CN109837298A - 一种甜荞麦抗逆遗传转化体系及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种甜荞麦抗逆遗传转化体系的构建方法，其包括：a.构建包含抗旱调控基因DREB2A的植物表达载体；b.诱导荞麦愈伤组织，对荞麦进行预处理，将其在种子萌发培养基中进行培养成无菌苗，分别将所述无菌苗的子叶和胚轴剪成小块，接种于愈伤组织诱导培养基中诱导培养；c.所述植物表达载体与所述荞麦愈伤组织在共培养基中培养后，经过筛选培养，得到转化的荞麦愈伤组织。本发明实施例的构建甜荞麦抗逆遗传转化体系的方法，其将利用农杆菌介导的方法已成功将抗旱调控基因DREB2A转入拟南芥等模式植物中，极大提高了作物对干旱的耐受性。

Description

一种甜荞麦抗逆遗传转化体系及其构建方法

技术领域

本发明实施例涉及生物工程技术领域，具体涉及一种甜荞麦抗逆遗传转化体系及其构建方法。

背景技术

荞麦是蓼科、荞麦属的双子叶禾谷类作物，主要有甜荞和苦荞两种类型。甜荞主要在东北、华北、西北等地种植，苦荞在西南等地种植。荞麦具有良好的广适性，其生育期错过春小麦等主要农作物，且生育周期短、生产成本低、栽培技术简单、茬口搭配主要农作物灵活等特点。荞麦营养十分丰富，对人类诸多疾病的预防和治疗具有明显的效果。

干旱和半干旱是植物常遇到的自然逆境。在干旱胁迫下，植物体内渗透压会进行调节以维持植物体内水分，避免或减轻因失水对细胞造成的损害。干旱应答元件结合蛋白(DREB)转录因子，可以特异地与DRE顺式作用元件结合，在非生物逆境胁迫如低温、干旱中激活胁迫诱导基因的表达，使作物可以耐受水分胁迫的影响。DREB2A转录因子最先由Liu等利用rd29A基因启动子的顺式作用元件从干旱处理的拟南芥cDNA文库中克隆，它可在干旱及高盐条件下调控一系列相关抗逆功能基因的表达，从整体上提高植物的抗逆性状。在干旱失水的条件下，利用抗旱调控基因DREB2A改良植物的抗旱性状是一种耗资少，覆盖面广的理想手段。

Kim发展了一个高效的通过使用农杆菌15834感染荞麦茎段外植体的荞麦转化方法，转染4周后，有90％的培养在无激素水平的外植体表现出卡那霉素的抗性，通过对20株有卡那霉素抗性的发状根进行NTPII基因的PCR分析，发现有17株转染成功。同时检测到高水平的GUS转录和酶活性，GUS组织化学定位也确认了转化成功。辽西地区近年来旱情愈加严重，荞麦作为生育周期短的抗灾补救作物，愈加受到重视。为了提高荞麦在干旱胁迫下的产量及品质，除了引水灌溉外，选育耐旱性强的荞麦品种更加经济和现实。目前荞麦的抗逆基因转化报道很少，其中还普遍存在筛选难度较大，转化效率较低等问题。

但是，传统的荞麦转化的技术方案中，其转化过程并未形成一个系统并且稳定的转化体系，对于荞麦品种的选择具有一定的局限性，没有针对甜荞的一套完整并经过验证的农杆菌介导高效转化体系，亟待研发一种新的稳定、高效的荞麦抗逆遗传转化体系。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种甜荞麦抗逆遗传转化体系及其构建方法，以解决现有技术中缺乏新的稳定、高效的荞麦抗逆遗传转化体系和构建方法的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种甜荞麦抗逆遗传转化体系的构建方法，其包括：

a.构建抗旱调控基因DREB2A的植物表达载体，将该植物表达载体导入农杆菌，获得农杆菌植物工程菌；

b.诱导荞麦愈伤组织，对荞麦进行预处理，将其在种子萌发培养基中进行培养成无菌苗，分别将所述无菌苗的子叶和胚轴剪成小块，接种于愈伤组织诱导培养基中诱导培养；

c.所述农杆菌植物工程菌与所述荞麦苗愈伤组织在共培养基中培养，筛选培养基筛选培养，得到荞麦苗抗性愈伤组织；

d.将所述荞麦苗抗性愈伤组织在分化培养基中分化培养，获得荞麦再生苗，所述荞麦再生苗在生根培养基移栽生根，获得抗逆遗传转基因荞麦苗植株。

优选的，所述植物表达载体的构建过程为：

提取干旱处理过的拟南芥RNA，经RT-PCR扩增到目的基因DREB2A，将该基因克隆至载体pCAMBIA3300上获得pCAMBIA3300-DREB2A表达载体，将所述pCAMBIA3300-DREB2A表达载体导入农杆菌LBA4404，获得含有植物表达载体的农杆菌植物工程菌LBA4404-pCAMBIA3300-DREB2A。

