CN101993481B - 一种与植物耐逆相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种本发明的目的在于提供一种蛋白，命名为OsMSr2，来源于水稻，是如下1)或2)的蛋白：1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与植物耐逆相关的由1)衍生的蛋白质。将该蛋白质的编码基因OsMsr2导入植物中，可以提高种子在逆境条件下的萌发率；增加根长及根重；增加植株的生长势，使种子变大；提高叶片净光合速率；增加逆境条件下植株的耐受性。

Description

一种与植物耐逆相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及与植物耐逆相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

干旱、低温、高温是影响作物生长发育的常见逆境因子，很大程度上限制了作物的产量和地理分布。为了提高作物在逆境下的产量并且打破地理分布限制，找到新的耐逆基因并利用基因工程手段提高作物耐逆性是一个行之有效的途径。传统方法由于植物抗逆调控机制的复杂性以及缺乏有效的筛选技术等原因而受到限制。有研究表明，植物中大部分基因组都参与了自身对干旱、高盐等逆境因子的响应，改变某单一基因的表达量可以明显提高植物的抗旱、抗盐能力。普遍看法认为，植物适应低温、干旱、高盐等逆境时存在不同作用机制，均被复杂的信号途径调控。因此，对信号途径的中间产物进行深入研究可能是一种行之有效的提高作物耐逆性的策略。以往研究表明，植物遭受低温、干旱、高盐等逆境胁迫时细胞内Ca²⁺浓度迅速升高，Ca²⁺作为信号分子，要将信号传递下去并调节多种生化与细胞反应，其下游Ca²⁺受体蛋白非常重要。EF-hand是含有螺旋-环-螺旋结构的结构域，可特异性结合Ca²⁺，普遍存在于大部分Ca²⁺结合蛋白中^[16]。植物中的Ca²⁺结合蛋白可划分为三大类：钙调素(calmodulin，CaM)，钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPK)以及钙调神经磷酸酶B样蛋白(calcineurin B-like protein，CBL。钙调素(Calmodulin，CaM)是真核细胞内广泛存在的、高度保守的一类钙离子结合蛋白，结合Ca²⁺后引起自身构象发生变化从而激活自身功能，并与下游蛋白相互作用共同组成多条信号系统，作为一个信号传导元件调控于其下游的靶蛋白，参与植物的生长发育^[20]以及对外界各种逆境信号的转导。除了钙调素外，植物中还存在许多类钙调素蛋白(Calmodulin-likeprotein，CML)。拟南芥全基因组存在约232个具有EF-Hand结构域的蛋白，其中包括7个典型钙调素蛋白和50个类钙调素蛋白，Bongkoj等对水稻全基因组进行分析后发现，水稻中存在243个具有EF-Hand结构域的蛋白，这其中包括5个钙调素蛋白和32个类钙调素蛋白。

干旱、低温等逆境胁迫通常引起植物细胞质内Ca²⁺浓度升高，Ca²⁺与CAM结合形成Ca²⁺-CaM复合体，通过与下游靶蛋白(蛋白酶、转录因子等)的相互作用，使细胞信号得以传递，并最终引发细胞反应。Hu等的研究表明干旱胁迫下玉米叶片中Ca²⁺/CaM的含量增加，并且发现Ca²⁺/CaM含量的增加对于干旱引起的抗氧化防卫反应是必须的；Zhang等的研究证明AtCaM3基因是拟南芥热激信号传导途径中的关键成分，与拟南芥的耐热性呈正相关；依赖CaM的蛋白激酶基因AtCPK23是拟南芥耐旱和耐盐胁迫的负调控因子。Delk等研究发现，CML24可以调控拟南芥体内离子的动态平衡，响应ABA、光周期变化等逆境信号。到目前为止，大量的研究表明，拟南芥中的类钙调素基因主要在抗病、耐盐、同源重组以及在ABA的信号途径中发挥作用。Barbara Vanderbeld等利用GUS作为报告基因研究了拟南芥类钙调素基因CML37、CML38和CML39在不同发育时期和不同逆境条件下的表达模式，发现CMLs表达具有组织和时间特异性，在逆境条件下尤为明显。目前，关于植物类钙调素基因的研究主要集中在拟南芥中，类钙调素基因在水稻中的功能知之甚少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白，命名为OsMSr2，来源于水稻，是如下1)或2)的蛋白：

