CN1950503A

CN1950503A - 用修饰的dreb2a基因调节植物中的环境胁迫耐受

Info

Publication number: CN1950503A
Application number: CNA2004800256953A
Authority: CN
Inventors: 筱崎和子; 佐久间洋
Original assignee: INTERNATIONAL FARM FOREST AND AQUASTIC PRODUCTS RESEARCH CENTER
Current assignee: INTERNATIONAL FARM FOREST AND AQUASTIC PRODUCTS RESEARCH CENTER
Priority date: 2004-07-07
Filing date: 2004-07-07
Publication date: 2007-04-18
Anticipated expiration: 2024-07-07
Also published as: WO2006006236A1; JP4706050B2; CN1950503B; BRPI0414161A; JP2008505603A

Abstract

本发明涉及修饰的转录因子基因DREB2A及其用于调节植物中的环境胁迫耐受的用途。

Description

用修饰的DREB2A基因调节植物中的环境胁迫耐受

发明背景

1.发明领域

2.现有技术

在自然界，植物在各种环境胁迫如脱水、高温、低温或盐的条件下生存。与动物不同，植物不能通过运动保护它们自身免受胁迫。因此，植物在它们的进化过程中获得了多种胁迫耐受机制。例如，低温耐受植物(拟南芥、菠菜、莴苣、豌豆、大麦、甜菜等)与低温敏感植物(玉米、稻、南瓜、黄瓜、香蕉、番茄等)相比，在其生物膜脂质中具有更低的不饱和脂肪酸含量。因此，即使将前面几种植物暴露于低温，在它们的生物膜脂质中也不容易发生相转变，因此，不容易发生低温损伤。

迄今为止，已经选择并杂交了脱水、低温或盐耐受品系，以尝试人工产生环境胁迫耐受植物。但是，所述选择需要长时间，并且杂交方法只能在有限的物种之间进行。因此，很难产生具有高度环境胁迫耐受的植物。

随着最近生物技术的进展，进行了试验以通过采用将特异性异源基因导入植物中的转基因技术而生产脱水、低温或盐耐受植物。这些用于生产环境胁迫耐受植物的基因包括渗透压保护物质(甘露醇、脯氨酸、甘氨酸甜菜碱等)的合成酶基因和细胞膜脂质的修饰酶基因。具体地，作为甘露醇合成酶基因，使用了大肠杆菌来源的甘露醇1-磷酸脱氢酶基因[Science 259：508-510(1993)]。作为脯氨酸合成酶基因，使用了菜豆来源的Δ¹-脯氨酸-5-羧酸合成酶基因[Plant Physiol.108：1387-1394(1995)]。作为甘氨酸甜菜碱合成酶基因，使用了细菌来源的胆碱脱氢酶基因[Plant J.12：1334-1342(1997)]。作为细胞膜脂质修饰酶基因，使用了拟南芥来源的ω-3脂肪去饱和酶基因[PlantPhysiol.105：601-605(1994)]和蓝绿藻来源的Δ9去饱和酶基因[NatureBiotech.14：1003-1006(1996)。但是，得到的导入了这些基因的植物在胁迫耐受方面是不稳定的，或者耐受水平低；目前还没有将它们用于实际的用途。

此外，报道了多种基因参与植物中脱水、低温或盐耐受的获得[Plant Physiol.，115：327-334(1997)]。因此，已经将能够同时激活参与获得胁迫耐受的多个基因表达的转录因子的编码基因导入植物中，产生了具有高度胁迫耐受的植物。但是，当诱导多个基因表达的基因被导入宿主植物时，同时激活了基因。因此，宿主植物的能量导向于这些基因产物的生产和所述基因产物的细胞内代谢，这通常导致宿主植物的生长延缓或者使植物矮小。

本发明人分离了基因DREB1A，DREB1B，DREB1C，DREB2A和DREB2B，它们编码结合于胁迫反应元件并且特异性激活位于来自拟南芥的元件下游的基因的转录的转录因子(Lie Q.et al.，The PlantCell，Vol.10，1391-1406，August 1998，JP10-228457)。他们报道了所述基因在植物中的导入和超量表达可以赋予胁迫耐受而不导致植物的生长延缓(Lie Q.et al.，The Plant Cell，Vol.10，1391-1406，August1998，JP10-292348)。

发明目的和概述

本发明的一个目的是提供对环境胁迫(如脱水、低温和盐)的耐受改进并且不变矮的转基因植物。

为了解决上述问题，本发明人用多种修饰的DREB2A基因转化了植物。因此，本发明人成功生产了具有显著改进的环境胁迫耐受并且不变矮的植物。

本发明提供了以下(1)-(26)。

(1)转基因植物，包含编码缺失了136-165位氨基酸的SEQ IDNO:4所示氨基酸序列组成的蛋白的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

(2)上述(1)的转基因植物，其中所述蛋白能够结合于所述胁迫反应启动子。

(3)上述(1)的转基因植物，其中缺失了136-165位氨基酸的SEQ ID NO：4所示氨基酸序列组成的蛋白与全长DREB2A蛋白相比，使报道基因的反式激活活性至少增加3倍。

(4)分离的核酸分子，其编码缺失了136-165位氨基酸的SEQ IDNO：4所示DREB2A蛋白。

(5)转基因植物，包含含有上述(4)的分离的核酸分子的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

(6)分离的蛋白，具有缺失了136-165位氨基酸的SEQ ID NO：4所示序列。

(7)转基因植物，包含编码SEQ ID NO：4的254-335位的氨基酸序列组成的蛋白的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

(8)上述(7)的转基因植物，进一步包含编码DNA结合域和核定位信号的DNA。

(9)上述(7)的转基因植物，其中所述蛋白能够结合于所述胁迫反应启动子。

(10)转基因植物，包含编码SEQ ID NO：4的254-335位的氨基酸序列组成的蛋白的DNA。

(11)上述(10)的转基因植物，其中与不存在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列组成的蛋白相比，所述蛋白使报道基因的反式激活活性提高了大约5-大约9倍。

(12)转基因植物，包含编码选自SEQ ID NO：4的254-317、136-335、318-335、166、335和282-335位的氨基酸序列组成的蛋白，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

(13)上述(12)的转基因植物，进一步包含编码DNA结合域和核定位信号的DNA。

(14)分离的核酸分子，编码DREB2A蛋白的翻译激活域，所述翻译激活域包含SEQ ID NO：4的254-335位的氨基酸序列。

(15)转基因植物，包含含有上述(14)的分离的核酸分子的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

(16)分离的蛋白，具有DREB2A蛋白活性，并且具有SEQ IDNO：4的254-335位的氨基酸序列。

(17)转基因植物，包含编码缺失了136-165位氨基酸的SEQ IDNO：4所示氨基酸序列的片段组成的蛋白的DNA，其中所述片段包含254-335位的氨基酸序列和DNA结合域以及核定位信号，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

(18)转基因植物，包含含有缺失了572-661位核苷酸的SEQ IDNO：3所示核苷酸序列的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

(19)上述(18)的转基因植物，其中所述DNA编码的蛋白能够结合于所述胁迫反应启动子。

(20)上述(18)的转基因植物，其中所述DNA编码能够结合于所述胁迫反应启动子的蛋白。

(21)缺失了572-661位核苷酸的区域的SEQ ID NO：3所示的分离的核酸分子。

(22)转基因植物，包含含有上述(21)的分离的核酸分子的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

(23)转基因植物，包含含有SEQ ID NO：3的926-1171位所示核苷酸序列的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

(24)上述(23)的转基因植物，其中所述DNA编码的蛋白能够结合于所述胁迫反应启动子。

(25)分离的核酸分子，包含SEQ ID NO：3的926-1171位所示核苷酸序列。

(26)转基因植物，包含含有上述(25)的分离的核酸分子的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

附图简述

图1显示用拟南芥T87细胞制备的原生质体分析DREB2A蛋白的C末端区的结构域分析结果。

(A)用于共转染实验中的报道物和效应物构建体的示意图。

(B)DREB1A、DREB2A或DREB2A的C末端区缺失突变体对rd29A启动子-GUS融合基因的反式激活。

图2显示融合于GAL4结合域的DREB2A C末端区进行转录激活的结果。

(A)报道物和效应物构建体的示意图。

(B)由GAL4DNA结合域和GAL4激活区或DREB2A C末端区的融合蛋白对GAL4结合位点-GUS融合基因的反式激活，如氨基酸残基数目所示。

图3显示在转基因植物中超量表达DREB2A的组成型活性形式的效果。

(A)显示生长延缓的携带DREB2A构建体的35S-组成型活性形式的30日龄幼苗(DREB2A CA-a，b和c)，携带35S-全长DREB2A构建体(DREB2A FL)和pBI121的那些(wt)。

(B)在5周龄DREB2A相关转基因植物之间的生长延缓比较。

(C)携带pBI 121的植物(wt)和携带DREB2A的35S：组成型活性形式(DREB2A-a)的精密观察。

(D)转基因植物中的DREB2A和d29A基因的RNA凝胶印迹分析。

图4显示照片，其显示携带pBI 121的植物(wt)、DREB2A的35S：组成型活性形式(35S：DREB2A CA)和35S：DREB1A构建体的植物中DREB靶基因的表达。

图5显示携带DREB2A的35S：组成型活性形式和35S：DREB1A构建体的植物的冷冻和干燥耐受。

(A)胁迫处理之前和之后的照片

(B)暴露于冷冻和干燥胁迫的植物的存活率

(C)种植在单个罐中时脱水10天之前和之后植物的照片。

发明详述

下文将详细描述本发明。

本发明的转基因植物耐受环境胁迫，它们是通过导入一种基因而生产的转基因植物，所述基因中编码结合于脱水反应元件(DRE)并且激活位于DRE下游的基因的转录的DNA(称作″DREB基因″)连接在胁迫反应启动子的下游。

可以按照下文所述克隆本发明的DREB基因。在所述DREB基因中，DRE结合蛋白1A基因被称作DREB1A基因；DRE结合蛋白1B基因被称作DREB1B基因；DRE结合蛋白1C基因被称作DREB1C基因；DRE结合蛋白2A基因被称作DREB2A基因；DRE结合蛋白2B基因被称作DREB2B基因。

1.DREB基因的克隆

1-1.从拟南芥制备mRNA和cDNA文库

作为mRNA来源，可以使用拟南芥的植株的一部分，如叶、茎、根或花，或使用完整的植株。或者，可以使用通过将拟南芥种子播种在固体培养基，如GM培养基、MS培养基或#3培养基并且无菌生长得到的幼苗而获得的植株。当暴露于低温胁迫(如10--4℃)时，拟南芥植物中DREB1A基因的mRNA水平增加。另一方面，当植物暴露于盐胁迫(如150-250mM NaCl)或脱水胁迫(如脱水状态)时，DREB2A基因的mRNA水平增加。因此，也可以使用暴露于所述胁迫的拟南芥植物。

例如，将在GM培养基上生长的拟南芥植物暴露于前面提到的脱水胁迫、低温胁迫或盐胁迫，然后用液氮对其冷冻，以制备mRNA。随后，可以使用常规的mRNA制备技术。例如，将冷冻的植物在臼中磨碎。从得到的磨碎的物质，通过乙二醛方法、硫氰酸胍-氯化铯方法、氯化锂-脲方法、蛋白酶K-脱氧核糖核苷酸方法等提取粗RNA级分。可以通过使用寡dT-纤维素或Sepharose 2B上携带的聚U-Sepharose的亲和柱方法或通过分批方法获得聚(A)⁺RNA(mRNA)。得到的mRNA可以通过蔗糖梯度离心等方法进一步分级分离。

