CN105968178A - 水稻OsRAD1蛋白及其编码基因在调控花粉育性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水稻OsRAD1蛋白及其编码基因在调控水稻花粉育性中的应用。本发明提供的OsRAD1蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花粉育性相关的由序列1衍生的蛋白质。OsRAD1基因也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育雄性不育植物的方法，为抑制目的植物中所述基因的表达，得到雄性不育植物。结合采用组织特异性抑制基因表达的方法，OsRAD1基因可以可用于水稻杂交育种，在水稻育种实践和中具有重要意义，可以为通过利用杂种优势途径提高水稻产量与品质提供重要资源。

Description

水稻OsRAD1蛋白及其编码基因在调控花粉育性中的应用
技术领域
本发明涉及一种水稻OsRAD1蛋白及其编码基因在调控花粉育性中的应用。
背景技术
水稻是重要的粮食作物，全世界50％以上的人口以稻米为主食。我国稻谷产量占全球37％左右，是世界上最大的稻米生产国。同时水稻也是我国第一大粮食作物，有超过60％的中国人口以水稻为主要食物。提高水稻产量一直是我国农业生产上的关键。20世纪60年代，以矮秆育种为标志的“绿色革命”让水稻产量得到了突破性增长，80年代末水稻单产比70年代初提高了63％。20世纪70年代，以杂种优势利用为特征的水稻品种改良使我国水稻单产发生了又一次飞跃。袁隆平研究出的三系法杂交水稻使我国稻谷单产在矮化育种的基础上再次增产20％，被誉为我国水稻生产的“第二次绿色革命”。杂交水稻在生活力、生长势、抗性、适应性和丰产性等许多性状上表现出显著的杂种优势。杂交水稻技术的推广应用，缓解了我国人口迅速增长与粮食短缺的矛盾，为保障我国粮食安全做出了巨大贡献。
三系法杂交水稻的三系由雄性不育系，雄性不育保持系和雄性不育恢复系组成。其中，雄性不育系是水稻杂种优势能够有效利用的基础。但自然界中雄性不育系种类极少，其鉴定需耗费大量人力物力，且对应的保持系难以寻找，这些都限制了杂种优势的利用。随着生物学技术的发展，利用基因工程途径获得雄性不育系水稻具有诱人前景。
减数分裂是真核生物进行有性生殖的关键。二倍体生物的生殖细胞经过减数分裂形成单倍体配子，单倍体的配子通过受精作用形成新的二倍体细胞。减数分裂使生物经过有性生殖过程，仍能够保持恒定的染色体数目，维持了物种基因组遗传的稳定性，此外，减数分裂过程中同源染色体间发生重组，为物种的遗传多样性提供了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻OsRAD1蛋白及其编码基因在调控花粉育性中的应用。
本发明提供的蛋白质，获自水稻，命名为OsRAD1蛋白，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花粉育性相关的由序列1衍生的蛋白质。花粉育性又称为雄性育性。
为了使(a)中的OsRAD1蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
C-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)中的OsRAD1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsRAD1蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述OsRAD1蛋白的基因(OsRAD1基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因为如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：
(1)编码区如序列表中序列2自5′末端第76至990位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码与植物花粉育性相关蛋白的DNA分子；
(4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物花粉育性相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
含有所述OsRAD1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述OsRAD1蛋白或其编码基因在调控植物雄性育性中的应用。
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如盐稻8号水稻。
本发明还保护一种特异DNA分子，包括如下元件：区段A、区段B和区段C；所述区段C(间隔序列)位于区段A和区段B之间；所述区段A与所述区段B反向互补；所述区段A如序列表中序列3自5′末端第15-416位核苷酸所示。所述特异DNA分子具体可如序列表的序列3所示。
所述特异DNA分子转录得到的RNA分子也属于本发明的保护范围。
