CN106367436A - 刚毛柽柳瞬时转化方法 - Google Patents

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Abstract

刚毛柽柳瞬时转化方法，涉及一种植物瞬时转基因的方法。本发明是要解决现有刚毛柽柳稳定转化周期太长，刚毛柽柳原瞬时转化方法的转化效率低的问题。方法：一、选取继代培养的刚毛柽柳组培苗，将选取的刚毛柽柳组培苗放入高渗透处理液中浸泡；二、将高渗处理过的刚毛柽柳组培苗迅速转移至加有含目的基因的根癌农杆菌的侵染液中，置于真空泵中对其抽真空，置于恒温振荡器侵染；三、取出侵染完成后的组培苗，洗涤，吸干水分，插入共培养固体培养基，共培养。本方法使得柽柳瞬时转化效率大大提高。瞬时转入标记基因GUS基因的酶活性测定结果显示，本发明比柽柳原始瞬时转化方法的GUS活性提高了2.45倍。本发明用于植物瞬时转基因领域。

Description

刚毛柽柳瞬时转化方法
技术领域
本发明涉及一种植物瞬时转基因的方法。
背景技术
刚毛柽柳(Tamarix hispida)是柽柳科柽柳属植物，灌木或小乔木，具有强的抗旱、耐盐、耐水湿、抗沙埋能力，是优良的防风固沙、水土保持和盐碱地造林树种。同时由于其优良的抗逆能力，使其成为研究植物抗逆机制和抗逆基因克隆的理想材料。但由于柽柳的遗传转化周期较长，通过转基因的方法过表达和RNAi抑制表达目的柽柳基因，用来研究基因的抗逆功能和抗逆机制较难、花费的时间较长。寻找一种快速有效的遗传转化方法对柽柳基因功能研究具有重要的意义。
发明内容
本发明是要解决现有刚毛柽柳稳定转化周期太长，刚毛柽柳转化方法的转化效率低的问题，提供一种刚毛柽柳瞬时转化方法。
本发明刚毛柽柳瞬时转化方法，按以下步骤进行：
一、选取继代培养30-35天的刚毛柽柳组培苗，株高为2.5-3.0cm，将选取的刚毛柽柳组培苗放入高渗透处理液中浸泡5-10min；
二、将步骤一高渗处理过的刚毛柽柳组培苗迅速转移至加有含目的基因的根癌农杆菌的侵染液中，其中侵染液OD600为0.6-0.8，置于真空泵中对其抽真空5-10min，然后将其置于恒温振荡器24～26℃，100～130rpm侵染4～5h；
三、取出步骤二中侵染完成后的组培苗，无菌水洗涤3-4次，用无菌滤纸吸干水分，插入共培养固体培养基，共培养32～38h。
进一步的，步骤一中所述高渗透处理液为1.0mol/L的甘露醇。
进一步的，步骤二所述含目的基因的根癌农杆菌为转化有含目的基因表达载体的根癌农杆菌，其中目的基因为待研究的柽柳基因。
进一步的，步骤二中所述的侵染液由400mM甘露醇、10mM硫酸镁、10mM氯化钙、150μM乙酰丁香酮(As)、1.5mg/L激动素、5mg/L 2,4-D、10mM吗啉代丙磺酸、0.02％(v/v)DTT和0.05％(v/v)Tween(pH＝5.6)组成(注：AS、DTT、Tween20不可高温灭菌，应过滤灭菌后加入)；所述吗啉代丙磺酸在使用前用KOH调节pH至5.4。
进一步的，步骤三中所述的共培养固体培养基为含150μM乙酰丁香酮(As)和3mg/L硝酸银的MS固体培养基(pH＝5.8)。
本发明的有益效果：
为快速研究柽柳基因功能，对刚毛柽柳进行瞬时遗传转化，是对原有的柽柳瞬时转化体系的完善。
本发明方法通过选择适宜生理状态的柽柳组培苗(适宜生理状态的组培苗比实生苗幼嫩，更适于进行转化)、高渗处理、真空泵抽真空处理及改良的侵染液等多因素的共同作用下促使了柽柳瞬时转化效率的大大提高。瞬时转入标记基因GUS基因的酶活性测定结果显示，本发明比柽柳原始瞬时转化方法的GUS活性提高了2.45倍。
本发明较现有的刚毛柽柳稳定转化方法的周期短。
附图说明
图1为实施例1中继代培养的柽柳组培苗；