使用由此得到的mRNA作为模板合成单链cDNA；该合成是使用商购试剂盒(如ZAP-cDNA合成试剂盒：Stratagene)、寡(dT)20和逆转录酶进行的。然后，从得到的单链cDNA合成双链cDNA。将合适的连接物，如EcoRI-NotI-BamHI连接物加入得到的双链cDNA，然后将双链cDNA连接在含有转录激活域的质粒(如pAD-GAL4质粒：Stratagene)中的转录激活域(如GAL4激活域)的下游，从而制备cDNA文库。

1-2.用于克隆DREB Gene基因的宿主

例如，可以通过采用酵母的杂交筛选方法克隆DREB基因。可以用商购试剂盒(如Matchmaker One杂交系统：Clontech)，通过该方法进行筛选。

在采用上述试剂盒进行的DREB基因克隆中，首先，必须将包含DRE序列的DNA片段连接到试剂盒中包含的质粒pHISi-1和pLacZi，所述DRE序列结合了DREB基因编码的蛋白(即DREB蛋白)。然后，将得到的质粒转化到试剂盒中所包含的酵母(啤酒糖酵母YM4271)，以制备用于克隆的宿主。

可以通过HIS3最小启动子渗漏表达的HIS3蛋白的作用生物合成用于克隆的宿主酵母。因此，通常，该酵母可以在不存在组氨酸的条件下生长。但是，由于用于表达编码HIS3蛋白的基因的启动子是仅仅能够维持最小转录水平的最小启动子，在细胞中产生的HIS3蛋白的量非常少。因此，当在作为抗HIS3蛋白的竞争性抑制剂的3-AT(3-氨基三唑)存在下培养宿主酵母时，3-AT以浓度依赖性方式抑制细胞中HIS3蛋白的功能。当3-AT的浓度超过特定水平时，细胞中的HIS3蛋白不能起作用，因此宿主酵母变得不能够在不存在组氨酸的条件下生长。类似地，LacZ基因也位于CYC1最小启动子的下游。因此，酵母细胞中产生的β-半乳糖苷酶的量非常少。因此，当宿主酵母铺板于含Xgal的平板上时，在其上出现的菌落不具有使菌落整体变成蓝色的Xgal降解能力。但是，当在宿主酵母中表达结合于位于HIS3和lacZ基因下游并且激活其转录的DRE序列的转录因子时，酵母变得能够在足量3-AT存在下存活，同时，Xgal被降解，使菌落变成蓝色。

如此处使用的，术语“脱水反应元件(DRE)”表示由位于在暴露于脱水胁迫、低温胁迫等时表达的基因上游的9bp保守序列5′-TACCGACAT-3′组成的顺式作用DNA结构域。

可以通过聚合物链反应(PCR)扩增rd29A的启动子区(基于基因翻译起始位点的-215--145)而获得包含DRE的DNA片段，rd29基因是脱水耐受基因之一[Kazuko Yamaguchi-Shinozaki and KazuoShinozaki，The Plant Cell 6：51-264(1994)]。作为可以用于此PCR的模板DNA，给出了拟南芥的基因组DNA。

1-3.克隆DREB1A基因和DREB2A基因

可以通过醋酸锂方法等将上文1-1小节中获得的cDNA文库转化到上文1-2小节中获得的宿主，将得到的转化体铺板到含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷)和3-AT(3-氨基三唑)的LB培养基板等，培养转化体，选择在平板上出现的蓝色菌落，以及从其分离质粒，从而获得DREB1A基因和DREB2A基因。

简言之，含有DREB1A基因或DREB2A基因的阳性克隆中含有由编码GAL4激活域(GAL4AD)的DNA区和编码DRE结合蛋白的DNA区组成的融合基因，并且在醇脱氢酶启动子的控制下表达融合蛋白(杂交蛋白)，所述融合蛋白由DRE结合蛋白和GAL4激活域组成。此后，表达的融合蛋白通过DRE结合蛋白部分与位于报道基因上游的DRE结合。然后，GAL4激活域激活lacZ基因和HIS3基因的转录。因此，阳性克隆产生显著量的HIS3蛋白和β-半乳糖苷酶。这样，由于产生的HIS3蛋白的激活，即使在3-AT的存在下，阳性克隆也可以生物合成组氨酸。因此，克隆变得能够在3-AT存在下存活，同时，培养基中的Xgal被产生的β-半乳糖苷酶降解，使菌落变成蓝色。

随后，所述蓝色菌落进行单细胞分离，并且培养分离的细胞。然后，从培养的细胞纯化质粒DNA，从而获得DREB1A基因或DREB2A基因。

1-4.DREB1A蛋白或DREB2A蛋白的同源物

生物体可以具有多种具有相似核苷酸序列的基因，所述基因被认为是从单个基因进化而来。由所述基因编码的蛋白被互称为同源物。可以使用核苷酸序列已知的基因的一部分作为探针，从相关基因文库克隆所述同源物。在本发明中，可以用上文1-3小节获得的DREB1AcDNA或DREB2A cDNA作为探针，从拟南芥cDNA文库克隆编码DREB1A或DREB2A蛋白的同源物的基因。

1-5.核苷酸序列的确定

使用限制酶从上述1-3或1-4小节获得的质粒切下cDNA部分，并且连接到合适的质粒，如pSK(Stratagene)，用于亚克隆。然后，确定完整的核苷酸序列。可以通过常规方法，如Maxam-Gilbert化学修饰方法或采用M13噬菌体进行的双脱氧核苷酸链终止方法进行测序。通常，用自动化DNA测序仪(如Perkin-Elmer 373A型DNA测序仪)进行测序。

SEQ ID NO：1表示DREB1A基因的核苷酸序列，SEQ ID NO：2表示由该基因编码的蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO：3表示DREB2A基因的核苷酸序列，SEQ ID NO：4表示由该基因编码的蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO：5表示DREB1B基因的核苷酸序列，SEQ ID NO：6表示由该基因编码的蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO：7表示DREB1C基因的核苷酸序列，SEQ ID NO：8表示由该基因编码的蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO：9表示DREB2B基因的核苷酸序列，SEQ ID NO：10表示由该基因编码的蛋白的氨基酸序列。只要由上述氨基酸序列之一组成的蛋白具有结合DRE从而激活位于DRE下游的基因的转录的功能，所述氨基酸序列可以具有至少一个氨基酸的突变(如缺失、取代或添加)。编码具有所述突变氨基酸序列的蛋白的突变基因也可以用于本发明。

例如，可以缺失SEQ ID NO：2，4，6，8或10所示氨基酸序列中的至少1个氨基酸，优选1-大约20个氨基酸，更优选1-5个氨基酸；可以给SEQ ID NO：2，4，8或10所示氨基酸序列添加至少1个氨基酸，优选1-大约20个氨基酸，更优选1-5个氨基酸；或SEQ ID NO：2，4，8或10所示氨基酸序列中至少1个氨基酸，优选1-大约160个氨基酸，更优选1-40个氨基酸可以被其它氨基酸取代。只要蛋白具有结合DRE从而激活位于DRE下游的基因的转录的功能，编码具有所述突变氨基酸序列的蛋白的基因可以用于本发明。

同样，只要由DNA编码的蛋白具有结合DRE从而激活位于DRE下游的基因的转录的功能，能够在严格条件下与上述基因杂交的DNA可以用于本发明中。“严格条件”表示，例如其中甲酰胺浓度为30-50％，优选50％，并且温度为37-50℃，优选42℃的条件。

可以通过公知技术，如Kunkel的方法、有空位的双链体方法或其变化形式，用导入突变的试剂盒[如Mutant-K(Takara)或Mutant-G(Takara)]或用LA PCR体外诱变系列试剂盒(Takara)制备突变的基因。

一旦DREB基因的核苷酸序列被明确确定，可以通过化学合成，或使用基因的cDNA或基因组DNA作为模板通过PCR，或通过用上述核苷酸序列作为探针与DNA片段杂交而获得所述基因。

在1998年8月11日，分别将含有DREB1A基因和DREB2A基因的重组载体导入大肠杆菌K-12菌株并且保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba City，Ibaraki，Japan)，保藏号为FERM BP-6654(含有DREB1A基因的大肠杆菌)和FERM BP-6655(含有DREB2A基因的大肠杆菌)。

2.由DREB基因编码的蛋白的DRE结合能力和转录激活能力的确定

2-1.由DREB基因编码的蛋白的DRE结合能力的分析

通过用上述蛋白和GST组成的融合蛋白进行凝胶位移测定[Urao，T.et al.，The Plant Cell 5：1529-1539(1993)]，可以证实DREB基因编码的蛋白(此后称作“DREB蛋白”)结合DRE的能力。可以按如下方法制备DREB1A蛋白和GST组成的融合蛋白。首先，将DREB1A基因连接在含有GST基因的质粒(如pGEX-4T-1载体：Pharmacia)的GST编码区下游，以便两种基因的读框彼此符合。将得到的质粒转化到大肠杆菌中，在诱导融合蛋白合成的条件下培养所述大肠杆菌。例如，通过超声处理破坏大肠杆菌细胞。通过离心从破坏的材料除去细胞碎片。然后，采用载体，如谷胱甘肽-Sepharose，通过亲和层析纯化上清夜，从而获得融合蛋白。

凝胶位移测定是一种检验DNA和蛋白之间的相互作用的方法。简言之，将用32P等标记的含DRE的DNA片段与上文描述的融合蛋白混合，并且温育。对得到的混合物进行电泳。干燥后，对凝胶进行放射自显影以检测由于DNA片段和蛋白的结合而向后迁移的那些带。在本发明中，可以证实DREB1A或DREB2A蛋白与DRE序列的特异性结合，所述结合是通过明确在使用含有变化的DRE序列的DNA片段时检测不到上述向后迁移的带而证实的。

2-2.由DREB基因编码的蛋白的转录激活能力的分析

用来自拟南芥的原生质体系统，通过反式激活实验可以分析DREB基因编码的蛋白的转录激活能力。例如，将DREB1A cDNA连接于含有CaMV35S启动子的pBI221质粒(Clontech)以构建效应质粒。另一方面，将含有在上文1-2小节获得的含DRE的71个碱基的DNA区的3个盒串连连接，以制备DNA片段，所述DNA片段然后连接在位于pBI221质粒中β-葡糖苷酶(GUS)基因上游的TATA启动子的上游，以构建报道质粒。随后，将这两个质粒导入拟南芥的原生质体，然后确定GUS活性。如果通过DREB1A蛋白的同时表达增加了GUS活性，理解为在原生质体中表达的DREB1A蛋白通过DRE序列激活GUS基因的转录。

在本发明中，可以通过Abel等的方法[Abel，S.et al.，Plant J.5：421-427(1994)]进行原生质体的制备和将质粒DNA导入原生质体。为了使通过实验导入质粒DNA的效力差异导致的实验误差最小，可以将荧光素酶基因连接在CaMV35S启动子下游的质粒与上文描述的两种质粒一起导入原生质体，并且可以确定针对荧光素酶活性的β-半乳糖苷酶活性。这样，确定的值可以作为表明转录激活能力的值。可以通过Jefferson等的方法[Jefferson，R.A.et al.，EMBO J.83：8447-8451(1986)]确定β-半乳糖苷酶活性；并且可以采用PicaGene荧光素酶测定试剂盒(Toyo Ink)确定荧光素酶活性。

3.生产转基因植物

可以通过使用重组技术将上文第1节获得的基因导入宿主植物而生产耐受环境胁迫，特别是低温胁迫(包括冷冻胁迫)的转基因植物。作为用于将基因导入宿主植物的方法，可以使用间接导入，如土壤杆菌感染法，或直接导入，如粒子枪法、聚乙二醇法、脂质体法、微量注射等。当使用土壤杆菌感染法时，可以通过以下程序生产转基因植物。