所述特异DNA分子编码的siRNA也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种培育雄性不育植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中所述OsRAD1基因的表达，得到雄性不育植物。
所述“抑制目的植物中所述OsRAD1基因的表达”是通过导入所述特异DNA分子实现的。
所述“抑制目的植物中所述OsRAD1基因的表达”是通过导入干扰载体实现的；所述干扰载体含有特异DNA片段(发夹结构DNA)；所述特异DNA片段包括如下元件：区段A、区段B和区段C；所述区段C(间隔序列)位于区段A和区段B之间；所述区段A与所述区段B反向互补；所述区段A如序列表中序列3自5′末端第15-416位核苷酸所示。所述干扰载体具体可为在pCAMBIA2300-Actin载体的多克隆位点(具体可为PstI位点)插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒。所述区段C具体可为pUCRNAi载体的GA20内含子核苷酸序列。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中所述OsRAD1基因的表达，得到花粉母细胞的同源染色体不能均等分离的转基因植物。
本发明还保护一种培育雄性不育植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中所述OsRAD1蛋白的活性，得到雄性不育植物。
所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如盐稻8号水稻。
本发明还保护OsRAD1蛋白、OsRAD1基因、所述特异DNA分子、所述RNA分子、所述siRNA或以上任一所述方法在植物育种中的应用。
所述育种的目的为选育雄性不育性的植物。
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如盐稻8号水稻。
以上任一所述雄性不育性具体体现为不结实和/或花粉呈现败育的表型和/或花粉母细胞的染色体不能均等分离。
本发明提供了OsRAD1蛋白及其编码基因，OsRAD1蛋白通过调控水稻减数分裂进而影响正常配子的产生来控制水稻的育性。结合采用组织特异性抑制基因表达的方法，OsRAD1基因可用于水稻杂交育种。因此，OsRAD1蛋白及其编码基因在水稻育种实践和中具有重要意义，可以为通过利用杂种优势途径提高水稻产量与品质提供重要资源。
附图说明
图1为广陆矮4号与水稻不育突变体OsRAD1的花粉观察图。
图2为OsRAD1基因的组织特异性表达分析图。
图3为日本晴花粉母细胞中的染色体行为观察图。
图4为水稻不育突变体OsRAD1花粉母细胞中的染色体行为观察图。
图5为OsRAD1-RNAi干扰植株花粉母细胞中的染色体行为观察图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
水稻品种盐稻8号：江苏省盐城市明天种业科技有限公司。
水稻品种广陆矮4号：中国农科院作物科学研究所水稻种质资源中心保藏，库编号I1A49051。
粳稻品种日本晴：中国农科院作物科学研究所水稻种质资源中心保藏，库编号I1A13071。
pUCRNAi载体：参考文献：Hengxiu Yu，Mo Wang，Ding Tang et a1.OsSPO11-1isessential for both homologous chromosome pairing and crossover formation inrice.Chromosoma.2010(119)：625-636.；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
pCAMBIA2300-Actin载体：参考文献：Hengxiu Yu，Mo Wang，Ding Tang et al.OsSPO11-1 is essential for both homologous chromosome pairing and crossoverformation in rice.Chromosoma.2010(119)：625-636.；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
根癌农杆菌EHA105：北京天恩泽生物技术有限公司，产品目录号：140383。
AAM液体培养基：CaCl2·2H2O 440mg，MgSO4·7H2O 370mg，KH2PO4170mg，KCl2940mg，KI 0.83mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O0.03mg，CoCl2·6H2O 0.03mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB11mg，VB6 0.5mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O37.3mg，蔗糖68.5g，葡萄糖36g，谷氨酰胺0.877g，水解酪蛋白0.5g，天冬氨酸0.266g，精氨酸0.228g，甘氨酸0.075g，去离子水加至1L，pH为5.2。