优选的，所述抗旱调控基因DREB2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述植物表达载体与所述荞麦愈伤组织在共培养基共培养的过程中，所述农杆菌植物工程菌菌体浓度为OD₆₀₀＝0.5；

所述农杆菌植物工程菌转化到所述荞麦愈伤组织过程的侵染时间为3min。

优选的，所述愈伤组织诱导培养基中，植物激素2,4-D的浓度为2mg/L；

植物激素6-BA的浓度为1mg/L。

优选的，所述农杆菌植物工程菌与所述愈伤组织共培养的时间为3天。

优选的，所述共培养基中AS的浓度为100mg/L。

优选的，所述筛选培养基中，Cb的浓度为50mg/L；PPT的浓度为100mg/L。

本发明实施例具有如下优点：

本发明实施例的构建甜荞麦抗逆遗传转化体系的方法，其将利用农杆菌介导的方法已成功将抗旱调控基因DREB2A转入拟南芥等模式植物中，极大提高了作物对干旱的耐受性；本发明实施例所提供的甜荞遗传转化方法，将各个条件进行优化，尤其是针对培养基的成分中的植物激素，Cb、PPT浓度等优化，其操作简单易行，重复性好，转化效率高，其可达到60％-75％，从转化起始至分化成苗、生根可以在50天内完成，为甜荞抗逆分子育种提供了新的途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例提供的植物表达载体pCAMBIA3300-DREB2A的结构图谱；

图2为本发明实施例提供的农杆菌植物工程均转化荞麦的过程，其中，a为荞麦种子脱皮预培养；b为荞麦组培苗；c为子叶愈伤组织的诱导；d为子叶愈伤组织继代；e为愈伤组织的分化；f为分化苗的移栽生根；

图3A为本发明实施例提供的辽荞5号基因荞麦苗的bar基因PCR鉴定的电泳图，其中，M为DL 2000Marker；1为阳性对照；2为阴性对照；3为H₂0模板；4～10为辽荞5号转基因荞麦苗；

图3B为本发明实施例提供的辽荞5号转基因荞麦苗的DREB2A基因PCR鉴定鉴定的电泳图；其中，M为DL 2000Marker；1为阳性对照；2为阴性对照；3为H₂0模板；4～10为辽荞5号转基因荞麦苗；

图4为本发明实施例提供的表示干旱胁迫下荞麦叶片相对含水量(RWC)的变化柱状图；

图5为本发明实施例提供的表示干旱胁迫下荞麦叶片丙二醛(MDA)的变化的柱状图；

图6为本发明实施例提供的表示干旱胁迫下荞麦叶片相对电导率的变化的柱状图；

图7为本发明实施例提供的表示干旱胁迫下转基因荞麦与野生型荞麦表型对比照片图，其中，A为转基因荞麦苗，B为野生型荞麦苗。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例建立起抗旱调控基因DREB2A转化辽荞麦5号的抗逆转化体系，并对体系进行优化。

实施例

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1荞麦材料

辽荞5号，耐瘠薄、高产、优质、抗病。由辽宁省农业科学院作物研究所提供。

1.1.2植物表达载体的构建

目的基因DREB2A的序列如SEQ ID NO.1所示。

在上、下游引物分别引入BglⅡ和SpeI酶切位点,上游引物(SEQ ID NO.2):5′-aacaagatct tatatggcag tttatgatca g-3′,

下游引物(SEQ ID NO.3):