3-1.用于导入植物的重组载体的制备和土壤杆菌的转化

可以通过以下方法制备用于导入植物的重组载体：用合适的限制酶消化上文第1节获得的含有DREB1A，DREB1B，DREB1C，DREB2A或DREB2B基因的DNA，如果需要，将合适的接头连接于得到的DNA，并且将DNA插入用于植物细胞的克隆载体。作为克隆载体，可以使用二元载体型质粒，如pBI2113Not，pBI2113，pBI101，pBI121，pGA482，pGAH，pBIG；或中间载体型质粒，如pLGV23Neo，pNCAT，pMON200。

当使用二元载体型质粒时，将感兴趣的基因插入二元载体的边界序列(LB，RB)之间。得到的重组载体在大肠杆菌中复制。通过冻-融、电穿孔等方法将扩增的重组载体导入根癌土壤杆菌C58，LBA4404，EHA101，C58C1Rif^R，EHA105等。得到的根癌土壤杆菌用于转导感兴趣的植物。

除了上述方法，也可以使用三员缀合方法[Nucleic AcidsResearch，12：8711(1984)]制备用于植物感染的含DREB基因的土壤杆菌。简言之，混合含有包含感兴趣基因的质粒的大肠杆菌、含有辅助质粒(如pRK2013)的大肠杆菌和土壤杆菌，并且在含有利福平和卡那霉素的培养基上培养。这样，可以获得用于植物感染的合子土壤杆菌。

由于DREB基因编码激活转录的蛋白，通过表达的DREB蛋白的作用激活导入了DREB基因的植物中的多种基因。这导致植物中能量消耗增加和代谢激活。因此，植物自身的生长会受抑制。作为阻止这种抑制作用的手段，考虑将胁迫反应启动子连接在DREB基因上游，这样只有在受到胁迫时DREB基因才表达。所述启动子的具体例子包括以下启动子：

rd29A基因启动子[Yamaguchi-Shinozaki，K.et al.，The Plant Cell6：251-264(1994)]

rd29B基因启动子[Yamaguchi-Shinozaki，K.et al.，The Plant Cell6：251-264(1994)]

rd17基因启动子[Iwasaki，T.et al.，Plant Physiol.，115：1287(1997)]

rd22基因启动子[Iwasaki，T.et al.，Mol.Gen.Genet.，247：391-398(1995)]

DREB1A基因启动子[Shinwari，Z.K.et al.，Biochem.Biophys.Res.Com.250：161-170(1988)]

cor6.6基因启动子[Wang，H.et al.，Plant Mol.Biol.28：619-634(1995)]

cor15a基因启动子[Baker，S.S.et al.，Plant Mol.Biol. 24：701-713(1994)]

erd1基因启动子[Nakashima K.et al.，Plant J.12：851-861(1997)]

kin1基因启动子[Wang，H.et al.，Plant Mol.Biol.28：605-617(1995)]

也可以使用其它启动子，只要已知它是胁迫反应性的并且在植物中起作用。可以采用基于包含启动子的DNA设计的引物，并且使用相关的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增这些引物。

如果必要，也可以连接终止子，该终止子强制DREB基因下游的转录终止。作为终止子，可以使用花椰菜花叶病毒衍生的终止子或胭脂碱合酶基因终止子。也可以使用其它终止子，只要已知它可以在植物中起作用。

如果必要，增强基因表达的内含子序列可以位于启动子序列和DREB基因之间。例如，可以导入来自玉米醇脱氢酶(Adh1)的内含子[Genes & Development 1：1183-1200(1987)]。

为了有效选择感兴趣的转化细胞，优选组合使用有效选择标记和DREB基因。作为选择标记，可以使用一种或多种选自卡那霉素抗性基因(NPTII)、赋予植物对抗生素潮霉素的抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(htp)、赋予对bialaphos的抗性的膦丝菌素乙酰转移酶基因(bar)等的基因。

可以将DREB基因和选择标记基因一起掺入单个载体。或者，可以将两种基因掺入分开的载体以制备两个重组DNA。

3-2.将DREB基因导入宿主植物

在本发明中，术语“宿主植物”表示以下任一种：培养的植物细胞、培养的植物的整个植株、植物器官(如叶、花瓣、茎、根、根状茎、种子)或植物组织(如表皮、韧皮部、实质、木质部、脉管束)。可以用作宿主的植物的特定实例包括拟南芥、烟草、稻和玉米。

可以通过土壤杆菌感染法、粒子枪法或聚乙二醇法将含DREB基因的载体导入植物切面，从而将DREB基因导入上述宿主植物。或者，可以通过电穿孔将含DREB基因的载体导入原生质体。

如果通过土壤杆菌感染法导入感兴趣的基因，用含有包含感兴趣基因的质粒的土壤杆菌感染宿主植物的步骤是必须的。可以通过真空浸润方法进行该步骤[CR Acad.Sci.Paris，Life Science，316：1194(1993)]。简言之，使拟南芥在由蛭石和珍珠岩(50∶50)组成的土壤中生长。得到的植物在含有包含DREB基因的质粒的土壤杆菌培养液中浸泡，置于干燥器中，然后用真空泵抽吸至65-70mmHg。然后，使植物在室温下静置5-10分钟。将植物盆转移到浅盘中，并且盖上套子以保持湿度。次日，除去套子。植物在该状态下生长直到收获种子。

随后，为了选择具有感兴趣基因的个体，在补充了合适抗生素的MS琼脂培养基上播种各个植物体的种子。将在该培养基上生长的拟南芥转移到盆中并在其中生长。结果，可以获得导入了DREB基因的转基因植物的种子。

通常，转基因位于宿主植物的基因组上。但是，由于基因组上位置的不同，转化体之间的转基因表达不同，产生了一种称作位置效应的现象。可以使用来自转基因的DNA片段作为探针，通过RNA印迹分析测定转化体中的mRNA水平，从而选择更高表达转基因的那些转化体。

可以通过常规方法从植物的细胞和组织提取DNA，并且通过本领域公知的PCR或DNA分析检测转基因，从而证实感兴趣的基因整合到本发明的转基因植物中并且整合到其后代中。

3-3.分析DREB基因在植物组织中的表达水平和表达位点

可以通过常规方法从植物的细胞和组织提取RNA，并且通过本领域公知的RT-PCR或RNA印迹分析检测DREB基因的mRNA，从而分析导入了DREB基因的转基因植物中所述基因的表达水平和表达位点。或者，可以采用抗DREB蛋白的抗体通过蛋白印迹等直接分析DREB蛋白。

3-4.导入了DREB基因的转基因植物中多种基因的mRNA水平的改变

可以通过RNA印迹分析鉴定基因，所述基因的表达水平被认为由于导入了DREB基因的转基因植物中DREB蛋白的作用而改变。RNA印迹可以通过比较导入了DREB基因的转基因植物和没有导入该基因的植物中DREB基因的mRNA水平而测定所述基因。

例如，在特定时间段(如1-2周)给予琼脂GM培养基等上生长的植物以脱水和/或低温胁迫。可以通过将植物从琼脂培养基上拔出并且在滤纸上干燥10分钟到2小时而给予脱水胁迫。可以通过将植物在15至-4℃下保持10分钟到24小时而给予低温胁迫。从不接受任何胁迫的对照植物和接受脱水和低温胁迫的植物制备总RNA。对得到的总RNA进行电泳。然后，通过RNA印迹分析或RT-PCR测定基因表达。

3-5.评估转基因植物对环境胁迫的耐受

可以通过以下步骤评估导入了DREB基因的转基因植物对环境胁迫的耐受：将植物栽于含土壤的盆中，所述土壤含蛭石、珍珠岩等，将植物暴露于各种胁迫，如脱水、低温和冷冻，并且检查植物的存活。例如，可以通过2-4小时不给植物供应水，然后检查存活而评估对脱水胁迫的耐受。可以通过以下步骤评估对冷冻胁迫的耐受：将植物置于-6至-10℃下5-10天，在20至25℃下生长5-10天，然后检查其存活比例。

4.DREB2A的修饰

作为干旱和高盐度胁迫诱导型转录因子，DREB2A的激活似乎需要某种类型的修饰，但是激活机制还没有阐明。作为DREB2A的结构域分析的结果，我们发现DREB2A的转录激活结构域存在于氨基酸残基254-335之间，氨基酸残基136-165之间的区域的缺失将DREB2A转变为组成型活性。超量表达组成型活性形式的DREB2A的转基因植物的微阵列分析表明，DREB2A调节许多水胁迫诱导型基因的表达。然而，一部分DREB2A靶基因不是识别相同顺式元件的DREB1A的靶。组成型活性形式的DREB2A的超量表达略微改进了转基因植物的冷冻耐受并且显著改进了干旱耐受。

本发明的优选实施方案

下文中将参考以下实施例更具体描述本发明。但是，本发明的技术范围不限于这些实施例。

实施例1

用组成型活性形式突变体对拟南芥DREB2A进行的功能分析

1.材料和方法

1)植物材料

植物(拟南芥哥伦比亚生态型)在发芽培养基琼脂板上生长3周。为进行RNA分析，对3周龄的植物进行胁迫处理，然后在液氮中冷冻，以提取RNA。为进行胁迫耐受实验，将3周龄的植物转移到土壤中并且生长1周。按照上文的描述进行胁迫处理。按以前的描述维持拟南芥T87悬浮液培养细胞(Axelos et al.，1992，Plant Physiol.Biochem.30，123-128)。

2)瞬时表达实验

按照以前的描述(Liu et al，1998 Plant Cell 10，1391-1406)构建关于DREB2A的C末端缺失突变体的瞬时反式激活实验中使用的效应质粒和报道质粒。按照上文所述构建编码与DREB2A的C末端区融合的GAL4DNA结合域的效应质粒和含有GAL4结合序列的报道质粒。使用表1所示的引物对(SEQ ID Nos：11-62)，通过PCR扩增用于构建效应质粒的插入片段。

按照以前的描述(Abel and Theologis，1994 Plant J.5，421-427)进行拟南芥T87细胞原生质体的分离和聚乙二醇介导的DNA转染。通过过滤收集5日龄拟南芥T87悬浮液培养细胞，并且用水清洗。在轻柔搅拌下，将5克T87细胞与酶溶液(0.4M甘露醇，5mM MES-KOH(pH 5.7)，8mM CaCl₂，1％[w/v]Cellulase ONOZUKA R10(Yakult)，0.5％[w/v]Macerozyme R10(Yakult))在室温下温育2小时。使细胞通过125μm尼龙网，通过在室温下450g离心5分钟而回收，在30ml的0.4mM甘露醇，70mM CaCl2和5mM MES-KOH(pH 5.7)中清洗两次。最后将原生质体重悬于MaMg溶液(0.4M甘露醇，15mMMgCl2，5mM MES-KOH(pH 5.7))，并且将浓度调节为3×10⁶细胞/ml。将分离的原生质体置于冰上备用。通过使用QINGEN质粒分离试剂盒(QIAGEN)并且以1μg/μL溶解于10mM Tris-HCl(pH 8.0)和1mM EDTA中而制备用于原生质体转化的质粒DNA。将100μL原生质体悬浮液与10μL效应质粒、10μL报道质粒和5μL 35S：荧光素酶内部对照质粒充分混合。然后立即将PEG-CMS溶液(0.4M甘露醇，0.1M Ca(NO3)2，和40％[w/v]聚乙二醇(PEG)3350(Sigma))加入该原生质体-质粒混合物并且充分混合。将原生质体至于冰上20分钟，然后用10mL 0.4M甘露醇，125mM CaCl2，5mM KCl，5mM葡萄糖和1.5mM MES-KOH(pH 5.7)稀释。通过室温下450g离心5分钟而收获稀释的原生质体。将转化的原生质体重悬于2.5mL培养基(0.4M甘露醇，1x Murashige和Skoog[1962]基本培养基)，并且在暗处在22℃下培养最多达24小时。

