CN1751065A - 棉蚜(Aphis gossypii)抗性基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及Vat基因的克隆，该基因参与对于蚜虫(棉蚜(Aphisgossypii))的抗性和/或对于经该蚜虫的病毒传播的抗性，以及涉及该基因的新型标记的鉴定。
Description
本发明涉及抵抗有害昆虫，特别是抵抗蚜虫的新型方法。
有害昆虫是在农业上主要的担忧的问题之一。除了昆虫本身造成的损害之外，昆虫的攻击十分通常地促进细菌、病毒或真菌病害向植物的传播和传染。
在害虫之中，蚜虫是最普遍的。世界上存在4000多种蚜虫，其中最普遍的是桃蚜(Myzus persicae)和棉蚜(Aphis gossypii)。
每个物种都具有特殊的生活周期和一组特有的宿主。蚜虫是极有活力的生物，它们能快速地适应环境条件。这种快速适应主要是由于蚜虫所发展出的多样的繁殖策略。根据气候条件，蚜虫通过有性或无性途径进行繁殖，和是卵生的或胎生的。它们可能是有翅的或没有翅的，这由此使得它们容易从一株植物到达另一株植物。正是由于这种强的适应和繁殖能力，在田野中更不必说在温室中，作物的完全侵害是极为迅速的。一个单独的蚜虫个体可产生40-100个这么多的幼虫。
棉花或甜瓜的蚜虫(棉蚜)存在于全世界的大部分地区，除了最北方的地区。其能够在一个星期之内完成一个完整的发育周期并进行繁殖。正是由于其适应和繁殖能力，因此不管气候条件如何，在一个季节内能产生巨大数量的后代。甜瓜的蚜虫具有大数量的宿主(大约700种种植的或野生的植物，其中有50种在法国)。在这些植物之中，最敏感的是葫芦科植物如甜瓜、小西葫芦、黄瓜，锦葵科植物如棉花或木槿，以及敏感程度较低的茄科植物和芸香科植物如柑橘类。
甜瓜的蚜虫主要侵袭叶的背面、芽和幼苗。在韧皮部中吸取营养元素的同时，蚜虫剥夺了植物的资源并使得植物变得虚弱。被侵袭的组织变成为缺绿病的，叶子发生卷曲，和光合作用的效率降低。蚜虫分泌一种非常富含糖的蜜露，这种蜜露作为腐生真菌的基质，例如煤污病，这种病在叶片上形成黑色的覆盖物，而且还减少植物的光合作用能力和造成患病的蔬菜和水果的商业价值的大大降低。另外，蚜虫是许多病毒的载体，当蚜虫刺入导管时，其直接将这些病毒引入了植物的韧皮部。
化学防治目前是最普遍的。然而，这种方法具有许多弊端。所使用的产品常常具有大的作用范围，在杀死蚜虫的同时也杀死了有益的昆虫。环境污染的风险同样是重要的：杀蚜虫剂事实上属于对于人、有用动物和环境最具有毒性的产品(Recueil des effects nonintentionnels des produits phytosanitaires，Acta 1998，256页，BERGER和VAN HOLST，2001，Environ.Sci.Pollut.Res.Int.，8，109-112)。此外，棉蚜这种蚜虫在某些地区形成了对于所使用的化学化合物的抗性，例如有机磷酸盐、氨基甲酸盐、拟除虫菊脂和有机氯化物(LARRY等人，The Journal of Cotton Science，5，22-29，2001；DELORME，Pesticide Science，49，90-96，1997)。
生物防治在于使用棉蚜的天然捕食者和寄生物，例如瓢虫、某些半翅目昆虫或病原性真菌。但是，这种方法只能用于温室中的作物。
另一种方法基于对于蚜虫天然具有抗性的品种的研究，和基于使用它们来进行品种改良和产生杂交种。
因此，已经找到了对于蚜虫具有抗性的品种，特别是小麦、苹果、紫花豌豆、莴苣、西红柿等。
在甜瓜(香瓜(Cucumis melo))中，于来自远东或印度的甜瓜品系之内发现了存在有一个赋予对于蚜虫(棉蚜)的抗性的显性座位。该座位称为Ag(对于棉蚜抗性)或Vat(对于病毒蚜虫传播抗性)，其赋予一种抗性双重表型：对于棉蚜侵害植物的抗性，和对于经蚜虫的病毒传播的抗性，在这种传播中蚜虫是载体(KISHABA等人，J.Econ.Entomol.，64，935-937，1971；BOHN等人，J.Amer.Soc.Hort.Science，98，37-40，1973；LECOQ等人，Phytopathology，69，1223-1225，1979；PITRAT和LECOQ，Phytopathology，70，958-961，1980)。
有利于抗性的Vat座位已经通过不同的商品化甜瓜品种之间的杂交而被引入；然而，通过常用的品种改良技术来形成抗蚜虫的甜瓜品种依然是漫长和昂贵的。
因此，看来希望确切地鉴定和克隆Vat基因，特别是以便能够进行以下工作：
-通过转基因将有利于抗性的Vat等位基因转移至对于棉蚜敏感的甜瓜品种中，和同时也转移至对于这种蚜虫敏感并且没有检测到任何天然抗性的其他物种中，例如小西葫芦、黄瓜或棉花；有利于抗性的Vat等位基因也能够转移至对于经蚜虫的病毒传播敏感的植物品种中，例如茄科植物，尤其是西红柿；
-在除甜瓜之外的其他物种中研究Vat基因的直向同源基因；
-定义特别是可在传统品种选择技术范围内使用的新型标记，以便推动抗性品种的鉴定和/或有利于在农学上值得关注的品种中追踪抗性特征的渐渗现象。
已经确定Vat基因位于甜瓜的染色体V上的近端粒位置(PERIN等人，Theor Appl Genet，104，1017-1034，2002)。在这一区域中已经绘制有几个与抗性基因同源的序列(KLINGER等人，J.Amer.Soc.Hort.Science，126，56-63，2001；BROTMAN等人，Theor.Apl.Genet.，104，1055-1063，2002)，这使得能够假设Vat基因属于NBS-LRR的超家族，大量目前所克隆的抗性基因均属于此超家族。
这一超家族聚集了含有一个与核苷酸连接的位点(NBS，核苷酸结合位点)和富含亮氨酸的重复序列(LRR，富亮氨酸重复序列)的基因。已经观察到，与NBS-LRR同源的序列和Vat座位有关(KLINGLER等人，J.Amer.Soc.Hort.Science，126，56-63，2001)。在这些抗性基因的同源序列中，已经确定NBS-2、NBS46-7、NBS5a和NBS5b分别位于距离Vat 4.75、7.5、10和11cM处；然而，其中没有一个与Vat座位共分离(BROTMAN等人，Theor.Appl.Genet.，104，1055-1063，2002)。
发明人构建了一个BAC(细菌人工染色体)库，以便从甜瓜纯合体基因组DNA中来获得有利于抗棉蚜和抗通过这一载体的病毒传播的Vat等位基因。同时还定义了比现有技术已知的标记更准确地定位Vat座位的标记。借助于这些标记的BAC库的筛选使得能够鉴定出具有整个Vat座位的克隆。
这些克隆之一的亚克隆过程使得能够获得含有Vat基因的大约11000bp的基因组DNA片段。这一片段的序列显示在图1中(4个外显子用灰色覆划，3个内含子加了下划线)，以及在附件的序列表中其编号为SEQ ID NO：1。相应的cDNA序列同样也已获得，相应的多肽序列已经确定。该cDNA和多肽序列分别显示在附件的序列表中，编号为SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3。
同样也已经从BAC库中分离得到下文中称为Vat-like的Vat基因的平行进化同源基因。Vat-like基因的序列显示在附件的序列表中，编号为SEQ ID NO：4。cDNA序列和推断出的多肽序列分别显示在附件中，编号为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
图2显示了Vat的cDNA与Vat-like的cDNA之间的序列比对。Vat的cDNA含有4422bp，而Vat-like的cDNA仅含有4233bp，这是由于缺失了位于Vat序列的3014-3210位之间的195bp，和添加了位于Vat-like序列的3649-3656位之间的6bp。Vat和Vat-like的序列之间具有92.4％的同一性。
图3显示了推断出的蛋白质VAT和VAT-like序列的比对，它们分别由1473个氨基酸和1410个氨基酸组成。VAT和VAT-like的序列之间具有90％的同一性。
Vat和Vat-like基因在遗传和物理上是相关的(相距17kb)。通过遗传分析已经鉴定了一些Vat和Vat-like之间的重组植物。只具有Vat-like基因的植物对于棉蚜的侵袭和由棉蚜引起的病毒传播是敏感的。与之相反，只具有Vat基因的植物对于棉蚜的侵袭和由棉蚜引起的病毒传播具有抗性。因此，Vat基因对于赋予上述的双重表型是必需和足够的。
本发明的目的是一种选自下列的分离的多核苷酸：
a)编码参与抗蚜虫(棉蚜)和/或抗经该蚜虫的病毒传播的多肽的多核苷酸，所述多肽与多肽SEQ ID NO：3具有至少80％，优选至少90％，十分优选至少95％的同一性；
b)多核苷酸a)的互补多核苷酸；
c)在严紧条件下能够与多核苷酸a)或多核苷酸b)选择性杂交的多核苷酸。
除非另有详细说明，此处对于核苷酸序列或肽序列所指出的序列同一性百分数涉及在由整个参考序列所构成的比较窗口上获得的值，其在由整个参考序列所构成的比较窗口上采用软件套件BLAST(ALTSCHUL等人，Nucleic Acids Res.，25，3389-3402，1997)并使用缺省参数。
将所有含有使得能够合成所述多肽的遗传信息的多核苷酸定义为“编码”指定多肽的多核苷酸。
因此，编码参与抗蚜虫(棉蚜)和/或抗经该蚜虫的病毒传播的多肽的本发明多核苷酸尤其包括序列SEQ ID NO：1的多核苷酸和SEQ IDNO：2的多核苷酸。
本发明同样也包括所有上述多核苷酸a)或b)的至少10bp，优选至少20bp，十分优选至少50bp的片段，或者在严紧条件下能够与上述多核苷酸a)或b)选择性杂交的片段。优选的片段为序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的多核苷酸中任何一个的片段，或者在严紧条件下能够与这些多核苷酸中的一个或其互补序列选择性杂交的片段。其他优选的片段为在多核苷酸SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5中不存在的多核苷酸SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中任何一个的片段，或者能够与多核苷酸SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2选择性杂交但不与多核苷酸SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5杂交的片段。
对于指定的多核苷酸的杂交严紧条件可以由本领域技术人员根据所涉及的多核苷酸的大小和碱基组成以及杂交混合物的组成来确定(特别是pH和离子强度)。一般地，对于指定大小和序列的多核苷酸的严紧条件是如此获得的，即于比在同一个反应混合物中由该多核苷酸和其互补序列形成的杂交物的解链温度(Tm)低大约5℃-10℃的温度下进行操作。
在此，将所有这样的多核苷酸定义为能够与本发明的多核苷酸a)或b)选择性杂交的多核苷酸，即这样的多核苷酸当在严紧条件下与甜瓜的核酸库(特别是基因组DNA或cDNA库)杂交时与所述多核苷酸产生可检测的(也就是说为背景噪音的至少2倍，优选至少5倍)杂交信号，但是与所述库的其他序列不产生任何可检测的信号，尤其是与编码NBS-LRR家族的其他蛋白质的序列。
本发明的目的同样也为从本发明的多核苷酸a)或b)或其片段中获得的多核苷酸探针或扩增引物。
本发明同样也包括所有编码参与抗蚜虫(棉蚜)和/或抗经该蚜虫的病毒传播的多肽的多核苷酸，和能够从植物的基因组DNA或cDNA库中通过借助于本发明的探针或引物筛选所述库而获得的多核苷酸。
这尤其包括甜瓜的Vat基因的其他等位基因，和尤其包括能够赋予对于蚜虫(棉蚜)和/或对于经该蚜虫的病毒传播的抗性的其他等位基因，以及在除甜瓜之外的其他植物中的，特别是在其他葫芦科植物如小西葫芦和黄瓜中的，一般在易被棉蚜感染的植物(例如锦葵科植物如棉花)和/或对于经该蚜虫的病毒传播敏感的植物(例如茄科植物如西红柿)中的Vat基因的直向同源基因。
本发明同样也包括使得能够在植物中，特别是在甜瓜中检测Vat基因的等位基因存在与否的遗传标记，该Vat基因的等位基因有利于抗蚜虫(棉蚜)的侵袭和/或抗经该蚜虫的病毒传播。
本发明的遗传标记特别包括下列标记：L273、L246、V681、V1684、V432、GRP805、M8、标记E、标记D。
标记E和D最特别地可用于在PI161375中区分Vat基因和Vat-like基因。
这些标记尤其可在葫芦科植物中使用，特别是甜瓜。它们同样也可以在其他植物中使用，例如锦葵科植物如棉花或木槿，或者茄科植物如西红柿。
本发明的标记分别由下列引物定义：
L273：
F2-B2：GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT(SEQ ID NO：7)
F2-Br：TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC(SEQ ID NO：8)
L246：
F2-B2 Eco：ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC(SEQ ID NO：9)
F2 Eco：GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA(SEQ ID NO：10)
V681：
V681：GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG(SEQ ID NO：11)
V681R：GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC(SEQ ID NO：12)
V1684：
V588：CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG(SEQ ID NO：13)
V551R：RGAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC(SEQ ID NO：14)
V432：
V432：AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC(SEQ ID NO：15)
V432R：TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG(SEQ ID NO：16)
GRP805：
GRP805：ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC(SEQ ID NO：17)
GRP805R：AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC(SEQ ID NO：18)
M8：
M8：CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG(SEQ ID NO：19)
M8R：TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA(SEQ ID NO：20)
标记E：
LRR1：CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC(SEQ ID NO：21)
LRR842R：CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC(SEQ ID NO：22)
标记D：
LRR915：AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC(SEQ ID NO：23)
LRR1R：GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC(SEQ ID NO：24)。
对于蚜虫(棉蚜)和/或对于经该蚜虫的病毒传播的抗性的其他遗传标记同样也可通过下列方法从序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中加以确定，即将这些序列与从对于棉蚜和/或对于经该蚜虫的病毒传播敏感的植物中获得的它们的同源序列进行比较，以便检测在这些序列之间存在的多态性，和确定与抗性相关的形式和与敏感性相关的形式。
这些多态性可以位于Vat基因的编码区，并通过VAT蛋白质的肽序列的修饰而表现出来。同样也可以涉及位于Vat基因的5′非编码区或内含子中的多态性，或者位于编码区中但不表现为VAT蛋白质的序列修饰的多态性。
当已经如此鉴定了多态性时，就可能使用其作为抗性或敏感性的遗传标记，和定义使得能够区分它们的不同形式的工具(核酸探针、扩增引物、限制性酶)。
本发明同样也包括将本发明的至少一种多核苷酸或至少一种遗传标记用于在植物中检测Vat基因的等位基因的存在的用途，该Vat基因的等位基因有利于抗蚜虫(棉蚜)和/或抗经该蚜虫的病毒传播。
特别地，本发明的目的为评价植物对于蚜虫(棉蚜)和/或对于经该蚜虫的病毒传播的抗性或敏感性的方法，其特征在于，该方法包括确定在所述植物中存在的Vat基因的等位形式。
本发明的目的同样也为可用于实施上述检测方法的寡核苷酸引物。
特别地，本发明的目的为：
-所有使得能够扩增出Vat基因的一个区域的引物对，该Vat基因的区域包含至少一种与对于棉蚜和/或对于经该蚜虫的病毒传播的抗性或敏感性相关的多态性；
-所有使得能够扩增出上述L273、L246、V681、V1684、V432、GRP805、M8、标记E或标记D这些标记之一的引物对。
本发明的目的同样也为实施本发明的方法的试剂盒。这些试剂盒含有至少一种本发明的引物对，可选地还联合有使得能够进行扩增反应的反应物，检测扩增产物的工具，一种或多种限制性酶，和/或扩增的阳性对照和/或阴性对照。
本发明的目的还为：
-表达盒，其含有本发明的多核苷酸，特别是编码参与抗蚜虫(棉蚜)和/或抗经该蚜虫的病毒传播的多肽的多核苷酸，该多核苷酸置于合适的启动子的转录调控之下；
-重组载体，其是通过将本发明的多核苷酸或表达盒插入宿主载体中而获得的。
本发明同样还包括制备重组多肽的方法，其特征在于，该方法包括用编码参与抗蚜虫(棉蚜)和/或抗经该蚜虫的病毒传播的多肽的本发明多核苷酸转化宿主细胞，包括原核细胞或真核细胞，并回收由所述细胞产生的所述多肽。
本发明的目的还为参与抗蚜虫(棉蚜)和/或抗经该蚜虫的病毒传播的多肽，该多肽与多肽SEQ ID NO：3具有至少80％，优选至少90％，十分优选至少95％的同一性，以及所述多肽的至少5个，优选至少10个，十分优选至少15个连续氨基酸的片段。
本发明还包括用本发明的多核苷酸或表达盒遗传转化的宿主细胞。
宿主细胞可以为真核细胞或原核细胞。作为实例，可以举例出细菌特别是大肠杆菌(E.coli)或土壤杆菌(Agrobacterium)，酵母如糖酵母(Saccharomyces)，动物细胞，或者优选脊椎动物细胞。
本发明同样也包括用本发明的多核苷酸转化的转基因植物。
构建重组载体、转化宿主细胞或生物体以及产生重组蛋白质的常规技术可用于本发明的实施。
宿主载体和表达调控序列的选择将根据所选择的宿主细胞或宿主生物体和所预期的应用来进行。
用本发明的多核苷酸遗传转化植物使得能够获得抗蚜虫(棉蚜)和/或抗经该蚜虫的病毒传播的转基因植物。
本发明的目的还为将本发明的多核苷酸用于增强植物对于蚜虫(棉蚜)的抗性。
更特别地，本发明的目的还为制备抗蚜虫(棉蚜)和/或抗经该蚜虫的病毒传播的转基因植物的方法，其特征在于，该方法包括用本发明的多核苷酸遗传转化所述植物。
所述植物有利地选自对于棉蚜敏感的物种，特别是葫芦科物种如甜瓜、黄瓜或小西葫芦，或者锦葵科植物如棉花或木槿，或者选自对于由棉蚜传播的病毒敏感的物种，特别是茄科植物如西红柿或辣椒。
而且，高水平的Vat基因的过表达能够在甜瓜或其他植物品种(葫芦科、茄科或锦葵科植物)中导致植物对于更多样化的病原体的组成型抗性。例如，这种过表达可以使得植物能够识别在系统发生方面远离棉蚜的蚜虫，或者赋予通常将会延缓病原体的感染周期的弱组成型抗性。为此，可以制备这样的转基因植物，即该转基因植物在强启动子(35S)调控下表达Vat基因，因此将会以比当Vat基因处于其本来的启动子调控之下时所具有的水平高的水平表达Vat基因。然而，必须将基因的表达控制为其更适当的水平，以避免在植物生物学上有害的影响(例如细胞死亡)。
植物的遗传转化可以通过本领域技术人员本身已知的常规方法来进行。
作为非限制性的实例，对于葫芦科植物特别是甜瓜的转化，可以使用GUIS等人所描述的技术(Biotechnology and Genetic EngineeringReviews，15，289-311，1998；Scientia horticulturae，84，91-99，2000)。对于棉花的转化，可以使用PANNETIER等人所描述的技术(Euphytica，96，163-166，1997)。对于西红柿的转化，可以使用HAMZA和CHUPEAU所描述的方案(J.Exp.Bot.，44，1837-1845，1993)。
作为另一种选择，对于蚜虫(棉蚜)和/或对于经该蚜虫的病毒传播具有增强的抗性的植物可以通过定向诱变而获得，以便在这些植物中存在的Vat基因等位基因之中引入对于赋予这种抗性所必需的修饰。
在本发明的范围内可以使用的定向诱变方法是本领域技术人员本身已知的；这些方法例如描述于D.TAGU的著作(eds INRA 1999)中。
本发明同样也涉及通过本发明的转基因或定向诱变方法而获得的转化植物，以及这些植物的后代。本发明同样还包括从这些植物获得的产品，例如植物的器官或组织、细胞、种子等。
借助于下面的补充描述将会更好地理解本发明，其涉及非限制性实施例，这些实施例举例说明了与Vat基因相关的标记的定义，该基因的克隆，和将所述基因用于获得抗蚜虫(棉蚜)和/或抗病毒传播的植物。
实施例1：通过遗传学方法鉴定Vat基因
-BAC库的形成
已经构建了一个甜瓜(对于棉蚜和对于经该蚜虫的病毒传播具有抗性的品种PI161375)基因组DNA的BAC库，其代表大约29个相当的基因组。该BAC库的第一部分含有66048个克隆(用BamHI、HindIII消化的DNA)，第二部分含有56448个克隆(用EcoRI消化的DNA)。
-BAC库的筛选及携带有Vat座位的BAC克隆的选择
为了鉴定携带Vat座基因的克隆，借助于位于Vat座位两侧的标记来筛选库。已经鉴定和排列了几个覆盖Vat座位的BAC克隆。从这些BAC克隆中产生了新的标记。选择出携带有包含Vat座位的170kb插入的BAC克隆3.18.9，以鉴定Vat基因和序列。该克隆含有围绕Vat座位的标记L273和L246。在6000株来自回交种群[(Védrantais(敏感的)×PI161375(抗性的))×Védrantais]的植物中，在标记L273和Vat基因之间鉴定了10株植物，而在标记L246和Vat基因之间只鉴定了1株植物。
标记L273由下列引物定义：
F2-B2：GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT(SEQ ID NO：7)
和
F2-Br：TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC(SEQ ID NO：8)
从Védrantais品种(Vilmorin)(对于棉蚜敏感)或PI161375品种(由INRA繁殖的高丽来源的引进种)(对于棉蚜具有抗性)的基因组DNA中获得的扩增产物长210bp。该扩增产物在PI161375品种中具有一个BsiWI限制酶切位点，从而导致获得181bp和29bp的两个片段。相反地，使用酶BsrGI的消化将Védrantais的扩增物减小为三个片段：153bp、28bp和29bp，和将PI161375的扩增物减小为182bp和28bp的两个片段。
标记L246由下列引物定义：
F2-B2 Eco：ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC(SEQ ID NO：9)
和
F2 Eco：GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA(SEQ ID NO：10)
从Védrantais品种或PI161375品种的基因组DNA中获得的扩增产物长173bp。PI161375品种的扩增产物具有一个对于酶EcoRV的限制酶切位点，从而导致获得分别为144bp和29bp的两个片段。
从具有两个标记L273和L246的BAC克隆3-18-9中，已经在位于这两个标记之间的区域中指定了一些寡核苷酸(表1)，以便减少它们之间的间隔和确定Vat基因的界限。
标记V432由下列引物定义：
V432：AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC(SEQ ID NO：15)
和
V432R：TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG(SEQ ID NO：16)
从Védrantais品种或PI161375品种的基因组DNA中获得的扩增产物长432bp。PI161375品种的扩增产物具有一个对于酶HaeII的限制酶切位点，从而导致获得分别为223bp和209bp的两个片段。
该限制酶切位点在Védrantais品种中不存在。
标记V681由下列引物定义：
V681：GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG(SEQ ID NO：11)
和
V681R：GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC(SEQ ID NO：12)
从Védrantais品种或PI161375品种的基因组DNA中获得的扩增产物长681bp。PI161375品种的扩增产物具有两个对于酶RsaI的限制酶切位点，从而导致获得分别为435b、221bp和25bp的三个片段。这些限制酶切位点在Védrantais品种中不存在。
标记V1684由下列引物定义：
V588：CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG(SEQ ID NO：13)
和
V551R：GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC(SEQ ID NO：14)
在Védrantais品种中扩增出的片段长大约1300bp，而在PI161375品种中，扩增物长1684bp。在这种情况下，涉及大小的多态性。
