的水平显著地低于野生型；过量表达AtGDPD1转基因植株的主根长显著长于对照植株(野生型)。缺磷生长环境下atgdpd1-1突变体明显地小于野生型的生理表型也表明AtGDPD1在适应低磷环境中的功能。

本发明的主要优点在于：

本发明为运用转基因等分子育种技术培育耐低磷生长环境及磷高效循环利用的农作物新品种，提供非常有价值的基因资源。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料和方法

主要试剂：

pENTR SD/D-TOPO cloning kits：购自Invitrogen；

Gateway LR clonase II enzyme Mix：购自Invitrogen；

QIAprep Spin Miniprep Kit：购自QIAGEN；

DNA片段回收试剂盒：购自博大泰克公司；

KOD-plus DNA聚合酶：购自ToYoBo；

Taq DNA聚合酶：购自TaKaRa；

高保真的DNA聚合酶pfu ultra：购自Strantagen，USA；

MS medium：购自Murashige and Skoog basal salt mixtures，Sigma；

Phytoagar：购自Duchefa Biochemie；

Kanamycin：购自Amresco

Hygromycin：购自Invitrogen；

Rifampicin：购自Sigma；

Gentamycin：购自Amresco。

菌株和质粒：

大肠杆菌(Escherichia coli)，DH5α；

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101：购自Invitrogen；

TOP 10Chemically competent E.coli：购自Invitrogen。

质粒载体：pENTR/SD/D-TOPO购自Invitrogen；

pGWB2：购自Research Institute of Molecular Genetics，Shimane University，Japan；

pGWB5：购自Research Institute of Molecular Genetics，Shimane University，Japan。

pGWB3(no promoter-GUS)：购自Research Institute of Molecular Genetics，Shimane University，Japan。

pENTRTM/SD/D-购自Invitrogen。

植物材料的培养：

将种子于消毒液(20％(v/v)白猫漂水含0.1％(v/v)Tween-20)中震荡15分钟，超净工作台中无菌水洗5次。再将种子置4℃春化72h。春化好的种子用0.1％(w/v)的琼脂糖悬浮，播种于1/2MS固体培养基上，含1％(w/v)的蔗糖，22℃培养。将培养基上生长7-10天的幼苗移栽至人工土壤(由5份黑土，4份珍珠岩和1份蛭石混合而成)中，在人工气候室中继续生长。相对湿度60-70％，恒温22℃，光照强度120μmol m^-2s^-1，光照周期为8h黑暗，16h光照。

II.实施例

实施例1、AtGDPD1的基因与蛋白质序列

基因组DNA的提取

(1)、取适量的植物(拟南芥，Col-0)组织置于1.5ml的离心管中，加入50μl的抽提液(0.2M Tris-HCl，pH 9.0，0.4M LiCl，25mM EDTA，1％(v/v)SDS)，用磨棒研磨成浆液之后，再加350μl的抽提液冲洗磨棒。