NB培养基：(NH4)2SO4 463mg，KNO3 2830mg，CaCl2·2H2O 166mg，MgSO4·7H2O 185mg，KH2PO4400mg，KI 0.8mg，H3BO3 1.6mg，MnSO4·4H2O 4.4mg，ZnSO4·7H2O 1.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 1mg，VB6 0.5mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，蔗糖30g，植物胶2.5g，2，4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。
NBC培养基：(NH4)2SO4 463mg，KNO3 2830mg，CaCl2·2H2O 166mg，MgSO4·7H2O185mg，KH2PO4400mg，KI 0.8mg，H3BO3 1.6mg，MnSO4·4H2O 4.4mg，ZnSO4·7H2O1.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 1mg，VB6 0.5mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，蔗糖30g，葡萄糖10g，植物胶2.5g，2，4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.2。倒平板之前加入乙酰丁香酮(AS)并使其浓度为100μM。
NBCS1培养基：NH4NO3 640mg，KNO3 1212mg，CaCl2·2H2O 588mg，MgSO4·7H2O247mg，KH2PO4136mg，KI 0.83mg，H3BO3 3.1mg，MnSO4·4H2O 11.2mg，ZnSO4·7H2O 5.76mg，Na2MoO4·2H2O 0.24mg，CuSO4·5H2O 0.03mg，CoCl2·6H2O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB1 8.5mg，VB6 1mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，甘露醇36.43g，蔗糖20g，植物胶2.5g，2，4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为100mg/l。
NBCS2培养基：NH4NO3 640mg，KNO3 1212mg，CaCl2·2H2O 588mg，MgSO4·7H2O247mg，KH2PO4136mg，KI 0.83mg，H3BO3 3.1mg，MnSO4·4H2O 11.2mg，ZnSO4·7H2O 5.76mg，Na2MoO4·2H2O 0.24mg，CuSO4·5H2O 0.03mg，CoCl2·6H2O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB1 8.5mg，VB6 1mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，甘露醇36.43g，蔗糖20g，植物胶2.5g，2，4-D2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为200mg/l。
NBA分化培养基：NH4NO3 640mg，KNO3 1212mg，CaCl2·2H2O 588mg，MgSO4·7H2O 247mg，KH2PO4136mg，KI 0.83mg，H3BO3 3.1mg，MnSO4·4H2O 11.2mg，ZnSO4·7H2O 5.76mg，Na2MoO4·2H2O 0.24mg，CuSO4·5H2O 0.03mg，CoCl2·6H2O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB1 8.5mg，VB6 1mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，麦芽糖20g，脱落酸(ABA)5mg，植物胶3g，2，4-D2mg，6-BA2mg，萘乙酸(NAA)1mg，水解酪蛋白0.3g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为200mg/l。
1/2MS培养基：NH4NO3 825mg，KNO3 950mg，CaCl2·2H2O 220mg，MgSO4·7H2O 185mg，KH2PO485mg，KI 0.83mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.03mg，CoCl2·6H2O 0.03mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O37.3mg，蔗糖30g，多效唑(MET)6mg，植物胶2g，萘乙酸(NAA)1mg，水解酪蛋白0.3g，去离子水加至1L，pH为5.8。
