CN101477098B - 利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法 - Google Patents
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Abstract
一种植物抗虫技术领域的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，包括以下步骤：在大豆播种、出苗后，在子叶节下形成刀口；大豆天然提取物的提取；天然提取物饲料的制造；天然提取物饲料的保鲜；蚜虫培养环境的控制；大量的大豆抗蚜虫性检测。和以往大豆抗蚜性检测的方法相比，本发明使大豆抗蚜性检测不受环境条件的影响，克服了大豆抗蚜性检测易受到植株形态、气候、温度等的影响等不足。同时本发明能够进行大批量大豆品种的抗蚜性检测，快速准确区分大豆品种抗性之间的差异，从而可以加快大豆杂交抗蚜虫品系选育工作。
Description
技术领域
本发明涉及一种农业虫害检测技术领域的方法，具体是一种利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法。
背景技术
大豆蚜虫是大豆苗期的主要害虫之一。近年来随着气候变暖趋势加剧，大豆蚜虫灾害发生的频率增加，大豆蚜虫已经成为我国大豆生产的主要虫害。2000年以前大豆蚜虫危害主要发生在中国、菲律宾、泰国、朝鲜、韩国、印尼和俄罗斯等国家，最近几年先后侵入美国、加拿大和澳大利亚。大豆蚜虫已成为世界范围内的主要农业害虫之一。选育抗蚜或耐蚜的大豆品种是大豆生产迫切需要解决的问题。
蚜虫以植物韧皮部汁液为食，食性高度特化，其饲喂技术及人工饲料的研究难度大，直至20世纪60年代初才有Mittler & Dadd及Auclair & Cartier取得历史性突破，使得蚜虫可在人工饲养条件下存活数周。Bradley RH在《Can JMicrobiol》的《Effects of depth of stylet penetration on aphid transmissionof potato virus Y》(蚜虫刺吸的深度对马铃薯病毒Y传播效应的影响.加拿大微生物学杂志，1956年，第二卷第6期，第539-547页)一文中指出，Bradley首次将parafilm M(泊拉膜)应用于蚜虫的人工饲料饲养技术中，并成功地检测到带病毒的蚜虫在其口针刺进或穿过惰性基质时病毒的损失情况。Parafilm M薄膜是美国Structure Probe，Inc.(结构探测有限公司)生产，商标为Parafilm，是一种自动封口、可模压、韧性好的特制薄膜产品，广泛用于常规实验室，包括常规电子显微实验室。Parafilm M薄膜具有独特的渗透性能，卓越的水汽通透性能和很强抗腐蚀性能。它能够紧紧锁住水分，试剂滴落在Parafilm薄膜表面上会形成一颗精致不流散的“水珠”，进而可对培养基试管、细颈瓶、培养管及陪替氏培养皿中的物质提供很好的保护。
人工饲养蚜虫多采用类似Mittler and Dadd所采用的膜取食系统。不同类型的蚜虫饲育器虽然在大小、外型及具体的构成部件等方面均存在较大差异，但都是由两个基本的部分组成：一、放置液态饲料的饲料室，由双层拉薄的Parafilm M薄膜以及人工饲料液滴构成；二、供蚜虫取食、活动的取食室，通常为有底或无底的圆筒形玻璃或塑料容器，并作为膜的支持物。饲养时，饲料室固定于取食室的一端，将蚜虫放入取食室，在取食室的另一端围以纱网，防止蚜虫逃逸，并可起到通风的作用。蚜虫口针可刺破Parafilm M薄膜吸食饲料，获取所需的营养物质。