1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与植物耐逆相关的由1)衍生的蛋白质。

序列表序列2为OsMSr2的氨基酸序列，包括151个氨基酸，在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占62个，亲水氨基酸占67个，碱性氨基酸占15个，酸性氨基酸占33个，该蛋白质的分子量为16.46KD，等电点为3.94。生物信息学分析结果发现，OsMSr2含有2个EF-Hand结构域(具有结合钙离子的功能)，分别是序列2中的第11-74位以及第89-149位的氨基酸组成的结构域。该蛋白质是国际上未曾报道的新蛋白质。

为了使1)中的OsMSr2便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的OsMSr2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的OsMSr2的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第134到586位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述蛋白的编码基因，命名为OsMSr2，也属于本发明的保护范围之内。

上述编码基因是如下1)或2)或3)或4)的基因：

1)编码序列是序列表中序列1的自5’端第134位-第586位所示的基因；

2)编码序列是序列表中序列1的自5’端第128位-622位所示的基因；

3)在高严谨条件下与1)或2)限定的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表1为编码OsMSr2的全长cDNA。该序列共由982个碱基组成，其中，5’端未翻译区包括133个碱基，3’端未翻译区包括396个碱基(其中包括179个碱基组成的PolyA)，编码区由453个碱基(从134位到586位)组成，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的OsMSr2蛋白，编码区中，A占17.22％(78个)，C占26.49％(120个)，G占41.06％(186个)，T占15.23％(69个)，A+T占32.45％(147个)，C+G占67.55％(306个)。

数据库搜索氨基酸与核苷酸序列发现，钙调素基因家族是目前已知基因中与OsMsr2同源性最高的基因，虽然核苷酸序列的同源性较低(35.4％-49.1％)，但是氨基酸的同源性达到48.4％，初步推测基因OsMsr2可能与钙调素功能相似。目前为止，尚未发现任何与该基因的相关的研究报道。

上述的高严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。

扩增上述OsMSr2基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述基因的转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

含有上述基因的重组菌也属于本发明的保护范围。

含有上述基因的重组载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有OsMSr2基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN、pBY505或其它衍生植物表达载体。

使用OsMSr2基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)、Actin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

上述重组载体具体的构建方法如下：是将上述的基因插入pCOsAC的多克隆位点，得到的重组载体；所述pCOsAC是将序列3所示pActin启动子插入pCambia1301的多克隆位点得到的重组质粒。

本发明的另一目的在于提供一种培育耐逆转基因植物的方法，是将上述的基因导入目的植物，得到耐逆转基因植物，所述耐逆转基因植物的耐逆性高于目的植物。

所述耐逆转基因植物为耐低温、耐高盐、耐甘露醇和/或耐干旱转基因植物。

上述的基因是通过上述的重组载体导入目的植物中。携带有本发明的OsMSr2基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、如基因枪法、花粉管通道、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

上述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物为拟南芥。

实验证明：OsMsr2可以提高种子在逆境条件下的萌发率；增加根长及根重；增加植株的生长势，使种子变大；提高叶片净光合速率；增加逆境条件下植株的耐受性。

附图说明

图1为PCR产物凝胶电泳图，M：Marker；1，2均为扩增产物。

图2为质粒PCR鉴定阳性克隆，M：Marker；1，2，3分别代表质粒编号。

图3为酶切鉴定阳性克隆，M：Marker；1，2分别代表质粒编号。

图4为pCOsAc图谱。

图5为载体构建流程图。

图6为表达载体酶切鉴定图，M1、M2分别代表200bp、100p landing marker；1-6分别代表不同质粒编号，其中1、2、3是BamHI酶切；4、5、6是Noc I和Kpn I双酶切。