通过按照上文所述从葡糖苷酸前体制备的4-甲基伞形酮的荧光计定量而测定GUS活性。通过使用发光计(Wallac 1420 ARVOsx)，用PikkaGene荧光素酶测定试剂盒(Toyo-ink)测量反应的光发射而测定荧光素酶活性。

表1

用于效应质粒构建的引物对
用于效应质粒构建的引物对					构建体	正向引物1	反向引物1	正向引物2	反向引物2
DREB2A 1-317DREB2A 1-281DREB2A 1-253DREB2A 1-165DREB2A 1-135DREB2AΔ136-165^DREB2AΔ166-253^DREB2AΔ254-281^DREB2AΔ282-317^DREB2AΔ136-253^DREB2AΔ135-165，Δ318-335^GAL4-BD-DREB2A 254-281GAL4-BD-DREB2A 254-317GAL4-BD-DREB2A 254-335GAL4-BD-DREB2A 136-253GAL4-BD-DREB2A 136-335GAL4-BD-DREB2A 318-335GAL4-BD-DREB2A 166-253GAL4-BD-DREB2A 282-317GAL4-BD-DREB2A 282-335	SEQ ID NO.11SEQ ID NO.13SEQ ID NO.15SEQ ID NO.17SEQ ID NO.19SEQ ID NO.21SEQ ID NO.23SEQ ID NO.25SEQ ID NO.27SEQ ID NO.29SEQ ID NO.31SEQ ID NO.33SEQ ID NO.35SEQ ID NO.37SEQ ID NO.39SEQ ID NO.41SEQ ID NO.43SEQ ID NO.45SEQ ID NO.47SEQ ID NO.49	SEQ ID NO.12SEQ ID NO.14SEQ ID NO.16SEQ ID NO.18SEQ ID NO.20SEQ ID NO.22SEQ ID NO.24SEQ ID NO.26SEQ ID NO.28SEQ ID NO.30SEQ ID NO.32SEQ ID NO.34SEQ ID NO.36SEQ ID NO.38SEQ ID NO.40SEQ ID NO.42SEQ ID NO.44SEQ ID NO.46SEQ ID NO.48SEQ ID NO.50	SEQ ID NO.51SEQ ID NO.53SEQ ID NO.55SEQ ID NO.57SEQ ID NO.59SEQ ID NO.61	SEQ ID NO.52SEQ ID NO.54SEQ ID NO.56SEQ ID NO.58SEQ ID NO.60SEQ ID NO.62	构建体	正向引物1	反向引物1	正向引物2	反向引物2
					^*这些片段是通过两步PCR制备的。第一次PCR使用正向引物1和反向引物1的引物对或正向引物2和反向引物2的引物对，单独进行。第一次PCR中的扩增的引物用于第二次PCR作为模板，使用正向引物1和反向引物2。

3)植物转化

用缺乏氨基酸残基136-165区域的突变DREB2A片段构建用于转化拟南芥的质粒。用NotI从反式激活实验中使用的Δ136-165效应质粒消化该片段，并且插入pBluescript II SK-(Stratagene)的NotI位点。然后用EcoRV和SacI从质粒切除片段，并且以有义方向亚克隆到pBE2113Not载体(Liu et al.，1998)的SmaI-SacI位点。通过电转化，将构建的质粒导入土壤杆菌C58。按照上文所述进行植物转化。

4)微阵列分析

用TRIZOL试剂(Invitrogen)从具有pBI121或超量表达组成型活性形式的DREB2A的3周龄植物分离总RNA。用PolyATract mRNA分离系统III(Promega)制备mRNA。以前已经描述过荧光探针的制备、微阵列杂交和扫描(Seki et al.，2002，Plant J.31，279-292)。

5)RNA印迹分析

用TRIZOL试剂提取总RNA。按照上文所述进行RNA印迹分析。

2.结果

1)DREB2A的缺失突变体的转录激活活性

由于DREB2A的C末端区富含酸性氨基酸，预测DREB2A蛋白的翻译激活域存在于该区域中(Liu et al.，1998)。为了鉴定翻译激活域，我们详细进行了DREB2A的结构域分析。含有多个DREB2A的C末端区缺失突变体的效应构建体与DRE序列驱动的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报道构建体共转染到从拟南芥T87悬浮液培养细胞制备的原生质体中(图1)。全长DREB2A的超量表达导致报道基因的反式激活比空效应物物对照高5-9倍。从C末端到氨基酸残基(a.a.)254的缺失(DREB2A：1-253)使得DREB2A-突变体依赖性反式激活降低到与对照相同的水平。另一方面，缺少a.a.136和a.a.253之间的区域的内部缺失突变体表现出与全长DREB2A相同水平的报道基因激活。这些结果表明，在a.a.254和C末端之间存在翻译激活域。

令人感兴趣的是，a.a.136和165之间的区域的缺失显著增加其活性。DREB2AΔ136-165对报道基因的表达比基线水平高30倍，比全长DREB2A的情况高3倍。该诱导与DREB1A效应构建体等价。a.a.136和165之间的区域似乎在DREB2A活性的调节中具有负作用。其它区域的缺失不导致显著调节的反式激活活性。

2)从254到C末端的区域含有翻译激活的必要和足够的结构域，a.a.136到a.a.165之间的区域在DREB2A活性中具有负作用。

为了进一步进行DREB2A的结构域分析，我们制备了含有多种来自于与GAL4DNA结合域(GB)融合的DREB2A的片段(Ma et al，1988，Nature 334，631-633)的效应构建体。将效应质粒与含有9个拷贝的与CaMV35S最小启动子融合的GAL4-结合位点和GUS报道基因的报道质粒共转染到拟南芥T87细胞的原生质体中(图2)。在图1中的结果中，GB-DREB2A 136-253和缺乏DREB2A的从a.a.254到C末端的区域的GB-DREB2A 166-253的效应构建体不诱导报道基因的表达。含有从a.a.254到C末端的区域的效应构建体在所有效应构建体中诱导了报道基因的最高表达。该区域由3个亚区域组成。当独立地与GAL4结合域融合时，每个亚区域不刺激或仅仅微弱刺激报道基因的表达(图2B，GB-DREB2A 254-281，282-317和318-335)，并且，至少一个亚结构域的缺失与GB-DREB2A 254-335相比显著降低了GUS报道物的活性(图2B，GB-DREB2A 254-317和282-335)。即使GB-DREB2A 254-335的片段延伸至N末端，如GB-DREB2A 166-335或136-335，没有观察到报道物活性的进一步增加。尽管效应构建体GB-DREB2A 166-335诱导了与GB-DREB2A 254-335几乎相同水平的报道基因表达，包含区域a.a.136-165的GB-DREB2A 136-335的反式激活比GB-DREB2A 254-335的反式激活低大约6倍。这些结果表明，a.a.254到a.a.335之间的区域是DREB2A的必要和足够的激活域，a.a.136-165之间的区域负控制DREB2A蛋白的翻译激活能力。

3)组成型活性形式的DREB2A在拟南芥中的超量表达

为了分析DREB2A的功能，在拟南芥植物中超量表达在瞬时反式激活实验中表现出最高活性的DREB2A缺失突变体DREB2AΔ136-165(图1)。在CaMV35S启动子(Mitsuhara et al.，1996)的控制下超量表达编码组成型活性形式的DREB2A的基因。将烟草花叶病毒(TMV)Ω序列(Gallie et al.，1987)插入突变的DREB2A片段上游，以增加翻译水平。采用真空抽滤方法制备55个转基因拟南芥植物。通过RNA印迹分析转基因T2植物中转基因的表达水平，我们选择了分别表现强、中等和弱的转基因表达的三个DREB2A系，即CA-a，-b和-c用于进一步分析。证实了T2转化体的DREB2A靶基因的生长和表达。将DREB2A CA植物的生长模式与具有pBI121载体(wt)的对照植物和超量表达全长DREB2A cDNA的DREB2A FL植物进行比较。所有的DREB2A CA植物表现出生长延缓(图3A和B)。在强表达转基因的DREB2A CA-a植物中观察到了最严重的生长延迟，弱表达转基因的DREB2A CA-c的生长延缓水平是轻微的。相反，在超量表达全长DREB2A的DREB2A FL中没有观察到生长延缓。DREB2A CA具有圆形的微暗绿色叶，具有短叶柄。这些表型在DREB2A CA-a中出现的程度比在DREB2A-c中高(图3C)。环境胁迫反应基因rd29A在启动子区具有DRE基序，并且证明DREB2A蛋白可以与上文所述的该DRE序列结合。rd29A mRNA的积累水平随组成型活性形式的DREB2A的表达水平而增加。

4)超量表达组成型活性形式的DREB2A的转基因拟南芥植物的微阵列分析

为了理解哪些基因受DREB2A的控制，我们采用拟南芥全长cDNA微阵列比较了野生型植物和DREB2A CA植物之间大约7000个基因的mRNA的积累。分别使用从DREB2A CA和没有胁迫处理的对照植物分离的mRNA制备Cy3-标记的和Cy5-标记的cDNA探针。这些探针与cDNA微阵列杂交，分析所述大约7000个基因的表达图。重复实验3次，进一步分析在至少一个实验中信号强度超过2000的基因。我们选择了在DREB2A CA-a植物中的表达比野生型植物高5倍或更多的基因作为DREB2A靶基因的候选物(图2)。

表2

DREB2A CA-a植物中显著上调的转录物^a
DREB2A CA-a植物中显著上调的转录物^a							基因名称^b	代码^c	比例^d		DREg	ABREg	说明^h
DREB2A CA-a	DREB1A^e								比例^d
DREB2A CA-a	DREB1A^e	rd29AAtGolS3rd29BRAFL06-13-J20rd17cor15ARAFL02-04-G03AtMT-KRAFL05-13-A17RAFL05-16-B15RAFL06-16-L13RAFL05-17-B13RAFL04-10-D13RAFL05-21-K17kin1RAFL04-18-B07RAFL03-05-E08AlGRP7kin2	At5g52310At1g09350At5g52300At1g52690At1g20440At2g42540At4g33720At3g09390At1g32860At1g69870At5g54960At1g01470At2g23120At5g54170At5g15960At5g62350At3g53990At2g21660At5g15970	16.014.312.512.011.210.710.310.09.49.07.06.36.05.65.55.55.35.25.2	14.7^f10.6^f2.80.88.3^f13.1^f0.82.01.42.51.67.1^f5.0^f0.811.7^f4.6^f2.33.3^f3.3^f	-265至-260-215至-210-158至-153-121至-116-800至-805-376至-381-772至-777-162至157-37至-32-985至-98O-151至146-956至951-350至-345-173至-168-402至-407-172至-167-61至-56-605至-600-332至-327-288至-293-357至-362-404至-399-56至-51-369至-374-117至-112-109至-104-550至-545-3至-26-182至-177-968至-973-181至-186-77至-72-121至-116			-55至-50-265至-260-168至-163-63至-58-704至-709-77至-82-35至-30-220至-225-622至-620-617至-622-228至-223-190至-185-909至-904-330至-335-121至-116-113至-118-289至-294-60至-55-16至-11-195至-200-572至-577-92至-87-190至-185-934至-929-631至-636-132至-137-88至-93-65至-60-85至-90-346至-351-67至-62-132至-137-292至-297-54至-59-62至-57-71至-76-79至-74-145至-149-365至-370	晚期胚胎发生充足蛋白肌醇半孔糖苷合酶晚期胚胎发生充足蛋白晚期胚胎发生充足蛋白Dehydrin晚期胚胎发生充足蛋白致病相关蛋白1金属硫蛋白样蛋白未知蛋白失知蛋白丙酮酸脱羧酶晚期胚胎发生充足蛋白未知蛋白膜相关蛋白样晚期胚胎发生充足蛋白未知蛋白未知蛋白富含甘氨酸的RNA结合蛋白晚期胚胎发生充足蛋白