蚜虫人工饲养技术的出现，使得蚜虫在脱离寄主植物后得以短期或长期存活。凭借这项技术，研究者们可以在小空间及特定的气候、生理试验条件下较方便地进行蚜虫实验。研究者们可对蚜虫取食过程、蚜虫唾液分泌及排泄过程进行观察，测定蚜虫对食物吸收以及氧消耗等指标。蚜虫人工饲养技术还可应用于蚜虫传播病毒机制、营养生理、共生菌、毒理与杀虫活性物质的生物测定以及昆虫与植物间相互关系等方面的研究，并已成为这些研究领域的重要实验手段。
经过对现有技术的文献检索发现，高月波和孙雅杰在《吉林农业大学学报》2004年第26卷第4期第429-430页及第437页“利用人工饲料饲养蚜虫的技术”中评述：不同植株形态的大豆品种对大豆蚜虫的抗性也有差异，裸大豆通常都表现较好的抗蚜性状，这可能是与其无毛性状有关，但具体的抗性机制并不明晰，且在田间接虫进行大豆抗蚜性检测易受到植株形态、气候、温度等的影响。杨振宇、本多健一郎、王曙明、马晓萍在《吉林农业科学》2004年第29卷第5期第3-6页“中国东北抗蚜野生大豆重复检测的研究”中评述：在人工气候箱内可进行抗蚜重复检测，但是由于大豆植株较大，该方法不适合进行大批量大豆品种的抗蚜性检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法。本发明使大豆抗蚜性检测不受环境条件的影响，克服了大豆抗蚜性检测易受到植株形态、气候、温度等的影响等不足。同时本发明能够进行大批量大豆品种的抗蚜性检测，快速准确区分大豆品种抗性之间的差异，从而可以加快大豆抗蚜虫品系选育。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括具体步骤如下：
①在大豆播种、出苗后，在子叶节下形成刀口；
②提取大豆天然提取物：取大豆苗，清洗干净，粉碎机粉碎，碾钵碾，提取大豆天然提取物；
③制作天然提取物饲料：过滤获得的天然大豆提取物，将过滤后的提取物滴于薄膜夹中，分装；
④天然提取物饲料的保鲜：采用钴-60射线辐射处理，冷冻贮存，保鲜贮存大豆天然提取物饲料；
⑤控制蚜虫生长环境：控制温度、光照、湿度、昼/夜光照的蚜虫生长环境；
⑥检测、筛选大豆抗蚜性的抗性品种和感蚜品种。
所述的大豆播种，是指：每个品种取大豆种子10-20粒，播种在沙土中，播种深度3cm-5cm，温度12℃-16℃，促进产生大豆次生代谢产物。
所述的产生大豆次生代谢产物，具体为：在大豆出苗2-4天后，使用手术刀在子叶节下0.3cm-0.5cm处形成长0.1mm-0.3mm，深0.05mm-1.00mm的刀口，促进大豆次生代谢产物的产生。
所述的提取大豆天然提取物，具体为：在大豆出苗8-10天时，取大豆10-20棵，清洗、冲洗，用小型粉碎机粉碎50-60秒后，放在碾钵里碾至大豆汁液出现，获得大豆天然提取物2ml-3ml。
所述的制作天然提取物饲料，具体为：用直径为50mm，过滤孔径为0.22μm-0.44μm规格的水系微孔过滤膜过滤得到的天然提取物，然后将过滤后的提取物以每个夹0.1ml-0.3ml的剂量滴于双层拉薄的Parafilm M薄膜夹中，分装成天然提取物饲料。
所述的天然提取物饲料的保鲜，具体方法为：将每个天然提取物饲料分别编号，每10个分装在一个塑料袋中。采用钴-60射线照射，选择照射剂量为2.0kGy-3.0kGy，照射时间为3h-5h，然后在-20℃--50℃的低温冰箱冷冻贮存。
所述的控制蚜虫生长环境，具体为：在面积为16m2-20m2的培养室内，温度保持在23℃-25℃，光照强度为300μmolm-2s-1-320μmolm-2s-1，相对湿度为70％-80％，昼/夜光照为18/6h-16/8h。