图2为实施例1中继代培养35天的柽柳组培苗；
图3为对照野生型柽柳原转化方法GUS活性染色图；
图4为实施例1中改进的柽柳瞬时转化后GUS活性染色图；
图5为图3的GUS活性染色局部放大图；
图6为图4的GUS活性染色局部放大图；
图7为两种转化柽柳方法测定的GUS酶活性数据分析结果；
图8为目的基因ThSOS瞬时侵染柽柳后实时荧光定量PCR的数据分析结果。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式刚毛柽柳瞬时转化方法，按以下步骤进行：
一、选取继代培养30-35天的刚毛柽柳组培苗，株高为2.5-3.0cm，将选取的刚毛柽柳组培苗放入高渗透处理液中浸泡5-10min；
二、将步骤一高渗处理过的刚毛柽柳组培苗迅速转移至加有含目的基因的根癌农杆菌的侵染液中，其中侵染液OD600为0.6-0.8，置于真空泵中对其抽真空5-10min，然后将其置于恒温振荡器24～26℃，100～130rpm侵染4～5h；
三、取出步骤二中侵染完成后的组培苗，无菌水洗涤3-4次，用无菌滤纸吸干水分，插入共培养固体培养基，共培养32～38h。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述高渗透处理液为1.0mol/L的甘露醇。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二所述含目的基因的根癌农杆菌为转化有含目的基因表达载体的根癌农杆菌。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中所述的侵染液由400mM甘露醇、10mM硫酸镁、10mM氯化钙、150μM乙酰丁香酮、1.5mg/L激动素、5mg/L 2,4-D、10mM吗啉代丙磺酸、0.02％(v/v)DTT和0.05％(v/v)Tween20组成。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中所述的共培养固体培养基为含150μM乙酰丁香酮和3mg/L硝酸银的MS固体培养基。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中所述共培养固体培养基的pH值为5.8。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中共培养34～36h。其它与具体实施方式一至六之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
一、选取继代培养35天幼嫩的刚毛柽柳组培苗，株高为2.5-3.0cm，将选取的刚毛柽柳组培苗放入1.0M的甘露醇高渗透处理液，浸泡10min。
在高渗处理的过程中要注意组培苗的状态。如果高渗后出现不同程度的萎蔫现象，可适当调整高渗时间为6min，避免组培苗的萎蔫，为下一步真空抽提处理提供条件。
二、将步骤一中的高渗处理过的组培苗迅速转移至已加有含pCAMBIA1301载体的根癌农杆菌的侵染液中；其中侵染液OD600为0.7，立即对其抽真空5min，然后将其置于恒温振荡器24℃，120rpm侵染4h；所述pCAMBIA1301载体含GUS基因。
抽真空时，要时刻注意抽提过程中的组培小苗；发现小苗被抽提在瓶子顶部，需立刻停止抽提，晃动瓶子，让小苗沉到底部后继续抽提；在抽提过程中如有发现小苗有萎蔫现象，需减少抽提时间(可将抽提时间调整为7min左右)。
三、取出步骤二中侵染完成后的组培苗，用无菌水洗涤3次，无菌滤纸吸干水分，插入共培养固体培养基，共培养36h。