图7为RNA凝胶电泳，1-2表示不同RNA样品。

图8为转基因植株PCR鉴定，M：marker，1、2为转基因株系，3为无模板对照。

图9为转基因植株PCR鉴定，M：marker；1：转基因植株1；2：转基因植株2；3：野生型cDNA；4：无模板对照。

图10为种子萌发图。

图11为种子生长势比较图。

图12为根长比较图。

图13为成熟根的照片。

图14为种子大小比较图。

图15为低温(12℃)条件下萌发率。

图16为NaCl胁迫下萌发率。

图17为NaCl胁迫下子叶出现率。

图18为高盐、甘露醇胁迫下根长比较结果。

图19为高盐胁迫处理的照片。

图20为盐胁迫复水后成活率比较。

图21为干旱胁迫后的照片。

图22为叶片失水率统计结果。

图23为正常条件下各植株净光合速率。

图24为高盐胁迫下各植株净光合速率。

上述图10-图24中，WT为野生型对照；WT-1空载体对照；L-1、L-5、L-8、L-9和L-15为pCOsAc-OsMsr2拟南芥的不同株系。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、培育耐逆转基因拟南芥

一、重组表达载体的构建

1、OsMsr2基因的克隆

①水稻总RNA提取

植物组织材料培矮64s(由国家杂交水稻工程技术研究中心罗孝和提供，公众可从湖南农业科学院种质资源库或培矮64s育种者罗孝和处获取)，文献：罗孝和，邱趾忠，李任华.导致不育临界温度低的两用核不育系培矮64S.杂交水稻，1992，(1)：27-29)取材后迅速在液氮中研磨成粉末状，取约100mg粉末状材料置于盛有1.0mlTRIzol(Invitrogen)的1.5ml离心管中，置-80℃保存备用。采用TRIzol试剂提取法：将-80℃保存备用的样品取出，室温解冻后，加入200μl氯仿，振荡混匀，离心后，小心取出上层水相，转入另一离心管中，加入500μl异丙醇，沉淀、离心分离出RNA，再经75％酒精洗涤，室温微干后，加入适当体积的RNase-free的水，充分溶解。所提RNA经DNA酶(Fermentas)处理。

②反转录反应

取培矮64s总RNA 2μg进行反转录，加入0.5μg/μL Oligo(dT)1μL，加入去离子水补足到12μL，70℃保温5min后，依次加入5×RT buffer 4μL，20U/μLRNase抑制剂1μL，10mmol/L dNTP 2μL，37℃保温5min后加入200U/μL M-MLV反转录酶1μL，反应终体积为20μL。42℃反应60min，70℃加热10min终止反应。

③PCR体外扩增

人工合成一对引物，并在其5’端分别加上Bgl II和Pmac I酶切位点。上游引物及下游引物如下：

OsMsr2-F：5′-AGATCTTCGACAATGGTTGTTGC-3′，

OsMsr2-R：5′-CACGTGAGCTAGCGGAGGGATCAGC-3′。

以上述培矮64s cDNA作为模板，以OsMsr2-F和OsMsr2-R为引物，采用保真性较高的LA Taq聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增。在灭菌的PCR管中建立如下反应体系：GC×Buffer溶液25μl，dNTP Mixture  8μl，LA Taq聚合酶0.5μl，OsMsr2-F(10nmol)2μl，OsMsr2-R(10nmol)2μl，培矮64s cDNA 3.5μl，ddH₂O9μl，总反应体积50μl.反应程序：95℃预变性6min，PCR扩增：94℃变性40s，61℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，反应结束后，电泳检测PCR结果(图1)。

④PCR产物的纯化

电泳后，在紫外光照射下进行切胶回收，利用凝胶回收试剂盒(天为时代)回收目的基因片断。

⑤DNA连接反应

参照pMD18-T Vector(TaKaRa)说明书，按试剂盒要求建立连接反应体系：pMD18-TVector 0.5μl，Solution I 4.5μl，回收基因片断2μl，ddH₂O 3μl，总反应体积10μl。16℃过夜连接。