这些标记以及标记D、E和M8(参见下文中的实施例4)，和定义这些标记的寡核苷酸显示在下面的表1中：
表1
| 标记 | 寡核苷酸 | 5′-寡核苷酸序列-3′ |
| L273 | F2-B2 | GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT(SEQ ID NO：7) |
| F2-Br | TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC(SEQ ID NO：8) | |
| L246 | F2-B2Eco | ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC(SEQ ID NO：9) |
| F2 Eco | GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA(SEQ ID NO：10) | |
| V681 | V681 | GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG(SEQ ID NO：11) |
| V681R | GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC(SEQ ID NO：12) | |
| V1684 | V588 | CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG(SEQ ID NO：13) |
| V551R | GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC(SEQ ID NO：14) | |
| V432 | V432 | AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC(SEQ ID NO：15) |
| V432R | TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG(SEQ ID NO：16) | |
| GRP805 | GRP805 | ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC(SEQ ID NO：17) |
| GRP805R | AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC(SEQ ID NO：18) | |
| M8 | M8 | CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG(SEQ ID NO：19) |
| M8R | TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA(SEQ ID NO：20) | |
| 标记E | LRR1 | CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC(SEQ ID NO：21) |
| LRR842R | CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC(SEQ ID NO：22) | |
| 标记D | LRR915 | AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC(SEQ ID NO：23) |
| LRR1R | GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC(SEQ ID NO：24) |
这些寡核苷酸的组合(表2)已经用于扩增来自杂交的回交植物[F1(Védrantais×PI161375)×Védrantais]的DNA，这些植物在Vat座位附近出现重组事件。
表2
| 标记 | L273 | GRP805 | V432 | V1684 | Vat | V681 | L246 | M8 | |
| Oligo1 | F2-B2 | GRP805 | V432 | V588 | 表型：对于棉蚜的侵袭和对于病毒传播的抗性 | V681 | F2-B2Eco | M8 | |
| Oligo2 | F2-Br | GRP805R | V432R | V551R | V681R | F2 Eco | M8R | ||
| 消化之后扩增 | 消化 | BsrGI | SapI | HaeII | 没有消化 | RsaI | EcoRV | Aat II | |
| Védrantais | 153bp+28bp29bp | 805bp | 432bp | 大约1300bp | 681bp | 173bp | 228bp | ||
| PI161375 | 182bp+28bp | 805bp+508bp297bp | 223bp+209bp | 1684bp | 435bp+221bp+25bp | 144bp+29bp | 195bp+33bp | ||
| 植物的编号 | P20 82 | - | + | + | + | R | + | + | + |
| P6 93 | - | - | + | + | R | + | + | + | |
| P1 47 | - | - | + | + | R | + | + | + | |
| 848 | - | - | - | - | S | - | - | + | |
| P4 23 | + | - | - | - | S | - | - | - | |
| P11 74 | + | - | - | - | S | - | - | - | |
| P35 35 | + | - | - | - | S | - | - | - | |
| P35 53 | + | + | - | - | S | - | - | - | |
| 310 | + | + | - | - | S | - | - | - | |
| P26 64 | + | + | + | - | S | - | - | - | |
| P10 35 | + | + | + | - | S | - | - | - | |
| P49 40 | + | + | + | + | R | + | - | - |
这些结果表明：
植物P26 64在标记V432和Vat基因之间出现一个重组事件。
植物P49 40在标记L246和Vat基因之间出现一个重组事件。
植物P10 35在标记V1684和Vat基因之间出现一个重组事件。由于标记V1684包含Vat基因的ATG，所以这一植物显现出破坏该基因功能的基因内重组。
标记V681与Vat基因共分离。
因此，这些资料使得能够在遗传上鉴定出Vat基因。
实施例2：Vat基因序列的亚克隆和检查
在载体pGEM3Zf+(Promega)中进行Vat基因的亚克隆。为了这一操作，用限制性酶MscI消化BAC克隆3-18-9。将这样产生的每一个片段连接入载体pGEM3Zf+(Promega)中，然后用围绕Vat基因或位于该基因内的标记进行筛选。
鉴定出了一个包含Vat基因的18185bp的克隆(克隆C7.1)。克隆C7.1的末端和核酸内切酶限制性的测序以及具有表1的寡核苷酸的Vat基因的测序使得能够确认与Vat基因非常相关。该克隆的11097bp的一部分序列显示在图1中，以及显示在附件的序列表中(SEQ ID NO：1)。
实施例3：Vat基因的cDNA的获得
通过使用Marathon cDNA clone kit(Clontech)这一试剂盒获得了cDNA。该cDNA显示在附件的序列表中，编号为SEQ ID NO：2。
Vat基因具有4个外显子和3个内含子：
第一个外显子有2367bp，并从起始密码子ATG的碱基1(相当于SEQ ID NO：1的2344位)延伸至碱基2367(相当于SEQ ID NO：1的4710位)。
第一个内含子从碱基2368延伸至碱基2921(SEQ ID NO：1的4711至5264)。
第二个外显子从碱基2922延伸至碱基4055(SEQ ID NO：1的5265至6398)。
第二个内含子从碱基4056延伸至碱基4876(SEQ ID NO：1的6399至7219)。
第三个外显子从碱基4877延伸至碱基5734(SEQ ID NO：1的7220至8077)。
第三个内含子从碱基5735延伸至碱基5833(SEQ ID NO：1的8078至8176)。
第四个外显子从碱基5834延伸至碱基5896(SEQ ID NO：1的8177至8239)。
实施例4：Vat基因和Vat-like基因之间的差异
在先前的筛选期间，鉴定出了一个具有Vat基因的同源物(Vat-like)的克隆(在核酸水平上具有93.8％的同一性，和在蛋白质水平上具有89.9％的同一性)。Vat-like的序列显示在附件的序列表中，编号为SEQ ID NO：4。
由于Vat基因和Vat-like基因相距17kb，所以它们在遗传和物理上是相关的。
两个标记(标记D和标记E)使得能够在PI161375中区分Vat基因和Vat-like基因。
标记E由下列引物定义：
LRR1：CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC(SEQ ID NO：21)
和
LRR842R：CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC(SEQ ID NO：22)
该标记使得能够在PI161375中扩增出一个相应于Vat基因的1722bp的片段，和一个相应于Vat-like基因的1527bp的片段。
从Védrantais品种的基因组DNA中获得的扩增产物在琼脂糖凝胶上具有大约1.3kb的长度。
标记D由下列引物定义：
LRR915：AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC(SEQ ID NO：23)
和
LRR1R：GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC(SEQ ID NO：24)
该标记使得能够在PI161375中扩增出一个相应于Vat基因的1549bp的片段，和一个相应于Vat-like基因的1372bp的片段。在Védrantais中，该标记使得能够扩增出4个大约750bp、900bp、1100bp、1300bp的DNA片段。
标记L246和M8使得能够表征Vat基因和Vat-like基因之间的重组体，和在遗传上区分这两个基因。
标记M8由下列引物定义：
M8：CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG(SEQ ID NO：19)
和
M8R：TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA(SEQ ID NO：20)
从Védrantais品种和PI161375品种的基因组DNA中获得的扩增产物长228bp。PI161375品种的扩增产物具有一个对于酶AatII的限制酶切位点，从而导致获得分别为195bp和33bp的两个片段。
事实上，在回交种群[F1(Védrantais×PI161375)×Védrantais]中已经鉴定出了Vat基因和Vat-like基因之间的重组植物。这些只具有Vat-like基因的植物对于棉蚜是敏感的，例如植物848(表2)。相反地，不具有Vat-like基因的植物对于蚜虫(棉蚜)是有抗性的，例如植物P4940(表2)。
实施例5：含有Vat基因的表达载体的构建
将没有其启动子的Vat基因的基因组DNA引入双元载体pBin 61(BENDAHMANE等人，The Plant Journal 32，195-204，2002；该序列也能够在以下网址获得：
http：//www.sainsbury-laboratory.ac.uk/david-baulcombe/Services/pBin61.doc)中，该双元载体特别地含有嵌合基因NOS/NPTII、卡那霉素抗性选择标记和启动子p35S。将Vat基因以有义方向引入至启动子p35S之后。将载体pBin 61导入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的不同菌株(LBA4404、C58C1-pch32)中。
作为另一种选择，将完整的基因组DNA在游离端引入载体SLJ7292(JONES等人，Transgenic Research，1，285-30 297，1992)和pBin19(BEVAN等人，Nucleic Acids Res 12：8711-8721，1984)中，该完整的基因组DNA含有Vat基因的上游和下游大约2.5kb，以确保启动子和调控序列的存在。将含有Vat基因的双元载体SLJ7292和pBin 19导入根癌土壤杆菌的不同菌株(LBA4404、C58C1-pch32、C58C1-pMP90(SCHWEITZER等人，Plasmid，4(2)，196-204，1980；GOODNER等人，Science，294(5550)，2323-2328，2001)或C58pGV2260(DEBLAERE等人，Nucleic Acids Res.13，4777-4788，1985))中。
表3显示了根据植物所使用的构建体。
表3
| 名称 | 启动子 | 菌株 | 质粒 | 抗生素 | 植物 |
| B1-1 | Vat | C58C1-pch32 | pBin 19 | 卡那霉素(50mg/L) | 甜瓜，西红柿 |
| B1-3 | Vat | C58C1-pMP90 | pBin 19 | 卡那霉素(50mg/L)艮他霉素(20mg/L) | 甜瓜，西红柿，棉花 |
| pGV2260Vat-Vat | Vat | C58C1-pGV2260 | pBin 19 | 卡那霉素(50mg/L)羧苄青霉素(50mg/L)利福平(50mg/L) | 棉花 |
| Vat11.1 | Vat | LBA4404 | SLJ7292 | 四环素(5mg/L)链霉素(300mg/L)利福平(50mg/L) | 棉花 |
| A6-3 | 35S | C58C1-pch32 | pBin 61 | 卡那霉素(50mg/L)四环素(5mg/L) | 甜瓜，西红柿，棉花 |
| 35C | 35S-GUS | LBA4404 | pBI121 | 卡那霉素(50mg/L) | 甜瓜 |
实施例6：在甜瓜中的功能验证
-遗传转化的甜瓜植物的获得
下面的方案是从GUIS等人的方案(Scientia horticulturae，84，91-99，2000)开始进行调整的。
将Védrantais品种(VILMORIN)的敏感性甜瓜的叶的幼外植体在根癌土壤杆菌的悬浮液(106-108细胞/mL)中搅拌培养30分钟。用实施例5中所述的构建体实施转化。
然后将潜在转化的外植体转移到1号Whatman纸上10分钟，随后在含有1μM 6-苄氨基嘌呤(BAP)、1μM 6-(g，g-二甲基烯丙基氨基)-嘌呤(2iP)、0.2mM乙酰丁香酮和0.7g/L琼脂的协同培养培养基中于27℃暗培养2天。
叶外植体的再生是通过采用KATHAL等人(Plant Cell Reports，7，449-451，1988)所述的条件并作某些改动而完成的。将这些叶外植体转移至再生培养基上，该再生培养基由添加有1μM 6-苄氨基嘌呤(BAP)、1μM 6-(g，g-二甲基烯丙基氨基)-嘌呤(2iP)的MURASHIGE和SKOOG(MS)培养基(Physiol.Plant，15，473-497，1962)组成，且含有100mg/L卡那霉素和225mg/L特美汀，并在0.7g/L的琼脂中凝固。
在培养3个星期之后，将在叶外植体上形成的芽切除，并在生长培养基上培育，该生长培养基由添加有1μM BAP和0.3μM赤霉酸(GA3)的MS培养基组成，且含有100mg/L卡那霉素和225mg/L特美汀，并在0.7g/L的琼脂中凝固。
然后，将芽置于生根培养基中，该生根培养基由没有生长调节剂并含有同样数量的抗生素和琼脂的MS培养基组成。
一旦出现根，就根据GUIS等人的方法(Scientia horticulturae，69，199-206，1997)使这些植物幼苗(plantule)适应气候，并依照AYUB等人(Nature Biotechnology，14，862-866，1996)所述的培养实践经验转移至温室中。
将经再生和生根的植物通过流式细胞计量法进行分析。只保留二倍体植物，并在分子水平上用PCR进行研究以检验转基因的存在。
为了揭示Vat基因的存在，使用如实施例1所述的位于Vat启动子水平的引物对V1684(SEQ ID NO：13和14)和位于Vat基因中的引物对D(SEQ ID NO：23和24)。
PCR的条件如下：
反应混合物：水补足至10μL；10×缓冲液1μL；dNTP’s(4mM)0.6μL；引物1(10pM)0.4μL和引物2(10pM)0.4μL；Taq Takara(5U/μL)0.08μL；DNA 1.2μL。
-所使用的PCR的条件：
阶段1：94℃2分钟
阶段2(变性)：94℃30秒
阶段3(配对)：60℃45秒
阶段4(延伸)：72℃2分钟
阶段5：30个循环的阶段2至阶段4
阶段6：72℃10分钟
b-为了揭示卡那霉素抗性基因nptII的存在，使用引物
Kana II：5′-CCGGCTACCTGCCCATTC-3′(SEQ ID NO：25)
和Kana III：5′-GCGATAGAAGGCGATGCG-3′(SEQ ID NO：26)
其条件为：
-反应混合物：水补足至10μL；10×缓冲液1μL；MgCl2(25mM)0.6μL；dNTP’s(4mM)0.2μL；引物1(10pM)0.4μL和引物2(10pM)0.4μL；Taq Promega(5U/μL)0.04μL；DNA 1.2μL。
-所使用的PCR的条件：
阶段1：94℃2分钟
阶段2(变性)：94℃30秒
阶段3(配对)：53℃1分钟
阶段4(延伸)：72℃1分钟
阶段5：30个循环的阶段2至阶段4
阶段6：72℃10分钟
c-为了检验没有任何扩增是由于在所研究的组织存在残留的细菌而引起的，将植物同样地用PCR进行测试，该PCR使用对于根癌土壤杆菌的菌株C58的染色体DNA特异的引物PicA+(ATGCGCATGAGGCTCGTCTTCGAG；SEQ ID NO：27)和PicA-(GACGCAACGCATCCTCGATCAGCT；SEQ ID NO：28)；反应混合物和PCR的反应条件与对于nptII基因所使用的相同。
从实施例5中所示的不同的构建体开始，对于甜瓜进行几个系列的转化。这些转化的结果概括在表4中。
表4
| 基因型 | 构建体 | 培养的外植体的数量 | 生根的二倍体植物的数量 | PCR阳性的二倍体植物的数量 | |||
| nptII | Vat标记V1684 | Vat标记D | PicA+/PicA- | ||||
| Védrantais | B1-1 | 100 | 2 | 2* | 2* | 2* | 0 |
| Védrantais | B1-3 | 106 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Védrantais | A6-3 | 112 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Védrantais敏感性的对照 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| PI161375抗性的对照(Vat) | 0 | + | + | 0 | |||
*将从构建体B1-1开始在同样的外植体上获得的两个Védrantais甜瓜二倍体植物(M1和M4)鉴定为携带有包含nptII和Vat基因的插入片段。
通过这第一方案已经获得了两个携带有Védrantais基因型的Vat基因的转化体。
将生根的二倍体植物于体外扦插在没有抗生素的培养基上，然后分株并于4个星期内在气候室中适应气候(于18℃黑暗8小时-于24℃光照16小时)，之后进行生物测试。
作为另一种选择，同样也可以采用在专利EP0412912(LIMAGRAIN)中所述的子叶外植体的遗传转化方法。已经将大约10000个C1Tz1甜瓜基因型的外植体用携带有pVat-Vat基因这一构建体的细菌C58C1pmp90进行接种。将在具有100mg/L卡那霉素的培养基上再生并生根的植物用PCR进行分析以检验转基因的存在：nptII和Vat。所使用的引物和PCR条件如上所述。27个转化事件鉴定为nptIl基因的携带者。
总之，通过第一方案获得了2个携带有Védrantais基因型的Vat基因的转化体，和通过第二方案获得了27个转化体。
-对于棉蚜侵袭的抗性的测量
使用在甜瓜上收集的并被描述为克隆13(LUPOLI等人，Entomologia Experimentalis et Applicata，65，291-300，1992)的克隆Nm1(G.LABONNE，INRA，Montpellier)。于培养室中在Védrantais甜瓜上饲养蚜虫(棉蚜)(于24℃光照16小时，和于18℃黑暗8小时)。
将来自遗传转化试验的植物以及来自对照植物进行体外发芽的植物进行10天的体内适应气候。
对于棉蚜侵袭的抗性的测试从PITRAT和LECOQ(Phytopathology，70，958-961，1980)的方案进行了调整。用细的刷子将无翅的成虫取出，并置于培养皿中禁食1小时。将10只蚜虫放置在每株待测试的植物的两片展开的叶子上。在放置之后48小时，计量定居在叶子上的蚜虫数量。在48小时，在敏感的植物上定居有10只放置的蚜虫，然而在抗性的植物上只有几只蚜虫(通常少于5只)停留在叶子上。在侵害之后7天，观察成体蚜虫和幼虫的数量以及它们的发育阶段。在这一时期之后，在敏感的植物上产生新一代的蚜虫(平均存在超过100只蚜虫)和存在大量的幼虫(同样超过100只)。在抗性的植物上，几只成虫(通常少于5只)残留在叶子上，和只存在有几只发育不良的幼虫(少于30只)。在每个测试中，所使用的敏感性的对照是Védrantais栽培种，和抗性的对照是对于Vat座位纯合的Margot栽培种。
所得的结果显示在表5和6中：
表5
| 植物 | 测试的植物数量 | 于48小时观察 | 于7天观察 | ||
| 抗性的植物数量 | 敏感的植物数量 | 抗性的植物数量 | 敏感的植物数量 | ||
| Védrantais敏感性的对照 | 10 | 0 | 10 | 0 | 10 |
| Margot抗性的对照 | 10 | 10 | 0 | 10 | 0 |
| M1 | 8 | 7 | 1 | 7 | 1 |
| M4 | 12 | 12 | 0 | 12 | 0 |
表6
| 植物 | 于48小时的个体的平均数量 | 于7天的个体的平均数量 | ||
| 成虫 | 幼虫 | 成虫 | 幼虫 | |
| Védrantais敏感性的对照 | 9.7 | 84 | 116 | 128 |
| Margot抗性的对照 | 2.5 | 3.2 | 1.1 | 18 |
| M1 | 3.6 | 17* | 8.7* | 34* |
| M4 | 3.2 | 10 | 4.5 | 30 |
*在抗性的植物上进行估算的
作为另一种选择，可以在每株待测试的植物的叶子上放置3只蚜虫而不是10只。蚜虫可以放在笼中也可以不放。在放置蚜虫7天之后。计数存在于植物上的成体蚜虫和幼虫的数量。
所得的结果显示在表7中：
表7
| 克隆的编号 | 经适应气候的植物幼苗数量 | 经接种的植物幼苗数量 | 抗性的植物幼苗数量 | “中间的”植物幼苗数量 | 敏感的植物幼苗数量 | 备注 |
| C1Tz1 | 5 | 5 | 0 | 0 | 5 | 敏感的对照 |
| C1Tz3 | 5 | 5 | 5 | 0 | 0 | 抗性的对照 |
| V2.3 | 9 | 9 | 0 | 0 | 9 | 敏感 |
| V2.4 | 6 | 4 | 2 | 2 | 0 | 存在花蕾 |
| V2.12 | 12 | 11 | 0 | 0 | 11 | 敏感 |
| V2.15 | 6 | 6 | 6 | 0 | 0 | 抗性 |
| V3.1 | 12 | 12 | 12 | 0 | 0 | 抗性 |
| V3.6 | 4 | 4 | 4 | 0 | 0 | 抗性 |
| V4.18 | 7 | 7 | 7 | 0 | 0 | 抗性 |
| V4.45 | 7 | 7 | 0 | 0 | 7 | 敏感 |
| V7.19 | 7 | 7 | 7 | 0 | 0 | 抗性 |
| V7.25 | 7 | 7 | 0 | 0 | 7 | 敏感 |
| V8.26 | 8 | 7 | 0 | 0 | 7 | 敏感 |
这些结果显示，克隆M1、M4、V2.15、V3.1、V3.6、V4.18和V7.19对于蚜虫具有抗性。
-对于经棉蚜的病毒传播的抗性的测量
病毒传播的测试基本上如PITRAT和LECOQ(Phytopathology，70，958-961，1980)所述来进行。可以将CMV(黄瓜花叶病毒)的毒株I17F用于在转化的植物和Védrantais与Margot对照品系中测试经棉蚜的传播。病毒通过机械接种而在Védrantais甜瓜上增殖。在禁食1小时之后，将成体蚜虫放置在置于培养皿中的经病毒感染的叶子上以获取病毒5分钟。然后将蚜虫转移至待测试的植物上。在放置了带病毒的蚜虫大约15分钟之后，用刷子回收蚜虫，然后用杀虫剂处理植物并置于培养室(于24℃光照12小时，和于18℃黑暗12小时)中。在接种15天之后，对于经棉蚜的CMV传播敏感的植物形成严重的花叶症状。抗性的植物不显示出任何的症状，而且在这些植物中用ELISA没有检测到病毒。ELISA测试根据CLARK和ADAMS(J.Gen.Virol.，34，475-483，1977)所述的方案用抗CMV的衣壳蛋白的抗体(ADGEN，fourni par la sociétéLCA，Bordeaux，France)来进行。
实施例7：在西红柿中的功能验证
-西红柿的转化
转化方案由P.Rousselle(INRA，Montfavet，France)从HAMZA和CHUPEAU(J.Exp.Bot.，44，1837-1845，1993)的方案进行了调整，该转化方案是从几个基因型Férum(INRA品系)和Montfavet63.5(杂交F1代)的子叶开始的。
用于转化的菌株为在实施例5中所描述的那些。将经再生和生根的植物通过流式细胞计量法进行分析，并只保留二倍体植物。