(2)、加400μl的酚/氯仿(1∶1)，剧烈震荡，12000rpm离心15min，取上清。

(3)、再加400μl的氯仿，剧烈震荡，12000rpm离心15min，取上清。

(4)、加500μl异丙醇，混匀，静置10min，12000rpm离心10min，弃上清。

(5)、用70％(v/v)乙醇洗沉淀一次，12000rpm离心5min。

(6)、弃上清，吹干，加入20-50μl的水溶解。

植物组织总RNA提取

总RNA用试剂盒RNAgents total RNA isolation system(Promega)提取。具体方法如下：

(1)、取适量的植物组织，加入液氮，迅速研磨成粉末。加入适量的Denaturingsolution，振荡混匀后，置冰上。

(2)、加适量的2M的醋酸钠(pH4.0)，颠倒混匀4-5次。

(3)、加适量的酚/氯仿/异丙醇(125/24/1)溶液，颠倒混匀4-5次后，剧烈振荡10s，置冰上15min。4℃，10000g离心20min。

(4)、将上清液转移到新的离心管中。加入等体积的异丙醇，混匀置-20℃沉淀RNA至少30min。4℃，10000g离心10min。

(5)、弃上清，加入1ml的75％的乙醇洗一次。4℃，10000g离心10min。

(6)、弃上清，超净台吹干。加入10-30μl DEPC水。-20℃短期保存，-70℃长期存放。

(7)、取1-2μl电泳检测。用紫外分光光度计测定波长在260nm和280nm处的OD值，确定RNA浓度和纯度。

反转录和PCR扩增

反转录按照Reverse transcription system(Promega)进行。

(1)、取1μg总RNA加入到PCR管中，70℃温育10min，短暂离心后放到冰上。

(2)、20μl反转录反应体系：

25mM MgCl₂ 4μl；

Reaverse transcription 10×缓冲液 2μl；

10mM dNTP混合物 2μl；

RNAase抑制剂 0.5μl；

反转录酶 15U；

Oligo(dT)₁₅引物 0.5μg；

总RNA 1μg；

加入不含核酸酶的水补足到 20μl。

(3)、42℃反应1h。

(4)、95℃保温5min。

(5)、4℃保温5min。

(6)、反应结束后，加入不含核酸的水稀释，取1-2μl作PCR反应的模板。

DNA序列测定和数据分析

PCR扩增产物由ABI3730测序仪测序，比对DNA和cDNA序列确定基因的内含子和外显子的序列。利用BioEdit version 7.0软件预测基因的阅读框架(ORF)、未翻译区域和蛋白质序列。

结果

测序获得的AtGDPD1基因序列如下(SEQ ID NO：1)：

(注明：为启动子序列，小写带下划线为5’UTR或3’UTR，小写正体(不带下划线)为内含子，大写正体为外显子)。

caaagcccccaaacccatatcc ctctcctcacaacatcaatctcacaggaaggaaagaaagaaagaaagacgagcccttttttctttctaaaaatagaaatATGTCTCTAAAAGCCATTCATGTCTCGGAAGTGCCAAGCCTCGACCACTTCCCTGAGAACCCGTCGCTCATTTGCTCCTCTCGCAAAGCGAATAACAAGTTTGTGGTGGTTGGCCATAGAGGACACGGCATGAACATGTCGCAGTCGCCGGATCTAAGGTTCTCTGCTCTCAAGGAGAACTCCATCCTCTCCTTTAATGCCGCTTCAAAATTCCCTCTCGACTTTATCGAATTCGATGTTCAGgtatttacttatttctttcaatcctctcttcgctctcggttcgccgcattcgagtttcgatcggcttcttttttttttttcaatttggttcagccacgtgaccgccggcaataccacgtggggtgcctaattcgttgacattttcttattttgcgcaaaaaaaaaaaaactgttaatgaaatgtaaaaaaaaaagatctgatctgatctctttatttttttaattgatcgcgcagGTCACCAGAGATGGCTGCCCAATCATATTCCACGACGACTTCATCTACTCCGAGGAACAGGGAGTGGTGTACGAGAAGAGGGTCACGGAGGTTTGCTTGTCGGAGTTCATGTCCTACGGGCCACAGAGGGATACAGGCAAGACAGGAAAGCCTTTGCTGAGAAAGTCAAAGGAAGGGAAGATCCATAAGTGGAGCGTCGCAACCGACGACTCTTTCTGTACTCTCCAAGAGGCTTTTGAGAAAGTAGAGAATCCAAACCTCGGTTTCAACATCGAACTCAAGCTTGACGACAACGTCTTCTATTCCTCCGATCACCTCTCCCGTCTTCTCCTCCCAATCTTGCAGGTCGTGTCTGATATCGGAAACGACAGAACTATCATCTTCTCCAGCTTCCATCCTGATGCAGCCCTTCTTGTCAGGAAGTTGCAGACCACCTACCCCgtaagttgatggaatcccaaaagctacgtacactctttccactttaatccatcaacttaatttatgatccaaattcaattacagGTATTCTTCTTGACCAACGGAGGAACTGAGATGTACCACGACACGAGAAGGAATTCGCTTGAGGAAGCAATCAAAGTATGTTTAGAAGGAGGCCTCCAAGGGATTGTCTCGGAGGTGAAGGGAGTATTCCGCAACCCCGCTCTTGTCAACAAGATAAAAGAATCCAAGCTCTCTCTGATGACATACGGAAAGCTAAACAATGTAGCCGAGGCGGTTTACATGCAGCATTTGATGGGGATAGAGGGAGTGATAGTTGATCATGTGGAGGAGATAACAGAGGCGGTGAGGGAGATGATGAAGCCATCCAACAGAGATGCTGATGGTACTAAGCCAAAGCCTAACTTCTCTGACAGAGAGCTCTCCTTTCTTCTCAAGCTCATTCCCGAGTTGATACAACACTTAAaatatctcttttagttaggatctctagtttcccaaaatgtgatagtgttttgtatcgggaaaatttgacaatgtgggtgctgctatcatgattcatga ggtgaaagcccaaatgttatggaatatatctgtttgcagacgggttatgacttatgaggtatcaaagcaccatcagcaaattatgtaaatgtat tcaaaagtggaaagtggggacttgggagaggaggccgtgctgcaggtgatatttgagacggggcaagagaggtctgtaaggatcctcct cccttctctgcttcacaaactttatgcatctctcgacctccttcttcacgtctgcg