⑥连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(热激法)

无菌条件下取5μl连接产物加到感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min。42℃热激90s，将离心管迅速转到冰浴中放置2-3min。加无抗生素的LB培养基800μl，37℃摇床(100-160rpm)，温和摇振1h左右。取200μl培养液涂于含抗生素50μg/ml的LB固体培养基上，在涂菌液之前首先加入X-Gal和IPTG涂匀，37℃倒置培养12-16h。

⑦阳性克隆的筛选及鉴定

1)阳性克隆的筛选

培养基中长出许多的蓝色和白色菌斑，待菌斑长到合适大小时，用灭菌的芽签挑取几个白斑，分别于含有50μg/ml Amp的LB液体培养基中振荡培养12-16h。

2)碱裂解法小量提取质粒DNA

3)PCR鉴定

鉴定分别采用PCR扩增和酶切鉴定。以上述克隆载体质粒为模板，进行PCR扩增，鉴定所提质粒中是否含有目的基因片段(图2)。PCR扩增反应条件与基因克隆时条件相同。酶切利用Bgl II和Pmac I(上、下游引物所加酶切位点)，结果见图3。选取鉴定出的阳性克隆，送交公司测定序列。测序结果表明目的片段的DNA序列为序列表中序列1所示的自5’端第128位-622位的核苷酸序列。其中编码区是自5’端第134位-586位，可编码序列2所示的蛋白。

2、构建重组表达载体

构建流程图如图5所示。

①载体材料

PCOsAc载体构建流程：

a、利用PCR技术从水稻培矮64s基因组中扩增得到pActin启动子(序列3)，在上游引物加了KpnI切点，下游引物依次添加了XbaI，PmacI和NCOI位点。其中上游引物是5’-GGTACCCTCGAGGTCATTCATATGCTTGAG-3；下游引物是5’-CCATGGCACGTGTCTAGATCTACCTACAAAAAAGCTCCG-3’。

b、将扩增产物先克隆到pMD18-T载体上，挑单克隆提取质粒，并且做了酶切鉴定。

c、用KpnI和NCOI酶切带有正确目的片段的克隆：先用NCOI酶切，接着用Klenow将末端填平，然后再用KpnI酶切，回收酶切产物，得到一端为KpnI粘性末端，一端为平端的启动子片段。

d、将pCambia1301质粒(CambiaLabs，http://www.cambia.org/daisy/bioforge_legacy/3725.html)用KpnI和PmacI双酶切，同样得到一端为KpnI粘性末端，一端为平端的载体片段。

e、将酶切好的启动子和载体连接，转化，鉴定，得到pCOsAc载体。

②基因片断的准备(片段粘性末端补平)

将目的基因片断从已经测序并证明序列正确的克隆载体上切割下来，所选用的限制性内切酶是：Bgl II(黏性末端)，Pmac I。回收基因片断利用Klenow酶(TaKaRa)将黏性末端补平。反应程序如下：

10×Klenow buffer            5.0ul

dNTP mixture                 5.0ul

Klenow enzyme                1.3ul(3.5U/ul)

目的片断                     38.7ul

                             共50ul

25℃下反应30分钟，然后75℃下反应25分钟。

③载体片断的准备

利用单一限制性内切酶Pmac I(平末端)酶切原始载体pCOsAC，对回收片断进行去磷酸化处理，防止自连。

④表达载体构建

利用T4连接酶将基因片断与载体片断进行连接，并进行方向性鉴定。连接程序如下：载体pCOsAC 2ul，T4 ligase 1ul，T4×buffer 1ul，OsMsr2 6ul，16℃，8小时。

热激转化及抽提质粒与前面方法相同。

⑤表达载体鉴定

表达载体pCOsAc-OsMsr2构建完成后，根据基因本身所具有的限制性内切酶位点和载体上的酶切位点，分别选用BamH I单酶切，Noc I、Kpn I双酶切，酶切后分别得到914bp和1932bp大小的条带，结果与预测结果吻合(图6)，说明构建载体成功，并且基因在载体上的插入方向正确。