通过PCR和RT-PCR进行分子分析，以检验包含nptII基因和Vat基因的插入片段的存在，以及其在再生植物的基因组中的表达。所采用的PCR条件与在实施例6中所述的相同。使用4对引物：位于Vat启动子水平的V1684(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)，位于Vat基因中的标记D(SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24)和E(SEQ ID NO：21和SEQ IDNO：22)的引物对，和扩增出位于该基因3′端的片段的引物对V632。引物对V632的序列如下：
Vat 632R：CTGGTGATGACATTCATATCTTCC(SEQ ID NO：29)
Vat 632F：CCCAGCAACATACTGATTCCAAGC(SEQ ID NO：30)
从不同的构建体(表8)开始，对于西红柿进行几个系列的转化，这是对于两个不同的基因型Ferum和Montfavet(INRA)来进行的。
表8
| 基因型 | 构建体 | 培养的外植体的数量 | 生根的二倍体植物的数量 | PCR阳性的植物的数量 | |||||
| nptII | Vat标记V1684 | Vat标记E | Vat标记D | Vat标记V632 | PicA+/PicA- | ||||
| Ferum | B1-1 | 120 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ferum | B1-2 | 105 | 3 | 3 | 3 | 2* | 2* | 2* | 0 |
| Ferum | B1-3 | 90 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ferum | A6-3 | 120 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Montfavet | B1-1 | 90 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
| Montfavet | B1-2 | 80 | 6 | 6 | 3 | 4 | 4 | 4 | 0 |
| Montfavet | B1-3 | 80 | 3 | 3 | 3 | 2 | 2 | 2 | 0 |
| Montfavet | A6-3 | 91 | 11 | 10 | ** | 9 | 10 | 10 | 0 |
| Ferum非转化的敏感性的对照 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| Montfavet敏感性的对照 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
*两株植物(T2和T7)中整个地整合有插入片段。在第三株植物中，只整合有nptII基因和Vat基因的一部分(包括标记V1684)。
**构建体A6-3含有位于35S启动子调控之下的Vat基因；引物对V1684(位于Vat启动子的一个区域)不能允许筛选转化体。
用标记D的引物对通过RT-PCR对于植物T7和Ferum对照进行分子分析(根据实施例6中所述的条件)使得能够揭示Vat基因在转化的植物(T7)中的表达。
全部的用于Montfavet基因型的转化植物的引物使得能够确定14株来自不同外植体的植物整合有完整的转基因。
总之，2株Ferum基因型的植物和14株Montfavet 63.5基因型的植物整合有Vat基因。
只将经转化的植物扦插、分株和于4个星期内在气候室中适应气候(于18℃黑暗8小时-于24℃光照16小时)，之后进行生物测试。当天只分析2株Ferum植物。
-病毒传播的测量
使用与对于在甜瓜上测试病毒传播抗性相同的棉蚜品种(Nm1)和同样的经棉蚜的传播方案。所选择的病毒为CMV(黄瓜花叶病毒)毒株I17F，其感染甜瓜和西红柿。该毒株在通过机械接种或经桃蚜传播时能有效地传播至西红柿中(JACQUEMOND等人，Molecular Breeding，8(1)，85-94，2001)。该病毒在Védrantais甜瓜的植物幼苗上增殖。棉蚜获取CMV是在感染的甜瓜的这些植物幼苗上完成的。在处于5叶阶段的来自体外培养的西红柿植物幼苗上，或者在处于2叶阶段的来自播种的植物幼苗(播种之后大约5个星期)上，通过将10只带病毒的蚜虫放置在每株植物上完成了传播过程。对于每个基因型(对照西红柿和转化的西红柿)的传播率通过20株植物的至少2次重复来进行评测。敏感性的对照品种为Férum品种。
ELISA测试根据CLARK和ADAMS(J.Gen.Virol.，34，475-483，1977)所述的方案用抗CMV的衣壳蛋白的抗体(ADGEN，fourni par lasociétéLCA，Bordeaux，France)来进行。
对于少数植物所获得的主要结果描述于表9中。
表9
| 植物 | 测试植物的数量 | 侵染后21天所进行的评测 | |
| 感染的植物数量 | 未感染的植物数量 | ||
| Ferum敏感性的对照 | 6 | 6 | 0 |
| Ferum T1 | 9 | 9 | 0 |
| Ferum T2 | 3 | 2 | 1 |
| Ferum T7 | 6 | 3 | 3 |
*没有症状且经ELISA未检测到病毒
携带有截短的Vat基因的编号T1的植物和敏感的对照植物100％被感染。在编号T12和T7的某些转化植物中，病毒没有传播，这表明Vat基因可能在具有完整的Vat的转基因西红柿中在对于经棉蚜的病毒传播的抗性方面发挥着作用。
实施例8：在棉花中的功能验证
-棉花的转化
棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum L.))的遗传转化基于由SHOEMAKER等人(Plant Cell Reports，3，178-181，1986)以及TROLINDER和GOODIN(Plant Cell Reports，6，231-234，1987)发表的通过体细胞胚胎发生过程的转化体再生。该转化方法根据UMBECK等人(Biotechnology，5，263-266，1987)以及FIROOZABADY等人(PlantMolecular Biology，10，105-116，1987)所述使用细菌根癌土壤杆菌作为转化载体，但相对于所提及的出版物作了某些修改和调整。用于转化的土壤杆菌菌株与在实施例5中所述的菌株相同，特别是LBA4404、C58C1pGV2260和C58C1pMP90菌株。第一个菌株或者含有质粒pSLJ7292，或者含有质粒pBin 61，质粒pSLJ7292除了其他之外由处于Nos启动子调控之下的卡那霉素抗性基因和处于其本来的启动子调控之下的Vat基因构成，质粒pBin 61含有处于35S启动子调控之下的Vat基因。另两个菌株携带有质粒pBin 19，该质粒除了其他之外由处于Nos启动子调控之下的卡那霉素抗性基因和处于其本来的启动子调控之下的Vat基因构成。
-棉花的再生
使用下胚轴的外植体(Coker 310品种)，其是在于无菌条件下培育的幼小植物上采集的。将这些外植体在土壤杆菌存在下放置20分钟，然后在培养基(基础培养基)上培养48小时，该培养基由MURASHIGE和SKOOG(MS)的矿物元素、30g/L葡萄糖、MOREL和WETMORE(Am.J.Bot.38，141-143，1951)的维生素、0.1-0.05mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.1-0.01mg/L激动素组成。该培养基既不含有选择试剂，也不含有为了阻止细菌增长的抗生素。在该协同培养时期之后，将这些外植体移栽至添加有25mg/L卡那霉素和500mg/L头孢氨噻肟的同样的培养基上。然后，每隔15天将这些外植体移栽至这一同样的培养基上。在培养3-5个星期之后，出现来自转化细胞增殖的愈伤组织。当愈伤组织的大小达到大约0.5cm的直径时，将它们分离并移栽至同样的培养基上，在该培养基中头孢氨噻肟的浓度降低一半，和生长物质(2，4-二氯苯氧乙酸和激动素)的浓度同样也降低。然后每隔2个星期进行一次移栽，直至出现胚胎组织。根据愈伤组织的情况，可以应用一系列在生长物质浓度方面变化的培养基。在没有添加生长物质的基础培养基上分离胚胎组织。在该培养基上，一定比例的原胚发育成植物幼苗。将这些植物幼苗用管转移至由液体基础培养基“浇灌的”蛭石支持物之上，该液体基础培养基不含生长物质，和其中蔗糖代替了葡萄糖。当它们达到大约4-6cm大小时，将它们直接转移至S2型温室中。
通过PCR进行分子分析，以检验Vat基因的存在，以及其在再生植物的基因组中的表达。使用一对引物用于扩增npt II基因。对于Vat基因使用两对引物：第一对指定的引物632扩增位于Vat基因3′端的Vat片段，第二对指定的引物LRR扩增位于Vat基因之中的片段。
用于扩增npt II基因的引物对的序列如下：
Kana III：GCGATAGAAGGCGATGCG(SEQ ID NO：26)
Kana R：CCGGCTACCTGCCATTCG(SEQ ID NO：31)
引物对632的序列如下：
Vat 632F：CCCAGCAACATACTGATTCCAAGC(SEQ ID NO：30)
Vat 632R：CTGGTGATGACATTCATATCTTCC(SEQ ID NO：29)
引物对LRR的序列如下：
LRR F：GTTGTTGAGAGCAATAGTGTAC(SEQ ID NO：32)
LRR R：CCTTAGAGAAGAATGAAGTCTC(SEQ ID NO：33)
无论使用何种引物，PCR的条件如下：
对于25μL的反应介质：
水9.5μL
10×缓冲液：2.5μL
dNTP(2.5mM)：2μL
Oligo 1(10μM)：2.5μL
Oligo 2(10μM)：2.5μL
Taq(5U/μL)：0.25μL
DNA：5μL
程序：
94℃3分钟
然后35个循环：94℃30秒-59℃45秒-72℃45秒。
总之，在8个月之后，将12株转化的植物转移至温室中；它们来自5个不同的胚胎发生来源。在这些之中，2株植物来自2个不同的来源，对于这2个来源在上述PCR条件下扩增出了Vat基因。其他的植物来自这样的来源，即对于这些来源扩增出了npt II基因而不是Vat基因。它们在这样的情况下可能表现为假阴性，即随着基质(matrice)量的改变可能用原先证明为阴性的提取物获得大小适当的扩增。
-对于棉蚜的侵害的抗性的测量
使用在棉花(留尼汪岛地区)上提取的棉蚜的一个克隆，并让其保留在棉花上。事实上，已经证明了，根据宿主植物棉蚜种群在遗传上具有紧密的结构(VANLERBERGHE-MASUTTI和CHAVIGNY，Molecular Ecology，7，905-914，1998)。测试根据与对于甜瓜同样的方案来进行，但培养条件是调整为棉花的植物的培养条件。将棉花于28℃-30℃的温度下保持在S2型温室中，并在强度和持续时间方面提供补充照明以达到12-12的光周期。
除了如对于甜瓜测试所进行的抗性评测之外，同样还可以进行有关转化植物上的蚜虫生活史(幼虫不同阶段的持续时间，成虫存活的时间，内在增长率，...)(XIA等人，Entomologia Experimentalis et Applicata，90，25-35，1999)的更精确的评测，以便检测在异源情况下Vat基因对于棉蚜可能更弱的作用。
序列表
<110>GENOPLANTE-VALOR
DOGIMONT，Catherine
BENDAHMANE，Abdelhafid
PITRAT，Michel
BURGET-BIGEARD，Emilie
HAGEN，Lynda
LE MENN，Aline
PAUQUET，Jérme
ROUSSELLE，Patrick
CABOCHE，Michel
CHOVELON，Véronique
<120>对棉蚜的抗性基因
<130>MJPbv1516/11
<150>FR 03 00287
<151>2003-01-13
<160>33
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>10922
<212>DNA
<213>香瓜
<220>
<221>外显子
<222>(2344)..(4710)
<223>
<220>
<221>内含子
<222>(4711)..(5264)
<223>
<220>
<221>外显子
<222>(5265)..(6398)
<223>
<220>
<221>内含子
<222>(6399)..(7219)
<223>
<220>
<221>外显子
<222>(7220)..(8077)
<223>
<220>
<221>内含子
<222>(8078)..(8176)
<223>
<220>
<221>外显子
<222>(8177)..(8239)
<223>
<400>1
ccggagtgta cataataagg agacaccatc acaagtcttg aagctttggc gctcttgaaa 60
ttcagctttt aaattaatta gtcatgtttt tcaaatatat aacataggag aatatgagtt 120
ttgcgtcaaa tcccatcttg gcagagtgta ttttgatgaa attccttatt ggaaggaact 180
gccatatttt tagaatttgg aatctgtaaa gttattctca tgtggttttt tgggcagtgg 240
agggagttgg agaagttgat tggtgtgcag atctatgtat aggacagatc attgaagagg 300
aaaaaagaat tggaatatta gggatttggt taattaagca atatgggaag ttggatttca 360
gaattgcaat tcatgattgg gtttcgattt aggaagaatg gacttgcaaa ttcaatttaa 420
cataaaattt cttttttttt tcctaaatta atttttattt gatcttcgga ctcatccaat 480
gcaatttaca ggtcactaca aacaatatcc atgtcagcac acataacgtg tctagtagac 540
attacgttaa cttaatgtag gaaacaaaaa gaaaaacgaa aaaggcaaga aatgaaaaag 600
gaaacgttgt gtatgatgat taaaatgtac gttgatagct aaattcaact ttgttcttca 660
ttagcaacaa caagggacaa caaaatgaaa atttcagcac agttatggaa tgttgaagaa 720
gaaggtgacg agagagatgc cacatcataa aaaattaata ttataatcat ttttgtcaca 780
tcagttttct gattacttat atttaaccta cacatcattt tgccgttact caactaacga 840
tcgatatgac ctttaaagct cgatgattaa aatgtttatt ttgaactttc agggactata 900
taaatgtata tatatcaact tcaaatctta gcggtcaaaa gtgcattttg ttttagttta 960
aaacaccgag atgtgacgat taataatgcc tacacactca cgtactcaca catgcagtga 1020
gttttttatg ttttttttac acacattaga cgcaaattga attcctaatt ccattcccta 1080
agacaagttt ctaatgactt atacaattca cataggcatg catgcagaac aagcgaaaaa 1140
cgacgaattt accttaagaa aatggcccaa ccaaccactt acacaatctc aggcatacca 1200
ttccccggga tgaaagaatt ttgcctgtaa ttcattcgat ctcaggcata caatgcatcg 1260
agaagacgca aaatgaaaga caaaagtata gaacaacaca atcctgtact tcattttaaa 1320
cgatagtttt caaatttaac gatcgtgtag atcatgatac acgatctcga gccttagtgg 1380
caccgagatg gcccgagatg aaagaattat gtctttattt tattcgatat taagcataca 1440
ttacttcgag atgaaagacc tctaccttta gttattcgat ctcgagcctt aattgaatcg 1500
agatgaccca agattgatag atcgcaaaga agatatatat cgtaagggca tatatgaaat 1560
ttatgaaaat acgatcatgt gtcataaact tttcttattt tgttatatag accgtaaata 1620
ttatagattt tggttacatt tgtgtaaatt actctatttt tttttagtaa aacaaatgaa 1680
ttaaattttt taaaaaaaaa ttattgagag ttgaagtaat tgggtgtttt ctaaaagatt 1740
gaaataaata cctttattaa ctttgcaaat atattttcaa agaggctaac aaatcaaata 1800
tattttctaa aaaaatcaca ttgcgttggg gataaggtaa gagtaatgga aaaatgaaag 1860
gttgtgaaca attcgtactc ttacttatga gatttgacag aacaaatatt tttcaaatac 1920
tctttttacg ttttcttttt taaaattaaa taacaaatac ttttccactg cttttctttt 1980
cttccattga ctcctcaact aataattttg gtcttcccat tattatcttc ttcttcttca 2040
tttttctctg cactgtctct tctccatttc aacatcttct tatatcttca ttcaggttaa 2100
atatttcatc ccttaccatt tttatttaca ttttccatct gatcatttct atacttataa 2160
actcgataat ttgtttagac tttctttaga tagtttttac ttggtgatct gtatgtgttc 2220
actcctactt ttctgttagg caaaatcttc aaaattatta tggttcattc ctcgtggttt 2280
tttagctctt caagtatttt tgtaggtttt gatccttttc aagctcaaga acagaggata 2340
ata atg gac atc ctt att tca gtc act gca aaa att gcc gaa tac act 2388
Met Asp Ile Leu Ile Ser Val Thr Ala Lys Ile Ala Glu Tyr Thr
1 5 10 15
gtt gag cct gtt gga cgc caa ctt ggt tat gta ttt ttc att cgt tcc 2436
Val Glu Pro Val Gly Arg Gln Leu Gly Tyr Val Phe Phe Ile Arg Ser
20 25 30
aac ttt caa aaa ctt aag act caa gta gaa aag ctg aag att aca aga 2484
Asn Phe Gln Lys Leu Lys Thr Gln Val Glu Lys Leu Lys Ile Thr Arg
35 40 45
gag tct gtg caa cac aag atc cat agt gca aga aga aat gct gaa gac 2532
Glu Ser Val Gln His Lys Ile His Ser Ala Arg Arg Asn Ala Glu Asp
50 55 60
ata aaa cct gcc gtt gag gaa tgg ttg aaa aag gtc gat gac ttt gtc 2580
Ile Lys Pro Ala Val Glu Glu Trp Leu Lys Lys Val Asp Asp Phe Val
65 70 75
cga gaa tct gac gag ata tta gcc aat gaa ggt gga cat ggt gga ctc 2628
Arg Glu Ser Asp Glu Ile Leu Ala Asn Glu Gly Gly His Gly Gly Leu
80 85 90 95
tgt tcc acc tat ttg gtc caa cga cac aag tta agt aga aaa gca agc 2676
Cys Ser Thr Tyr Leu Val Gln Arg His Lys Leu Ser Arg Lys Ala Ser
100 105 110
aaa atg gta gat gag gtt ctt gag atg aaa aat gag ggg gaa agt ttt 2724
Lys Met Val Asp Glu Val Leu Glu Met Lys Asn Glu Gly Glu Ser Phe
115 120 125
gat atg gta tcc tat aaa agt gtt atc cca tca gtt gat tgt tca ctt 2772
Asp Met Val Ser Tyr Lys Ser Val Ile Pro Ser Val Asp Cys Ser Leu
130 135 140
cca aaa gtg cct gac ttt ctt gac ttt gag tca aga aag tcg att atg 2820
Pro Lys Val Pro Asp Phe Leu Asp Phe Glu Ser Arg Lys Ser Ile Met
145 150 155
gaa caa atc atg gat gca cta tct gat ggt aat gtc cat agg att gga 2868
Glu Gln Ile Met Asp Ala Leu Ser Asp Gly Asn Val His Arg Ile Gly
160 165 170 175
gta tat ggg atg ggg ggt gtt ggc aaa aca atg cta gtg aag gat att 2916
Val Tyr Gly Met Gly Gly Val Gly Lys Thr Met Leu Val Lys Asp Ile
180 185 190
tta aga aaa att gtg gag agt aag aag cct ttt gat gag gtg gta aca 2964
Leu Arg Lys Ile Val Glu Ser Lys Lys Pro Phe Asp Glu Val Val Thr
195 200 205
tcc acg atc agc caa aca cca gat ttt aga agt atc caa gga caa cta 3012
Ser Thr Ile Ser Gln Thr Pro Asp Phe Arg Ser Ile Gln Gly Gln Leu
210 215 220
gct gac aag cta ggt ttg aaa ttc gaa caa gaa aca ata gaa gga agg 3060
Ala Asp Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Gln Glu Thr Ile Glu Gly Arg
225 230 235
gct act att cta cga aag agg tta aag atg gag aga agt atc cta gtt 3108
Ala Thr Ile Leu Arg Lys Arg Leu Lys Met Glu Arg Ser Ile Leu Val
240 245 250 255
gtg ttg gat gat gtt tgg gag tat att gat ttg gaa act ata gga att 3156
Val Leu Asp Asp Val Trp Glu Tyr Ile Asp Leu Glu Thr Ile Gly Ile
260 265 270
cca agt gtt gaa gat cat acg ggg tgc aag atc ttg ttt acc act agg 3204
Pro Ser Val Glu Asp His Thr Gly Cys Lys Ile Leu Phe Thr Thr Arg
275 280 285
att aaa cat ttg atc tca aat caa atg tgc gcc aat aaa att ttt gag 3252
Ile Lys His Leu Ile Ser Asn Gln Met Cys Ala Asn Lys Ile Phe Glu
290 295 300
ata aaa gtt tta gga aaa gat gag tca tgg aat tta ttt aag gca atg 3300
Ile Lys Val Leu Gly Lys Asp Glu Ser Trp Asn Leu Phe Lys Ala Met
305 310 315
gca ggt gac att gtt gat gca agt gat ttg aag cct ata gcc att cga 3348
Ala Gly Asp Ile Val Asp Ala Ser Asp Leu Lys Pro Ile Ala Ile Arg
320 325 330 335
att gtg aga gaa tgt gca ggt ttg cct att gct att act act gtt gct 3396
Ile Val Arg Glu Cys Ala Gly Leu Pro Ile Ala Ile Thr Thr Val Ala