其中，AtGDPD1cds序列如下(SEQ ID NO：2)：

ATGTCTCTAAAAGCCATTCATGTCTCGGAAGTGCCAAGCCTCGACCACTTCCCTGAGAACCCGTCGCTCATTTGCTCCTCTCGCAAAGCGAATAACAAGTTTGTGGTGGTTGGCCATAGAGGACACGGCATGAACATGTCGCAGTCGCCGGATCTAAGGTTCTCTGCTCTCAAGGAGAACTCCATCCTCTCCTTTAATGCCGCTTCAAAATTCCCTCTCGACTTTATCGAATTCGATGTTCAGGTCACCAGAGATGGCTGCCCAATCATATTCCACGACGACTTCATCTACTCCGAGGAACAGGGAGTGGTGTACGAGAAGAGGGTCACGGAGGTTTGCTTGTCGGAGTTCATGTCCTACGGGCCACAGAGGGATACAGGCAAGACAGGAAAGCCTTTGCTGAGAAAGTCAAAGGAAGGGAAGATCCATAAGTGGAGCGTCGCAACCGACGACTCTTTCTGTACTCTCCAAGAGGCTTTTGAGAAAGTAGAGAATCCAAACCTCGGTTTCAACATCGAACTCAAGCTTGACGACAACGTCTTCTATTCCTCCGATCACCTCTCCCGTCTTCTCCTCCCAATCTTGCAGGTCGTGTCTGATATCGGAAACGACAGAACTATCATCTTCTCCAGCTTCCATCCTGATGCAGCCCTTCTTGTCAGGAAGTTGCAGACCACCTACCCCGTATTCTTCTTGACCAACGGAGGAACTGAGATGTACCACGACACGAGAAGGAATTCGCTTGAGGAAGCAATCAAAGTATGTTTAGAAGGAGGCCTCCAAGGGATTGTCTCGGAGGTGAAGGGAGTATTCCGCAACCCCGCTCTTGTCAACAAGATAAAAGAATCCAAGCTCTCTCTGATGACATACGGAAAGCTAAACAATGTAGCCGAGGCGGTTTACATGCAGCATTTGATGGGGATAGAGGGAGTGATAGTTGATCATGTGGAGGAGATAACAGAGGCGGTGAGGGAGATGATGAAGCCATCCAACAGAGATGCTGATGGTACTAAGCCAAAGCCTAACTTCTCTGACAGAGAGCTCTCCTTTCTTCTCAAGCTCATTCCCGAGTTGATACAACACTTAA