实施例1、OsRAD1蛋白及其编码基因的获得
一、水稻突变体OsRAD1的获得及其表型分析和遗传分析
以广陆矮4号为出发植株，经过Co60辐射诱导，获得一个不育突变体，命名为水稻突变体OsRAD1。
水稻突变体OsRAD1与广陆矮4号在营养生长及开花时间等方面均无明显差异。抽穗后，水稻突变体OsRAD1表现出不育表型且最终不结实。对花粉进行I2-KI染色分析，广陆矮4号植株的成熟花药为黄色，经I2-KI染色花粉可变为蓝色(图1A)，而水稻突变体OsRAD1的成熟花药表现为白色，花粉用I2-KI染色不会变蓝，而呈现干瘪无规则的黄褐色，呈现典型不育花粉特征(图1B)。
对分离出不育突变体的株系中的可育株与不育株的数目进行统计，发现在95株的株系群体中，正常表型株为72株，不育株为23株，卡方检验显示其分离比符合3∶1的分离比(X2＝0.03；P＞0.05)，说明突变体的不育表型是由隐性单基因控制的。
二、OsRAD1基因的图位克隆
选取分离株系中的7株正常植株(包含AA和Aa)与日本晴杂交，对F2群体中28株不育隐性个体进行突变基因的初步定位。利用STS标记，将该基因初步定位于6号染色体短臂位置，与分子标记M1连锁。为对突变基因进行精细定位，从F2和F3群体中又获得了327株突变植株，最终将该基因定位在P1和P2这两个STS分子标记之间的280Kb范围内。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS(Rice Genome AutomatedAnnotation System)进行分析，此范围内存在一个编码细胞周期检验点蛋白的基因。对突变体和野生型中该基因序列进行扩增并测序，结果发现突变体在该基因预测的ORF区存在一个核苷酸C的缺失，导致该蛋白的翻译移码和提前终止。
三、OsRAD1蛋白及其编码基因的获得
提取日本晴的总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，分别进行ORF扩增、5’RACE和3’RACE，拼接后得到全长序列。全长序列编码序列表的序列1所示的蛋白质。
将序列表的序列1所示的蛋白质命名为OsRAD1蛋白，由304个氨基酸残基组成。将编码OsRAD1蛋白的基因命名为OsRAD1基因，OsRAD1基因包含7个外显子和6个内含子，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第76-990位核苷酸所示。
实施例2、OsRAD1基因表达分析
待测样本为：日本晴的根、叶、幼穗(5cm)、幼苗、叶鞘。
1、提取待测样本的总RNA，反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，进行Real-time PCR反应，采用引物qRT-F和引物qRT-R检测OsRAD1基因的表达水平，采用引物Actin-F和引物Actin-R检测内参基因(Actin基因)的表达水平。
qRT-F：5’-CAGGTTCCAGCATTCAGATTC-3’；
qRT-R：5’-TGTTTCATGGTCACATTGGAATG-3’；
Actin-F：5’-CTGACAGGATGAGCAAGGAG-3’；
Actin-R：5’-GGCAATCCACATCTGCTGGA-3’。
Real-time PCR采用SYBR Green I(Invitrogen)嵌合荧光法进行，PCR反应用Bio-Rad CFX96-real-time RCR仪完成，得到的结果用Bio-Rad CFX Manager软件分析。扩增反应所用酶为Hot Start Taq聚合酶(TAKARA)。
检测结果如图2所示。结果表明，OsRAD1基因在水稻各个组织中均有表达，幼穗中表达量最高。
实施例3、突变体OsRAD1细胞学表型分析
待测样本为：日本晴减数分裂时期的幼穗、水稻不育突变体OsRAD1减数分裂时期的幼穗。
依次进行如下步骤：
1、取待测样本，用卡诺氏固定液(无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1；体积比)固定24h。
2、用解剖针将花药拨出至载玻片上，加少许醋酸洋红，用解剖针迅速将花药敲碎，使花粉母细胞游离出来，盖上盖玻片。
3、取载玻片，在盖玻片一侧加适量45％醋酸水溶液，在另一侧放置一张大小合适的滤纸条，反复重复此步骤，直到将载玻片上的醋酸洋红清除干净，然后将载玻片放入液氮中浸泡20sec，迅速取出，用刀片揭去盖玻片。
4、取载玻片，依次放入70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液和100％乙醇中浸泡各5min，进行梯度脱水，干燥后滴加4’，6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)，然后用荧光显微镜观察染色体表型。