340 345 350
aag gca tta cga aat aaa cct tcc gac att tgg aat gat gcc tta gat 3444
Lys Ala Leu Arg Asn Lys Pro Ser Asp Ile Trp Asn Asp Ala Leu Asp
355 360 365
cag ctt aaa act gtt gat gtg ggt atg gca aac att gga gaa atg gaa 3492
Gln Leu Lys Thr Val Asp Val Gly Met Ala Asn Ile Gly Glu Met Glu
370 375 380
aag aaa gtg tat ttg tca cta aaa ctg agt tac gat tgc ttg gga tat 3540
Lys Lys Val Tyr Leu Ser Leu Lys Leu Ser Tyr Asp Cys Leu Gly Tyr
385 390 395
gaa gag gtg aag tta tta ttc ttg tta tgc agc atg ttt cca gaa gac 3588
Glu Glu Val Lys Leu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Met Phe Pro Glu Asp
400 405 410 415
ttt agc att gac gtg gaa ggg ttg cat gta tat gcc atg ggc atg gga 3636
Phe Ser Ile Asp Val Glu Gly Leu His Val Tyr Ala Met Gly Met Gly
420 425 430
ttc tta cat ggt gtt gat act gtg gta aaa gga cga cgt agg ata aaa 3684
Phe Leu His Gly Val Asp Thr Val Val Lys Gly Arg Arg Arg Ile Lys
435 440 445
aaa ttg gtt gat gat ctt ata tct tct tct ttg ctt caa caa tat tct 3732
Lys Leu Val Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Gln Gln Tyr Ser
450 455 460
gag tat ggg tgc aat tat gtg aaa atg cat gat atg gtt cgt gat gta 3780
Glu Tyr Gly Cys Asn Tyr Val Lys Met His Asp Met Val Arg Asp Val
465 470 475
gcc cta tta att gca tct aag aat gaa cac gta cgt aca ttg agc tat 3828
Ala Leu Leu Ile Ala Ser Lys Asn Glu His Val Arg Thr Leu Ser Tyr
480 485 490 495
gtg aaa aga tcg aat gaa gaa tgg gaa gaa gag aaa cta ttg ggt aat 3876
Val Lys Arg Ser Asn Glu Glu Trp Glu Glu Glu Lys Leu Leu Gly Asn
500 505 510
cat acc gca gtg ttc att gat ggt tta cat tat cct ctc ccg aag tta 3924
His Thr Ala Val Phe Ile Asp Gly Leu His Tyr Pro Leu Pro Lys Leu
515 520 525
acg tta ccc aaa gtt caa tta tta agg tta gtt gca aaa tat tgt tgg 3972
Thr Leu Pro Lys Val Gln Leu Leu Arg Leu Val Ala Lys Tyr Cys Trp
530 535 540
gaa cat aat aag cgt gtg tcg gtg gta gaa act ttt ttt gaa gaa atg 4020
Glu His Asn Lys Arg Val Ser Val Val Glu Thr Phe Phe Glu Glu Met
545 550 555
aaa gag ctc aaa ggt tta gta gta gaa aac gta aat ata tca ttg atg 4068
Lys Glu Leu Lys Gly Leu Val Val Glu Asn Val Asn Ile Ser Leu Met
560 565 570 575
caa cga cca tct gat gtt tac tcc tta gca aac atc aga gta tta cgt 4116
Gln Arg Pro Ser Asp Val Tyr Ser Leu Ala Asn Ile Arg Val Leu Arg
580 585 590
ttg gaa aga tgt caa tta tta ggg agc ata gat tgg att ggt gaa tta 4164
Leu Glu Arg Cys Gln Leu Leu Gly Ser Ile Asp Trp Ile Gly Glu Leu
595 600 605
aaa aag ctt gaa att ctt gat ttt agt gaa tct aac atc aca caa att 4212
Lys Lys Leu Glu Ile Leu Asp Phe Ser Glu Ser Asn Ile Thr Gln Ile
610 615 620
cct aca acc atg agc caa ttg aca cag cta aaa gtg ttg aat tta tct 4260
Pro Thr Thr Met Ser Gln Leu Thr Gln Leu Lys Val Leu Asn Leu Ser
625 630 635
tct tgt gaa caa ctt gag gta att cca cca aat att ctt tca aag ttg 4308
Ser Cys Glu Gln Leu Glu Val Ile Pro Pro Asn Ile Leu Ser Lys Leu
640 645 650 655
aca aaa ttg gaa gaa tta gat ctg gaa act ttt gat gga tgg gaa gga 4356
Thr Lys Leu Glu Glu Leu Asp Leu Glu Thr Phe Asp Gly Trp Glu Gly
660 665 670
gaa gaa tgg tat gaa gga agg aaa aat gct agc ctt tct gaa ctc aag 4404
Glu Glu Trp Tyr Glu Gly Arg Lys Asn Ala Ser Leu Ser Glu Leu Lys
675 680 685
tgc ttg cga cac ctt tat gct tta aac tta acc att caa gat gaa gaa 4452
Cys Leu Arg His Leu Tyr Ala Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asp Glu Glu
690 695 700
att atg cca gaa aac ttg ttc tta gtt ggg aag ttg aag ctt caa aaa 4500
Ile Met Pro Glu Asn Leu Phe Leu Val Gly Lys Leu Lys Leu Gln Lys
705 710 715
ttc aac att tgt att ggt tgc gaa agc aaa tta aag tat act ttt gca 4548
Phe Asn Ile Cys Ile Gly Cys Glu Ser Lys Leu Lys Tyr Thr Phe Ala
720 725 730 735
tac aag aac aga atc aaa aac ttc att gga atc aag atg gaa tca gga 4596
Tyr Lys Asn Arg Ile Lys Asn Phe Ile Gly Ile Lys Met Glu Ser Gly
740 745 750
agg tgc ttg gat gat tgg ata aaa aat ttg tta aag agg tcg gac aat 4644
Arg Cys Leu Asp Asp Trp Ile Lys Asn Leu Leu Lys Arg Ser Asp Asn
755 760 765
gtg ctt ttg gaa gga tca gtt tgt tca aag gtt ctc cac tca gaa ttg 4692
Val Leu Leu Glu Gly Ser Val Cys Ser Lys Val Leu His Ser Glu Leu
770 775 780
gta ggt gcc aat aac ttc gtaagtttgc agtatctcta cctttatgat 4740
Val Gly Ala Asn Asn Phe
785
aattcaaaat ttcaacattt tatcaacgtt agcaatacca tcaacattga agaatcattt 4800
tttagtgaaa tggtaaattt catcaacaca tttttctatg tttctatata cacatcaaaa 4860
tttataaatc acctgtttgt tcatttttat tgttccttcc acaagttcct tctaacattt 4920
gtggttagta atgatattag ggataagatt ctattcttct ttgttttaga aggctcttct 4980
cttggtgtag agagactctt tcttgtttca tacattaatg ataatatata attttagact 5040
tctaaaatat ataaatgcat gtcaggtgat attccaagaa aatttaaaga agtttattag 5100
atatttccta tctaaggaag caaatttgaa gtaatcattt tacacaattt gttatggtaa 5160
ttttaaaaca ctatataaat tatatgttgt tagttagcat cagttgtgat gatatggtta 5220
attacgttgt cacaaactga acttttaagg acgtaaattt gtag gta tca ctt cct 5276
Val Ser Leu Pro
790
aat ttg gag aag ttg gaa att gtg aat gca aag agt ttg aag atg ata 5324
Asn Leu Glu Lys Leu Glu Ile Val Asn Ala Lys Ser Leu Lys Met Ile
795 800 805
tgg agc aat aac gtg cca att ctt aat tcc ttt tcc aaa ctc gag gaa 5372
Trp Ser Asn Asn Val Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu
810 815 820 825
ata aaa att tat tca tgc aac aat ctt caa aaa gta tta ttt cct cca 5420
Ile Lys Ile Tyr Ser Cys Asn Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Pro
830 835 840
aat atg atg gac att ctc aca tgc ctt aaa gtc tta gag atc aaa aat 5468
Asn Met Met Asp Ile Leu Thr Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Lys Asn
845 850 855
tgt gat ttg ttg gaa ggg ata ttt gaa gcg caa gag cca att agt gtt 5516
Cys Asp Leu Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Gln Glu Pro Ile Ser Val
860 865 870
gtt gag agc aat aat tta ccc att ctt aat tcc ttt tcc aaa ctc gag 5564
Val Glu Ser Asn Asn Leu Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu
875 880 885
gaa ata aga att tgg tca tgc aac aat ctt caa aaa gta tta ttt cct 5612
Glu Ile Arg Ile Trp Ser Cys Asn Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro
890 895 900 905
tca aat atg atg ggc att ctt cca tgc ctt aaa gtc tta gat att aga 5660
Ser Asn Met Met Gly Ile Leu Pro Cys Leu Lys Val Leu Asp Ile Arg
910 915 920
ggt tgt gaa ttg ttg gaa ggg ata ttt gaa gtg caa gag cca att agt 5708
Gly Cys Glu Leu Leu Glu Gly Ile Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser
925 930 935
gtt gtt gag agc aat agt gta ccc att ctt aat tcc ttt tcc aaa ctc 5756
Val Val Glu Ser Asn Ser Val Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu
940 945 950
gag aaa ata aga att tgg tca tgc aac aat ctt caa aaa ata tta ttt 5804
Glu Lys Ile Arg Ile Trp Ser Cys Asn Asn Leu Gln Lys Ile Leu Phe
955 960 965
cct tca aat atg atg ggc att ctt aca tgc ctt aaa gtc tta gag atc 5852
Pro Ser Asn Met Met Gly Ile Leu Thr Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile
970 975 980 985
aga gat tgt gaa ttg ttg gaa ggg ata ttt gaa gtg caa gag cca att 5900
Arg Asp Cys Glu Leu Leu Glu Gly Ile Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile
990 995 1000
agt gtt gtt gag agc aat aat tta ccc att ctt aat tcc ttt tcc 5945
Ser Val Val Glu Ser Asn Asn Leu Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser
1005 1010 1015
aaa ctc gag gaa ata aga att ggg tca tgc aac aat ctt caa aaa 5990
Lys Leu Glu Glu Ile Arg Ile Gly Ser Cys Asn Asn Leu Gln Lys
1020 1025 1030
gta tta ttt cct cca aat atg atg ggc att ctt aca tgc ctt aaa 6035
Val Leu Phe Pro Pro Asn Met Met Gly Ile Leu Thr Cys Leu Lys
1035 1040 1045
gtc tta gag att aga cat tgt aat ttg ttg gaa ggg ata ttt gaa 6080
Val Leu Glu Ile Arg His Cys Asn Leu Leu Glu Gly Ile Phe Glu
1050 1055 1060
gtg caa gag cca att agt att gtt gaa gcg agt cct atc ttg ctc 6125
Val Gln Glu Pro Ile Ser Ile Val Glu Ala Ser Pro Ile Leu Leu
1065 1070 1075
caa aat tta tct tcg ttg atg tta tgt aat ctt cca aac ctt gag 6170
Gln Asn Leu Ser Ser Leu Met Leu Cys Asn Leu Pro Asn Leu Glu
1080 1085 1090
tac gtg tgg agc aaa aat cct tat gaa ctt ctg agt ttg gaa aat 6215
Tyr Val Trp Ser Lys Asn Pro Tyr Glu Leu Leu Ser Leu Glu Asn
1095 1100 1105
ata aaa agt ttg acc att gat aaa tgt cca aga ctt aga aga gaa 6260
Ile Lys Ser Leu Thr Ile Asp Lys Cys Pro Arg Leu Arg Arg Glu
1110 1115 1120
tac tca gtc aaa att cta aag caa ctt gaa gat gta agc ata gat 6305
Tyr Ser Val Lys Ile Leu Lys Gln Leu Glu Asp Val Ser Ile Asp
1125 1130 1135
atc aaa caa ttg atg aag gtt att gag aag gaa aag tca gca cat 6350
Ile Lys Gln Leu Met Lys Val Ile Glu Lys Glu Lys Ser Ala His
1140 1145 1150
cat aat atg ttg gaa tca aag caa tgg gag act tca tct tct tct 6395
His Asn Met Leu Glu Ser Lys Gln Trp Glu Thr Ser Ser Ser Ser
1155 1160 1165
aag gtacgtatat attctacaag aaaacatgtt tgttcaattt aattttcaga 6448
Lys
aaataaattg ttttcaagaa ttagttgaac agaattggtt ctgttagttg aacagagttt 6508
taaagaaaac aaattattat gtttgttcta gaaacctatg gaaattagtg ttattagggg 6568
ttaattattt acctgaatta aaaaagaata agcaagtaaa ccgcttaatt ttaatatgtt 6628
tatcaataga aattaggatc cgtttggatt gacttgaatg atatgttttc ctggaaagaa 6688
actcattttt gtttgaactc atttttatga aaattggcta aaatatattt aaaaaattag 6748
gtggctttca aatattcaat ttttttttta aaataactta ttttttgaat taaacactcc 6808
aaaatgtaat tcaaaaacac ccctaagtta attagatata taattaatac ataaattaat 6868
taattttatt tagttgagtt aaattagttt taatgcaaac aataatatat ttttatagcc 6928
aatatacaag aatgaaagta agaaaagaag acaaaaaaaa atgatatgtt aattagaatt 6988
ttacataaag aatgatctga ttaaaagcta atctctatcg atatagtttt ttaattatat 7048
taaatatagt aagtagtcca ttataataat tgaatttttt tgtaccaaat taattaaact 7108
aattcttttt actaattatt gaatatttaa gatatttttg gctaattaat taataatttg 7168
tgtgcaaata taagttatta ttgcatttat ttaatagatt ttgatcatca g gat ggg 7225
Asp Gly
gtt cta cgg ctg gga gat ggt tct aag ttg ttt cca aat ctt aaa 7270
Val Leu Arg Leu Gly Asp Gly Ser Lys Leu Phe Pro Asn Leu Lys
1170 1175 1180
agt ttg aag cta tat ggt ttt gtt gat tat aac tca acc cat tta 7315
Ser Leu Lys Leu Tyr Gly Phe Val Asp Tyr Asn Ser Thr His Leu
1185 1190 1195
cca atg gaa atg ttg caa atc tta ttc caa ctt gta gtc ttt gaa 7360
Pro Met Glu Met Leu Gln Ile Leu Phe Gln Leu Val Val Phe Glu
1200 1205 1210
ttg gaa gga gca ttt ctt gaa gaa att ttc ccc agc aac ata ctg 7405
Leu Glu Gly Ala Phe Leu Glu Glu Ile Phe Pro Ser Asn Ile Leu
1215 1220 1225
att cca agc tat atg gtt tta aga aga tta gct cta tct aaa cta 7450
Ile Pro Ser Tyr Met Val Leu Arg Arg Leu Ala Leu Ser Lys Leu
1230 1235 1240
ccc aag ctt aag cat ttg tgg agt gaa gaa tgc tca caa aac aat 7495
Pro Lys Leu Lys His Leu Trp Ser Glu Glu Cys Ser Gln Asn Asn
1245 1250 1255
atc acc tca gtt ctt caa cat ttg att tct cta aga att tca gaa 7540
Ile Thr Ser Val Leu Gln His Leu Ile Ser Leu Arg Ile Ser Glu
1260 1265 1270
tgt gga aga ttg agt agt tta ctg tcg tca ata gtg tgt ttt aca 7585
Cys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Ile Val Cys Phe Thr
1275 1280 1285
aac ttg aaa cat ctt cgg gtt tat aaa tgt gat gga cta acc cat 7630
Asn Leu Lys His Leu Arg Val Tyr Lys Cys Asp Gly Leu Thr His
1290 1295 1300
ttg ctg aat cct tcg gtg gct aca acg ctt gtg caa ctt gag tct 7675
Leu Leu Asn Pro Ser Val Ala Thr Thr Leu Val Gln Leu Glu Ser
1305 1310 1315
ttg aca ata gaa gaa tgc aaa agg atg agt agt gta att gag gga 7720
Leu Thr Ile Glu Glu Cys Lys Arg Met Ser Ser Val Ile Glu Gly
1320 1325 1330
gga tca acc gaa gaa gat gga aat gat gaa atg gtt gta ttc aac 7765
Gly Ser Thr Glu Glu Asp Gly Asn Asp Glu Met Val Val Phe Asn
1335 1340 1345
aac cta caa cat tta tac att ttt aat tgt tcc aac cta aca agc 7810
Asn Leu Gln His Leu Tyr Ile Phe Asn Cys Ser Asn Leu Thr Ser
1350 1355 1360
ttt tat tgt ggg aga tgc att att aaa ttt cca tgt ttg agg caa 7855
Phe Tyr Cys Gly Arg Cys Ile Ile Lys Phe Pro Cys Leu Arg Gln
1365 1370 1375
gta gac att tgg aac tgt tct gaa atg aag gtc ttt tcg ctt gga 7900