二、培育耐逆转基因拟南芥及其检测

1、耐逆转基因拟南芥的获得

1)表达载体转化农杆菌

将表达载体pCOsAc-OsMsr2利用热激法分别转化农杆菌GV3101(购于天根生化科技(北京)有限公司)，抽提质粒并进行酶切鉴定，采用方法与上述表达载体鉴定的步骤相同，结果表示表达载体pCOsAc-OsMsr2已经成功转化农杆菌。

2)拟南芥的转化

采用农杆菌浸染花序法将表达载体整合到拟南芥(Col-0)基因组中，筛选在含有潮霉素(50mg/l)的MS培养基上进行，T2代种子继续在含潮霉素的MS上筛选，选取分离比例为3∶1的株系在T3代继续筛选，T3代时若种子100％可以在含潮霉素的MS上生长，则认为该株系为纯合株系。

随机选取其中两个纯合株系进行分子检测。采用Trizol试剂提取法(Invitrogen)提取拟南芥总RNA。提取后的RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，从凝胶电泳结果来看，RNA质量高(图7)。

转基因拟南芥总RNA经反转录得到cDNA。反转录所得cDNA为模板(反转录步骤与实施例1相同)，利用如下引物pC13(可扩增潮霉素基因片断)进行PCR扩增：

pC13-F：5′-ACCTGCCTGAAACCGAACTG-3′；

pC13-R：5′-CTGCTCCATACAAGCCAACC-3′。

扩增后的琼脂糖凝胶电泳如图8。结果显示，以转基因植株1、2的cDNA为模板的反应可以扩增出与潮霉素基因大小一致的条带(约480bp)，无模板对照无条带，证明潮霉素基因(筛选标记)已整合到拟南芥基因组中。

同时，本发明还利用另外一对OsMsr2的特异引物(可扩增基因本身)进行PCR扩增。结果显示，转基因植株1，2均可以扩增出目的基因大小的条带，野生型cDNA和无模板对照均无条带，如图9。

以上结果共同说明，pCOsAc-OsMsr2载体已经存在于转基因拟南芥植株，并且基因OsMsr2基因已整合到拟南芥基因组中，且在转基因拟南芥中能进行表达。

2、检测分析

将上述转pCOsAc-OsMsr2拟南芥移至温室培养，自交，收集转基因拟南芥的种子。

同时以转pCOsAc的拟南芥为空载体对照；以野生型拟南芥作为野生型对照。

1)无逆境胁迫时的表型分析

A.萌发率

取转pCOsAc-OsMsr2拟南芥、转pCOsAc的拟南芥和野生型拟南芥的种子消毒，消毒后的种子点种于MS培养基上，培养皿置于4℃，黑暗。2天后将皿取出放到光照培养箱中，常规生长条件培养(16h/8h，光期/暗期；22℃；光强，80μmolm^-2s^-1)，每日统计种子萌发数目。结果如图10所示，正常生长条件下(无任何逆境胁迫)，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥种子(L-5、L-8、L-9和L-15)萌发第1天的萌发率高于野生型对照WT和空载体对照WT-1，随后萌发率无差别。

B.生长势

实验步骤与上述步骤A萌发率相同，萌发第3天时拍照，结果如图11所示，L-5的生长势更强，先于野生型和空载体对照出现子叶。

C.根长

实验步骤与上述A或B相同，只是将培养皿始终保持直立，第5天时拍照，结果如图12所示，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥(L-5和L-15)根长长于野生型和空载体对照。

D.根的干重

将转pCOsAc-OsMsr2拟南芥、转pCOsAc的拟南芥和野生型拟南芥的种子播种于土中，待95天拟南芥成熟后，将根从土中挖出，经过洗净、烘干(60℃下4天)称其重量并拍照。照片如图13所示，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥L-5的成熟根的根毛多于野生型对照和空载体对照。干重结果如表1所示，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥的成熟根的根重与野生型对照和空载体对照相比，平均根重增加56.6％和48.48％。