结果如图3和图4所示。图3为日本晴花粉母细胞的观察结果图，图4为水稻突变体OsRAD1花粉母细胞的观察结果图。图3中，日本晴的花粉母细胞细线期时染色体呈相互缠绕的细线状。偶线期时，同源染色体开始配对和联会。在粗线期时，同源染色体完全配对并完成联会复合体的组装，染色体呈现粗线状结构(图3A)。终变期时，染色体高度浓缩，同源染色体间通过交叉结连接在一起，并且可以清晰的看到12个呈环状或者棒状的二价体(图3B)。在中期I，12个二价体整齐排列于赤道板上(图3C)。后期I时，同源染色体均等分离，在纺锤丝的牵引下移动至细胞两极(图3D)。中期II时，两个子细胞的染色体分别排布于各自的赤道板上(图3E)，姊妹染色单体在后期II均等分离，最终产生染色体数目减半大小均匀的四分体(图3F)。图4中，水稻突变体OsRAD1的花粉母细胞细线期到粗线期时染色体行为无明显异常。粗线期时，同源染色体能完成联会，形成粗现状结构，但可以观察到非同源染色体间的粘连(图4A)。在终变期，非同源染色体间的粘连更加明显，已经难以分辨出12个独立的二价体(图4B)。中期I时，二价体与多价体共同排列于赤道板上(图4C)。后期I(图4D)，染色体分离，同时产生大量染色体碎片。在减数第二次分裂过程中，同样存在染色体的碎片(图4E)，最终形成染色体数目不均等的四分体，且能观察到微核(图4F)。这种染色体的行为缺陷造成随后形成的小孢子内染色体组的紊乱，导致花粉败育。
实施例4、OsRAD1基因功能分析
一、构建RNAi载体及重组农杆菌
1、选取日本晴的6cm幼穗，提取总RNA，并反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用OsRAD1-RNAi-F和OsRAD1-RNAi-R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
OsRAD1-RNAi-F：5’-GTCGACGAGTGGCCAGGTTCCAGCAT-3’；
OsRAD1-RNAi-R：5’-GGATCCCTACGCATCATTTATCTCAT-3’。
OsRAD1-RNAi-F和OsRAD1-RNAi-R中，下划线分别标注SalI和BamHI酶切位点。
3、用限制性内切酶SalI和BamHI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶XholI和Bg1II双酶切pUCRNAi载体，回收约2880bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。
6、用限制性内切酶SalI和BamHI双酶切步骤5的重组质粒，然后将载体骨架与步骤3得到的酶切产物连接，得到重组质粒。
7、用限制性内切酶PstI酶切步骤6的重组质粒，回收酶切产物。
8、用限制性内切酶PstI酶切pCAMBIA2300-Actin载体，回收10379bp的载体骨架，将载体骨架去磷酸化。
9、将步骤7的酶切产物和步骤8去磷酸化的载体骨架进行连接，得到得到OsRAD1-RNAi干扰载体。根据测序结果，对OsRAD1-RNAi干扰载体进行结构描述如下：在pCAMBIA2300-Actin载体的PstI位点间插入了序列表的序列3所示的双链DNA分子。OsRAD1-RNAi干扰载体可在植物细胞中转录产生带发夹结构的dsRNA，引发RNAi，从而抑制目的基因OsRAD1基因的表达。
序列3所示的双链DNA分子包括一个正向序列及其反向互补系列，正向序列如序列3自5′末端第15-416位核苷酸所示，反向互补序列如序列3自5′末端第630-1031位核苷酸所示。在正向序列和反向序列之间，为来自pUCRNAi载体的GA20内含子核苷酸序列。
二、农杆菌介导的水稻基因转化
1、取步骤一得到的OsRAD1-RNAi干扰载体，导入根癌农杆菌EHA105，得到重组菌EHA105/OsRAD1-RNAi。
2、将步骤1得到的重组菌EHA105/OsRAD1-RNAi的单菌落接种于3mL含50mg/L卡那霉素和10mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃、150rpm振荡培养直至OD600nm为0.6-0.8，用含有200μM乙酰丁香酮的AAM液体培养基重悬菌体，将OD600nm值调为0.8-1.0，得到菌悬液。
3、选取饱满的盐稻8号成熟种子，小心去除颖壳(避免胚受到损伤)。用70％酒精浸泡消毒2min后，使用0.1％HgCl2水溶液浸泡12min，无菌水冲洗5次，每次5min。
4、将经过步骤3处理后的种子在NB培养基中26℃避光培养14天以诱导愈伤组织。
5、将步骤4挑选的愈伤组织浸泡于步骤2制备的菌悬液中，侵染20min，侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后转入NBC培养基，26℃避光培养3天。
6、将步骤5培养的愈伤组织转入NBCS1培养基，26℃避光培养14天。
7、将步骤6培养的愈伤组织转入NBCS2培养基，26℃避光培养14天。
8、将步骤7生长状态较好的愈伤组织转入NBA分化培养基，26℃光照培养20天。
9、将步骤8分化出的幼苗转入1/2MS培养基，26℃光照培养至生根。