^a将来自DREB2A CA-a和pBI121植物的mRNA用于制备Cy3标记的和Cy5标记的cDNA探针。这些cDNA探针与cDNA微阵列混合并杂交。在该研究中，我们使用λDNA作为内部对照，因为其荧光水平在两种植物中几乎是相同的。

^b基因名称是全长cDNA克隆(Seki et al.，2002)。

^c用于该研究中的cDNA的AGI代码

^d35S：DREB2A CA植物的每个cDNA的荧光强度(FI)÷DREB2A CA植物的λDNA的FI

pBI121植物的每个cDNA的FI pBI121植物的λDNA的FI

^eMaruyama et al.，2003。

^fDREB1A靶基因，(Maruyama et al.，2003)。

^g列出了存在于分离的最长cDNA克隆的5’末端上游的l000个核苷酸中观察到的DRE序列(RCCGAC)或ABRE序列(ACGTGY)。数字表示分离的最长cDNA克隆的5’未端开始的核苷酸的编号。负号表示存在于推定的转录位点的5’未端上游的核苷酸。

^h说明是从MIPS数据库引用的。

19种基因在DREB2A CA-a植物中的表达比在野生型植物中增加5倍以上。在DREB2A CA-a，b和c中，这些基因的表达水平与组成型活性形式的DREB2A的mRNA积累相关(数据未示出)。这些基因中的许多是编码水胁迫相关蛋白如LEA蛋白的基因。为了证实这19种基因的启动子区是否包含DRE和ABA反应元件(ABRE)，我们研究了从ATG到上游1kb的启动子区。这19种基因中的17种具有DRE序列，15种基因具有ABRE基因，14种基因在它们的启动子区具有这两种顺式元件。这些事实表明，大多数DREB2A靶基因在水胁迫耐受中是重要的，因此这些基因受到DREB途径和ABA途径这两者的调节。另一方面，令人感兴趣的是，其中仅有10种基因被鉴定为DREB1A靶基因。

为了进一步分析由组成型活性形式的DREB2A的超量表达上调的基因，我们进行了RNA印迹分析。将从进行4℃下5小时或脱水5小时的胁迫处理或未进行该处理的野生型、DREB1A-b和DREB2A CAa-c植物分离的总RNA用于RNA印迹分析(图4)。与野生型植物相比，11种基因的mRNA积累在DREB1A-b和DREB2A CA植物中都有增加(图4B)。DREB1A-b是在CaMV35S启动子控制下超量表达DREB1A的转基因植物。DREB1A-b植物在DREB1A超量表达者中表现出中等的表型改变。尽管AtGolS3在启动子区具有DRE序列，已知该基因是冷诱导型而不是干旱诱导型。因此，预测该基因的启动子区含有在干旱条件下负调节基因表达的新的顺式元件(Taji et al.，2002，Plant J.29，417-426)。AtGolS3在DREB2A CA植物中的表达在对照和冷处理中较强，在干旱处理中较弱。这一事实强烈支持上文所述的假设，尽管DREB2A蛋白能够结合AtGolS3启动子区，但AtGolS3在生理学上可能不是DREB2A的靶基因。尽管At2g02100和At1g29395是DREB1A的靶基因，并且在它们的启动子区具有DRE，与野生型植物相比，在DREB2A CA植物中没有诱导这些基因的表达。但是，在野生型植物中，干旱诱导了At1g29395的表达。ABRE中的四种存在于At1g29395的启动子区，因此，ABA似乎参与干旱诱导的At1g29395表达。图4D中示出了关于特定基因的RNA印迹分析，这些基因的表达在DREB2A CA植物中被诱导，而在DREB1A-b植物中没有被诱导。具体地，rd29B，At1g52690，At3g09390，At1g69870和At1g2298表现出不同的干旱特异性基因表达。这提示通过DRE进行的这些基因表达的调节是受DREB2A，而不是受DREB1A调节。由于At5g54170的启动子区不含DRE序列，该基因的干旱特异性基因表达可能是DREB2A的间接作用。At1g22985编码含有ERF/AP2结构域的转录因子。如At1g22985的基因似乎控制在启动子区不含DRE的DREB2A靶基因，如At5g54170。At4g33720不表现胁迫诱导型基因表达。此外，该基因的启动子区不含DRE。因此，At4g33720表达的增加可能是组成型活性形式的DREB2A的强表达的间接和人工的效果。

5)超量表达组成型活性形式的DREB2A的转基因拟南芥植物的冷冻和干旱胁迫耐受

将DREB2A CA植物的冷冻和干旱胁迫耐受与DREB1A-b和野生型植物进行比较(图5)。植物在发芽培养基琼脂板上生长3周，然后转移到装有土壤的盆中，22℃下生长一周。为进行干旱胁迫处理，2周不给植物供应水。然后浇水，在对照条件下生长3天。该处理使所有的野生型植物枯萎，而大约60％的DREB1A-b植物经此处理后仍存活。对于DREB1A-b，62.8％-83.3％的DREB2A CA植物经此处理后仍存活。为进行冷冻胁迫处理，将植物暴露于-6℃的温度下30小时，然后返回22℃5天。该处理使所有的野生型植物枯萎，而大约40％的DREB1A-b植物经此处理后仍存活。与干旱胁迫耐受不同，仅仅5.0％-11.7％的DREB2A CA植物经冷冻处理后仍存活。在另一个实验中，将野生型植物和转基因植物(DREB1A-a，DREB2A CA-a，DREB2ACA-b和DREB2A CA-c)种植在单个盆中，在失水10天后比较它们的存活。野生型植物在缺水10天后枯萎，而转基因植物生长很好。这些结果表明，DREB2A的靶基因在获得对干旱胁迫的耐受方面起重要作用，但这些还不足以抗冷冻胁迫。

3.讨论

尽管CaMV35S启动子控制下的DREB1A超量表达导致转基因植物中的表型改变，超量表达DREB2A的全长cDNA的转基因植物与野生型植物表现出几乎相同的表型。因此，似乎翻译的DREB2A蛋白是无活性形式，DREB2A蛋白的激活需要某种类型的修饰。

在该研究中，发现DREB2A蛋白的翻译激活域存在于C末端a.a.254-335区中。该区和GAL4 DNA结合域的融合蛋白表现出报道基因的显著反式激活(图2，GD-DREB2A 254-335)。这些结果表明，该区不经过任何修饰就具有转录激活能力，并且存在另一个负控制DREB2A蛋白活性的区域。实际上，a.a.136-165区的缺失显著增加了DREB2A活性。该事实表明，该区域在DREB2A蛋白活性的调节中起负作用。a.a.254-335和a.a.136-165区分别由SEQ ID NO：3的572-661位和926-1171位编码。

DREB2A基因N末端区的DNA结合域和核定位信号(NLS)对实现DREB2A的反式激活活性也是关键的。实际上，图1所示含有DREB2A基因的各种C末端区缺失突变体的效应构建体在N末端区含有DNA结合域和核定位信号。同样，图2所示效应构建体含有外源GAL4DNA结合域，其中包含NLS而不是DREB2A基因的内源DNA结合域和NLS。Liu等人描述了“我们检索了DNA和蛋白数据库中与DREB1A和DREB2A蛋白的序列同源的序列，并且发现每个DREB蛋白都具有58个氨基酸的保守的DNA结合域，该DNA结合域存在于DNA结合蛋白，包括烟草的EREBP和拟南芥的AP2的一大族植物基因中。除保守的DNA结合域外，推定的DREB1A和DREB2A的氨基酸序列没有表现出明显的序列同一性。但是，每个DREB蛋白在其N末端区含有一个可能作为核定位信号的碱性区，并且含有一个酸性的C末端区，该C末端区可能作为转录的激活域。这些数据表明，每个DREBcDNA编码可能作为植物中的转录激活物的DNA结合蛋白。

为了确定DREB2A的NLS和DNA结合域的位置，我们进行了以下分析和数据库检索。通过PSORT程序(http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/)进行的分析发现，DREB2A在N末端区具有二分的核定位信号(NLS)，是从第19位氨基酸开始的RKRK和从第52位氨基酸开始的KKRK。对CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)的检索发现DREB2A具有三个DNA结合域，分别在a.a.78-138，a.a.77-137和a.a.79-135的区域内。

DREB1A蛋白和DREB2A蛋白似乎识别相同的顺式元件DRE。但是，在该研究中发现，DREB1A靶基因系列和DREB2A靶基因系列并不完全一致。此外，尽管这两种DREB都识别Cor15A和B，但DREB1A-b植物和DREB2A CA-a的这些基因的表达水平显著不同(图4B)。DREB蛋白之间靶基因系列的不一致性可能是DREB2A CA植物比DREB1A-b植物的冷冻耐受性低的原因，尽管这两种转基因植物表现出相同水平的干旱胁迫耐受。在以前的报道中，我们揭示了DREB1A和DREB2A蛋白都识别RCCGAC的相同核心序列(Sakumaet al.，2002)。但是，最近我们通过仔细分析DREB1A靶基因的启动子区，阐明了DREB1A蛋白具有与RCCGACxT序列的最高的亲和力(Maruyama et al.，2003)。为了找到DREB1A和DREB2A的靶基因系列不一致的原因，我们分析了基因的ATG上游500bp内的启动子区，在微阵列分析中，与野生型植物相比，该基因的表达水平在DREB2A CA-a植物中增加了5倍以上，而在DREB1A-b植物中增加了不到3倍。我们发现了8个DRE序列，但仅有2个(25％)DRE序列具有RCCGACxT序列。DREB2A蛋白可能能够结合于除RCCGACxT以外的DRE序列并且控制特定基因的表达，DREB1A很难控制所述特定基因的表达。我们也试图鉴定作为结合DREB2A蛋白的先决条件的序列。但是，没有观察到核苷酸丰度比的显著偏差。为了实现该目的，可能需要更多的DREB2A特异性靶基因。

干旱和高盐度胁迫诱导了DREB2A的表达，并且DREB2A蛋白特异性结合于DRE元件，因此，预计DREB2A参与不依赖于ABA的水胁迫诱导的基因表达。但是，还没有获得证明该假设的明确证据，因为DREB2A的超量表达没有诱导转基因植物中的任何表型改变。同样，DREB2基因家族至少由两个成员(DREB2A和DREB2B)组成，因此引物DREB2基因的功能可能是冗余的。此外，大多数水胁迫诱导的基因在它们的启动子区具有DRE和ABRE这两者，ABA信号也可以经DREB1D/CBF4传递到DRE。该研究明确表明DREB2A必然在脱水胁迫诱导的信号转导途径中起作用。该事实表明，我们获得了用于分子改进植物对环境胁迫的耐受的新工具。

在此全文引入本文中所引用的所有公开文献、专利和专利申请作为参考。

本发明的作用

根据本发明，提供了含有一种基因的转基因植物，在该基因中，结合于胁迫反应元件并且调节位于该元件下游的基因转录的蛋白的编码DNA连接在胁迫反应启动子的下游，所述转基因植物对环境胁迫(如脱水、低温和盐)的耐受得到改进，并且没有变矮。