5′-acaaactagt tccagatcca agtaactcaa g-3′。

从干旱处理拟南芥叶片中克隆获得并构建到载体pCAMBIA3300上，以干旱处理拟南芥叶片总RNA为模板,利用RT-PCR合成DREB2A基因的cDNA序列。PCR反应条件为:第1条cDNA链的合成,48℃45min,94℃2min；第2条cDNA链的合成与PCR扩增,94℃30s、52℃30s、72℃30s,30个循环；72℃10min。PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳分析并回收PCR产物，对阳性克隆进行测序，得到正确克隆。

以pCAMBIA3300质粒为载体构建植物表达载体，该质粒有bar标记基因，35S启动子。将DREB2A基因两端加上BamH I和Sac I酶切位点，连接到用BamH I和Sac I双切的pCAMBIA3300载体上，即获得植物表达载体pCAMBIA3300-DREB2A。如图1所示。通过冻融法将该载体导入农杆菌LBA4404，制备农杆菌植物工程菌LBA4404-pCAMBIA3300-DREB2A。

1.1.3试验用基础培养基配方

如表1所示，转基因荞麦苗制备过程中所用到的基础培养基

表1

注：上述培养基pH值均在5.8-6.0之间。固体培养基凝固剂均采用4g/L植物凝胶。

本发明实施例中，CH：水解酪蛋白；YE：酵母提取物；2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸；6-BA：6-苄氨基腺嘌呤；AS:乙酰丁香酮；PPT：草丁膦；Cb：羧苄青霉素；NAA：萘乙酸；IBA：吲哚乙酸。

1.2试验方法

1.2.1荞麦愈伤组织诱导

无菌苗获取，将无菌苗子叶剪成0.5cm×0.5cm正方形，下胚轴切成0.5cm-1cm左右小段各100份，分别接种于含有不同激素组合的愈伤组织诱导培养基中。设计2,4-D、6-BA两种激素因素，10个处理。培养温度25℃，光照强度2500lx，每d光照12h，暗培养12h，诱导10-15d，三次重复，统计诱导频率最高的培养基作为最适诱导愈伤培养基，得到新鲜淡黄色愈伤组织备用。

1.2.2荞麦农杆菌植物工程菌转化

YEB平板挑取农杆菌植物工程菌LBA4404-pCAMBIA3300-DREB2A，接种到含100mg/L利福平及50mg/L卡那霉素的液体YEB培养基中，28℃，180rpm，培养过夜至OD₆₀₀至0.1-1.0，转化外植体。根据影响转化的若干要素，分别将100粒新鲜的愈伤组织为材料，设计正交试验L2556，以得到转基因荞麦转化苗的多少作为考察转化效率高低的标准。

1.2.3转基因荞麦苗植株的PCR检测

随机选取生根壮苗后生长状况良好的抗逆遗传转基因荞麦苗植株，采用CTAB法提取叶片DNA，根据bar基因设计引物：

SEQ ID NO:4：bar-F(5'-cgtgttagca gttggtgatg tagctc-3')；

SEQ ID NO:5：bar-R(5'-acttcaggtc gacggtcttt gggtg-3')。

根据DREB2A基因设计引物：

SEQ ID NO:6：DREB2A-F(5'-ccggtagcaa cttctacgga gacg-3')；

SEQ ID NO:7：DREB2A-R(5'-ttaggtaatg gtaggaaagg gagc-3')。

PCR反应条件为：95℃，3min；95℃，50s；60℃，50s；72℃，75s；共进行35个循环，最后72℃延伸9min。

PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像仪观察，出现目的条带的即为阳性转基因荞麦苗植株。

1.2.4干旱胁迫下转基因荞麦与野生型荞麦表型对比

用30％聚乙二醇6000(PEG-6000)模拟干旱环境在温室对抗逆遗传转基因荞麦苗植株及野生荞麦幼苗进行水分胁迫，干旱模拟试验的控水方法采用Hsiao.T C提出的水分梯度法，按照土壤含水量百分比共分4个干旱胁迫程度：对照(Ck)40％-45％；轻度干旱胁迫(LS)30％-35％；中度干旱胁迫(MS)20％-25％；(4)重度干旱胁迫(HS)10％-15％。设计6份转基因荞麦对照6份野生型荞麦，通过每天测定土壤含水量使样品保持各处理土壤水分区间范围内，观察抗逆遗传转基因荞麦苗植株和野生型的表型差异及生长状况，试验重复3次。

1.2.5荞麦生理指标测定

干旱处理后，叶片相对含水量采用饱和称重法；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸比色法；叶片相对电导率采用电导率法；脯氨酸含量采用茚三酮法。