表1.转基因植株的成熟根的干重

	棵数	总重(克)	平均重量(克)
				野生型植株(WT)	15	0.0792	0.00528
转基因株系(L-5)	15	0.125	0.00833
				空载体对照植株(WT-1)	15	0.0842	0.00561

E.种子大小

相同生长条件下(16h/8h，光期/暗期；22℃；光强，80μmolm^-2s^-1)，同期播种转pCOsAc-OsMsr2拟南芥、转pCOsAc的拟南芥和野生型拟南芥的种子播于培养土中、同期收获种子，然后在显微镜下比较大小，结果如图14所示，L-5明显大于野生型对照和空载体对照。

2)逆境胁迫时的表型分析

A.低温胁迫

将同期收获的转pCOsAc-OsMsr2拟南芥、转pCOsAc的拟南芥和野生型拟南芥的种子消毒后点种于MS培养基，4℃，黑暗两天后移至光照培养箱中，12℃(16h/8h，光期/暗期；光强，80μmolm^-2s^-1)培养，每日统计种子萌发数目，结果如图15所示，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥的种子(L-5；L-9)在低温下的萌发先于野生型对照和空载体对照。

B.高盐胁迫

将同期收获的转pCOsAc-OsMsr2拟南芥、转pCOsAc的拟南芥和野生型拟南芥的种子消毒后分别点种于含100mM NaCl的MS培养基和不含NaCl的MS培养基上，4℃，黑暗两天后移至光照培养箱(16h/8h，光期/暗期；22℃；光强，80μmolm^-2s^-1)中，每日统计种子萌发数目，3天后子叶出现率。

结果如图16所示，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥的种子((L-5、L-8、L-9和L-15))在高盐胁迫下的萌发先于野生型对照和空载体对照。图17显示，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥的种子((L-5、L-8、L-9和L-15))在高盐胁迫下的子叶出现早于野生型对照和空载体对照。

C.高盐和甘露醇胁迫

将同期收获的转pCOsAc-OsMsr2拟南芥、转pCOsAc的拟南芥和野生型拟南芥的种子消毒后分别点种于含50mM NaCl的MS培养基、含100mM NaCl的MS培养基、含200mM的甘露醇(Mannitol)的MS培养基以及不含NaCl和甘露醇的MS培养基上，4℃，黑暗两天后移至光照培养箱(16h/8h，光期/暗期；22℃；光强，80μmolm^-2s^-1)中，培养皿保持直立，第10天统计根长。

在高盐和甘露醇胁迫下，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥与野生型对照和空载体对照相比，生长势旺盛，根长较长。根长的具体统计结果如图18所示，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥(L-5、L-9和L-15)的根长明显大于野生型对照和空载体对照。

D、干旱和高盐胁迫

①将转pCOsAc-OsMsr2拟南芥、转pCOsAc的拟南芥和野生型拟南芥的种子直接播到土中，常规条件生长3周后开始利用盐溶液直接浇灌。NaCl浓度为300mM。盐处理2周后开始复水，复水两周后统计死亡率和成活率。

结果如图19所示，a图为浇灌前；b图表示盐胁迫复水两周后。

盐胁迫复水后的成活率统计结果如图20所示，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥(L-5、L-9)在盐胁迫复水后的成活率明显高于野生型对照和空载体对照。

②将转pCOsAc-OsMsr2拟南芥、转pCOsAc的拟南芥和野生型拟南芥的种子直接播到土中，常规条件生长3周后开始断水。断水14天后开始复水，复水一周后拍照。结果如图21所示，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥(L-5、L-15)在经历先断水后复水之后的成活率明显高于野生型对照和空载体对照。

取常规生长条件下(16h/8h，光期/暗期；22℃；光强，80μmolm^-2s^-1)4周大小、相同位置的莲座叶，置于操作台上，室温、湿度40％，称量不同时间段时叶片重量，计算失水率。结果如图22所示，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥(L-5、L-15)的叶片失水率明显低于野生型对照和空载体对照。