AtGDPD1蛋白质序列(SEQ ID NO：3)：

MSLKAIHVSEVPSLDHFPENPSLICSSRKANNKFVVVGHRGHGMNMSQSPDLRFSALKENSILSFNAASKFPLDFIEFDVQVTRDGCPIIFHDDFIYSEEQGVVYEKRVTEVCLSEFMSYGPQRDTGKTGKPLLRKSKEGKIHKWSVATDDSFCTLQEAFEKVENPNLGFNIELKLDDNVFYSSDHLSRLLLPILQVVSDIGNDRTIIFSSFHPDAALLVRKLQTTYPVFFLTNGGTEMYHDTRRNSLEEAIKVCLEGGLQGIVSEVKGVFRNPALVNKIKESKLSLMTYGKLNNVAEAVYMQHLMGIEGVIVDHVEEITEAVREMMKPSNRDADGTKPKPNFSDRELSFLLKLIPELIQH

实施例2、AtGDPD1组织表达特性

总RNA的提取、反转录和PCR扩增，与实施例1中相同。

Northern blot方法同文献Huang，J.R.，Takano，T.and Akita，S.(2000)Expression of a-expansin genes in young seedlings of rice(oryza sativa L.).Planta，211，467-473所述。

GUS检测

方法同文献Jefferson，R.A.，Kavanagh，T.A.and Bevan，M.W.(1987)GUSfusions：β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higherplants.EMBO J.6，3901-3907所述。

大肠杆菌转化

大肠杆菌感受态细胞TOP10购置于Invitrogen公司。转化大肠杆菌采用热激法，将质粒与融化的感受态细胞混合，冰上放置30min之后，42℃水浴中热激45s，冰上放置2min。加入400μl的LB液体培养基，37℃复苏培养1h，涂于选择含50μg/ml卡那霉素的LB平板，培养12-16h。选择单克隆菌落，培养用于质粒分离。

质粒抽提

质粒采用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN公司)试剂盒，按厂家说明书步骤操作。

农杆菌转化

采用冻融法转化农杆菌。加质粒于融化的GV3101感受态细胞中，混匀，冰上放置30min。液氮速冻60s，37℃水浴3min。加1mL的LB液体培养基，28℃复苏培养1h。12000rpm离心30s，去上清，剩100μl，混匀，涂于LB的抗生素选择平板(50μg/mL利福平+50μg/mL庆大毒素+50μg/mL卡那霉素+50μg/mL潮霉素)，28℃培养2至3d。选择单克隆菌落，培养用于植物转化。

拟南芥植株转化采用农杆菌侵染的方法(Clough，S.J.and Bent，A.F.(1998)Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.Plant J.16，735-743)：取生长状况良好、正处于开花期的植株，去除已经授粉花朵和结实果荚，转化前一天浇足水。将带有转基因载体的农杆菌GV3101于28℃培养过夜，菌液OD600在1.2至1.6之间，5000rpm离心15min，菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转浸润培养基中，至菌体终浓度OD600在0.8左右。浸润培养基成分(1L)：2.2g Murashige-Skoog medium，5％蔗糖，0.5g MES，用KOH调至pH5.7，200μl Silwet L-77。转化时将拟南芥地上部分浸泡于菌液中大约20s，确保全部花苞都被浸没。将植物平放并保持湿度，避光过夜。第二天将植物取出，竖直并转移到正常条件下生长收获种子。种子消毒后低温春化3天，涂在用琼脂固体筛选培养基(含50μg/mL卡那霉素)表面，抗卡那霉素的苗为转基因植株。

结果

用Northern blot杂交法，本发明人分别检测了幼苗的根和叶、成熟苗的盘叶、茎生叶、茎、花和果实中AtGDPD1的转录表达水平，如图1a所示，在幼苗中的表达量较高，另外根中AtGDPD1表达比叶中高。

为了清楚AtGDPD1的表达特性，本发明人构建AtGDPD1启动子驱动GUS报告基因的融合植物表达载体：将AtGDPD1启动子序列克隆到pENTR^TM/SD/D-TOPO载体中；测序证实无误后，再将目的片段通过LR反应克隆到pGWB3(no promoter-GUS)植物表达载体上；将该双元质粒转化农杆菌GV3101；再通过农杆菌侵染的方法转化拟南芥基因组中。获得的植株为AtGDPD1启动子驱动GUS报告基因的转基因植物，对转基因植株进行组织水平的GUS化学染色法，结果如图1b所示，在幼苗根中的GUS表达量最高。

