CN101307322A - 在植物中瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的方法 - Google Patents

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王兴智
朱筱娟
刘晶莹
麻鹏达
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本发明公开了在植物中瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的方法，涉及酸性成纤维细胞生长因子制备工艺的改进，进一步讲是属于植物基因工程技术领域。首先，进行人源酸性成纤维细胞生长因子植物病毒表达载体的构建，将编码人源酸性成纤维细胞生长因子DNA序列468bp连入改造的植物病毒表达载体，随后转入农杆菌GV3101中用于在植物中瞬时表达。选取适宜苗龄的植物材料进行农杆菌侵染，即用注射器针头在叶片背面主叶脉两侧各轻划一小伤痕，接着用除去针头的注射器将菌液从伤处注入叶片，待植物病毒携带目的基因hafgf迅速在植物体中扩散、表达、聚集。当此聚集达峰值时，收集植株，提取目的蛋白。

Description

在植物中瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的方法
技术领域
本发明公开了在植物中瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的方法，涉及酸性成纤维细胞生长因子制备工艺的改进，进一步讲是属于植物基因工程技术领域。
背景技术
成纤维细胞生长因子超家族至今发现有23个成员。酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblastgrowth factors，简称：aFGF)是其中一员，它具有很强的促有丝分裂的能力，它能刺激多种细胞的DNA合成与增殖，包括成纤维细胞，上皮细胞，内皮细胞，平滑肌细胞，成肌细胞，软骨细胞及神经胶质细胞。此外，还认为aFGF可以直接刺激引发内皮细胞及成纤维细胞的迁移。aFGF在个体发育、形态发生过程的很多阶段、血管的生成及伤口的愈合过程中都发挥着重要作用。酸性成纤维细胞生长因子在临床医学上有着广泛的应用。如神经元损伤的修复，缺血性疾病的恢复，胃溃疡的愈合等。
目前，获得aFGF的传统方法是从动物组织中提取及在大肠杆菌中原核表达，然而第一种方法产率低、价格昂贵，第二种方法是由原核表达系统产生重组蛋白，由于缺少糖基化，磷酸化等翻译后修饰，且常形成包涵体而影响所得aFGF的生物学活性。
发明内容：
本发明提供一种在植物中瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的方法，目的是解决其常规制备方法产率低、成本高等缺欠，适用于工业化生产。
本发明的技术解决方案如下：
1、人源酸性成纤维细胞生长因子(HaFGF)植物病毒表达载体的构建
将编码人源酸性成纤维细胞生长因子DNA序列468bp连入改造的植物病毒表达载体，随后转入农杆菌用于在烟草中瞬时表达。
2、在植物中瞬时表达人源酸性成纤维细胞生长因子
选取适宜苗龄的植物为材料进行农杆菌侵染，即用注射器针头在叶片背面主叶脉两侧各轻划一小伤痕，接着用除去针头的注射器将菌液从伤处注入叶片，待植物病毒携带目的基因hafgf迅速在植物体中扩散、表达、聚集。当此聚集达峰值时，收集植株，提取目的蛋白。
本发明的积极效果在于：应用改造的植物病毒做载体在植物中瞬时表达haFGF，表达量约为植物总可溶性蛋白的1％，蛋白生产成本低，操作过程简单，生产蛋白较传统转基因法周期短，表达量高，方便并保持了很好的蛋白活性。
附图说明：
图1本发明酸性成纤维细胞生长因子的蛋白电泳图。
具体实施方式：
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
1、HaFGF植物马铃薯X病毒表达载体的构建
根据hafgf序列设计引物，经PCR扩增出hafgf片段。PCR参数：94℃3min；94℃35sec，54℃30sec，72℃1min共20个循环；72℃1min；4℃10min。
应用平端连接法将hafgf序列连入经Sma I酶切的植物马铃薯X病毒表达载体pGR107。构建成pGR107-haFGF。该质粒用冻融法转入感受态农杆菌GV3101，得GV3101.pGR107-haFGF。
2、在烟草中瞬时表达HaFGF
以生长期为40天(五叶期或六叶期)的烟草幼苗为材料进行侵染。