综上所述：在干旱和/或高盐胁迫下，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥的耐受性明显强于与野生型对照和空载体对照。

E.高盐胁迫下的光合速率

取4周大小、位置相同莲座叶，一组用盐离子处理(晚上用200mM NaCl溶液灌溉)，另一组不做盐离子处理，第二天利用Li-6400光合仪测光合数据，重复3个。实验数据利用SPSS生物统计软件分析。结果如图23和图24所示，正常和高盐胁迫下当光强(PPFD)200和300μmolm^-2s^-1时，转pCOsAc-OsMsr2拟南芥L-5、L-9和L-15的净光合速率(Pn)明显高于野生型对照和空载体对照。

大量的实验结果表明，OsMsr2可以提高种子在逆境条件下的萌发率；增加根长及根重；增加植株的生长势，使种子变大；提高叶片净光合速率；增加逆境条件下植株的耐受性。

序列表

<110>中国科学院亚热带农业生态研究所

<120>一种与植物耐逆相关的蛋白及其编码基因与应用

<130>CGGNARL92498

<160>3

<210>1

<211>982

<212>DNA

<213>水稻(Oryza Sativa)

<400>1

aatggctcgt tcaccacaat tcgcaagcaa cgtccgtgca agtagtgctc cattattcta    60

gcaaagaagg caagcagaat tcatccgctt aaggatcaga accagatcga tcagttcgat    120

atatcgatcg acaatggttg ttgcatcagc agcatcgccg tgcgagtcca gtgcgttgtt    180

cgcgacgttc gaccacgacg gcgacggcag gatctccgcg gcggagctgc ggctgtgcat    240

gaagacgacg ctcggggagg aggtgtcgga cgaggaggcg gggcagctgg tggcgtcggt    300

ggacgcggac ggcgacgggc tgctgtgcga ggcggagttc gtgcggctgg tgcaggcggc    360

ggaggtggag gaggaagacg agcggcgggg caccggcctc cgggaggcgt tcggcatgta    420

cgagatggaa ggggaagggt gcatcacgcc gacgagcctc aggcggatgc tgcgccggct    480

gggctccgac caggacatcg acgactgccg cgccatgatc tgcaggttcg atctcaacgg    540

cgacggcgtc ctcagcttcg acgagttcaa gatcatgatg aacgcctaaa ccagctgcta    600

tctgctgatc cctccgctag ctccatcaga gcgcgcgcat ccatcgatct gcagtacaag    660

tagtgttctt gcagcgtgtc gtgtatatac acataggtgc tgtaaatcat gctcagttca    720

cttgattggt ttaggtgttt atacatcatt catttcattt gttaataatg ggatttatac    780

atagtaaatt catttcattt gttgatggat ctgtaaatgc ttcatggatt tattaaggaa    840

gatgatttgt aaatttgaat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat    900

atatatatat atatatatat atatatatat atatatatag taaatttgtt tggtgctcca    960

tggtgcccgg gcaccattgt tg                                             982

<210>2

<211>151

<212>PRT

<213>水稻(Oryza Sativa)

<400>2

Met Val Val Ala Ser Ala Ala Ser Pro Cys Glu Ser Ser Ala Leu Phe

1               5                   10                  15

Ala Thr Phe Asp His Asp Gly Asp Gly Arg Ile Ser Ala Ala Glu Leu

            20                  25                  30

Arg Leu Cys Met Lys Thr Thr Leu Gly Glu Glu Val Ser Asp Glu Glu

        35                  40                  45

Ala Gly Gln Leu Val Ala Ser Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Leu Leu