实施例3、AtGDPD1表达受低磷营养生长环境诱导

本发明人用Northern blot分析法检测发现，AtGDPD1基因表达强烈地被低磷营养生长环境所诱导，并且随着低磷生长环境胁迫时间延长，AtGDPD1基因表达也逐渐增加(图2a)。这暗示AtGDPD1参与植物适应低磷营养环境的生长。

为了进一步了解AtGDPD1基因对低磷生长环境响应的分子机制，本发明人检测了AtGDPD1基因的启动子是否对低磷生长环境存在响应。结果如图2b所示，AtGDPD1基因启动子的活性明显地受低磷环境所诱导，与野生型相比，幼苗的整个组织，无论在地上部分还是根中，GUS的表达水平都呈现明显的增加。这进一步显示AtGDPD1参与植物适应低磷营养环境的生长。

实施例4、低磷营养环境下AtGDPD1突变体表型

植物基因组DNA的提取和PCR扩增，与实施例1中相同。

本发明人筛选得到AtGDPD1基因的一个Null突变体atgdpd1-1，用这个材料分析atgdpd1-1突变体与低磷营养环境相关的表型。

AtGDPD1基因突变体鉴定(SALK_087106，该编号表示TAIR中的购买编号)；Col-0)

在基因T-DNA插入区域前后设计一对引物(TATCGGAAACGACAGAACTATCATC(SEQ ID NO：4)和ATCCTTACAGACCTCTCTTGCCC(SEQ ID NO：5))。T-DNA引物为LBB1(GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT(SEQ ID NO：6))，通过PCR及产物的测序来鉴定T-DNA的插入。

Semi-RT-PCR

提取植物总RNA，定量并分析纯度；取相同的植物总RNA，反转录生成cDNA，用作模板用于PCR；以Actin2基因为作为内标，对反转录合成cDNA模板进行统一标定；用标定完的cDNA作为模板，进行目标基因的PCR反应；PCR产物进行电泳。

含磷MS培养基配方

盐分及用量与文献Murashige，T.and Skoog，F.(1962)A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissue culture.Physiol Plant.15，473-497中描述的配方相同，另外加入8g/L琼脂、1％蔗糖。

无磷MS培养基

无KH₂PO₄成分，其它与含磷MS培养基相同。

结果

为了了解AtGDPD1在低磷生长环境中的生理功能，本发明人筛选AtGDPD1基因的T-DNA插入突变体。经PCR及其产物DNA测序分析，显示AtGDPD1基因中有T-DNA插入，该突变体命名为atgdpd1-1，T-DNA插入在第三个外显子上的第135位核苷酸上(图3a)。Southern blot分析表明atgdpd1-1中仅仅有一个T-DNA插入(图3b)。

因此，本发明人得到AtGDPD1基因的单突变体atgdpd1-1。用Semi-RT-PCR分析显示，AtGDPD1的转录表达没有检测到，AtGDPD1-5的各基因表达也没有呈现明显的变化，事实上atgdpd1-1是一个Null突变体(图3c)。本发明人分析atgdpd1-1突变体在幼苗期的表型，在正常的培养条件下atgdpd1-1突变体与野生型相比，其表型如：主根的长、鲜重均无显著性差异。然而，在缺磷的生长环境下，atgdpd1-1突变体的主根长却明显地短于野生型(图3d)。