Val Asp Ile Trp Asn Cys Ser Glu Met Lys Val Phe Ser Leu Gly
1380 1385 1390
att gta agc aca cct cga ttg aaa tat gaa aat ttt tct tta aag 7945
Ile Val Ser Thr Pro Arg Leu Lys Tyr Glu Asn Phe Ser Leu Lys
1395 1400 1405
aat gat tac gat gat gaa cgg tgt cat cca aaa tat ccc aaa gat 7990
Asn Asp Tyr Asp Asp Glu Arg Cys His Pro Lys Tyr Pro Lys Asp
1410 1415 1420
atg ttg gtg gaa gat atg aat gtc atc acc aga gaa tat tgg gag 8035
Met Leu Val Glu Asp Met Asn Val Ile Thr Arg Glu Tyr Trp Glu
1425 1430 1435
gat aat gtt gat acc gga att cca aat tta ttt gcc gaa cag 8077
Asp Asn Val Asp Thr Gly Ile Pro Asn Leu Phe Ala Glu Gln
1440 1445 1450
gtttgtatat ttaattacct tttcatattt ggtaataatt aatttttatt atttgtgtgt 8137
tagagtatga actttaatga atttatttaa ttaatgcag agt ttg gag gaa aac 8191
Ser Leu Glu Glu Asn
1455
cga tct gaa aat tct tct tct tcg aag aat aat gtt gag aaa gaa 8236
Arg Ser Glu Asn Ser Ser Ser Ser Lys Asn Asn Val Glu Lys Glu
1460 1465 1470
taa ggaattatat ggatattgtt gtacactact taatatatca tttcatccac 8289
aaggaaaagg tcagaatctt gaaatcctcc attctttttt atgagagaat atcatccaat 8349
gtcaaattga aaagtctcga tagatttgtt aaattaactt ttgatacaag tcataaaatg 8409
ttaattagta taataataat atatctgatc ccatcaaatt aattagaagt aacgacaaat 8469
ttaacttctg taatatcaat tcaatttgat gtctcaatca actgcataaa atttgatgtc 8529
acaaatttaa cttctgtaat gtgaatcttt tttttttttc cctttgcaca taaaaccaac 8589
aagttaaaat agatataaca aagaatttaa ttcacatata ataaattcat ccaatataat 8649
gttctttcac ctttttctct ctttcacaaa actgtaataa taatatctac cacaaaaggt 8709
aaaccattaa tatgattctt caagaaggtt gtttatttgg tcaaattttc atgaaagtat 8769
taatacagtg tatgttttgc aaaggaagct gccaaatacc tacctcaatc ctagcagatg 8829
cgttctttgc aagttggctg tcaaagactt gaaccatatt ttcacaacct gtgccaattc 8889
gcaaatagcc tctgggtcaa actgcacgac aaaattggtg gaaactttga tacaaacagt 8949
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gagctttgtt agattaatgt ttgttgtata tggcttccct gtagccaaag aaatatacat 9249
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tataatgcgt tattttattt ttctgaataa gttaaattta accactagaa atttttttac 9489
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ttcaaggaaa gtgtagaatg atgaatctaa aagaaacaaa aaaeaaggta tataagttta 9609
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ttttttgttt ttatatatta ttttaaaaat atatattgaa attaatattt tattgatatt 10209
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gtaaatatgt tttggtgtac tttgccatat attaaaacat actactaaac aaaacgaaat 10509
gattaaaaag gaagggaagg tattaaaaat tataaatttt aagaaaggaa aagaagaaga 10569
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ctctttgagt acataaccta atggttaaga aaaaaaaaaa tctcatatca aattcaaagt 10689
gccatgctat tattacttaa tattttatat ggaagttaaa taaattgtta gagagaagtc 10749
ttgttttctg tctgtttgtt aactcatttt tgtaattaat gtttaatttg atcattgtca 10809
ttccaattaa ttgtaacata attttctgcc caatttatct cttttgcttt cgtttttgtt 10869
tagataccct actcggctac tcctcaactt ttcctcattt cattttcagt tgg 10922
<210>2
<211>5085
<212>DNA
<213>香瓜
<400>2
attattatgg ttcattcctc gtggtttttt agctcttcaa gtatttttgt aggttttgat 60
ccttttcaag ctcaagaaca gaggataata atggacatcc ttatttcagt cactgcaaaa 120
attgccgaat acactgttga gcctgttgga cgccaacttg gttatgtatt tttcattcgt 180
tccaactttc aaaaacttaa gactcaagta gaaaagctga agattacaag agagtctgtg 240
caacacaaga tccatagtgc aagaagaaat gctgaagaca taaaacctgc cgttgaggaa 300
tggttgaaaa aggtcgatga ctttgtccga gaatctgacg agatattagc caatgaaggt 360
ggacatggtg gactctgttc cacctatttg gtccaacgac acaagttaag tagaaaagca 420
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tcctataaaa gtgttatccc atcagttgat tgttcacttc caaaagtgcc tgactttctt 540
gactttgagt caagaaagtc gattatggaa caaatcatgg atgcactatc tgatggtaat 600
gtccatagga ttggagtata tgggatgggg ggtgttggca aaacaatgct agtgaaggat 660
attttaagaa aaattgtgga gagtaagaag ccttttgatg aggtggtaac atccacgatc 720
agccaaacac cagattttag aagtatccaa ggacaactag ctgacaagct aggtttgaaa 780
ttcgaacaag aaacaataga aggaagggct actattctac gaaagaggtt aaagatggag 840
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attccaagtg ttgaagatca tacggggtgc aagatcttgt ttaccactag gattaaacat 960
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cctatagcca ttcgaattgt gagagaatgt gcaggtttgc ctattgctat tactactgtt 1140
gctaaggcat tacgaaataa accttccgac atttggaatg atgccttaga tcagcttaaa 1200
actgttgatg tgggtatggc aaacattgga gaaatggaaa agaaagtgta tttgtcacta 1260
aaactgagtt acgattgctt gggatatgaa gaggtgaagt tattattctt gttatgcagc 1320
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aatcataccg cagtgttcat tgatggttta cattatcctc tcccgaagtt aacgttaccc 1680
aaagttcaat tattaaggtt agttgcaaaa tattgttggg aacataataa gcgtgtgtcg 1740
gtggtagaaa ctttttttga agaaatgaaa gagctcaaag gtttagtagt agaaaacgta 1800
aatatatcat tgatgcaacg accatctgat gtttactcct tagcaaacat cagagtatta 1860
cgtttggaaa gatgtcaatt attagggagc atagattgga ttggtgaatt aaaaaagctt 1920
gaaattcttg attttagtga atctaacatc acacaaattc ctacaaccat gagccaattg 1980
acacagctaa aagtgttgaa tttatcttct tgtgaacaac ttgaggtaat tccaccaaat 2040
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catcataata tgttggaatc aaagcaatgg gagacttcat cttcttctaa ggatggggtt 3600
ctacggetgg gagatggttc taagttgttt ccaaatctta aaagtttgaa gctatatggt 3660
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tggagtgaag aatgctcaca aaacaatatc acctcagttc ttcaacattt gatttctcta 3900
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ttgaaacatc ttcgggttta taaatgtgat ggactaaccc atttgctgaa tccttcggtg 4020
gctacaacgc ttgtgcaact tgagtctttg acaatagaag aatgcaaaag gatgagtagt 4080
gtaattgagg gaggatcaac cgaagaagat ggaaatgatg aaatggttgt attcaacaac 4140
ctacaacatt tatacatttt taattgttcc aacctaacaa gcttttattg tgggagatgc 4200
attattaaat ttccatgttt gaggcaagta gacatttgga actgttctga aatgaaggtc 4260
ttttcgcttg gaattgtaag cacacctcga ttgaaatatg aaaatttttc tttaaagaat 4320
gattacgatg atgaacggtg tcatccaaaa tatcccaaag atatgttggt ggaagatatg 4380
aatgtcatca ceagagaata ttgggaggat aatgttgata ccggaattcc aaatttattt 4440
gccgaacaga gtttggagga aaaccgatct gaaaattctt cttcttcgaa gaataatgtt 4500
gagaaagaat aaggaattat atggatattg ttgtacacta cttaatatat catttcatcc 4560
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ttggctgtca aagacttgaa ccatattttc acaacctgtg ccaattcgca aatagcctct 4680
gggtcaaact gcacgacaaa attggtggaa actttgatac aaacagtatc aaagccctct 4740
gttggtctct tggetcgctg aaacaatcaa acagaaagaa catcattctc tcgatgtagg 4800
tgtggatctt ctttagtcca tttgggtgga aagaaacaat aggattttca tagacacaga 4860
aagaagctta gtcacatttg ggaagatatc gaaactttga ttggaccatg gtcgagtaga 4920
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ttaatgtttg ttgtatatgg cttccctgta gccaaagaaa tatacattgt aacaatggtt 5040
tgatgaaatg ataatgaagt ggtatggtgt gtttcaattg caaaa 5085
<210>3
<211>1473
<212>PRT
<213>香瓜
<400>3
Met Asp Ile Leu Ile Ser Val Thr Ala Lys Ile Ala Glu Tyr Thr Val
1 5 10 15
Glu Pro Val Gly Arg Gln Leu Gly Tyr Val Phe Phe Ile Arg Ser Asn
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Ser Asp Glu Ile Leu Ala Asn Glu Gly Gly His Gly Gly Leu Cys
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Ser Thr Tyr Leu Val Gln Arg His Lys Leu Ser Arg Lys Ala Ser Lys
100 105 110
Met Val Asp Glu Val Leu Glu Met Lys Asn Glu Gly Glu Ser Phe Asp
115 120 125
Met Val Ser Tyr Lys Ser Val Ile Pro Ser Val Asp Cys Ser Leu Pro
130 135 140
Lys Val Pro Asp Phe Leu Asp Phe Glu Ser Arg Lys Ser Ile Met Glu
145 150 155 160
Gln Ile Met Asp Ala Leu Ser Asp Gly Asn Val His Arg Ile Gly Val
165 170 175
Tyr Gly Met Gly Gly Val Gly Lys Thr Met Leu Val Lys Asp Ile Leu
180 185 190
Arg Lys Ile Val Glu Ser Lys Lys Pro Phe Asp Glu Val Val Thr Ser
195 200 205
Thr Ile Ser Gln Thr Pro Asp Phe Arg Ser Ile Gln Gly Gln Leu Ala
210 215 220
Asp Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Gln Glu Thr Ile Glu Gly Arg Ala
225 230 235 240
Thr Ile Leu Arg Lys Arg Leu Lys Met Glu Arg Ser Ile Leu Val Val
245 250 255
Leu Asp Asp Val Trp Glu Tyr Ile Asp Leu Glu Thr Ile Gly Ile Pro
260 265 270
Ser Val Glu Asp His Thr Gly Cys Lys Ile Leu Phe Thr Thr Arg Ile
275 280 285
Lys His Leu Ile Ser Asn Gln Met Cys Ala Asn Lys Ile Phe Glu Ile
290 295 300
Lys Val Leu Gly Lys Asp Glu Ser Trp Asn Leu Phe Lys Ala Met Ala
305 310 315 320
Gly Asp Ile Val Asp Ala Ser Asp Leu Lys Pro Ile Ala Ile Arg Ile
325 330 335
Val Arg Glu Cys Ala Gly Leu Pro Ile Ala Ile Thr Thr Val Ala Lys
340 345 350
Ala Leu Arg Asn Lys Pro Ser Asp Ile Trp Asn Asp Ala Leu Asp Gln
355 360 365
Leu Lys Thr Val Asp Val Gly Met Ala Asn Ile Gly Glu Met Glu Lys
370 375 380
Lys Val Tyr Leu Ser Leu Lys Leu Ser Tyr Asp Cys Leu Gly Tyr Glu
385 390 395 400
Glu Val Lys Leu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Met Phe Pro Glu Asp Phe
405 410 415
Ser Ile Asp Val Glu Gly Leu His Val Tyr Ala Met Gly Met Gly Phe
420 425 430
Leu His Gly Val Asp Thr Val Val Lys Gly Arg Arg Arg Ile Lys Lys
435 440 445
Leu Val Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Gln Gln Tyr Ser Glu
450 455 460
Tyr Gly Cys Asn Tyr Val Lys Met His Asp Met Val Arg Asp Val Ala
465 470 475 480
Leu Leu Ile Ala Ser Lys Asn Glu His Val Arg Thr Leu Ser Tyr Val
485 490 495
Lys Arg Ser Asn Glu Glu Trp Glu Glu Glu Lys Leu Leu Gly Asn His
500 505 510
Thr Ala Val Phe Ile Asp Gly Leu His Tyr Pro Leu Pro Lys Leu Thr
5l5 520 525
Leu Pro Lys Val Gln Leu Leu Arg Leu Val Ala Lys Tyr Cys Trp Glu
530 535 540
His Asn Lys Arg Val Ser Val Val Glu Thr Phe Phe Glu Glu Met Lys
545 550 555 560
Glu Leu Lys Gly Leu Val Val Glu Asn Val Asn Ile Ser Leu Met Gln
565 570 575
Arg Pro Ser Asp Val Tyr Ser Leu Ala Asn Ile Arg Val Leu Arg Leu
580 585 590
Glu Arg Cys Gln Leu Leu Gly Ser Ile Asp Trp Ile Gly Glu Leu Lys
595 600 605
Lys Leu Glu Ile Leu Asp Phe Ser Glu Ser Asn Ile Thr Gln Ile Pro
610 615 620
Thr Thr Met Ser Gln Leu Thr Gln Leu Lys Val Leu Asn Leu Ser Ser
625 630 635 640
Cys Glu Gln Leu Glu Val Ile Pro Pro Asn Ile Leu Ser Lys Leu Thr
645 650 655
Lys Leu Glu Glu Leu Asp Leu Glu Thr Phe Asp Gly Trp Glu Gly Glu
660 665 670
Glu Trp Tyr Glu Gly Arg Lys Asn Ala Ser Leu Ser Glu Leu Lys Cys
675 680 685
Leu Arg His Leu Tyr Ala Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asp Glu Glu Ile
690 695 700
Met Pro Glu Asn Leu Phe Leu Val Gly Lys Leu Lys Leu Gln Lys Phe
705 710 715 720
Asn Ile Cys Ile Gly Cys Glu Ser Lys Leu Lys Tyr Thr Phe Ala Tyr
725 730 735
Lys Asn Arg Ile Lys Asn Phe Ile Gly Ile Lys Met Glu Ser Gly Arg
740 745 750
Cys Leu Asp Asp Trp Ile Lys Asn Leu Leu Lys Arg Ser Asp Asn Val
755 760 765
Leu Leu Glu Gly Ser Val Cys Ser Lys Val Leu His Ser Glu Leu Val
770 775 780
Gly Ala Asn Asn Phe Val Ser Leu Pro Asn Leu Glu Lys Leu Glu Ile
785 790 795 800
Val Asn Ala Lys Ser Leu Lys Met Ile Trp Ser Asn Asn Val Pro Ile
805 810 815
Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Lys Ile Tyr Ser Cys Asn
820 825 830
Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Pro Asn Met Met Asp Ile Leu Thr
835 840 845
Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Lys Asn Cys Asp Leu Leu Glu Gly Ile
850 855 860
Phe Glu Ala Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Asn Leu Pro
865 870 875 880
Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Arg Ile Trp Ser Cys
885 890 895
Asn Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Ser Asn Met Met Gly Ile Leu
900 905 910
Pro Cys Leu Lys Val Leu Asp Ile Arg Gly Cys Glu Leu Leu Glu Gly
915 920 925
Ile Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Ser Val
930 935 940
Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Lys Ile Arg Ile Trp Ser
945 950 955 960
Cys Asn Asn Leu Gln Lys Ile Leu Phe Pro Ser Asn Met Met Gly Ile
965 970 975
Leu Thr Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Arg Asp Cys Glu Leu Leu Glu
980 985 990
Gly Ile Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Asn