共培养的过程是侵染的材料与含有目的基因的根癌农杆菌在一起共同培养的过程，这个过程便于农杆菌的侵附，能提高侵染效率。但是在共培养期间应注意观察以避免农杆菌包裹住侵染材料，发现根癌农杆菌大量繁殖后，应及时更换培养基。
其中步骤一中所述的高渗透处理液含1.0M甘露醇；
步骤二中所述的侵染液含400mM甘露醇、10mM硫酸镁、10mM氯化钙、150μMAs、1.5mg/L激动素、5mg/L 2,4-D、10mM吗啉代丙磺酸(用KOH调节pH至5.4)、0.02％(v/v)DTT和0.05％(v/v)Tween20(pH＝5.6)(注：在整个实验过程中，这是关键的一步。此步应注意一是侵染液的配置过程中应分开配置母液1M硫酸镁、1M氯化钙，再取相应的体积与其他药品混合，如果一起称量药品硫酸镁和氯化钙加水溶，会出现白色浑浊现象。二是配置2,4-D、KT等药品时首先用1M KOH助溶，然后加相应体积的去离子水，配制成所需浓度；配制不可高温灭菌的药品，如AS、DTT、Tween20等时，可通过过滤灭菌，使用0.22μm的过滤器进行过滤。在过滤后的药品溶液中加入相应体积已灭过菌的去离子水，配制成所需浓度。待培养基配制灭菌完成后，加入相应药品的要求量即可。)；步骤三中所述的共培养固体培养基为含150μM乙酰丁香酮(As)和3mg/L硝酸银的MS固体培养基(pH＝5.8)。
同时设置对照，对照为野生型柽柳原转化方法。
本发明的方法通过选择适宜生理状态的柽柳组培苗与高渗处理和真空泵抽真空处理及改良的侵染液等因素的共同作用下大大提高了柽柳瞬时转化效率。
本实施例中继代培养的柽柳组培苗如图1和2所示。图1为刚刚继代的柽柳组培小苗，此时的柽柳组培小苗还不能用于柽柳的瞬时转化；图2为继代35天后的柽柳组培苗，此时的柽柳组培苗可用于柽柳的瞬时转化。
从柽柳GUS活性染色图即图3和图4的对照比较得出，图4的柽柳GUS活性染色效果具有显著的提升。图5、图6分别是图3、图4的局部放大图，能从柽柳GUS着色的深浅、着色均匀度等细节上进一步观察图3、图4柽柳GUS活性染色效果。
图7为测量的两种瞬时转化方法即对照和本实施例改进的柽柳瞬时转化方法进行pCAMBIA1301瞬时转化后的GUS酶活性数据，图中表示对照方法，表示本实施例改进方法。由SPSS软件的差异显著性分析，结果显示野生型柽柳原转化方法和改进的柽柳瞬时转化方法获得的GUS酶活性之间差异达到了极显著水平。此结果进一步证明了改进后的柽柳瞬时转化体系的优越性。
实施例2：
(一)构建柽柳ThSOS基因的过表达载体pROKII-ThSOS
根据植物过表达载体pROKII的多克隆位点，及ThSOS基因特征，设计引物时在ThSOS基因5’端和3’端分别引入XbaI和KpnI限制性内切酶位点。
以刚毛柽柳cDNA为模板，进行ThSOS基因RT-PCR克隆，RT-PCR反应体系为20μL，其中包括模板2μL，基因特异性上下游引物(pROKⅡ-ThSOS-F和pROKⅡ-ThSOS-R)(10μmol/L)各1μL，dNTP Mix(10mmol/L)0.40μL，10×LA Taq PCR buffer 2.00μL，LA Taq(5U/μL)0.25μL。反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸7min。使用胶回收试剂盒对扩增目的片段进行回收。用KpnI和XbaI酶分别对胶回收ThSOS基因产物和pROKII质粒进行双酶切，分别回收后用T4连接酶进行连接。将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆进行PCR验证，并进一步测序验证。序列正确的载体即为ThSOS基因过表达载体，命名为pROKⅡ-ThSOS，转化农杆菌菌株EHA105。将构建好的EHA105(pROKⅡ-ThSOS)保存在-80℃超低温冰箱备用。其中扩增得到的ThSOS基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