1.3数据分析及处理

采用EXCEL 2007进行试验数据汇总，数据均设3次重复，实验所得结果用表示。采用SPSS Statistics 19进行方差及显著性分析。

2.结果与分析

2.1抗旱调控基因DREB2A的遗传转化

通过农杆菌介导的方法将抗旱调控基因DREB2A转化到辽荞5号中。如图2所示，荞麦经预培养、共培养、筛选、分化、生根等阶段，成功培育出转基因荞麦苗植株。

2.2农杆菌介导抗旱调控基因DREB2A转化辽荞5号体系

2.2.1不同外植体及激素配比对辽荞5号愈伤组织诱导的影响

如表2所示，不同激素浓度分别对辽荞5号子叶、下胚轴外植体诱导愈伤的影响

表2

注：受体愈伤组织诱导率＝(愈伤组织块数/接种外植体数)×100％

由表2可以看出，在2,4-D二氯苯氧乙酸浓度为2mg/L，无6-BA添加时，子叶及下胚轴的愈伤诱导率均低于60％。随着6-BA浓度的增加，子叶和下胚轴愈伤诱导率快速升高至100％。当6-BA浓度达到1mg/L时，子叶边缘卷曲，愈伤诱导速率和生长速度适中，愈伤组织呈黄绿色并且结构疏松，这类愈伤组织后期分化效率高，而下胚轴两端膨大并形成纺锤型，愈伤诱导较子叶更迅速，但愈伤过于紧密且呈现红褐色，这类愈伤组织后期分化效率较低。随着2,4-D浓度的提高，子叶和下胚轴形成愈伤组织诱导速率加快，接种一周后就生长出较明显的愈伤组织，但受体愈伤诱导率反而下降，愈伤组织过于紧实，并严重褐化，因此，植物激素2,4-D的最佳使用浓度为2mg/L。2.2.2辽荞5号农杆菌植物工程菌转化体系的优化

如表3所示，农杆菌植物工程菌介导转化辽荞5号正交试验。

表3

如表4所示，农杆菌植物工程菌转化体系各因素方差分析表。

表4

注：F0.05＝2.78,F0.01＝4.22。

如表5所示，农杆菌植物工程菌转化体系各因素各水平的差异显著性。

表5

农杆菌介导辽荞5号的转化效率受多种因素影响，通过SPSS软件正交试验F值比较直观得出，各试验因素对转化体系的影响均为极显著(F>F0.01)。故需要进行因素内多水平分析。

2.2.3农杆菌植物工程菌浓度各水平的差异显著性分析

由表5可以看出当OD₆₀₀达到0.5时，得到转基因荞麦苗均值最高，与其它水平差异显著，随着OD值升高，转基因荞麦苗的均值数开始下降，这可能是由于农杆菌植物工程菌浓度过高，造成菌体生长过盛，筛选抗生素无法抑制其繁殖，造成大面积染菌的原因。

2.2.4侵染时间各水平的差异显著性分析

农杆菌植物工程菌侵染时间是影响转化过程的重要因素，由表5可知，侵染时间超过3min时，得到的转化苗差异不显著，这是由于农杆菌与愈伤组织接触过于充分，细胞内溶物被农杆菌过多侵染，转化后期难以抑制菌体生长，造成转化失败，因此，3min的侵染时间足以保证农杆菌植物工程菌的顺利导入。

2.2.5共培养时间各水平的差异显著性分析

由表5可知，共培养时间较短的情况下，得到的抗性苗均值较低，菌体与愈伤组织转化时间较短，造成转化率较低，当共培养超过3d以后，转化效率明显提升，共培养3d、5d、10d转化结果差异不显著，为了节省转化时间，提高转化效率，选择3d作为共培养时间。

2.2.6AS浓度各水平的差异显著性分析

AS是一种酚类化合物，它可以诱发农杆菌内Ti或Ri质粒DNA上Vir区域基因的活化和高效表达，被广泛的应用在农杆菌介导的遗传转化体系中。由表5可知，AS浓度处于较低水平下，实验结果差异不显著，当AS浓度达到100mg/L时，此时转化效果最佳，与其他水平差异极显著。实验表明AS的浓度太高会影响转化效率，愈伤组织褐化现象较重，这可能是由于过高浓度的AS对愈伤组织产生了毒性。