序列表

<110>Japan International Research Center for Agricultural Sciences

<120>用修饰的DREB2A基因调节植物中的环境胁迫耐受

<130>PH-2210-PCT

<140>

<141>

<160>62

<210>1

<211>933

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<223>发明人：Shinozaki，Kazuko；Sakuma，Yoh

<220>

<221>CDS

<222>(119)..(766)

<400>1

cctgaactag aacagaaaga gagagaaact attatttcag caaaccatac caacaaaaaa 60

gacagagatc ttttagttac cttatccagt ttcttgaaac agagtactct tctgatca 118

atg aac tca ttt tct gct ttt tct gaa atg ttt ggc tcc gat tac gag 166

Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr Glu

1 5 10 15

tct tcg gtt tcc tca ggc ggt gat tat att ccg acg ctt gcg agc agc 214

Ser Ser Val Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Pro Thr Leu Ala Ser Ser

20 25 30

tgc ccc aag aaa ccg gcg ggt cgt aag aag ttt cgt gag act cgt cac 262

Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His

35 40 45

cca ata tac aga gga gtt cgt cgg aga aac tcc ggt aag tgg gtt tgt 310

Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Cys

50 55 60

gag gtt aga gaa cca aac aag aaa aca agg att tgg ctc gga aca ttt 358

Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe

65 70 75 80

caa acc gct gag atg gca gct cga gct cac gac gtt gcc gct tta gcc 406

Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala

85 90 95

ctt cgt ggc cga tca gcc tgt ctc aat ttc gct gac tcg gct tgg aga 454

Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg

100 105 110

ctc cga atc ccg gaa tca act tgc gct aag gac atc caa aag gcg gcg 502

Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala

115 120 125

gct gaa gct gcg ttg gcg ttt cag gat gag atg tgt gat gcg acg acg 550

Ala Glu Ala Ala Leu Ala Phe Gln Asp Glu Met Cys Asp Ala Thr Thr

130 135 140

gat cat ggc ttc gac atg gag gag acg ttg gtg gag gct att tac acg 598

Asp His Gly Phe Asp Met Glu Glu Thr Leu Val Glu Ala Ile Tyr Thr

145 150 155 160

gcg gaa cag agc gaa aat gcg ttt tat atg cac gat gag gcg atg ttt 646

Ala Glu Gln Ser Glu Asn Ala Phe Tyr Met His Asp Glu Ala Met Phe

165 170 175

gag atg ccg agt ttg ttg gct aat atg gca gaa ggg atg ctt ttg ccg 694

Glu Met Pro Ser Leu Leu Ala Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro

180 185 190

ctt ccg tcc gta cag tgg aat cat aat cat gaa gtc gac ggc gat gat 742

Leu Pro Ser Val Gln Trp Asn His Asn His Glu Val Asp Gly Asp Asp

195 200 205

gac gac gta tcg tta tgg agt tat taaaactcag attattattt ccatttttag 796

Asp Asp Val Ser Leu Trp Ser Tyr

210 215

tacgatactt tttattttat tattattttt agatcctttt ttagaatgga atcttcatta 856

tgtttgtaaa actgagaaac gagtgtaaat taaattgatt cagtttcagt ataaaaaaaa 916

aaaaaaaaaa aaaaaaa 933

<210>2

<211>216

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>2

Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr Glu

1 5 10 15

Ser Ser Val Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Pro Thr Leu Ala Ser Ser

20 25 30

Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His

35 40 45

Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Cys

50 55 60

Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe

65 70 75 80

Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala

85 90 95

Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg

100 105 110

Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala

115 l20 125

Ala Glu Ala Ala Leu Ala Phe Gln Asp Glu Met Cys Asp Ala Thr Thr

130 135 140

Asp His Gly Phe Asp Met Glu Glu Thr Leu Val Glu Ala Ile Tyr Thr

145 150 155 160

Ala Glu Gln Ser Glu Asn Ala Phe Tyr Met His Asp Glu Ala Met Phe

165 170 175

Glu Met Pro Ser Leu Leu Ala Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro

180 185 190

Leu Pro Ser Val Gln Trp Asn His Asn His Glu Val Asp Gly Asp Asp

195 200 205

Asp Asp Val Ser Leu Trp Ser Tyr

210 215

<210>3

<211>1437

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>CDS

<222>(167)..(1171)

<400>3

gctgtctgat aaaaagaaga ggaaaactcg aaaaagctac acacaagaag aagaagaaaa 60

gatacgagca agaagactaa acacgaaagc gatttatcaa ctcgaaggaa gagactttga 120

ttttcaaatt tcgtccccta tagattgtgt tgtttctggg aaggag atg gca gtt 175

Met Ala Val

1

tat gat cag agt gga gat aga aac aga aca caa att gat aca tcg agg 223

Tyr Asp Gln Ser Gly Asp Arg Asn Arg Thr Gln Ile Asp Thr Ser Arg

5 10 15

aaa agg aaa tct aga agt aga ggt ga cggt act act gtg gct gag aga 271

Lys Arg Lys Ser Arg Ser Arg Gly Asp Gly Thr Thr Val Ala Glu Arg

20 25 30 35

tta aag aga tgg aaa gag tat aac gag acc gta gaa gaa gtt tct acc 319

Leu Lys Arg Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Thr Val Glu Glu Val Ser Thr

40 45 50

aag aag agg aaa gta cctgcg aaa ggg tcg aag aag ggt tgt atg aaa 367

Lys Lys ARg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Lys

55 60 65

ggt aaa gga gga cca gag aat agc cga tgt agt ttc aga gga gtt agg 415

Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Arg Cys Ser Phe Arg Gly Val Arg

70 75 80

caa agg att tgg ggt aaa tgg gtt gct gag atc aga gag cct aat cga 463

Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg

85 90 95

ggt agc agg ctt tgg ctt ggt act ttc cct act gct caa gaa gct gct 511

Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Gln Glu Ala Ala

100 105 110 115

tct gct tat gat gag gct gct aaa gct atg tat ggt cct ttg gct cgt 559

Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Ala Met Tyr Gly Pro Leu Ala Arg

120 125 130

ctt aat ttc cct cgg tct gat gcg tct gag gtt acg agt acc tca agt 607

Leu Asn Phe Pro Arg Ser Asp Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Ser Ser

135 140 145

cag tct gag gtg tgt act gtt gag act cct ggt tgt gtt cat gtg aaa 655

Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Thr Pro Gly Cys Val His Val Lys

150 155 160

aca gag gat cca gat tgt gaa tct aaa ccc ttc tcc ggt gga gtg gag 703

Thr Glu Asp Pro Asp Cys Glu Ser Lys Pro Phe Ser Gly Gly Val Glu

165 170 175

ccg atg tatt gt ctg gag aat ggt gcg gaa gag atg aag aga ggt gtt 751

Pro Met Tyr Cys Leu Glu Asn Gly Ala Glu Glu Met Lys Arg Gly Val

180 185 190 195

aaa gcg gat aag cat tgg ctg agc gag ttt gaa cat aac tat tgg agt 799

Lys Ala Asp Lys His Trp Leu Ser Glu Phe Glu His Asn Tyr Trp Ser

200 205 210

gat att ctg aaa gag aaa gag aaa cag aag gag caa ggg att gta gaa 847

Asp Ile Leu Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Glu Gln Gly Ile Val Glu

215 220 225

acc tgt cag caa caa cag cag gat tcg cta tct gtt gca gac tat ggt 895

Thr Cys Gln Gln Gln Gln Gln Asp Ser Leu Ser Val Ala Asp Tyr Gly

230 235 240

tgg ccc aat gat gtg gat cag agt cac ttg gat tct tca gac atg ttt 943

Trp Pro Asn Asp Val Asp Gln Ser His Leu Asp Ser Ser Asp Met Phe

245 250 255

gat gtc gat gag ctt cta cgt gac cta aat ggc gac gat gtg ttt gca 991

Asp Val Asp Glu Leu Leu Arg Asp Leu Asn Gly Asp Asp Val Phe Ala

260 265 270 275

ggc tta aat cag gac cgg tac ccg ggg aac agt gtt gcc aac ggt tca 1039

Gly Leu Asn Gln Asp Arg Tyr Pro Gly Asn Ser Val Ala Asn Gly Ser

280 285 290

tac agg ccc gag agt caa caa agt ggt ttt gat ccg cta caa agc ctc 1087

Tyr Arg Pro Glu Ser Gln Gln Ser Gly Phe Asp Pro Leu Gln Ser Leu

295 300 305

aac tac gga ata cct ccg ttt cag ctc gag gga aag gat ggt aat gga 1135

Asn Tyr Gly Ile Pro Pro Phe Gln Leu Glu Gly Lys Asp Gly Asn Gly

310 315 320

ttc ttc gac gac ttg agt tac ttg gat ctg gag aac taaacaaaac 1181

Phe Phe Asp Asp Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Glu Asn

325 330 335

aatatgaagc tttttggatt tgatatttgc cttaatccca caacgactgt tgattctcta 1241

tccgagtttt agtgatatag agaactacag aacacgtttt ttcttgttat aaaggtgaac 1301

tgtatatatc gaaacagtga tatgacaata gagaagacaa ctatagtttg ttagtctgct 1361

tctcttaagt tgttctttag atatgtttta tgttttgtaa caacaggaat gaataataca 1421

cacttgtaaa aaaaa 1437

<210>4

<211>335

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>4

Met Ala Val Tyr Asp Gln Ser Gly Asp Arg Asn Arg Thr Gln Ile Asp

1 5 10 15

Thr Ser Arg Lys Arg Lys Ser Arg Ser Arg Gly Asp Gly Thr Thr Val

20 25 30

Ala Glu Arg Leu Lys Arg Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Thr Val Glu Glu

35 40 45

Val Ser Thr Lys Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly

50 55 60

Cys Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Arg Cys Ser Phe Arg

65 70 75 80

Gly Val Arg Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu

85 90 95

Pro Asn Arg Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Gln

100 105 110

Glu Ala Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Ala Met Tyr Gly Pro

115 120 125

Leu Ala Arg Leu Asn Phe Pro Arg Ser Asp Ala Ser Glu Val Thr Ser

130 135 140

Thr Ser Ser Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Thr Pro Gly Cys Val

145 150 155 160

His Val Lys Thr Glu Asp Pro Asp Cys Glu Ser Lys Pro Phe Ser Gly

165 170 175

Gly Val Glu Pro Met Tyr Cys Leu Glu Asn Gly Ala Glu Glu Met Lys

180 185 190

Arg Gly Val Lys Ala Asp Lys His Trp Leu Ser Glu Phe Glu His Asn

195 200 205

Tyr Trp Ser Asp Ile Leu Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Glu Gln Gly

210 215 220

Ile Val Glu Thr Cys Gln Gln Gln Gln Gln Asp Ser Leu Ser Val Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Gly Trp Pro Asn Asp Val Asp Gln Ser His Leu Asp Ser Ser

245 250 255

Asp Met Phe Asp Val Asp Glu Leu Leu Arg Asp Leu Asn Gly Asp Asp

260 265 270

Val Phe Ala Gly Leu Asn Gln Asp Arg Tyr Pro Gly Asn Ser Val Ala

275 280 285

Asn Gly Ser Tyr Arg Pro Glu Ser Gln Gln Ser Gly Phe Asp Pro Leu

290 295 300

Gln Ser Leu Asn Tyr Gly Ile Pro Pro Phe Gln Leu Glu Gly Lys Asp

305 310 315 320

Gly Asn Gly Phe Phe Asp Asp Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Glu Asn