所述的检测、筛选大豆抗蚜性，具体为：在培养室中放置蚜虫饲育膜取食器，每一个蚜虫饲育膜取食器里放一种大豆的天然提取物饲料，在取食器天然提取物饲料上接种2-4只1龄幼虫，在之后第13-15天时测定大豆蚜虫的繁殖数量，每个品种重复三次，经筛选获得抗性品系。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：和以往大豆抗蚜性检测的方法相比，本发明使大豆抗蚜性检测不受环境条件的影响，克服了大豆抗蚜性检测易受到植株形态、气候、温度等的影响等不足。同时本发明的大豆天然提取物饲料及其保鲜方法，能够保存试验样本和便于重复检测，从而能够进行大批量大豆品种的抗蚜性检测，快速准确区分大豆品种抗性之间的差异，从而可以加快大豆抗蚜虫品系选育工作。
具体实施方式
以下实例将对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
对抗、感品种杂交大豆的后代进行抗蚜性检测，母本品种东农42号表现感蚜虫，父本品种P574表现抗蚜虫，杂交F2代80个品系进行抗蚜虫检测。检测步骤如下：
①大豆的生长培养，F2代80个大豆品系，每个品系取大豆种子10粒，播种在沙土中，播种深度3cm，控制温度12℃；促进大豆次生代谢产物的产生，在大豆出苗后2天，使用手术刀在子叶节下0.3cm形成长0.1mm深0.05mm的刀口，促进大豆次生代谢产物的产生；
②大豆品系天然提取物的提取，在大豆出苗8天时，取大豆10棵，用清水清洗干净，然后用超纯水冲洗，用小型粉碎机粉碎50秒后，放在碾钵里碾至大豆汁液出现，获得大豆品系天然提取物2ml；
③天然提取物饲料的制造，用直径为50mm，过滤孔径为0.22μm规格的水系微孔过滤膜过滤得到的天然提取物，然后将过滤后的提取物以每个夹0.1ml的剂量滴于双层拉薄的Parafilm M薄膜夹中，分装成天然提取物饲料；
④天然代谢产物饲料的保鲜，将每个天然提取物饲料分别编号，每10个分装在一个塑料袋中。采用钴-60射线，选择照射剂量2.0kGy，照射时间3h，然后在-20℃的低温冰箱冷冻贮存；
⑤蚜虫培养环境条件的控制，在16m2培养室采用Mittler and Dadd的蚜虫饲育膜取食器，温度保持在23℃，光照强度300μmolm-2s-1，相对湿度为70％，昼/夜光照为18/6h；
⑥大豆抗蚜虫性检测，每一个Mittler and Dadd蚜虫饲育膜取食器里放一种大豆的天然提取物饲料，用毛笔在取食器天然提取物饲料上接种2只1龄幼虫，在之后第13天时测定大豆蚜虫的繁殖数量，80个大豆品系，每个品系重复三次，经筛选获得抗性品系。
检测结果，筛选得到的抗性品系06-5、06-13、06-19、06-21、06-22、06-78、06-80等61个，蚜虫表现是原来接虫数量的3倍，其余等19个感蚜品系蚜虫表现是原来接虫数量的30倍，抗性基因呈单基因显性遗传方式，大豆品系抗蚜性表现显著的差异。
实施例2
对抗、感品种杂交大豆的后代进行抗蚜性检测，母本品种交大02-89号表现感蚜虫，父本品种P574表现抗蚜虫，杂交F2代90个品系进行抗蚜虫检测。检测步骤如下：
①大豆的生长培养，F2代90个大豆品系，每个品系取大豆种子25粒，播种在沙土中，播种深度4cm，控制温度14℃；促进大豆次生代谢产物的产生，在大豆出苗后3天，使用手术刀在子叶节下0.4cm形成长0.2mm深0.75mm的刀口，促进大豆次生代谢产物的产生；
②大豆品系提取物的提取，在大豆出苗9天时，取大豆15棵，用清水清洗干净，然后用超纯水冲洗，用小型粉碎机粉碎55秒后，放在碾钵里碾至大豆汁液出现，获得大豆品系天然提取物2.5ml；
③天然提取物饲料的制造，用直径为50mm，过滤孔径为0.33μm规格的水系微孔过滤膜过滤得到的天然提取物，然后将过滤后的提取物以0.2ml/每个夹的剂量滴于双层拉薄的Parafilm M薄膜夹中，分装成天然提取物饲料；