2.2.7Cb浓度各水平的差异显著性分析

由表5可知，筛选培养基Cb浓度各水平梯度之间并无明显差异，当Cb浓度为50mg/L时，试验结果均值最高。当Cb浓度过低时，筛选作用不明显，会造成过多假阳性植株；当Cb浓度过高，其对愈伤组织的抑制作用使其失去了继续分化成苗的能力，并严重褐化。

2.2.8草丁膦浓度各水平的差异显著性分析

草丁膦通过有效抑制植物谷酰胺合成酶的活性，使铵在植物细胞内大量累积，造成植株死亡。含抗性bar基因的植株能编码膦丝菌素乙酰转移酶，使草丁膦的氨基乙酰化，解除植物的毒性。基因转化中，作为筛选抗生素应用广泛。由表5可知，草丁膦浓度达到100mg/L时，试验结果均值最高，与其他浓度梯度差异显著。草丁膦浓度过低，对愈伤组织的筛选效果不佳，造成假阳性植株过多。

经过比较分析得出，最佳转化体系为农杆菌OD₆₀₀为0.5，侵染时间为3min，共培养时间为3d，乙酰丁香酮浓度为100mg/L，筛选培养羧苄酶素浓度为50mg/L，草丁膦浓度为100mg/L。

2.3DREB2A转基因辽荞5号的PCR鉴定

通过2对特异性引物对经过最优转化体系得到的拟转基因辽荞5号进行PCR鉴定，如图3所示，目的条带与预测条带大小一致，本发明实施例将DREB2A基因已成功导入辽荞5号。

2.4干旱胁迫对荞麦叶片相对含水量的影响

由图4可知，在干旱胁迫前，转基因荞麦(N1、N2、N3)和对照非转基因荞麦(CK)叶片的相对含水量差异不明显(P＞0.05)，随着干旱胁迫的进行，转基因荞麦苗植株和非转基因荞麦苗植株，叶片含水率均呈下降趋势，其中非转基因荞麦下降幅度更大，干旱胁迫5d和10d，转基因荞麦叶片相对含水量与非转基因对照相比差异极显著(P＜0.01)，在第11d复水后，转基因荞麦苗叶片相对含水量有所提高，植物干旱胁迫得到一定缓解，而对照植株则枯死。

2.5干旱胁迫对荞麦叶片丙二醛(MDA)含量的影响

由图5可知，转基因荞麦(N1、N2、N3)和非转基因荞麦(CK)在干旱胁迫前(0d)，叶片的丙二醛(MDA)含量维持在一个较低水平，相互间差异不显著(P＞0.05)。随着干旱胁迫的进行，转基因和非转基因荞麦叶片丙二醛含量均显著提高，而MDA量过多会导致细胞质膜的过氧化，破坏其通透性，紊乱细胞代谢功能，加剧植株的凋亡。在干旱10d时，荞麦转基因苗MDA含量与对照差异显著(P<0.05)，复水后转基因荞麦比对照组叶片MDA含量下降明显。

2.6干旱胁迫对荞麦叶片相对电导率的影响

由图6可知，转基因荞麦(N1、N2、N3)和非转基因荞麦(CK)在干旱胁迫前(0d)，叶片的相对电导率相互间差异不显著(P＞0.05)，经过干旱处理后，对照组的叶片相对电导率比转基因植株提升明显，差异极显著(P<0.01)，复水后，对照组叶片相对电导率仍旧保持一个较高水平，而转基因荞麦叶片相对电导率下降明显，互相之间差异极显著(P<0.01)。转基因荞麦在干旱胁迫下，其电解质外渗相对较少，生物膜的受伤害程度明显较少，说明转基因株系已经具备一定的抵御干旱胁迫的能力。

以非转基因辽荞5号为对照，对同一生长期的转DREB2A基因苗进行盆栽干旱胁迫处理，观察二者其表型差异。干旱胁迫开始时二者之间表型无明显差别，4d后对照组叶片皱缩，茎秆发黄，而转DREB2A基因植株仍表现为正常生长。中度干旱胁迫(6d)时，此时，对照植株茎秆失水，植株茎秆弯曲，萎蔫；转基因植株叶片仍保持绿色。继续干旱处理第8d时，对照苗叶片失水卷曲严重，茎秆由粉红色转为锈黄色，转基因部分植株叶片开始失水叶片出现边缘卷曲。当达到HS重度干旱胁迫时，对照植株完全匍匐在盆中，死亡。DREB2A转基因苗叶片变黄，有少量枯叶出现但植株整体长势良好，表现出了较好的抗旱性，如图7所示。