10、完成步骤9后，取出幼苗，洗净培养基，将幼苗用清水浸泡，26℃光照培养2天，然后移入大田，常规栽培管理。
11、采用pCAMBIA2300-Actin载体替代OsRAD1-RNAi干扰载体按照步骤1-10进行操作。
三、转基因植株的PCR鉴定
1、取步骤二的10获得的植株，提取具有G418抗性的植株的基因组DNA，用pCAMBIA2300-Actin的特异引物23-F和23-R进行PCR鉴定。
23-F：5’-CCTTATCTGGGAACTACTCA-3’；
23-R：5’-ATCTCCTGTCATCTCACCTT-3’。
可以扩出约600bp大小条带的植株为转基因植株，命名为OsRAD1-RNAi干扰植株。
2、取步骤二的11获得的植株，提取具有G418抗性的植株的DNA，用pCAMBIA2300-Actin的特异引物23-F和23-R进行PCR鉴定。
23A-F：5’-CCTTATCTGGGAACTACTCA-3’；
23A-R：5’-ATCTCCTGTCATCTCACCTT-3’。
可以扩出约600bp大小条带的植株为转空载体植株。
四、转基因植株性状分析
待测样本为：10株野生型植株(盐稻8号)、12株转空载体植株、17株OsRAD1-RNAi干扰植株、10株突变体OsRAD1植株。
1、观察植株表型，在营养生殖阶段，OsRAD1-RNAi干扰植株、突变体OsRAD1植株、转空载体植株和野生型植株的生长状况无明显差异。在抽穗后，17株OsRAD1-RNAi干扰植株均表现为育性降低，其中有13株表现出完全败育，突变体OsRAD1植株表现出完全败育，而转空载体植株和野生型植株结实正常。
2、进一步观察待测样本花粉母细胞减数分裂细胞学表型，方法如下：
(1)取待测样本，用卡诺氏固定液(无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1；体积比)固定24h。
(2)用解剖针将花药拨出至载玻片上，加少许醋酸洋红，用解剖针迅速将花药敲碎，使花粉母细胞游离出来，盖上盖玻片。
(3)取载玻片，在盖玻片一侧加适量45％醋酸水溶液，在另一侧放置一张大小合适的滤纸条，反复重复此步骤，直到将载玻片上的醋酸洋红清除干净，然后将载玻片放入液氮中浸泡20sec，迅速取出，用刀片揭去盖玻片。
(4)取载玻片，依次放入70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液和100％乙醇中浸泡各5min，进行梯度脱水，干燥后滴加4’，6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)，然后用荧光显微镜观察染色体表型。
结果如图5所示。图5为OsRAD1-RNAi干扰植株花粉母细胞染色体表型。结果表明，OsRAD1-RNAi干扰植株花粉母细胞中期I出现非同源染色体的粘连，后期I出现染色体桥和碎片，最终导致遗传物质的不均等分离，造成败育。突变体OsRAD1植株和OsRAD1-RNAi干扰植株花粉母细胞染色体表型一致。转空载体植株和野生型植株染色体表型正常。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花粉育性相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：
(1)编码区如序列表中序列2自5′末端第76至990位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码与植物花粉育性相关蛋白的DNA分子；
(4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物花粉育性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述基因，在调控植物雄性育性中的应用。
6.一种特异DNA分子或所述特异DNA分子转录得到的RNA分子或所述特异DNA分子编码的siRNA；所述特异DNA分子包括如下元件：区段A、区段B和区段C；所述区段C位于区段A和区段B之间；所述区段A与所述区段B反向互补；所述区段A如序列表中序列3自5′末端第15-416位核苷酸所示。
7.一种培育雄性不育植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求2或3所述基因的表达，得到雄性不育植物。
8.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求2或3所述基因的表达，得到花粉母细胞的染色体不能均等分离的转基因植物。
9.一种培育雄性不育植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到雄性不育植物。
10.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述基因，或，权利要求6所述特异DNA分子或RNA分子或siRNA，或，权利要求7-9中任一所述方法，在植物育种中的应用。
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