表1
(二)构建柽柳ThSOS基因的抑制表达载体pFGC5941-ThSOS
首先构建pFGC5941-ThSOS-Cis，根据植物抑制表达载体pFGC5941的多克隆位点，及ThSOS基因的特征，在ThSOS基因5’端和3’端分别引入NcoI、AscI限制性内切酶位点，设计引物。
以pROKII-ThSOS质粒为模板，pFGC5941-ThSOS-Cis-F/R为引物进行PCR，扩增带有AscI、NcoI限制性内切酶位点的目的基因。用胶回收试剂盒对PCR产物ThSOS-Cis目的片段进行回收纯化。用AscI、NcoI限制性内切酶分别双酶切ThSOS-Cis目的基因片段和植物干扰载体pFGC5941质粒。37℃温育4h后，将获得的酶切产物分别进行回收纯化，用T4DNA ligase将纯化好的ThSOS-Cis双酶切目的片段与植物干扰载体pFGC5941双酶切大片段进行16℃催化连接12～16h，重组载体命名为pFGC5941-ThSOS-Cis，进而转化大肠杆菌，检测完毕，保存备用。然后构建pFGC5941-ThSOS-Anti，先以pROKII-ThSOS质粒为模板，pFGC5941-ThSOS-Anti-F/R为引物进行PCR扩增带有SmaI、XbaI限制性内切酶位点的目的基因。同上，胶回收后用SmaI、XbaI限制性内切酶分别双酶切ThSOS-Anti目的基因片段和重组载体pFGC5941-ThSOS-Cis。将获得的酶切产物分别进行回收纯化，用T4连接酶将纯化好的ThSOS-Anti双酶切目的片段与pFGC5941-ThSOS-Cis双酶切大片段进行16℃催化连接12～16h。将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆进行菌液PCR检测阳性克隆，并进一步测序验证。获得ThSOS基因抑制表达载体，命名为pFGC5941-ThSOS，转农杆菌菌株EHA105。将构建好的EHA105(pFGC5941-ThSOS)保存在-80℃超低温冰箱备用。
表2
(三)将刚毛柽柳组培苗分别移至含ThSOS基因的过表达载体pROKII-ThSOS和抑制表达载体pFGC5941-ThSOS根癌农杆菌的侵染液中，进行侵染，具体如下：
一、选取继代培养35天幼嫩的柽柳组培苗，株高为2.5-3.0cm，将选取的柽柳组培苗放入1.0M的甘露醇高渗透处理液，浸泡10min。
在高渗处理的过程中要注意组培苗的状态。如果高渗后出现不同程度的萎蔫现象，可适当调整高渗时间为6min，避免组培苗的萎蔫，为下一步真空抽提处理提供条件。
二、将一部分步骤一中的高渗处理过的组培苗迅速转移至已加有含有pROKII-ThSOS载体的根癌农杆菌的侵染液中，将另一部分高渗处理过的组培苗迅速转移至已加有含抑制表达载体pFGC5941-ThSOS的根癌农杆菌侵染液中；其中侵染液OD600为0.7，立即对其抽真空10min，然后将其置于恒温振荡器24℃，120rpm侵染4h；
抽真空时，要时刻注意抽提过程中的组培小苗；发现小苗被抽提在瓶子顶部，需立刻停止抽提，晃动瓶子，让小苗沉到底部后继续抽提；在抽提过程中如有发现小苗有萎蔫现象，需减少抽提时间(可将抽提时间调整为7min左右)。
三、取出步骤二中侵染完成后的组培苗，用无菌水洗涤3次，无菌滤纸吸干水分，插入共培养固体培养基，共培养36h。
共培养的过程是侵染的材料与含有目的基因的根癌农杆菌在一起共同培养的过程，这个过程便于农杆菌的侵附，能提高侵染效率。但是在共培养期间应注意观察以避免农杆菌包裹住侵染材料，发现根癌农杆菌大量繁殖后，应及时更换培养基。