325 330 335

<210>5

<211>937

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>CDS

<222>(164)..(802)

<400>5

cttgaaaaag aatctacctg aaaagaaaaa aaagagagag agatataaat agctttacca 60

agacagatat actatctttt attaatccaa aaagactgag aactctagta actacgtact 120

acttaaacct tatccagttt cttgaaacag agtactctga tca atg aac tca ttt 175

Met Asn Ser Phe

1

tca gct ttt tct gaa atg ttt ggc tcc gat tac gag cct caa ggc gga 223

Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Pro Gln Gly Gly

5 10 15 20

gat tat tgt ccg acg ttg gcc acg agt tgt ccg aag aaa ccg gcg ggc 271

Asp Tyr Cys Pro Thr Leu Ala Thr Ser Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly

25 30 35

cgt aag aag ttt cgt gag act cgt cac cca att tac aga gga gtt cgt 319

Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg

40 45 50

caa aga aac tcc ggt aag tgg gtt tct gaa gtg aga gag cca aac aag 367

Gln Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Ser Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys

55 60 65

aaa acc agg att tgg ctc ggg act ttc caa acc gct gag atg gca gct 415

Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala

70 75 80

cgt gct cac gac gtc gct gca tta gcc ctc cgt ggc cga tca gca tgt 463

Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys

85 90 95 100

ctc aac ttc gct gac tcg gct tgg cgg cta cga atc ccg gag tca aca 511

Lell Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr

105 110 115

tgc gcc aag gat atc caa aaa gcg gct gct gaa gcg gcg ttg gct ttt 559

Cys Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Leu Ala Phe

120 l25 130

caa gat gag acg tgt gat acg acg acc acg aat cat ggc ctg gac atg 607

Gln Asp Glu Thr Cys Asp Thr Thr Thr Thr Asn His Gly Leu Asp Met

135 14O 145

gag gag acg atg gtg gaa gct att tat aca ccg gaa cag agc gaa ggt 655

Glu Glu Thr Met Val Glu Ala Ile Tyr Thr Pro Glu Gln Ser Glu Gly

150 155 160

gcg ttt tat atg gat gag gag aca atg ttt ggg atg ccg act ttg ttg 703

Ala Phe Tyr Met Asp Glu Glu Thr Met Phe Gly Met Pro Thr Leu Leu

165 170 175 180

gat aat atg gct gaa ggc atg ctt tta ccg ccg ccg tct gtt caa tgg 751

Asp Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro Pro Pro Ser Val Gln Trp

185 190 195

aat cat aat tat gac ggc gaa gga gat ggt gac gtg tcg ctt tgg agt 799

Asn His Asn Tyr Asp Gly Glu Gly Asp Gly Asp Val Ser Leu Trp Ser

200 205 210

tac taatattcga tagtcgtttc catttttgta ctatagtttg aaaatattct 852

Tyr

agttcctttt tttagaatgg ttccttcatt ttattttatt ttattgttgt agaaacgagt 912

ggaaaataat tcaatacaaa aaaaa 937

<210>6

<211>213

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>6

Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr Glu

1 5 10 15

Pro Gln Gly Gly Asp Tyr Cys Pro Thr Leu Ala Thr Ser Cys Pro Lys

20 25 30

Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Ile Tyr

35 40 45

Arg Gly Val Arg Gln Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Ser Glu Val Arg

50 55 60

Glu Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Gln Thr Ala

65 70 75 80

Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Leu Arg Gly

85 90 95

Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Leu Arg Ile

100 105 110

Pro Glu Ser Thr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala

115 120 125

Ala Leu Ala Phe Gln Asp Glu Thr Cys Asp Thr Thr Thr Thr Asn His

130 135 140

Gly Leu Asp Met Glu Glu Thr Met Val Glu Ala Ile Tyr Thr Pro Glu

145 150 155 160

Gln Ser Glu Gly Ala Phe Tyr Met Asp Glu Glu Thr Met Phe Gly Met

165 170 175

Pro Thr Leu Leu Asp Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro Pro Pro

180 185 190

Ser Val Gln Trp Asn His Asn Tyr Asp Gly Glu Gly Asp Gly Asp Val

195 200 205

Ser Leu Trp Ser Tyr

210

<210>7

<211>944

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>CDS

<222>(135)..(782)

<400>7

cctgaattag aaaagaaaga tagatagaga aataaatatt ttatcatacc atacaaaaaa 60

agacagagat cttctactta ctctactctc ataaacctta tccagtttct tgaaacagag 120

tactcttctg atca atg aac tca ttt tct gcc ttt tct gaa atg ttt ggc 170

Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly

1 5 10

ttc gat tac gag tct ccg gtt tcc tca ggc ggt gat tac agt ccg aag 218

Ser Asp Tyr Glu Ser Pro Val Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ser Pro Lys

15 20 25

ctt gcc acg agc tgc ccc aag aaa cca gcg gga agg aag aag ttt cgt 266

Leu Ala Thr Ser Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg

30 35 40

gag act cgt cac cca att tac aga gga gtt cgt caa aga aac tcc ggt 314

Glu Thr Arg His Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Asn Ser Gly

45 50 55 60

aag tgg gtg tgt gag ttg aga gag cca aac aag aaa acg agg att tgg 362

Lys Trp Val Cys Glu Leu Arg Glu Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp

65 70 75

ctc ggg act ttc caa acc gct gag atg gca gct cgt gct cac gac gtc 410

Leu Gly Thr Phe Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val

80 85 90

gcc gcc ata gct ctc cgt ggc aga tct gcc tgt ctc aat ttc gct gac 458

Ala Ala Ile Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp

95 100 105

tcg gct tgg cgg cta cga atc ccg gaa tca acc tgt gcc aag gaa atc 506

Ser Ala Trp Arg Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr Cys Ala Lys Glu Ile

110 115 120

caa aag gcg gcg gct gaa gcc gcg ttg aat ttt caa gat gag atg tgt 554

Gln Lys ALa Ala Ala Glu Ala Ala Leu Asn Phe Gln Asp Glu Met Cys

125 130 135 140

cat atg acg acg gat gct cat ggt ctt gac atg gag gag acc ttg gtg 602

His Met Thr Thr Asp Ala His Gly Leu Asp Met Glu Glu Thr Leu VAl

145 150 155

gag gct att tat acg ccg gaa cag agc caa gat gcg ttt tat atg gat 650

Glu Ala Ile Tyr Thr Pro Glu Gln Ser Gln Asp Ala Phe Tyr Met Asp

160 165 170

gaa gag gcg atg ttg ggg atg tct agt ttg ttg gat aac atg gcc gaa 698

Glu Glu Ala Met Leu Gly Met Ser Ser Leu Leu Asp Asn Met Ala Glu

175 180 185

ggg atg ctt tta ccg tcg ccg tcg gtt caa tgg aac tat aat ttt gat 746

Gly Met Leu Leu Pro Ser Pro Ser Val Gln Trp Asn Tyr Asn Phe Asp

190 195 200

gtc gag gga gat gat gac gtg tcc tta tgg agc tat taa aattcga 792

Val Glu Gly Asp Asp Asp Val Ser Leu Trp Ser Tyr

205 210 215

tttttatttc catttttggt attatagctt tttatacatt tgatcctttt ttagaatgga 852

tcttcttctt tttttggttg tgagaaacga atgtaaatgg taaaagttgt tgtcaaatgc 912

aaatgttttt gagtgcagaa tatataatct tt 944

<210>8

<211>216

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>8

Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr Glu

1 5 10 15

Ser Pro Val Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ser Pro Lys Leu Ala Thr Ser

20 25 30

Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His

35 40 45

Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Cys

50 55 60

Glu Leu Arg Glu Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe

65 70 75 80

Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Ile Ala

85 90 95

Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg

100 105 110

Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr Cys Ala Lys Glu Ile Gln Lys Ala Ala

115 120 125

Ala Glu Ala Ala Leu Asn Phe Gln Asp Glu Met Cys His Met Thr Thr

130 135 140

Asp Ala His Gly Leu Asp Met Glu Glu Thr Leu Val Glu Ala Ile Tyr

145 150 155 160

Thr Pro Glu Gln Ser Gln Asp Ala Phe Tyr Met Asp Glu Glu Ala Met

165 170 175

Leu Gly Met Ser Ser Leu Leu Asp Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu

180 185 190

Pro Ser Pro Ser Val Gln Trp Asn Tyr Asn Phe Asp Val Glu Gly Asp

195 200 205

Asp Asp Val Ser Leu Trp Ser Tyr

210 215

<210>9

<211>1513

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>CDS

<222>(183)..(1172)

<400>9

gagacgctag aaagaacgcg aaagcttgcg aagaagattt gcttttgatc gacttaacac 60

gaacaacaaa caacatctgc gtgataaaga agagattttt gcctaaataa agaagagatt 120

cgactctaat cctggagtta tcattcacga tagattctta gattgcgact ataaagaaga 180

ag atg gct gta tat gaa caa acc gga acc gag cag ccg aag aaa agg 227

Met Ala Val Tyr Glu Gln Thr Gly Thr Glu Gln Pro Lys Lys Arg

1 5 10 15

aaa tct agg gct cga gca ggt ggt tta acg gtg gct gat agg cta aag 275

Lys Ser Arg Ala Arg Ala Gly Gly Leu Thr Val Ala Asp Arg Leu Lys

20 25 30

aag tgg aaa gag tac aac gag att gtt gaa gct tcg gct gtt aaa gaa 323

Lys Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Ile Val Glu Ala Ser Ala Val Lys Glu

35 40 45

gga gag aaa ccg aaa cgc aaa gtt cct gcg aaa ggg tcg aag aaa ggt 371

Gly Glu Lys Pro Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly

50 55 60

tgt atg aag ggt aaa gga gga cca gat aat tct cac tgt agt ttt aga 419

Cys Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Asp Asn Ser His Cys Ser Phe Arg

65 70 75

gga gtt aga caa agg att tgg ggt aaa tgg gtt gca gag att cga gaa 467

Gly Val Arg Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu

80 85 90 95

ccg aaa ata gga act aga ctt tgg ctt ggt act ttt cct acc gcg gaa 515

Pro Lys Ile Gly Thr Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu

100 105 110

aaa gct gct tcc gct tat gat gaa gcg gct acc gct atg tac ggt tca 563

Lys Ala Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Thr Ala Met Tyr Gly Ser

115 120 125

ttg gct cgt ctt aac ttc cct cag tct gtt ggg tct gag ttt act agt 611

Leu Ala Arg Leu Asn Phe Pro Gln Ser Val Gly Ser Glu Phe Thr Ser

130 135 140

acg tct agt caa tct gag gtg tgt acg gtt gaa aat aag gcg gtt gtt 659

Thr Ser Ser Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Asn Lys Ala Val Val

145 150 155

tgt ggt gat gtt tgt gtg aag cat gaa gat act gat tgt gaa tct aat 707

Cys Gly Asp Val Cys Val Lys His Glu Asp Thr Asp Cys Glu Ser Asn

160 165 170 175

cca ttt agt cag att tta gat gtt aga gaa gag tct tgt gga acc agg 755

Pro Phe Ser Gln Ile Leu Asp Val Arg Glu Glu Ser Cys Gly Thr Arg

180 185 190

ccg gac agt tgc acg gtt gga cat caa gat atg aat tct tcg ctg aat 803

Pro Asp Ser Cys Thr Val Gly His Gln Asp Met Asn Ser Ser Leu Asn

195 200 205

tac gat ttg ctg tta gag ttt gag cag cag tat tgg ggc caa gtt ttg 851

Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Phe Glu Gln Gln Tyr Trp Gly Gln Val Leu