另外，atgdpd1-1突变体的鲜重也明显地低于野生型(图3e)。

这表明低磷生长环境逆境对atgdpd1-1突变体的影响比野生型更大，同时也提示AtGDPD1基因对植物适应低磷环境逆境具有重要的功能。

实施例5、AtGDPD1在缺磷营养生长环境下调控磷脂分解代谢

脂的提取、分析及质谱定量

实验操作按文献Devaiah，S.P.，Roth，M.R.，Baughman，E.，Li，M.，Tamura，P.，Jeannotte，R.，Welti，R.and Wang，X.(2006)Quantitative profiling of polarglycerolipid species from organs of wild-type Arabidopsis and a phospholipase Dalpha1knockout mutant.Phytochemistry 67，1907-1924中所描述的进行。

含磷MS培养基配方

无磷MS培养基

无KH₂PO₄成分，其它与含磷MS培养基相同。

无机磷的测定参照文献Chiou，T.J.，Aung，K.，Lin，S.I.，Wu，C.C.，Chiang，S.F.and Su，C.L.(2006)Regulation of phosphate homeostasis by microRNA inArabidopsis.Plant Cell，18，412-421进行。

结果：

磷脂是一种含量最丰富的细胞内膜脂，其磷量占植物总磷量的30％左右(Jouhet，J.，Marechal，E.，and Block，M.A.(2007)Glycerolipid transfer for thebuilding of membranes in plant cells.Prog.Lipid Res.46，37-55)。植物在低磷环境下膜脂的主要成分发生重塑，以非磷脂如：DGDG替代磷脂。它是植物适应低磷环境一种重要方式(Cruz-Ramirez，A.，Oropeza-Aburto，A.，Razo-Hernandez，F.，Ramirez-Chavez，E.and Herrera-Estrella，L.(2006)Phospholipase DZ2playsan important role in extraplastidic galactolipid biosynthesis and phosphaterecycling in Arabidopsis roots.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103，6765-6770；Gallazzini，M.，Ferraris，J.D.and Burg，M.B.(2008)GDPD5is aglycerophosphocholine phosphodiesterase that osmotically regulates theosmoprotective organic osmolyte GPC.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，105，11026-11031；Russo，M.A.，Quartacci，M.F.，Izzo，R.，Belligno，A.andNavari-Izzo，F.(2007)Long-and short-term phosphate deprivation in bean roots：plasma membrane lipid alterations and transient stimulation of phospholipases.Phytochemistry，68，1564-1571.)。磷脂中磷素的释放通过磷脂的降解及非磷脂的生物合成，两方面代谢途径完成的。通过磷脂酶A(phospholipase A，PLA)或脂类酰基水解酶(lipid acyl hydrolase，LAH)能够催化水解磷脂生成甘油磷酸二酯(glycerophosphodiester)，甘油磷酸二酯进一步由甘油磷酸二酯酶(glycerophosphodiester phosphodiesterase，GDPD)水解生成甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate，G-3-P)，G-3-P是叶绿体中半乳糖苷脂生物合成的前体，还能够经磷酸化酶去磷酸化、释放出无机磷。

本发明人利用AtGDPD1基因突变体材料，分析AtGDPD1参与低磷营养环境生长功能的分子机制。通过质谱定性及定量分析表明，在无磷生长环境下野生型和atgdpd1-1突变体的根及叶中的磷脂PC、PG、PE、PS、PI、PA及非磷脂如糖苷脂DGDG、MGDG均无显著的差异。然而，在缺磷生长环境下atgdpd1-1突变体的根、叶中的无机磷(Pi)的水平显著地低于野生型(图4)。这些结果表明缺磷环境下AtGDPD1在磷脂的降解及循环利用中起关键功能，缺磷生长环境下atgdpd1-1突变体明显地小于野生型(图3d-e)的生理表型也表明AtGDPD1在适应缺磷环境中的功能。

实施例6、过量表达AtGDPD1增强转基因植株耐缺磷生长环境的能力

TOPO载体的构建

基因克隆选用pENTRTM/SD/D-作为入门载体，根据通路克隆技术的要求，以拟南芥cDNA为扩增模板利用KOD高保真DNA聚合酶，通过PCR的方法在目的基因(AtGDPD1基因(cds))的5’端加上CACC序列，然后将PCR目的产物纯化，与入门载体混合，室温过夜连接(目的片段连接入pENTRTM/SD/D-载体上)。然后转化进入One Shot TOP10(指TOP10Chemically competent E.coli)化学转化感受态大肠杆菌细胞中，结合卡那霉素(Kan)抗性和菌落PCR的方法筛选阳性克隆，对可能的重组目的质粒进行繁殖，提取质粒，用M13引物测序鉴定。