挑取经转化和鉴定的农杆菌GV3101.pGR107-haFGF单菌落，接种于5ml含有50mg/L卡那霉素，12.5mg/L四环素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃过夜培养。次日，按照1∶50的比例将1ml的菌液加入50ml的含有上述抗生素的LB液体培养基中，并加入乙酰丁香酮至终浓度20μM和MES至终浓度10mM。28℃过夜培养。测定菌液的OD600值，选择OD600值范围在0.8-1.0的菌液进行下一步操作。于常温下4000rpm，10分钟离心收集菌体，菌体沉淀用含有终浓度100μM乙酰丁香酮和终浓度10mM MES的等体积无菌水溶液重悬，室温放置2-3小时后用以侵染植物。用注射器针头在叶片背面主叶脉两侧各轻划一小伤痕，接着用除去针头的注射器将菌液从伤处注入叶片。为了利于农杆菌中T-DNA的转移，在侵染后的一天内，将被侵染烟草置于24℃以下放置。之后转移至正常条件培养。
在侵染7-10天后，取经GV3101.pGR107.haFGF侵染的植株叶片100mg，用蛋白提取缓冲液提取植物总可溶性蛋白。方法如下：
取烟草叶片，快速称量后放入研钵，加入液氮进行充分研磨。成粉末后转移到Eppendorf管中，加入预冷的蛋白提取缓冲溶液200μl，颠倒混匀，置于冰上。12000转/分在4℃条件下离心，取上清。用Heparin SepharoseTM CL-6B进行纯化，得到一条在分子量约17kDa处条带。
实施例2
1、HaFGF植物碗豆早褐病毒表达载体的构建
根据hafgf序列设计引物，经PCR扩增出hafgf片段。PCR参数：94℃3min；94℃35sec，54℃30sec，72℃1min共20个循环；72℃1min；4℃10min。
将hafgf序列连入经Nco I，EcoR I双酶切的植物碗豆早褐病毒表达载体pCAPE2。构建成pCAPE2-haFGF。该质粒用冻融法转入感受态农杆菌GV3101，得GV3101.pCAPE2-haFGF。
2、在豌豆中瞬时表达HaFGF
以生长期为2周的豌豆幼苗为材料进行侵染。
分别挑取经转化和鉴定的农杆菌GV3101.pCAPE2-haFGF单菌落及GV3101.pCAPE1，接种于5ml含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养24-36小时。按照1∶50的比例将1ml的培养物加入50ml的含有上述抗生素的LB液体培养基中，并加入乙酰丁香酮至终浓度20μM和MES至终浓度10mM。28℃过夜培养后，测定菌液的OD600值，选择OD600值范围在0.8-1.0的菌液进行下一步操作。于常温下4000转/分离心10分钟收集菌体，菌体沉淀用含有100μM乙酰丁香酮和10mM MES的等体积无菌水溶液重悬，室温放置2-3小时。两者1∶1混匀后，用注射器针头在叶片背面主叶脉两侧各轻划一小伤痕，接着用除去针头的注射器将菌液从伤处注入叶片。为了利于农杆菌中T-DNA的转移，在侵染后的一天内，将被侵染豌豆置于24℃以下放置。之后转移至正常条件培养。
在侵染7-10天后，取经GV3101.pCAPE1，GV3101.pCAPE2-haFGF侵染的植株叶片100mg，用蛋白提取缓冲液提取植物总可溶性蛋白。方法如下：
取豌豆叶片，快速称量后放入研钵，加入液氮进行充分研磨。成粉末后转移到Eppendorf管中，加入预冷的蛋白提取缓冲溶液200μl，颠倒混匀，置于冰上。12000转/分在4℃条件下离心，取上清。用Heparin SepharoseTM CL-6B进行纯化，得到一条在分子量约17kDa处条带。

Claims (1)

1、一种在植物中瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的方法，主要包括以下步骤：
1)人源酸性成纤维细胞生长因子植物病毒表达载体的构建
将编码人源酸性成纤维细胞生长因子DNA序列468bp连入改造的植物病毒表达载体，随后转入农杆菌中用于在植物中瞬时表达；
2)在植物中瞬时表达人源酸性成纤维细胞生长因子
选取适宜苗龄的植物材料进行农杆菌侵染，即用注射器针头在叶片背面主叶脉两侧各轻划一小伤痕，接着用除去针头的注射器将菌液从伤处注入叶片，待植物病毒携带目的基因hafgf迅速在植物体中扩散、表达、聚集；当此聚集达峰值时，收集植株，提取目的蛋白。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102337291A (zh) * 2011-07-27 2012-02-01 湖南农业大学 一种柑橘的基因瞬时表达方法
CN103333256A (zh) * 2013-07-05 2013-10-02 中国农业科学院生物技术研究所 人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其编码基因和应用
CN114223426A (zh) * 2021-12-27 2022-03-25 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种单子叶植物叶片液体注射方法

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