210 215 220

cag gag aaa gag aaa ccg aag cag gaa gaa gag gag ata cag caa cag 899

Gln Glu Lys Glu Lys Pro Lys Gln Glu Glu Glu Glu Ile Gln Gln Gln

225 230 235

caa cag gaa cag caa cag caa cag ctg caa ccg gat ttg ctt act gtt 947

Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Pro Asp Leu Leu Thr Val

240 245 250 255

gca gat tac ggt tgg cct tgg tct aat gat att gta aat gat cag act 995

Ala Asp Tyr Gly Trp Pro Trp Ser Asn Asp Ile Val Asn Asp Gln Thr

260 265 270

tct tgg gat cct aat gag tgc ttt gat att aat gaa ctc ctt gga gat 1043

Ser Trp Asp Pro Asn Glu Cys Phe Asp Ile Asn Glu Leu Leu Gly Asp

275 280 285

ttg aat gaa cct ggt ccc cat cag agc caa gac caa aac cac gta aat 1091

Leu Asn Glu Pro Gly Pro His Gln Ser Gln Asp Gln Asn His Val Asn

290 295 300

tct ggt agt tat gat ttg cat ccg ctt cat ctc gag cca cac gat ggt 1139

Ser Gly Ser Tyr Asp Leu His Pro Leu His Leu Glu Pro His Asp Gly

305 310 315

cac gag ttc aat ggt ttg agt tct ctg gat att tgagagttct gaggcaatgg 1192

His Glu Phe Asn Gly Leu Ser Ser Leu Asp Ile

320 325 330

tcctacaaga ctacaacata atctttggat tgatcatagg agaaacaaga aataggtgtt 1252

aatgatctga ttcacaatga aaaaatattt aataactcta tagtttttgt tctttccttg 1312

gatcatgaac tgttgcttct catctattga gttaatatag cgaatagcag agtttctctc 1372

tttcttctct ttgtagaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaayh sakmabgcar 1432

srcsdvsnaa nntrnatnar sarchcntrr agrctrascn csrcaswash tskbabarak 1492

aantamaysa kmasrngnga c 1513

<210>10

<211>330

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>10

Met Ala Val Tyr Glu Gln Thr Gly Thr Glu Gln Pro Lys Lys Arg Lys

1 5 10 15

Ser Arg Ala Arg Ala Gly Gly Leu Thr Val Ala Asp Arg Leu Lys Lys

20 25 30

Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Ile Val Glu Ala Ser Ala Val Lys Glu Gly

35 40 45

Glu Lys Pro Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys

50 55 60

Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Asp Asn Ser His Cys Ser Phe Arg Gly

65 70 75 80

Val Arg Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro

85 90 95

Lys Ile Gly Thr Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu Lys

100 105 110

Ala Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Thr Ala Met Tyr Gly Ser Leu

115 120 125

Ala Arg Leu Asn Phe Pro Gln Ser Val Gly Ser Glu Phe Thr Ser Thr

130 135 140

Ser Ser Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Asn Lys Ala Val Val Cys

145 150 155 160

Gly Asp Val Cys Val Lys His Glu Asp Thr Asp Cys Glu Ser Asn Pro

165 170 175

Phe Ser Gln Ile Leu Asp Val Arg Glu Glu Ser Cys Gly Thr Arg Pro

180 185 190

Asp Ser Cys Thr Val Gly His Gln Asp Met Asn Ser Ser Leu Asn Tyr

195 200 205

Asp Leu Leu Leu Glu Phe Glu Gln Gln Tyr Trp Gly Gln Val Leu Gln

210 215 220

Glu Lys Glu Lys Pro Lys Gln Glu Glu Glu Glu Ile Gln Gln Gln Gln

225 230 235 240

Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Pro Asp Leu Leu Thr Val Ala

245 250 255

Asp Tyr Gly Trp Pro Trp Ser Asn Asp Ile Val Asn Asp Gln Thr Ser

260 265 270

Trp Asp Pro Asn Glu Cys Phe Asp Ile Asn Glu Leu Leu Gly Asp Leu

275 280 285

Asn Glu Pro Gly Pro His Gln Ser Gln Asp Gln Asn His Val Asn Ser

290 295 300

Gly Ser Tyr Asp Leu His Pro Leu His Leu Glu Pro His Asp Gly His

305 310 315 320

Glu Phe Asn Gly Leu Ser Ser Leu Asp Ile

325 330

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>11

ggggcggccg catggcagtt tatgatcaga g 31

<210>l2

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>12

tttgcggccg ctcactcgag ctgaaacgga ggta 34

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>13

ggggcggccg catggcagtt tatgatcaga g 31

<210>14

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>14

tttgcggccg ctcaccggtc ctgatttaag cctg 34

<210>15

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>15

ggggcggccg catggcagtt tatgatcaga g 31

<210>16

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>16

tttgcggccg ctcacaagtg actctgatcc acat 34

<210>17

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>17

ggggcggccg catggcagtt tatgatcaga g 31

<210>18

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>18

tttgcggccg ctcactctgt tttcacatga acac 34

<210>19

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>19

ggggcggccg catggcagtt tatgatcaga g 31

<210>20

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>20

tttgcggccgct caagggaa attaagacga gcca 34

<210>21

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>21

ggggcggccg catggcagtt tatgatcaga g 31

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>22

ttcacaatct ggatcaggga aattaagacg 30

<210>23

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>23

ggggcggccg catggcagtt tatgatcaga g 31

<210>24

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>24

catgtctgaa gaatcctctg ttttcacatg 30

<210>25

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>25

ggggcggccg catggcagtt tatgatcaga g 31

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>26

actgttcccc gggtacaagt gactctgatc 30

<210>27

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>27

ggggcggccg catggcagtt tatgatcaga g 31

<210>28

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>28

aatttagtcc tggccccttt cctaccatta 30

<210>29

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>29

ggggcggccg catggcagtt tatgatcaga g 31

<210>30

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>30

tcaaacatgt ctgaagaatc agggaaatta agacgagcca 40

<210>31

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>31

ggggcggccg catggcagtt tatgatcaga g 31

<210>32

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>32

ttcacaatct ggatcaggga aattaagacg 30

<210>33

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>33

gggggatccg gattcttcag acatgtttga 30

<210>34

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>34

tttgcggccg ctcaccggtc ctgatttaag cctg 34

<210>35

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>35

gggggatccg gattcttcag acatgtttga 30

<210>36

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>36

tttgcggccg ctcactcgag ctgaaacgga ggta 34

<210>37

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>37

gggggatccg gattcttcag acatgtttga 30

<210>38

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>38

ggggcggccg ctttagttct ccagatccaa gt 32

<210>39

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>39

gggagatctc ggtctgatgc gtctgaggt 29

<210>40

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>40

tttgcggccg ctcacaagtg actctgatcc acat 34

<210>41

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>41

gggagatctc ggtctgatgc gtctgaggt 29

<210>42

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>42

ggggcggccg ctttagttct ccagatccaa gt 32

<210>43

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>43

gggagatctg gaaaggatgg taatggatt 29

<210>44

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>44

ggggcggccg ctttagttctccagatccaa gt 32

<210>45

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>45

gggagatctg atccagattg tgaatctaa 29

<210>46

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>46

tttgcggccg ctcacaagtg actctgatcc acat 34

<210>47

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>47

gggagatctt acccggggaa cagtgttgc 29

<210>48

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>48

tttgcggccg ctcactcgag ctgaaacgga ggta 34

<210>49

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>49

gggagatctt acccggggaa cagtgttgc 29

<210>50

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>50

ggggcggccg ctttagttct ccagatccaa gt 32

<210>51

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>51

cgtcttaatt tccctgatcc agattgtgaa 30

<210>52

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>52

ggggcggccg ctttagttct ccagatccaa gt 32

<210>53

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>53

catgtgaaaa cagaggattc ttcagacatg 30

<210>54

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>54

ggggcggccg ctttagttct ccagatccaa gt 32

<210>55

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>55

gatcagagtc acttgtaccc ggggaacagt 30

<210>56

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>56

ggggcggccg ctttagttct ccagatccaa gt 32

<210>57

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>57

ttaaatcagg accggggaaa ggatggtaat 30

<210>58

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>58

ggggcggccg ctttagttct ccagatccaa gt 32

<210>59

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>59

tggctcgtc ttaatttccct gattcttcag acatgtttga 40

<210>60

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>60

ggggcggccg ctttagttct ccagatccaa gt 32

<210>61

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>61

cgtcttaatt tccctgatcc agattgtgaa 30

<210>62

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>62

tttgcggccg ctcactcgag ctgaaacgga ggta 34

Claims

1.转基因植物，包含编码含有SEQ ID NO：4的254-335位的氨基酸序列的蛋白。

2.权利要求1的转基因植物，其中与不存在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列组成的蛋白相比，所述蛋白使报道基因的反式激活活性提高了大约5-大约9倍。

3.转基因植物，包含编码缺失了136-165位氨基酸的SEQ ID NO：4所示氨基酸序列组成的蛋白的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

4.权利要求3的转基因植物，其中所述蛋白能够结合于所述胁迫反应启动子。

5.权利要求3或4的转基因植物，其中缺失了136-165位氨基酸的SEQ ID NO：4所示氨基酸序列组成的蛋白与全长DREB2A蛋白相比，使报道基因的反式激活活性至少增加3倍。

6.分离的核酸分子，其编码缺失了136-165位氨基酸的SEQ IDNO：4所示DREB2A蛋白。

7.转基因植物，包含含有权利要求6的分离的核酸分子的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

8.分离的蛋白，具有缺失了136-165位氨基酸的SEQ ID NO：4所示序列。

9.转基因植物，包含编码SEQ ID NO：4的254-335位的氨基酸序列组成的蛋白的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

10.权利要求9的转基因植物，进一步包含编码DNA结合域和核定位信号的DNA。

11.权利要求9或10的转基因植物，其中所述蛋白能够结合于所述胁迫反应启动子。

12.转基因植物，包含编码选自SEQ ID NO：4的254-317、136-335、318-335、166、335和282-335位的氨基酸序列组成的蛋白，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

13.权利要求12的转基因植物，进一步包含编码DNA结合域和核定位信号的DNA。

14.分离的核酸分子，编码DREB2A蛋白的翻译激活域，所述翻译激活域包含SEQ ID NO：4的254-335位的氨基酸序列。

15.转基因植物，包含含有权利要求14的分离的核酸分子的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

16.分离的蛋白，具有DREB2A蛋白活性，并且具有SEQ ID NO：4的254-335位的氨基酸序列。

17.转基因植物，包含编码缺失了136-165位氨基酸的SEQ IDNO：4所示氨基酸序列的片段组成的蛋白的DNA，其中所述片段包含254-335位的氨基酸序列和DNA结合域以及核定位信号，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

18.转基因植物，包含含有缺失了572-661位核苷酸的SEQ IDNO：3所示核苷酸序列的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

19.权利要求18的转基因植物，其中所述DNA编码的蛋白能够结合于所述胁迫反应启动子。

20.权利要求18的转基因植物，其中所述DNA编码能够结合于所述胁迫反应启动子的蛋白。

21.缺失了572-661位核苷酸的区域的SEQ ID NO：3所示的分离的核酸分子。

22.转基因植物，包含含有权利要求21的分离的核酸分子的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

23.转基因植物，包含含有SEQ ID NO：3的926-1171位所示核苷酸序列的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。

24.权利要求23的转基因植物，其中所述DNA编码的蛋白能够结合于所述胁迫反应启动子。

25.分离的核酸分子，包含SEQ ID NO：3的926-1171位所示核苷酸序列。

26.转基因植物，包含含有权利要求25的分离的核酸分子的DNA，所述DNA可操作性连接于胁迫反应启动子的下游。