3结果与分析

作物的抗逆性状是多个基因协同作用的结果，提高作物的耐旱性状可以选择导入与耐旱相关的转录因子。DREB转录因子属于逆境适应中关键性调节因子，能和抗逆基因启动子区域的DRE顺式作用元件特异性地结合，具有保守的AP2结构域，在干早、低温、高盐等环境下调控下游逆境应答基因的表达。本发明实施例选取基因DREB2A，并将其成功导入荞麦中，有望选育出抗旱性较强的育种新材料。本发明实施例从辽荞5号这一广适优质品种出发，建立并优化了转化体系，提高了植株其抗旱能力，为更多优质荞麦品种分子改良，提高抗旱、抗病等抗逆性状提供了参考和借鉴。

本发明实施例甜荞麦抗逆遗传转化体系中选取影响转化的核心因素，包括外植体类型、诱导愈伤激素浓度、农杆菌浓度、农杆菌侵染时间、共培养时间、筛选抗生素浓度等等。试验因素较多，各因素水平较多，需要进行多次梯度试验，试验步骤极为繁琐，且各因素间的交互作用无法兼顾，试验结果缺少量化标准。本发明实施例借助正交试验，有效地减少了试验次数，利用差异显著性分析了各因素间及因素内各水平间的相关性，优化了甜荞麦抗逆遗传转化体系。

本发明实施例发现针对辽荞5号这一品种，在MS培养基中添加2，4-D及6-BA，下胚轴和子叶都能有效诱导出胚性愈伤组织，但是子叶愈伤诱导率高于下胚轴，效果更好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 辽宁省农业科学院

<120> 一种甜荞麦抗逆遗传转化体系及其构建方法

<130> GG19469646A

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1908

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatattttg atttctgcta aagctgtctg ataaaaagaa gaggaaaact cgaaaaagct 60