995 1000 1005
Leu Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Arg Ile
1010 1015 1020
Gly Ser Cys Asn Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Pro Asn Met
1025 1030 1035
Met Gly Ile Leu Thr Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Arg His Cys
1040 1045 1050
Asn Leu Leu Glu Gly Ile Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser Ile
1055 1060 1065
Val Glu Ala Ser Pro Ile Leu Leu Gln Asn Leu Ser Ser Leu Met
1070 1075 1080
Leu Cys Asn Leu Pro Asn Leu Glu Tyr Val Trp Ser Lys Asn Pro
1085 1090 1095
Tyr Glu Leu Leu Ser Leu Glu Asn Ile Lys Ser Leu Thr Ile Asp
1100 1105 1110
Lys Cys Pro Arg Leu Arg Arg Glu Tyr Ser Val Lys Ile Leu Lys
1115 1120 1125
Gln Leu Glu Asp Val Ser Ile Asp Ile Lys Gln Leu Met Lys Val
1130 1135 1140
Ile Glu Lys Glu Lys Ser Ala His His Asn Met Leu Glu Ser Lys
1145 1150 1155
Gln Trp Glu Thr Ser Ser Ser Ser Lys Asp Gly Val Leu Arg Leu
1160 1165 1170
Gly Asp Gly Ser Lys Leu Phe Pro Asn Leu Lys Ser Leu Lys Leu
1175 1180 1185
Tyr Gly Phe Val Asp Tyr Asn Ser Thr His Leu Pro Met Glu Met
1190 1195 1200
Leu Gln Ile Leu Phe Gln Leu Val Val Phe Glu Leu Glu Gly Ala
1205 1210 1215
Phe Leu Glu Glu Ile Phe Pro Ser Asn Ile Leu Ile Pro Ser Tyr
1220 1225 1230
Met Val Leu Arg Arg Leu Ala Leu Ser Lys Leu Pro Lys Leu Lys
1235 1240 1245
His Leu Trp Ser Glu Glu Cys Ser Gln Asn Asn Ile Thr Ser Val
1250 1255 1260
Leu Gln His Leu Ile Ser Leu Arg Ile Ser Glu Cys Gly Arg Leu
1265 1270 1275
Ser Ser Leu Leu Ser Ser Ile Val Cys Phe Thr Asn Leu Lys His
1280 1285 1290
Leu Arg Val Tyr Lys Cys Asp Gly Leu Thr His Leu Leu Asn Pro
1295 1300 1305
Ser Val Ala Thr Thr Leu Val Gln Leu Glu Ser Leu Thr Ile Glu
1310 1315 1320
Glu Cys Lys Arg Met Ser Ser Val Ile Glu Gly Gly Ser Thr Glu
1325 1330 1335
Glu Asp Gly Asn Asp Glu Met Val Val Phe Asn Asn Leu Gln His
1340 1345 1350
Leu Tyr Ile Phe Asn Cys Ser Asn Leu Thr Ser Phe Tyr Cys Gly
1355 1360 1365
Arg Cys Ile Ile Lys Phe Pro Cys Leu Arg Gln Val Asp Ile Trp
1370 1375 1380
Asn Cys Ser Glu Met Lys Val Phe Ser Leu Gly Ile Val Ser Thr
1385 1390 1395
Pro Arg Leu Lys Tyr Glu Asn Phe Ser Leu Lys Asn Asp Tyr Asp
1400 1405 1410
Asp Glu Arg Cys His Pro Lys Tyr Pro Lys Asp Met Leu Val Glu
1415 1420 1425
Asp Met Asn Val Ile Thr Arg Glu Tyr Trp Glu Asp Asn Val Asp
1430 1435 1440
Thr Gly Ile Pro Asn Leu Phe Ala Glu Gln Ser Leu Glu Glu Asn
1445 1450 1455
Arg Ser Glu Asn Ser Ser Ser Ser Lys Asn Asn Val Glu Lys Glu
1460 1465 1470
<210>4
<211>10773
<212>DNA
<213>香瓜
<400>4
tcaacctccc aattaccata agtgcaaaat tcttttgtcg tccatattat tgttaatgaa 60
gaacaaagat gaatttaacc aatcaccata cattttattt agatcgtatg caacattttc 120
tttttcattt ctagcctaaa tccctcatat tttcccctaa aattcctctg tttttctctt 180
cttcttctaa ttcttgatct ctctctctct ctttttggtt tcttcttcta actcttctct 240
cttcctcgca aatccaagaa aaagaaccat agaatagttt caagattttt ttcaggggaa 300
ggggggttgg attttaattt tcaaagtggg ttattaattt gttctattta tgtttttgtt 360
aatgattatt agatgacgaa gttgttttgg gctacctaaa gtcgaatctt caaagctgta 420
agttttgtta ttaagagtgg atgagaaaga aacttccagg caaatttcca atgattttta 480
cgcttacaca tactgatatt accttcttaa cttactcttg ccatttctca ctctattaac 540
aacaaaatga gtgtatgtaa gtgataatat tggttggacg aaaaagaaaa aaaaaaaaaa 600
aggttctagg aaacaaaaag aaaaacgaaa aaggcaagaa atggaaaagg aaacgttgtg 660
tatgatgatt aaaatgtacg ttgatagcta aattcaactt tgttcttcat tagcaacaac 720
aagggacaac aaaatgaaaa tttcagcaca gttatggagg gttgaagaag aaggtgacga 780
gagagatgcc acatcataaa aaattaatat tataatcatt tttgtcacat tagttttctg 840
attacttata tttaacctac acatcatttt gccgttactc aactaacgat caatatgacc 900
tttaaagctc gatgattaaa atgtttattt tgaactttca gggactatat aaatgtatat 960
atatcaactt caaatcttag cggtcaaaag tgcattttgt tttagtttaa aagaccgaga 1020
tgtgaccatt aataatgcct acacacacat atccccgtac tcacacatgc agtgagtttt 1080
ttatgttttt tttacacaca ttagacagca aattgaattc ctaattccat tccctaagac 1140
aagtttctaa tgacttatac aattcacata ggcatgcatg cagaacaagc gaaaaacgac 1200
gaatttacct taagaaaatg gcccaaccaa ccacttacac aatctcaggc ataccattcc 1260
ccgggatgaa agaatttttc ctgtaattca ttcgatctca ggcatacaat gcatcgagaa 1320
gacgcaaaat gaaagacaaa agtatagaac aacacaatcc tgtacttcat tttaaacgat 1380
agttttcaaa tttaacgatc gtgtagatca tgatacacga tctcgagcct tagtggcacc 1440
gagatggccc gagatgaaag acctctacct ttagttattc gatctcgagc cttaattgaa 1500
tcgagatgac ccaagattaa tagatcggaa agaagatata tatcgtaagg gcatatatga 1560
aatttatgaa aatacgatca tgtgtcataa acttttctta ttttgttata tagaccgtaa 1620
atattataga ttttggttac atttgtgtaa attactctat ttttttttag taaaacaaat 1680
gaattaaatt aaaaaaaaaa ttattaagag ttgaagtaat tgggtgtttt ctaaaagatt 1740
gaaataaata cctttattaa ctttgcaaat atattttcaa agaggctaac aaatcaaata 1800
tattttctaa aaaaatcaca ttgcgttggg gataaggtaa gagtaatgga aaaatgaaag 1860
gttgtgaaca attcgtactc ttacttatga gatttgacag aacaaatatt tttcaaatac 1920
tctttttacg ttttcttttt taaaattaaa taacaaatac ttttccactg cttttctttt 1980
cttccattga ctcctcaact aataattttg gtcttcccat tattatcttc ttcttcttca 2040
tttttctctg cactgtctct tctccatttc aacatcttct tatatcttca ttcaggttaa 2100
atatttcatc ccttaccatt tttatttaca ttttccatct gatcatttct atacttataa 2160
actcgataat ttgtttagac tttctttaga tagtttttac tcggtgatct gtatgtgttc 2220
actcctactt ttctgttagg caaaatcttc aaaattatta tggttcattc ctcgtggttt 2280
tttagctctt caagtatttt tgtaggtttt gatccttttc aagctcaaga acagaggata 2340
ataatggaca tccttatttc agtcactgca aaaattgctg aatacactgt tgagcctgtt 2400
ggacgccaac ttggttatgt atttttcatt cgttccaact ttcaaaaact taagactcaa 2460
gtagaaaagc tgaagattac aagagagtct gtgcaacaca agatccatag tgcaagaaga 2520
aatgctgaag acataaaacc tgccgttgag gaatggttga aaaaggtcga tgactttgtt 2580
cgagaatctg acgagatatt agccaatgaa ggtggacatg gtggactctg ttccacctat 2640
ttggtccaac gacacaagtt aagtagaaaa gcaagcaaaa tggtagatga ggttcttgag 2700
atgaaaaatg agggggaaag ttttgatatg gtatcctata aaagtgttat cccatcagtt 2760
gattgttcac ttccaaaagt gcctgacttt attgactttg agtcaagaaa gtcgattatg 2820
gaacaaatca tggatgcact atctgatggt aatgtccata ggattggagt atatgggatg 2880
gggggtgttg gcaaaacaat gctagtgaag gatattttaa gaaaaattgt ggagagtaag 2940
aagccttttg atgaggtggt aacatccacg atcagccaaa caccagattt tagaagtatc 3000
caaggacaac tagctgacaa gctaggtttg aaattcgaac aagaaacaat agaaggaagg 3060
gctactattc tacgaaagag gttaaagatg gagagaagta tcctagttgt gttggatgat 3120
gtttgggagt atattgattt ggaaactata ggaattccaa gtgttgaaga tcatacgggg 3180
tgcaagatct tgtttaccac taggattaaa catttgatct caaatcaaat gtgcgccaat 3240
aaaatttttg agataaaagt tttaggaaaa gatgagtcat ggaatttatt taaggcaatg 3300
gcaggtgaca ttgttgatgc aagtgatttg aagcctatag ccattcgaat tgtgagagaa 3360
tgtgcaggtt tgcctattgc tattactact gttgctaagg cattacgaaa taaaccttcc 3420
gacatttgga atgatgcctt agatcagctt aaaagtgttg atgtgggtat ggcaaacatt 3480
ggagaaatgg aaaagaaagt gtatttgtca ctaaaactga gttacgattg cttgggatat 3540
gaagaggtga agttattatt cttgttatgc agcatgtttc cagaagactt tagcattgac 3600
gtggaagggt tgcatgtata tgccatgggc atgggattct tacatggtgt tgatactgtg 3660
gtaaaaggac gacgtaggat aaaaaaattg gttgatgatc ttatatcttc ttctttgctt 3720
caacaatatt ctgagtatgg gtgcaattat gtgaaaatgc atgatatggt tcgtgatgta 3780
gccctattaa ttgcatctaa gaatgaacac gtacgtacat tgagctatgt gaaaagatcg 3840
aatgaagaat gggaagaaga gaaactattg ggtaatcata ctgcagtgtt cattgatggt 3900
ttacattatc ctctcccgaa gttaacgtta cccaaagttc aattattaag gttagttgca 3960
caagattgtt gggaacataa taagcgtgtg tcggtggtag aaactttttt tgaagaaatg 4020
aaagagctca aaggtttagt attagcaaac gtaaatatat cattgatgca acgaacatct 4080
gatctttact ccttagcaaa catcagagta ttacgtttgc aaagctgtaa tttattaggg 4140
agcatagatt ggattggtga attaaaaaag cttgaaattc ttgattttat aggatctaac 4200
atcacacaaa ttcctacaac catgagccaa ttgacacaac tcaaagtgtt aaatttatct 4260
tcttgtcatc aactcaaggt aattccacca aatattcttt caaagttgac aaaactggaa 4320
gaattaagtc tggaaacttt tgatagatgg gaaggagaag aatggtatga aggaaggaaa 4380
aatgctagcc tttctgaact caagtgcttg cgacatcttt atgctttaaa tttaaccatt 4440
caagatgaag aaattatgcc aaaagatttg tttttagctg aggagttgaa gcttcaaaaa 4500
ttcaacattt gtattggtta ccaaagcaaa ttaaagtata cttttggacc cacaaacaga 4560
atcaaaaact tcattgcaat caagatggaa tcaggaaggt gcttggataa ttggataaaa 4620
aatttgttaa agaggtcgga caatgtgttt ttggaaggat caatttgttc aaaggttcte 4680
cactcagaat tggtaggtgc aaatgacttc gtaaatttga agtatctcta cctttattat 4740
aattcaaaat ttcaacattt tatcaacgtt agcaatacca tcaacattga agaatcattt 4800
tttagtgaaa tggtaaattt catcaacaca tttttctatg tttctatata cacatcaaaa 4860
tttataaatc acctgtttgt tcatttttat tgttccttcc acaagttcct tctaacattt 4920
gtggttagta atgatagtag ggataagatt ctattcttct ttgttttaga aggctcttct 4980
cttggtgtag agagactctt tcttgtttca tacattaatg ataatatata attttagact 5040
tctaaaatat ataaatgcat gtcaggtgat attccaagaa aatttaaaga agtttattag 5100
atatttccta tctaaggaag cagatttgaa gtaatcattt tacacaattt gttatggtaa 5160
ttttaaaaca ctatataaat tatatgttgt tagttagcat cagttgtgat gatatggtta 5220
attacgttgt cacaaactga acttttaagg acgtaaattt gtaggtatcg cttcctaatt 5280
tggagaagtt ggaaattgtg aatgcaaaga gtttgaagat gatatggagc aataacgtgc 5340
caattcttaa ttccttttcc aaactcgagg aaataaaaat ttattcatgc aacaatcttc 5400
aaaaagtatt atttcctcca aatatgatgg acattetcac atgccttaaa gtcttagaga 5460
tcaaaaattg tgatttgttg gaagggatat ttgaagcgca agagccaatt agtgttgttg 5520
agagcaataa tttacccatt cttaattcct tttccaaact cgaggaaata agaatttggt 5580
catgcaacaa tcttcaaaaa gtattatttc cttcaaatat gatgggcatt cttccatgcc 5640
ttaaagtctt agatattaga ggttgtgaat tgttggaagg gatatttgaa gtgcaagagc 5700
caattagtgt tgttgagagc aatagtgtac ccattcttaa ttccttttcc aaactcgaga 5760
aaataagaat ttggtcatgc aacaatcttc aaaaaatatt atttccttca aatatgatgg 5820
gcattcttac atgccttaaa gtcttagaga tcagagattg tgaattgttg gaagggatat 5880
ttgaagtgca agagccaatt agtgttgttg aagcgagtcc tatcgtgctc caaaatttaa 5940
ttaggttgga attatataat cttccaaacc ttgagtacgt gtggagcaaa aatccttgtg 6000
agcttctgag tttggaaaat ataaaaagtt tgaccattga ggaatgtcca agacttagaa 6060
gagaatactc agtcaaaatt ttcaagccac ttcaatatgt aagcatagat atcaaacaat 6120
tgatgaaggt tattgagaag gaaaagtcag cagatcataa tatgttggaa tcaaagcaat 6180
gggagacttc ttcttcttct aaggtacgta tatattctac aacaaaacat gtttgttcaa 6240
tttaattttc agaaaatata taaattgttt tcaagacctt agttgaacag aattggttct 6300
gttagttgaa cagagtttta aagaaaacaa attattatgt ttgttctaga aacctatgga 6360
aattagtgtt attaggggtt aattatttac ctgaattaaa aaagaataag caacgtaaac 6420
cgcttaattt taatatgttt atcaatagaa attaggatcc gtttggattg acttgaatga 6480
tatgttttcc tggaaagaaa ctcatttttg tttgaactca tttttatgaa aattggctaa 6540
aatacattta aaaaatgagg tggctttcaa atattcaatt ttttttttaa ataacttatt 6600
ttttgaatta aacactccaa aatgtaattc aaaaacaccc atataagtta attagatata 6660
taattaatac ataaattaat taattttatt tagtttgagt taaattagtt ttaatgcaaa 6720
caataatata tttttatagc caatatacaa gaatgaaagt aagaaaagaa gacaaaaaaa 6780
aaaaaaaaaa tgatatgtta attagaattt tacataaaga atgatctgat taaagctaat 6840
ctctatcgat atagtttttt aattatatta aatatagtaa gtagtccatt ataataattg 6900
aatttttttg taccaaatta attaaactaa ttctttttac taattattga atatttaaga 6960
tatttttggc taattaatta ataatttgtg tggatatata agttattatt gcatttattt 7020
aatagatatt tttgatcatc aggatggggt tctacggctg ggagatggtt ctaagttgtt 7080
tccaaatctt aaaagtttga agctatatgg ttttgttgat tataactcaa cccatttacc 7140
aatggaaatg ttgcaaatct tattccaact taaacacttt gaattggaag gagcatttat 7200
tgaagaaatt ttccccagca atatactgat ttcaagctct atggatttac agagtttggc 7260
tctatataaa ctacccaagc ttaagcattt gtggagtgaa gaatgctcac gaaacaatat 7320
cacctcagtt cttcaacatt tgatttttct aagaatttca gattgtggaa gattgagtag 7380
tttaacttta gtgtcatcat tagtgtgttt tacaaacttg aaaagtcttg cggtttataa 7440
atgtgataga ctaacccatt tgctgaatcc ttcgatggct acaacgcttg tgcaacttca 7500
agatttgaca ataaaagaat gcaaaagaat gagaagtgta attgaggaag gatcaaccga 7560
agaagatgga aatgatgaaa tggttgtatt caacaaccta cgacatttat acatttttaa 7620
ttgttccaac ctaacaagct tttattgtgg gagatgcatc gttaaattcc catgtttgga 7680