其中步骤一中所述的高渗透处理液含1.0M甘露醇；
步骤二中所述的侵染液含400mM甘露醇、10mM硫酸镁、10mM氯化钙、150μM As、1.5mg/L激动素、5mg/L 2,4-D、10mM吗啉代丙磺酸(用KOH调节pH至5.4)、0.02％(v/v)DTT和0.05％(v/v)Tween20(pH＝5.6)(注：在整个实验过程中，这是关键的一步。此步应注意一是侵染液的配置过程中应分开配置母液1M硫酸镁、1M氯化钙，再取相应的体积与其他药品混合，如果一起称量药品硫酸镁和氯化钙加水溶，会出现白色浑浊现象。二是配置2,4-D、KT等药品时首先用1M KOH助溶，然后加相应体积的去离子水，配制成所需浓度；配制不可高温灭菌的药品，如AS、DTT、Tween20等时，可通过过滤灭菌，使用0.22μm的过滤器进行过滤。在过滤后的药品溶液中加入相应体积已灭过菌的去离子水，配制成所需浓度。待培养基配制灭菌完成后，加入相应药品的要求量即可)；步骤三中所述的共培养固体培养基为含150μM乙酰丁香酮(As)和3mg/L硝酸银的MS固体培养基(pH＝5.8)。
图8为目的基因ThSOS的过表达载体pROKII-ThSOS和抑制表达载体pFGC5941-ThSOS通过瞬时侵染柽柳后置于150mM NaCl胁迫12h、24h和36h后的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的数据分析结果，表示对照，表示过表达株系，表示抑制表达株系。结果表明与对照相比，ThSOS基因在过表达株系中的表达量明显增高，而在RNAi抑制表达株系中明显降低。表明成功获得了瞬时过表达和抑制表达ThSOS基因柽柳，即瞬时侵染转化成功。综上所述，改进的柽柳瞬时转化技术在改良的侵染液、高渗处理与真空抽提等多因素的共同作用下促使了柽柳瞬时转化效率的大大提高。

Claims (7)

1.刚毛柽柳瞬时转化方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、选取继代培养30-35天的刚毛柽柳组培苗，株高为2.5-3.0cm，将选取的刚毛柽柳组培苗放入高渗透处理液中浸泡5-10min；
二、将步骤一高渗处理过的刚毛柽柳组培苗迅速转移至加有含目的基因的根癌农杆菌的侵染液中，其中侵染液OD600为0.6-0.8，置于真空泵中对其抽真空5-10min，然后将其置于恒温振荡器24～26℃，100～130rpm侵染4～5h；
三、取出步骤二中侵染完成后的组培苗，无菌水洗涤3-4次，用无菌滤纸吸干水分，插入共培养固体培养基，共培养32～38h。
2.根据权利要求1所述的刚毛柽柳瞬时转化方法，其特征在于步骤一中所述高渗透处理液为1.0mol/L的甘露醇。
3.根据权利要求1所述的刚毛柽柳瞬时转化方法，其特征在于步骤二所述含目的基因的根癌农杆菌为转化有含目的基因表达载体的根癌农杆菌。
4.根据权利要求1所述的刚毛柽柳瞬时转化方法，其特征在于步骤二中所述的侵染液由400mM甘露醇、10mM硫酸镁、10mM氯化钙、150μM乙酰丁香酮、1.5mg/L激动素、5mg/L 2,4-D、10mM吗啉代丙磺酸、0.02％DTT(v/v)和0.05％(v/v)Tween20组成。
5.根据权利要求1所述的刚毛柽柳瞬时转化方法，其特征在于步骤三中所述的共培养固体培养基为含150μM乙酰丁香酮和3mg/L硝酸银的MS固体培养基。
6.根据权利要求1所述的刚毛柽柳瞬时转化方法，其特征在于步骤三中所述共培养固体培养基的pH值为5.8。
7.根据权利要求1所述的刚毛柽柳瞬时转化方法，其特征在于步骤三中共培养34～36h。
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