    50                  55                  60

Cys Glu Ala Glu Phe Val Arg Leu Val Gln Ala Ala Glu Val Glu Glu

65                  70                  75                  80

Glu Asp Glu Arg Arg Gly Thr Gly Leu Arg Glu Ala Phe Gly Met Tyr

                85                  90                  95

Glu Met Glu Gly Glu Gly Cys Ile Thr Pro Thr Ser Leu Arg Arg Met

            100                 105                 110

Leu Arg Arg Leu Gly Ser Asp Gln Asp Ile Asp Asp Cys Arg Ala Met

        115                 120                 125

Ile Cys Arg Phe Asp Leu Asn Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Asp Glu

    130                 135                 140

Phe Lys Ile Met Met Asn Ala

145                 150

<210>3

<211>1425

<212>DNA

<213>水稻(Oryza Sativa)

<400>3

ggtaccctcg aggtcattca tatgcttgag aagagagtcg ggatagtcca aaataaaaca    60

aaggtaagat tacctggtca aaagtgaaaa catcagttaa aaggtggtat aaagtaaaat    120

atcggtaata aaaggtggcc caaagtgaaa tttactcttt tctactatta taaaaattga    180

ggatgttttt gtcggtactt tgatacgtca tttttgtatg aattggtttt taagtttatt    240

cgcttttgga aatgcatatc tgtatttgag tcgggtttta agttcgtttg cttttgtaaa    300

tacagaggga tttgtataag aaatatcttt aaaaaaaccc atatgctaat ttgacataat    360

ttttgagaaa aatatatatt caggcgaatt ctcacaatga acaataataa gattaaaata    420

gctttccccc gttgcagcgc atgggtattt tttctagtaa aaataaaaga taaacttaga    480

ctcaaaacat ttacaaaaac aacccctaaa gttcctaaag cccaaagtgc tatccacgat    540

ccatagcaag cccagcccaa cccaacccaa cccaacccac cccagtccag ccaactggac    600

aatagtctcc acaccccccc actatcaccg tgagttgtcc gcacgcaccg cacgtctcgc    660

agccaaaaaa aaaaaaagaa agaaaaaaaa gaaaaagaaa aaacagcagg tgggtccggg    720

tcgtgggggc cggaaacgcg aggaggatcg cgagccagcg acgaggccgg ccctccctcc    780

gcttccaaag aaacgccccc catcgccact atatacatac ccccccctct cctcccatcc    840

ccccaaccct accaccacca ccaccaccac ctccacctcc tcccccctcg ctgccggacg    900

acgagctcct cccccctccc cctccgccgc cgccgcgccg gtaaccaccc cgcccctctc    960

ctctttcttt ctccgttttt tttttccgtc tcggtctcga tctttggcct tggtagtttg    1020

ggtgggcgag aggcggcttc gtgcgcgccc agatcggtgc gcgggagggg cgggatctcg    1080

cggctggggc tctcgccggc gtggatccgg cccggatctc gcggggaatg gggctctcgg    1140

atgtagatct gcgatccgcc gttgttgggg gagatgatgg ggggtttaaa atttccgcca    1200

tgctaaacaa gatcaggaag aggggaaaag ggcactatgg tttatatttt tatatatttc    1260

tgctgcttcg tcaggcttag atgtgctaga tctttctttc ttctttttgt gggtagaatt    1320

tgaatccctc agcattgttc atcggtagtt tttcttttca tgatttgtga caaatgcagc    1380

ctcgtgcgga gcttttttgt aggtagatct agacacgtgc catgg                    1425

Claims (3)

1.一种培育耐逆转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因导入目的植物，得到耐逆转基因植物；

所述耐逆转基因植物为耐低温、耐高盐、耐甘露醇和/或耐干旱转基因植物；

所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基因是通过重组载体导入目的植物中；

所述重组载体的构建方法如下：是将序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因插入pC0sAC的多克隆位点，得到的重组载体；所述pC0sAC是将序列3所示pActin启动子插入pCambia1301的多克隆位点得到的重组质粒。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述基因是如下1)或2)的基因：

1)编码序列是序列表中序列1的自5’端第134位-第586位所示的基因；

2)编码序列是序列表中序列1的自5’端第128位-622位所示的基因。

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