aagagtattc attcaaaatt gtcctgaaat gaaggtcttt tcacttggaa ttgtaagcac 7740
gcctcgtttg aaatatgaaa agtttacttt aatgaatgat tacgatgata aatggtgtca 7800
tctgaaatat cccaaatata tgttggtgga agatatgaat gtcatcacca gagaatattg 7860
ggaggataat gttgataccg gaattccaaa tttatttgcc gaacaggttt gtatatttaa 7920
ttaccttttc atatttggta ataattaatt tttattattt gtgtgttaga gtatgaactt 7980
taatgaattt atttaattaa tgcagagttt ggaggaaaac cgatctgaaa attcttcttc 8040
ttcaaagaat aatgttgaga aagaataagg aattatatgg atattgttgt acactactta 8100
atatatcatt tcatccacaa ggaaaaggtc agactcttga aatcctccat tcttttttat 8160
gagagaatat catccaatgt caaattgaaa agtctcgata gatttgttaa attaattttt 8220
gatacaagtc ataaaatgtt aattagtata ataataatat atctgatccc atcaaattaa 8280
ttagaagtaa cgacaaattt aacttctgta atatcaattc aatttgatgt ctgcataaaa 8340
tttgatgtca caaatttaac ttctgtaatg tgaatctttt ttttttcctt tggacataaa 8400
accaacaagt taaaatagat ataacaatga atttaactca catataataa attcatccaa 8460
tataatgttc tttcaccttt ttctctcttt cacaaaactg taataataat atctaccaca 8520
aaaggtaaac aattaatatg attcttcaag aaggttgttt atttggtcaa attttcatga 8580
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cagatgcgtt ctttgcaagc cggctgtcga agacttgaac catattttca caacctgtgc 8700
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atcattctct cgatgtaggt gtggatcttc ttttgtccat ttgggtggaa agaaacaata 8880
ggattttcat agacatagaa agaagcttag tcacatttgg gaagatatcg aaactttgat 8940
tggaccatgg tcgagtagaa acaaaatgtt caaagactac aatccaacat caatctttaa 9000
actttagagc tttgttagat taatgtttgt tgtatatggc ttccctgtgg ccaaagaaat 9060
atacattgta acaatggttt gatgaaatga taatgaagtg gtatggtgtt aaaatcacct 9120
ttatcactct gtgtttcaat ttcaaaaaat atgattttga acattttcat agtactttca 9180
taatccccac ttcattgata tgaatcaata aagtctaagg aaagtggaga atgatgaatc 9240
aataaagttc atgaaaagtg cagaatgatg aatccaaaat gaaaaaaaaa caaggtcgat 9300
aagtttaaag taacggtggt agcattgtaa tgatcacaag ggagcacaca tttccccaca 9360
aattatttta ttatcattca cataacaatt caaatttctt atcttttaat tgatatataa 9420
tttcataatc agttataatt gaatttttca aatgattgga tccatatatc aacgtcaatc 9480
aaatttttaa aggtaaagtt ttaaatttta aaatgtttaa ttagtataaa attgagaaat 9540
cacaaagaat aatttctctt cgatatatga gatttgaacc aacctttttg tttggagact 9600
aaatgtgcaa tataatttta tataatttta taaacatgca aatattgaaa ttagattcaa 9660
aagtatgtat aataacaatt tttttttttt aaatcgtaaa tgtagcaaaa tttattagag 9720
tatttattaa taattgaaat gtgaaccata ttgcaaaaat tggttctatc actaatagat 9780
cataagagtc tttaaaaaaa atgattaaaa atagtttgtt gctaacaaac tttgttattt 9840
ttataatttt tttttaaata ttattatata cttaattaaa tgtctaaaat tattaccatt 9900
ataattaatg agatattaca cgtggattga tggtgggccc ttatatgcta ttatacactt 9960
tgcctaccct cttcccaaca agattcccaa gttaaataat tgaaactttt aacatctttc 10020
attacagttt gataaatgaa cgcaaacatg tgttgtttat tttactgaat tcgcgatcga 10080
ttattaaaat agacatgcag ttgatagcaa gcacacgaca ttaaataaaa atcatgaagt 10140
atttaatatc taatgaataa ccacataaac aatgaaacga aaatataaac taagaaaagt 10200
caaatcatgt gcatattgat gaatetacac ttctcgatct cttcaaaacc tagcaaaatc 10260
aatagaattg aacattaaca atctaagcat acttgtgaat ataacaattt ttcggaaaaa 10320
taaaaattag gcaagagaat aagaacttgt gggtaaatta aattattgaa atggattgaa 10380
atctaaatgt tgtgtgattg ctactatctg attttcattt gatactgact gttttctatt 10440
acattatgat atactaattt tcatggatat tgattgcatg tcgtctaatt aatatctgat 10500
ttgtatattt gatatttgat tgttatttta tactatattt gttatttaat agttgtttga 10560
ttgctattta ttattgattg ttctaatgat atcaattgtt gtttgattaa gatctaataa 10620
tattggttgt caattataga aattgttata tgataatgat tgtaaaattg ttgatgatac 10680
tgattgttgt ttgaatataa caatcaatga tattgattgt tgtttgattg ctctcagatt 10740
actatctaeg cctttaaact aatattaatt gat 10773
<210>5
<211>4919
<212>DNA
<213>香瓜
<400>5
attattatgg ttcattcctc gtggtttttt agctcttcaa gtatttttgt aggttttgat 60
ccttttcaag ctcaagaaca gaggataata atggacatcc ttatttcagt cactgcaaaa 120
attgctgaat acactgttga gcctgttgga cgccaacttg gttatgtatt tttcattcgt 180
tccaactttc aaaaacttaa gactcaagta gaaaagctga agattacaag agagtctgtg 240
caacacaaga tccatagtgc aagaagaaat gctgaagaca taaaacctgc cgttgaggaa 300
tggttgaaaa aggtcgatga ctttgttcga gaatctgacg agatattagc caatgaaggt 360
ggacatggtg gactctgttc cacctatttg gtccaacgac acaagttaag tagaaaagca 420
agcaaaatgg tagatgaggt tcttgagatg aaaaatgagg gggaaagttt tgatatggta 480
tcctataaaa gtgttatccc atcagttgat tgttcacttc caaaagtgcc tgactttatt 540
gactttgagt caagaaagtc gattatggaa caaatcatgg atgcactatc tgatggtaat 600
gtccatagga ttggagtata tgggatgggg ggtgttggca aaacaatgct agtgaaggat 660
attttaagaa aaattgtgga gagtaagaag ccttttgatg aggtggtaac atccacgatc 720
agccaaacac cagattttag aagtatccaa ggacaactag ctgacaagct aggtttgaaa 780
ttcgaacaag aaacaataga aggaagggct actattctac gaaagaggtt aaagatggag 840
agaagtatcc tagttgtgtt ggatgatgtt tgggagtata ttgatttgga aactatagga 900
attccaagtg ttgaagatca tacggggtgc aagatcttgt ttaccactag gattaaacat 960
ttgatctcaa atcaaatgtg cgccaataaa atttttgaga taaaagtttt aggaaaagat 1020
gagtcatgga atttatttaa ggcaatggca ggtgacattg ttgatgcaag tgatttgaag 1080
cctatagcca ttcgaattgt gagagaatgt gcaggtttgc ctattgctat tactactgtt 1140
gctaaggcat tacgaaataa accttccgac atttggaatg atgccttaga tcagcttaaa 1200
agtgttgatg tgggtatggc aaacattgga gaaatggaaa agaaagtgta tttgtcacta 1260
aaactgagtt acgattgctt gggatatgaa gaggtgaagt tattattctt gttatgcagc 1320
atgtttccag aagactttag cattgacgtg gaagggttgc atgtatatgc catgggcatg 1380
ggattcttac atggtgttga tactgtggta aaaggacgac gtaggataaa aaaattggtt 1440
gatgatctta tatcttcttc tttgcttcaa caatattctg agtatgggtg caattatgtg 1500
aaaatgcatg atatggttcg tgatgtagcc ctattaattg catctaagaa tgaacacgta 1560
cgtacattga gctatgtgaa aagatcgaat gaagaatggg aagaagagaa actattgggt 1620
aatcatactg cagtgttcat tgatggttta cattatcctc tcccgaagtt aacgttaccc 1680
aaagttcaat tattaaggtt agttgcacaa gattgttggg aacataataa gcgtgtgtcg 1740
gtggtagaaa ctttttttga agaaatgaaa gagctcaaag gtttagtatt agcaaacgta 1800
aatatatcat tgatgcaacg aacatctgat ctttactcct tagcaaacat cagagtatta 1860
cgtttgcaaa gctgtaattt attagggagc atagattgga ttggtgaatt aaaaaagctt 1920
gaaattcttg attttatagg atctaacatc acacaaattc ctacaaccat gagccaattg 1980
acacaactca aagtgttaaa tttatcttct tgtcatcaac tcaaggtaat tccaccaaat 2040
attctttcaa agttgacaaa actggaagaa ttaagtctgg aaacttttga tagatgggaa 2100
ggagaagaat ggtatgaagg aaggaaaaat gctagccttt ctgaactcaa gtgcttgcga 2160
catctttatg ctttaaattt aaccattcaa gatgaagaaa ttatgccaaa agatttgttt 2220
ttagctgagg agttgaagct tcaaaaattc aacatttgta ttggttacca aagcaaatta 2280
aagtatactt ttggacccac aaacagaatc aaaaacttca ttgcaatcaa gatggaatca 2340
ggaaggtgct tggataattg gataaaaaat ttgttaaaga ggtcggacaa tgtgtttttg 2400
gaaggatcaa tttgttcaaa ggttctccac tcagaattgg taggtgcaaa tgacttcgta 2460
tcgcttccta atttggagaa gttggaaatt gtgaatgcaa agagtttgaa gatgatatgg 2520
agcaataacg tgccaattct taattccttt tccaaactcg aggaaataaa aatttattca 2580
tgcaacaatc ttcaaaaagt attatttcct ccaaatatga tggacattct cacatgcctt 2640
aaagtcttag agatcaaaaa ttgtgatttg ttggaaggga tatttgaagc gcaagagcca 2700
attagtgttg ttgagagcaa taatttaccc attcttaatt ccttttccaa actcgaggaa 2760
ataagaattt ggtcatgcaa caatcttcaa aaagtattat ttccttcaaa tatgatgggc 2820
attcttccat gccttaaagt cttagatatt agaggttgtg aattgttgga agggatattt 2880
gaagtgcaag agccaattag tgttgttgag agcaatagtg tacccattct taattccttt 2940
tccaaactcg agaaaataag aatttggtca tgcaacaatc ttcaaaaaat attatttcct 3000
tcaaatatga tgggcattct tacatgcctt aaagtcttag agatcagaga ttgtgaattg 3060
ttggaaggga tatttgaagt gcaagagcca attagtgttg ttgaagcgag tcctatcgtg 3120
ctccaaaatt taattaggtt ggaattatat aatcttccaa accttgagta cgtgtggagc 3180
aaaaatcctt gtgagcttct gagtttggaa aatataaaaa gtttgaccat tgaggaatgt 3240
ccaagactta gaagagaata ctcagtcaaa attttcaagc cacttcaata tgtaagcata 3300
gatatcaaac aattgatgaa ggttattgag aaggaaaagt cagcagatca taatatgttg 3360
gaatcaaagc aatgggagac ttcttcttct tctaaggatg gggttctacg gctgggagat 3420
ggttctaagt tgtttccaaa tcttaaaagt ttgaagctat atggttttgt tgattataac 3480
tcaacccatt taccaatgga aatgttgcaa atcttattcc aacttaaaca ctttgaattg 3540
gaaggagcat ttattgaaga aattttcccc agcaatatac tgatttcaag ctctatggat 3600
ttacagagtt tggctctata taaactaccc aagcttaagc atttgtggag tgaagaatgc 3660
tcacgaaaca atatcacctc agttcttcaa catttgattt ttctaagaat ttcagattgt 3720
ggaagattga gtagtttaac tttagtgtca tcattagtgt gttttacaaa cttgaaaagt 3780
cttgcggttt ataaatgtga tagactaacc catttgctga atccttcgat ggctacaacg 3840
cttgtgcaac ttcaagattt gacaataaaa gaatgcaaaa gaatgagaag tgtaattgag 3900
gaaggatcaa ccgaagaaga tggaaatgat gaaatggttg tattcaacaa cctacgacat 3960
ttatacattt ttaattgttc caacctaaca agcttttatt gtgggagatg catcgttaaa 4020
ttcccatgtt tggaaagagt attcattcaa aattgtcctg aaatgaaggt cttttcactt 4080
ggaattgtaa gcacgcctcg tttgaaatat gaaaagttta ctttaatgaa tgattacgat 4140
gataaatggt gtcatctgaa atatcccaaa tatatgttgg tggaagatat gaatgtcatc 4200
accagagaat attgggagga taatgttgat accggaattc caaatttatt tgccgaacag 4260
agtttggagg aaaaccgatc tgaaaattct tcttcttcaa agaataatgt tgagaaagaa 4320
taaggaatta tatggatatt gttgtacact acttaatata tcatttcatc cacaaggaaa 4380
aggaagctgc caaataacct actcaatcct agcagatgcg ttctttgcaa gccggctgtc 4440
gaagacttga accatatttt cacaacctgt gccaattcgc aaatagcctc tgggtcaaac 4500
tgcacgacaa aattggtgga aactttgata caaacagtat caaagccctc tgttggtctc 4560
ttggctcgct gaaacaatca aacagaaaga acatcattct ctcgatgtag gtgtggatct 4620
tcttttgtcc atttgggtgg aaagaaacaa taggattttc atagacatag aaagaagctt 4680
agtcacattt gggaagatat cgaaactttg attggaccat ggtcgagtag aaacaaaatg 4740
ttcaaagact acaatccaac atcaatcttt aaactttaga gctttgttag attaatgttt 4800
gttgtatatg gcttccctgt ggccaaagaa atatacattg taacaatggt ttgatgaaat 4860
gataatgaag tggtatggtg ttaaaatcac ctttatcact ctgtgtttca atttcaaaa 4919
<210>6
<211>1410
<212>PRT
<213>香瓜
<400>6
Met Asp Ile Leu Ile Ser Val Thr Ala Lys Ile Ala Glu Tyr Thr Val
1 5 10 15
Glu Pro Val Gly Arg Gln Leu Gly Tyr Val Phe Phe Ile Arg Ser Asn
20 25 30
Phe Gln Lys Leu Lys Thr Gln Val Glu Lys Leu Lys Ile Thr Arg Glu
35 40 45
Ser Val Gln His Lys Ile His Ser Ala Arg Arg Asn Ala Glu Asp Ile
50 55 60
Lys Pro Ala Val Glu Glu Trp Leu Lys Lys Val Asp Asp Phe Val Arg
65 70 75 80
Glu Ser Asp Glu Ile Leu Ala Asn Glu Gly Gly His Gly Gly Leu Cys
85 90 95
Ser Thr Tyr Leu Val Gln Arg His Lys Leu Ser Arg Lys Ala Ser Lys
100 105 110
Met Val Asp Glu Val Leu Glu Met Lys Asn Glu Gly Glu Ser Phe Asp
115 120 125
Met Val Ser Tyr Lys Ser Val Ile Pro Ser Val Asp Cys Ser Leu Pro
130 135 140
Lys Val Pro Asp Phe Ile Asp Phe Glu Ser Arg Lys Ser Ile Met Glu
145 150 155 160
Gln Ile Met Asp Ala Leu Ser Asp Gly Asn Val His Arg Ile Gly Val
165 170 175
Tyr Gly Met Gly Gly Val Gly Lys Thr Met Leu Val Lys Asp Ile Leu
180 185 190
Arg Lys Ile Val Glu Ser Lys Lys Pro Phe Asp Glu Val Val Thr Ser
195 200 205
Thr Ile Ser Gln Thr Pro Asp Phe Arg Ser Ile Gln Gly Gln Leu Ala
210 215 220
Asp Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Gln Glu Thr Ile Glu Gly Arg Ala
225 230 235 240
Thr Ile Leu Arg Lys Arg Leu Lys Met Glu Arg Ser Ile Leu Val Val
245 250 255
Leu Asp Asp Val Trp Glu Tyr Ile Asp Leu Glu Thr Ile Gly Ile Pro
260 265 270
Ser Val Glu Asp His Thr Gly Cys Lys Ile Leu Phe Thr Thr Arg Ile
275 280 285
Lys His Leu Ile Ser Asn Gln Met Cys Ala Asn Lys Ile Phe Glu Ile
290 295 300
Lys Val Leu Gly Lys Asp Glu Ser Trp Asn Leu Phe Lys Ala Met Ala
305 310 315 320
Gly Asp Ile Val Asp Ala Ser Asp Leu Lys Pro Ile Ala Ile Arg Ile
325 330 335
Val Arg Glu Cys Ala Gly Leu Pro Ile Ala Ile Thr Thr Val Ala Lys
340 345 350
Ala Leu Arg Asn Lys Pro Ser Asp Ile Trp Asn Asp Ala Leu Asp Gln
355 360 365
Leu Lys Ser Val Asp Val Gly Met Ala Asn Ile Gly Glu Met Glu Lys
370 375 380
Lys Val Tyr Leu Ser Leu Lys Leu Ser Tyr Asp Cys Leu Gly Tyr Glu
385 390 395 400
Glu Val Lys Leu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Met Phe Pro Glu Asp Phe
405 410 415
