CN102337291A

CN102337291A - 一种柑橘的基因瞬时表达方法

Info

Publication number: CN102337291A
Application number: CN2011102119613A
Authority: CN
Inventors: 戴素明; 李芳�; 李大志; 邓子牛
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2011-07-27
Filing date: 2011-07-27
Publication date: 2012-02-01

Abstract

一种柑橘的基因瞬时表达方法，包括以下步骤：（1）将公知的含有外源基因的植物表达载体导入农杆菌EHA105中，再将含有植物表达载体的农杆菌EHA105接种于YEB培养基中，振荡培育16小时，使农杆菌EHA105生长达到对数生长期；（2）离心收集菌体并悬浮于缓冲液中，调整农杆菌EHA105菌液浓度OD值为0.1～1.2，28℃静置2小时，取1mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液待用；（3）在柑橘植株上选取刚转绿的成熟叶片，用针头将叶片背面表皮刺破，将注射器管口顶住叶片刺破处并推动，将菌液从破损处渗入叶片并扩展到全叶片。本发明操作方便，无需组织培育过程而不受再生效率、转化效率低的限制，能快速使外源基因在柑橘体内表达。

Description

一种柑橘的基因瞬时表达方法

技术领域

本发明涉及一种柑橘的基因表达方法，尤其是涉及一种柑橘的基因瞬时表达方法。

背景技术

将外源基因转入生物体中进行有效表达是评价基因功能的重要指标。

目前，主要是通过遗传转化的方法将外源基因导入柑橘体内。植物遗传转化的操作进程实际上是一个组织培育的分化再生过程，其操作复杂；而且因为柑橘是多年生木本植物，再生效率和转化效率低(﹤3%)，使遗传转化受到极大的限制。此外，从获得转基因抗性芽到成苗的过程周期长，最快也需要4个月时间。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有柑橘基因表达方法存在的操作复杂，周期长，很难获得转基因植株的不足，提供一种操作方便，无需组织培育过程而不受再生效率、转化效率低的限制，能快速地使外源基因在墨西哥来檬、柠檬、甜橙、椪柑等柑橘品种体内表达的方法。

本发明解决所述技术问题所采用的技术方案是，一种柑橘的基因瞬时表达方法，包括以下步骤：

（1）农杆菌培养：将公知的含有外源基因（gus）的植物表达载体pBI 121、pCAMBIA 1301或pCAMBIA 2301（优选pCAMBIA 2301）导入公知的农杆菌EHA105中，再将含有植物表达载体pBI 121、pCAMBIA 1301或pCAMBIA 2301的农杆菌EHA105 (OD值为0.6)按0.5％（V/V）的比例接种于YEB培养基中，在28℃、220rpm条件下振荡培育16小时，使农杆菌EHA105生长达到对数生长期（OD值0.6）；

（2）菌体收集：离心收集菌体并悬浮于缓冲液中，调整农杆菌EHA105菌液浓度OD值为0.1～1.2（优选0.4），28℃静置2小时，取1mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液待用；

所述缓冲液成分优选pH5.6 10mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸、2mM 氯化镁、150mM 乙酰丁香酮；

（3）注射菌液：在柑橘植株上选取刚转绿的成熟叶片，先用针头将叶片背面表皮刺破（不刺穿叶片），将注射器管口顶住叶片刺破处并推动，将菌液从破损处渗入叶片并扩展到全叶片。

注射后1～5天，通过公知的组织化学染色法检查外源基因（gus）在叶片中的表达。

本发明之柑橘基因表达技术，操作方便，无需组织培育过程而不受再生效率、转化效率低的限制，最早能在1天时间内快速地使外源基因在柑橘体内表达，能够高通量在柑橘中鉴定基因功能，挖潜提高柑橘抗病的基因。

附图说明

图1是外源基因gus在墨西哥来檬体内表达；

图2是外源基因gus在柠檬体内表达；

图3是外源基因gus在甜橙体内表达；

图4是外源基因gus在椪柑体内表达。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

（1）农杆菌培养：将公知的含有外源基因（gus）的植物表达载体pCAMBIA 2301导入公知的农杆菌EHA105中，再将含有植物表达载体的农杆菌EHA105 (OD值0.6)按0.5％（V/V）的比例接种于YEB培养基中，在28℃、220rpm条件下振荡培育16小时，使农杆菌EHA105生长达到对数生长期（OD值0.6）；

（2）菌体收集：离心收集菌体并悬浮于缓冲液中（缓冲液成分为pH5.6 10mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸、2mM 氯化镁、150mM 乙酰丁香酮），调整菌液浓度OD值为0.4，28℃静置2小时，取1mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液待用；

（3）注射菌液：选取刚转绿的成熟墨西哥来檬叶片，先用针头将叶片背面表皮刺破（不刺穿叶片），将注射器管口顶住叶片刺破处并推动，将菌液从破损处渗入叶片并扩展到全叶片。

注射后1天，通过公知的组织化学染色法检查外源基因（gus）在叶片中表达。结果表明（参见图1），gus基因导入墨西哥来檬叶片并表达。

实施例2

（1）整个步骤同实施例1，注射叶片为柠檬叶。

注射后4天，通过公知的组织化学染色法检查外源基因（gus）在叶片中表达。结果表明（参见图2），gus基因导入柠檬叶片并表达。

实施例3

（1）整个步骤同实施例1，注射叶片为甜橙。

注射后4天，通过公知的组织化学染色法检查外源基因（gus）在叶片中表达。结果表明（图3），gus基因导入甜橙叶片并表达。

实施例4

（1）整个步骤同实施例1，注射叶片为椪柑。

注射后4天，通过公知的组织化学染色法检查外源基因（gus）在叶片中表达。结果表明（图4），gus基因导入椪柑叶片并表达。

以上所述实施例只是本发明的几个优选实施例，不得用于解释对本发明保护范围的不当限制。

Claims

1.一种柑橘的基因瞬时表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）农杆菌培养：将公知的含有外源基因的植物表达载体pBI 121、pCAMBIA 1301或pCAMBIA 2301导入公知的农杆菌EHA105中，再将含有植物表达载体pBI 121、pCAMBIA 1301或pCAMBIA 2301的农杆菌EHA105按0.5％（V/V）的比例接种于YEB培养基中，在28℃、220rpm条件下振荡培育16小时，使农杆菌EHA105生长达到对数生长期；

（2）菌体收集：离心收集菌体并悬浮于缓冲液中，调整农杆菌EHA105菌液浓度OD值为0.1～1.2，28℃静置2小时，取1mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液待用；

（3）注射菌液：在柑橘植株上选取刚转绿的成熟叶片，先用针头将叶片背面表皮刺破，将注射器管口顶住叶片刺破处并推动，将菌液从破损处渗入叶片并扩展到全叶片。

2.如权利要求1所述柑橘的基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤(1)，农杆菌EHA105 的OD值为0.6。

3.如权利要求1或2所述柑橘的基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤(2)，所述缓冲液成分为pH5.6 50mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸、2mM 磷酸钠、0.5wt％葡萄糖、100mM 乙酰丁香酮。

4.如权利要求1或2所述柑橘的基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤(2)，所述缓冲液成分为pH5.6 10mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸、2mM 氯化镁、150mM 乙酰丁香酮。

5.如权利要求1或2所述柑橘的基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤(2)，调整农杆菌EHA105菌液浓度OD值为0.4。

6.如权利要求3所述柑橘的基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤(2)，调整农杆菌EHA105菌液浓度OD值为0.4。

7.如权利要求4所述柑橘的基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤(2)，调整农杆菌EHA105菌液浓度OD值为0.4。