acacacaaga agaagaagaa aagatacgag caagaagact aaacacgaaa gcgatttatc 120

aactcgaagg aagagacttt gattttcaaa tttcgtcccc tataggtacg ttgatttctg 180

atttcttaca aattttcaat taatttctct gattaggtct cgtcaattgg tgattctagg 240

gtttatcttc gtctttaggt tttcgattat ttccttttag gtatagctgt gaaattggga 300

aattttaggt gttcctaatt tgataacaaa taagtaaatc gatctgattt tgaaccaagt 360

ttaagttctc ttgccttatg tttcagcttg tgttctgata ttgaagtgtt gttgtattgt 420

agattgtgtt gtttctggga aggagatggc agtttatgat cagagtggag atagaaacag 480

aacacaaatt gatacatcga ggaaaaggaa atctagaagt agaggtgacg gtactactgt 540

ggctgagaga ttaaagagat ggaaagagta taacgagacc gtagaagaag tttctaccaa 600

gaagaggaaa gtacctgcga aagggtcgaa gaagggttgt atgaaaggta aaggaggacc 660

agagaatagc cgatgtagtt tcagaggagt taggcaaagg atttggggta aatgggttgc 720

tgagatcaga gagcctaatc gaggtagcag gctttggctt ggtactttcc ctactgctca 780

agaagctgct tctgcttatg atgaggctgc taaagctatg tatggtcctt tggctcgtct 840

taatttccct cggtctgatg cgtctgaggt tacgagtacc tcaagtcagt ctgaggtgtg 900

tactgttgag actcctggtt gtgttcatgt gaaaacagag gatccagatt gtgaatctaa 960

acccttctcc ggtggagtgg agccgatgta ttgtctggag aatggtgcgg aagagatgaa 1020

gagaggtgtt aaagcggata agcattggct gagcgagttt gaacataact attggagtga 1080

tattctgaaa gagaaagaga aacagaagga gcaagggatt gtagaaacct gtcagcaaca 1140

acagcaggat tcgctatctg ttgcagacta tggttggccc aatgatgtgg atcagagtca 1200

cttggattct tcagacatgt ttgatgtcga tgagcttcta cgtgacctaa atggcgacga 1260

tgtgtttgca ggcttaaatc aggaccggta cccggggaac agtgttgcca acggttcata 1320

caggcccgag agtcaacaaa gtggttttga tccgctacaa agcctcaact acggaatacc 1380

tccgtttcag ctcgagggaa aggatggtaa tggattcttc gacgacttga gttacttgga 1440

tctggagaac taaacaaaac aatatgaagc tttttggatt tgatatttgc cttaatccca 1500

caacgactgt tgattctcta tccgagtttt agtgatatag agaactacag aacacgtttt 1560

ttcttgttat aaaggtgaac tgtatatatc gaaacagtga tatgacaata gagaagacaa 1620

ctatagtttg ttagtctgct tctcttaagt tgttctttag atatgtttta tgttttgtaa 1680

caacaggaat gaataataca cacttgtgaa gctttatggg ccttagtgtg tctcacaata 1740

tttgaaatcg taagaggaaa aactatacga tctccacaaa aaaactcatc attggattga 1800

gtcttaggaa gttctctagg gattagaggg cagctttatt taacattaag cagctcgaca 1860

tcaaagacca gccaagagtc agggggaatg ctaccagcac cttccgca 1908

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacaagatct tatatggcag tttatgatca g 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acaaactagt tccagatcca agtaactcaa g 31

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtgttagca gttggtgatg tagctc 26

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acttcaggtc gacggtcttt gggtg 25

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccggtagcaa cttctacgga gacg 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttaggtaatg gtaggaaagg gagc 24

Claims (8)

1.一种甜荞麦抗逆遗传转化体系的构建方法，其特征在于包括：

a.构建抗旱调控基因DREB2A的植物表达载体，将该植物表达载体导入农杆菌，获得农杆菌植物工程菌；

b.诱导荞麦愈伤组织，对荞麦进行预处理，将其在种子萌发培养基中进行培养成无菌苗，分别将所述无菌苗的子叶和胚轴剪成小块，接种于愈伤组织诱导培养基中诱导培养；

c.所述农杆菌植物工程菌与所述荞麦苗愈伤组织在共培养基中培养，筛选培养基筛选培养，得到荞麦苗抗性愈伤组织；

d.将所述荞麦苗抗性愈伤组织在分化培养基中分化培养，获得荞麦再生苗，所述荞麦再生苗在生根培养基移栽生根，获得抗逆遗传转基因荞麦苗植株。

2.如权利要求1所述的甜荞麦抗逆遗传转化体系的构建方法，其特征在于，

所述植物表达载体的构建过程为：

提取干旱处理过的拟南芥RNA，经RT-PCR扩增到目的基因DREB2A，将该基因克隆至载体pCAMBIA3300上获得pCAMBIA3300-DREB2A表达载体，将所述pCAMBIA3300-DREB2A表达载体导入农杆菌LBA4404，获得含有植物表达载体的农杆菌植物工程菌LBA4404-pCAMBIA3300-DREB2A。

3.如权利要求2所述的甜荞麦抗逆遗传转化体系的构建方法，其特征在于，

所述抗旱调控基因DREB2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.如权利要求1所述的甜荞麦抗逆遗传转化体系的构建方法，其特征在于，

所述植物表达载体与所述荞麦愈伤组织在共培养基共培养的过程中，所述农杆菌植物工程菌菌体浓度为OD₆₀₀＝0.5；

所述农杆菌植物工程菌转化到所述荞麦愈伤组织过程的侵染时间为3min。

5.如权利要求1所述的甜荞麦抗逆遗传转化体系的构建方法，其特征在于，

所述愈伤组织诱导培养基中，植物激素2,4-D的浓度为2mg/L；

植物激素6-BA的浓度为1mg/L。

6.如权利要求1所述的甜荞麦抗逆遗传转化体系的构建方法，其特征在于，

所述农杆菌植物工程菌与所述愈伤组织共培养的时间为3天。

7.如权利要求5所述的甜荞麦抗逆遗传转化体系的构建方法，其特征在于，

所述共培养基中AS的浓度为100mg/L。

8.如权利要求6所述的甜荞麦抗逆遗传转化体系的构建方法，其特征在于，

所述筛选培养基中，Cb的浓度为50mg/L；PPT的浓度为100mg/L。