构建植物表达载体

混合包含有目的基因的TOPO质粒和pGWB2(Research Institute of MolecularGenetics，Shimane University，Japan)植物表达质粒以及Gateway^TM LR clonase^TM酶，通过LR反应将目的基因克隆到pGWB2载体上。然后转化进入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，结合卡那霉素(Kan)和潮霉素(Hygro)抗性以及菌落PCR的方法对重组质粒进行筛选，选择阳性克隆，对重组的目的质粒进行繁殖，提取质粒作为模板用目的基因PCR进行确认。

拟南芥转化

拟南芥植株转化采用农杆菌侵染的方法。取生长一个月左右，生长状况良好的植株，去除已经授粉花朵和结实的果荚，转化前一天浇足水。将含有转基因载体的农杆菌GV3101于28℃培养过夜，OD600在1.2至1.3之间，5000rpm离心15min，菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化液中，至终浓度OD600在0.8左右。转化时将拟南芥地上部分浸泡于菌液中大约20s，确保全部花苞都被浸没。将植物平放并保持湿度，避光过夜。第二天将植物取出，竖直并转移到正常条件下生长收获种子。转化后植株种子消毒后，春化3天。处理好的种子用琼脂糖均匀涂布在固体筛选培养基(含卡那霉素)表面。一般卡那霉素筛选能够直观的通过黄绿苗来判断，而且一般萌发后5天左右即可判断出来。

含磷MS培养基配方

盐分及用量与文献Murashige和Skoog(1962)配方相同，另外加入8g/L琼脂、1％蔗糖。

不同磷MS培养基

调整KH₂PO₄浓度，其它与含磷MS培养基相同。

缺磷生长环境胁迫

将野生型(WT)、AtGDPD1过量表达植株(OE)的种子成一条线方式平铺在不同磷MS培养基，再将不同磷MS培养基垂直放置在植物培养室，进行发芽、生长，连续观察野生型(WT)、AtGDPD1过量表达植株生长、发育状况。

结果

为了确定AtGDPD1对拟南芥在缺磷生长环境中的作用，本发明人拟通过在野生型拟南芥中过量表达AtGDPD1来进一步探明其功能。本发明人通过农杆菌转化、得到过表达植株OE-AtGDPD1，分析在不同磷(Pi)浓度下的MS培养基上OE-AtGDPD1及WT植株的生长、发育情况。在含1.5mM Pi的正常磷营养生长环境下，OE-AtGDPD1及WT种子从发芽到幼苗生长整个过程中未发现两者有明显表现型差异。

然而，在缺磷生长环境下尽管OE-AtGDPD1及WT植株主根生长明显地被抑制，但OE-AtGDPD1主根长显著长于对照WT(图5)。本发明人分别选择0μM Pi及15μM Pi的磷营养生长环境下观察两者对缺磷生长环境反应，结果显示两种不同程度的缺磷环境下OE-AtGDPD1主根长均明显地长于WT的，这表明AtGDPD1对拟南芥在缺磷生长环境中有着重要的生理功能。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种甘油磷酸二酯酶或其编码基因的用途，用于提高植物耐低磷环境能力；所述甘油磷酸二酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述甘油磷酸二酯酶还用于促进低磷生长环境下植物体内磷的循环利用。

3.一种提高植物耐低磷环境能力或促进低磷生长环境下植物体内磷的循环利用的方法，所述方法包括：提高植物中甘油磷酸二酯酶的表达或活性；所述甘油磷酸二酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：将甘油磷酸二酯酶的编码基因转入植物中。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

6.一种甘油磷酸二酯酶或其编码基因的用途，用作鉴定植物的耐低磷环境能力的分子标记物；所述甘油磷酸二酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。