Ser Ile Asp Val Glu Gly Leu His Val Tyr Ala Met Gly Met Gly Phe
420 425 430
Leu His Gly Val Asp Thr Val Val Lys Gly Arg Arg Arg Ile Lys Lys
435 440 445
Leu Val Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Gln Gln Tyr Ser Glu
450 455 460
Tyr Gly Cys Asn Tyr Val Lys Met His Asp Met Val Arg Asp Val Ala
465 470 475 480
Leu Leu Ile Ala Ser Lys Asn Glu His Val Arg Thr Leu Ser Tyr Val
485 490 495
Lys Arg Ser Asn Glu Glu Trp Glu Glu Glu Lys Leu Leu Gly Asn His
500 505 510
Thr Ala Val Phe Ile Asp Gly Leu His Tyr Pro Leu Pro Lys Leu Thr
515 520 525
Leu Pro Lys Val Gln Leu Leu Arg Leu Val Ala Gln Asp Cys Trp Glu
530 535 540
His Asn Lys Arg Val Ser Val Val Glu Thr Phe Phe Glu Glu Met Lys
545 550 555 560
Glu Leu Lys Gly Leu Val Leu Ala Asn Val Asn Ile Ser Leu Met Gln
565 570 575
Arg Thr Ser Asp Leu Tyr Ser Leu Ala Asn Ile Arg Val Leu Arg Leu
580 585 590
Gln Ser Cys Asn Leu Leu Gly Ser Ile Asp Trp Ile Gly Glu Leu Lys
595 600 605
Lys Leu Glu Ile Leu Asp Phe Ile Gly Ser Asn Ile Thr Gln Ile Pro
610 615 620
Thr Thr Met Ser Gln Leu Thr Gln Leu Lys Val Leu Asn Leu Ser Ser
625 630 635 640
Cys His Gln Leu Lys Val Ile Pro Pro Asn Ile Leu Ser Lys Leu Thr
645 650 655
Lys Leu Glu Glu Leu Ser Leu Glu Thr Phe Asp Arg Trp Glu Gly Glu
660 665 670
Glu Trp Tyr Glu Gly Arg Lys Asn Ala Ser Leu Ser Glu Leu Lys Cys
675 680 685
Leu Arg His Leu Tyr Ala Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asp Glu Glu Ile
690 695 700
Met Pro Lys Asp Leu Phe Leu Ala Glu Glu Leu Lys Leu Gln Lys Phe
705 710 715 720
Asn Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Lys Leu Lys Tyr Thr Phe Gly Pro
725 730 735
Thr Asn Arg Ile Lys Asn Phe Ile Ala Ile Lys Met Glu Ser Gly Arg
740 745 750
Cys Leu Asp Asn Trp Ile Lys Asn Leu Leu Lys Arg Ser Asp Asn Val
755 760 765
Phe Leu Glu Gly Ser Ile Cys Ser Lys Val Leu His Ser Glu Leu Val
770 775 780
Gly Ala Asn Asp Phe Val Ser Leu Pro Asn Leu Glu Lys Leu Glu Ile
785 790 795 800
Val Asn Ala Lys Ser Leu Lys Met Ile Trp Ser Asn Asn Val Pro Ile
805 810 815
Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Lys Ile Tyr Ser Cys Asn
820 825 830
Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Pro Asn Met Met Asp Ile Leu Thr
835 840 845
Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Lys Asn Cys Asp Leu Leu Glu Gly Ile
850 855 860
Phe Glu Ala Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Asn Leu Pro
865 870 875 880
Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Arg Ile Trp Ser Cys
885 890 895
Asn Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Ser Asn Met Met Gly Ile Leu
900 905 910
Pro Cys Leu Lys Val Leu Asp Ile Arg Gly Cys Glu Leu Leu Glu Gly
915 920 925
Ile Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Ser Val
930 935 940
Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Lys Ile Arg Ile Trp Ser
945 950 955 960
Cys Asn Asn Leu Gln Lys Ile Leu Phe Pro Ser Asn Met Met Gly Ile
965 970 975
Leu Thr Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Arg Asp Cys Glu Leu Leu Glu
980 985 990
Gly Ile Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ala Ser Pro
995 1000 1005
Ile Val Leu Gln Asn Leu Ile Arg Leu Glu Leu Tyr Asn Leu Pro
1010 1015 1020
Asn Leu Glu Tyr Val Trp Ser Lys Asn Pro Cys Glu Leu Leu Ser
1025 1030 1035
Leu Glu Asn Ile Lys Ser Leu Thr Ile Glu Glu Cys Pro Arg Leu
1040 1045 1050
Arg Arg Glu Tyr Ser Val Lys Ile Phe Lys Pro Leu Gln Tyr Val
1055 1060 1065
Ser Ile Asp Ile Lys Gln Leu Met Lys Val Ile Glu Lys Glu Lys
1070 1075 1080
Ser Ala Asp His Asn Met Leu Glu Ser Lys Gln Trp Glu Thr Ser
1085 1090 1095
Ser Ser Ser Lys Asp Gly Val Leu Arg Leu Gly Asp Gly Ser Lys
1100 1105 1110
Leu Phe Pro Asn Leu Lys Ser Leu Lys Leu Tyr Gly Phe Val Asp
1115 1120 1125
Tyr Asn Ser Thr His Leu Pro Met Glu Met Leu Gln Ile Leu Phe
1130 1135 1140
Gln Leu Lys His Phe Glu Leu Glu Gly Ala Phe Ile Glu Glu Ile
1145 1150 1155
Phe Pro Ser Asn Ile Leu Ile Ser Ser Ser Met Asp Leu Gln Ser
1160 1165 1170
Leu Ala Leu Tyr Lys Leu Pro Lys Leu Lys His Leu Trp Ser Glu
1175 1180 1185
Glu Cys Ser Arg Asn Asn Ile Thr Ser Val Leu Gln His Leu Ile
1190 1195 1200
Phe Leu Arg Ile Ser Asp Cys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Thr Leu
1205 1210 1215
Val Ser Ser Leu Val Cys Phe Thr Asn Leu Lys Ser Leu Ala Val
1220 1225 1230
Tyr Lys Cys Asp Arg Leu Thr His Leu Leu Asn Pro Ser Met Ala
1235 1240 1245
Thr Thr Leu Val Gln Leu Gln Asp Leu Thr Ile Lys Glu Cys Lys
1250 1255 1260
Arg Met Arg Ser Val Ile Glu Glu Gly Ser Thr Glu Glu Asp Gly
1265 1270 1275
Asn Asp Glu Met Val Val Phe Asn Asn Leu Arg His Leu Tyr Ile
1280 1285 1290
Phe Asn Cys Ser Asn Leu Thr Ser Phe Tyr Cys Gly Arg Cys Ile
1295 1300 1305
Val Lys Phe Pro Cys Leu Glu Arg Val Phe Ile Gln Asn Cys Pro
1310 1315 1320
Glu Met Lys Val Phe Ser Leu Gly Ile Val Ser Thr Pro Arg Leu
1325 1330 1335
Lys Tyr Glu Lys Phe Thr Leu Met Asn Asp Tyr Asp Asp Lys Trp
1340 1345 1350
Cys His Leu Lys Tyr Pro Lys Tyr Met Leu Val Glu Asp Met Asn
1355 1360 1365
Val Ile Thr Arg Glu Tyr Trp Glu Asp Asn Val Asp Thr Gly Ile
1370 1375 1380
Pro Asn Leu Phe Ala Glu Gln Ser Leu Glu Glu Asn Arg Ser Glu
1385 1390 1395
Asn Ser Ser Ser Ser Lys Asn Asn Val Glu Lys Glu
1400 1405 1410
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记L273的PCR引物F2-B2
<400>7
ggagagagaa tccgggacta agtgact 27
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记L273的PCR引物F2-Br
<400>8
taaccacctt ttccgatcaa atttcgtac 29
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记L246的PCR引物F2-B2 Eco
<400>9
attgatgaat ctacactcct cgatctcttc 30
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记L246的PCR引物F2 Eco
<400>10
gagttcaatc catttcaatg atttaagata 30
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记V681的PCR引物V681
<400>11
ggaatcttgt tgaggccgag aggg 24
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记V681的PCR引物V681R
<400>12
gttgtatatg gcttccctgt agcc 24
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记V1684的PCR引物V588
<400>13
caacaggctc aacagtgtat tcgg 24
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记V1684的PCR引物V551R
<400>14
gaagaaggtg acgagagaga tgcc 24
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记V432的PCR引物V432
<400>15
aacttctcca actccctcca ctgc 24
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记V432的PCR引物V432R
<400>16
ttagagtggc aaagggaaga tggg 24
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记GRP805的PCR引物GRP805
<400>17
atcccctgtt tccttcaaca accc 24
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记GRP805的PCR引物GRP805R
<400>18
aacccccaag aagaagaaca accc 24
<210>19
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记M8的PCR引物M8
<400>19
ccgacgcatc tcccgacgcg ttgttg 26
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记M8的PCR引物M8R
<400>20
tcgtgaaggg ttttggagag tgagaaa 27
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记E的PCR引物LRR1
<400>21
ccttagaaga agatgaagtc tccc 24
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记E的PCR引物LRR842R
<400>22
ctccactcag aattggtagg tgcc 24
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记D的PCR引物LRR915
<400>23
aacaacttag aaccatctcc cagc 24
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记D的PCR引物LRR1
<400>24
gttgttgaga gcaatagtgt accc 24
<210>25
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物Kana II
<400>25
ccggctacct gcccattc 18
<210>26
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物Kana III
<400>26
gcgatagaag gcgatgcg 18
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PicaA+
<400>27
atgcgcatga ggctcgtctt cgag 24
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PicaA-
<400>28
gacgcaacgc atcctcgatc agct 24
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物Vat 632R
<400>29
ctggtgatga cattcatatc ttcc 24
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物Vat 632F
<400>30
cccagcaaca tactgattcc aagc 24
<210>31
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物Kana R
<400>31
ccggctacct gccattcg 18
<210>32
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物LRR F
<400>32
gttgttgaga gcaatagtgt ac 22
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物LRR R
<400>33
ccttagagaa gaatgaagtctc 22
Claims (18)
1.选自下列的分离的多核苷酸：
a)编码参与抗棉蚜这种蚜虫和/或抗经该蚜虫的病毒传播的多肽的多核苷酸，所述多肽与多肽SEQ ID NO：3具有至少80％，优选至少90％，特别优选至少95％的同一性；
b)多核苷酸a)的互补多核苷酸；
c)在严紧条件下能够与多核苷酸a)或多核苷酸b)选择性杂交的多核苷酸。
2.根据权利要求1的多核苷酸，其选自：
a)序列SEQ ID NO：1的多核苷酸；
b)序列SEQ ID NO：2的多核苷酸；
c)多核苷酸a)或多核苷酸b)的互补多核苷酸；
c)在严紧条件下能够与多核苷酸a)、b)或c)中任一个选择性杂交的多核苷酸。
3.多核苷酸，其由根据权利要求1或2中任一项的一种多核苷酸的至少10bp的片段组成。
4.多核苷酸，其编码参与抗棉蚜这种蚜虫和/或抗经该蚜虫的病毒传播的多肽，和能够通过借助于由根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸获得的至少一种核酸探针和/或至少一对扩增引物来筛选植物的基因组DNA库或cDNA库而获得。
5.可检测有利于抗棉蚜和/或抗经该蚜虫的病毒传播的Vat基因的等位基因存在与否的遗传标记，其特征在于，该标记选自下列标记：L273、L246、V681、V1684、V432、GRP805、M8、标记E、标记D，它们分别由下列引物定义：
L273：
F2-B2：GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT(SEQ ID NO：7)
F2-Br：TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC(SEQ ID NO：8)
L246：
F2-B2 Eco：ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC(SEQ ID NO：9)
F2 Eco：GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA(SEQ ID NO：10)
V681：
V681：GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG(SEQ ID NO：11)
V681R：GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC(SEQ ID NO：12)
V1684：
V588：CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG(SEQ ID NO：13)
V551R：GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC(SEQ ID NO：14)
V432：
V432：AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC(SEQ ID NO：15)
V432R：TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG(SEQ ID NO：16)
GRP805：
GRP805：ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC(SEQ ID NO：17)
GRP805R：AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC(SEQ ID NO：18)
M8：
M8：CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG(SEQ ID NO：19)
M8R：TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA(SEQ ID NO：20)
标记E：
LRR1：CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC(SEQ ID NO：21)
LRR842R：CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC(SEQ ID NO：22)
标记D：
LRR915：AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC(SEQ ID NO：23)
LRR1R：GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC(SEQ ID NO：24)。
6.可扩增出如在权利要求5中所定义的标记之一的引物对，其特征在于，该引物对选自：
-由多核苷酸SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8组成的引物对，
-由多核苷酸SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10组成的引物对，
-由多核苷酸SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12组成的引物对，
-由多核苷酸SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的引物对，
-由多核苷酸SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16组成的引物对，
-由多核苷酸SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18组成的引物对，
-由多核苷酸SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20组成的引物对，
-由多核苷酸SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22组成的引物对，和
-由多核苷酸SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24组成的引物对。
7.用于在植物中检测有利于抗棉蚜这种蚜虫和/或抗经该蚜虫的病毒传播的Vat基因的等位基因的存在的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含至少一个如在权利要求6中所定义的引物对。
8.根据权利要求1-3中任一项的至少一种多核苷酸的用途，其用于在植物中检测有利于抗棉蚜这种蚜虫和/或抗经该蚜虫的病毒传播的Vat基因的等位基因的存在。
9.根据权利要求5的至少一种遗传标记的用途，其用于在植物中检测有利于抗棉蚜这种蚜虫和/或抗经该蚜虫的病毒传播的Vat基因的等位基因的存在。
10.根据权利要求8或9中任一项的用途，其特征在于，所述植物为葫芦科植物。
11.检测植物对于棉蚜这种蚜虫的抗性或敏感性和/或对于经该蚜虫的病毒传播的抗性的方法，其特征在于，该方法包括确定在所述植物中存在的Vat基因的等位形式。
12.含有处于合适启动子的转录调控之下的根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸的表达盒。
13.含有根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸或根据权利要求12的表达盒的重组载体。
14.用根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸遗传转化的细胞。
15.根据权利要求1或2中任一项的多核苷酸的用途，其用于制备对于棉蚜这种蚜虫和/或对于经该蚜虫的病毒传播具有抗性的转基因植物。
16.用根据权利要求1或2中任一项的多核苷酸遗传转化的转基因植物。
17.根据权利要求16的转基因植物，其选自葫芦科、锦葵科和茄科植物。
18.参与抗棉蚜这种蚜虫和/或抗经该蚜虫的病毒传播的多肽，其特征在于，该多肽与多肽SEQ ID NO：3具有至少80％的同一性。
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