④将每个天然提取物饲料分别编号，每10个分装在一个塑料袋中。采用钴-60射线，选择照射剂量2.5kGy，照射时间4h，然后在35℃的低温冰箱冷冻贮存；
⑤蚜虫培养环境条件的控制，在18m2培养室采用Mittler and Dadd的蚜虫饲育膜取食器，温度保持在24℃，光照强度310μmolm-2s-1，相对湿度为75％，昼/夜光照为17/7h；
⑥大豆抗蚜虫性检测，每一个Mittler and Dadd蚜虫饲育膜取食器里放一种大豆的天然提取物饲料，用毛笔在取食器天然提取物饲料上接种3只1龄幼虫，在之后第14天时测定大豆蚜虫的繁殖数量，90个大豆品系，每个品系重复三次，经筛选获得抗性品系。
检测结果，筛选得到的抗性品系09-1、09-7、09-16、09-38、09-53、09-69、09-90等65个，蚜虫表现是原来接虫数量的4倍，其余25个感蚜品系蚜虫表现是原来接虫数量的35倍，抗性基因呈单基因显性遗传方式，大豆品系抗蚜性表现显著的差异。
实施例3
对抗、感品种杂交大豆的后代进行抗蚜性检测，母本品种合丰45号表现感蚜虫，父本品种P574表现抗蚜虫，杂交F2代100个品系进行抗蚜虫检测。检测步骤如下：
①大豆的生长培养，F2代100个大豆品系，每个品系取大豆种子20粒，播种在沙土中，播种深度5cm，控制温度16℃；促进大豆次生代谢产物的产生，在大豆出苗后4天，使用手术刀在子叶节下0.5cm形成长0.3mm深1.00mm的刀口，促进大豆次生代谢产物的产生；
②大豆品系天然提取物的提取，在大豆出苗10天时，取大豆20棵，用清水清洗干净，然后用超纯水冲洗，用小型粉碎机粉碎60秒后，放在碾钵里碾至大豆汁液出现，获得大豆品系天然提取物3ml；
③天然提取物饲料的制造，用直径为50mm，过滤孔径为0.44μm规格的水系微孔过滤膜过滤得到的天然提取物，然后将过滤后的提取物以0.3ml/每个夹的剂量滴于双层拉薄的Parafilm M薄膜夹中，分装成天然提取物饲料；
④将每个天然提取物饲料分别编号，每10个分装在一个塑料袋中，把100个天然提取物饲料装在一个塑料袋。天然提取物饲料的保鲜，把100个天然提取物饲料装在一个塑料袋中，采用钴-60射线，选择照射剂量3.0kGy，照射时间5h，然后在50℃的低温冰箱冷冻贮存；
⑤蚜虫培养环境条件的控制，在20m2培养室采用Mittler and Dadd的蚜虫饲育膜取食器，温度保持在25℃，光照强度320μmolm-2s-1，相对湿度为80％，昼/夜光照为16/8h；
⑥大豆抗蚜虫性检测，每一个Mittler and Dadd蚜虫饲育膜取食器里放一种大豆的天然提取物饲料，用毛笔在取食器天然提取物饲料上接种4只1龄幼虫，在之后第15天时测定大豆蚜虫的繁殖数量，100个大豆品系，每个品系重复三次，经筛选获得抗性品系。
检测结果，筛选得到的抗性品系02-6、02-15、02-32、02-49、02-73、02-81、02-96等78个，蚜虫表现是原来接虫数量的5倍，其余22个感蚜品系蚜虫表现是原来接虫数量的40倍，抗性基因呈单基因显性遗传方式，大豆品系抗蚜性表现显著的差异。
本实施例使大豆抗蚜性检测不受环境条件的影响，克服了大豆抗蚜性检测易受到植株形态、气候、温度等的影响等不足。同时本发明的大豆天然提取物饲料及其保鲜方法，能够保存试验样本和便于重复检测，进而能够进行大批量大豆品种的抗蚜性检测，快速准确区分大豆品种抗性之间的差异，从而可以加快大豆抗蚜虫品系选育工作。
Claims (9)
1.一种利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征在于，包括步骤如下：
①在大豆播种、出苗后，在子叶节下形成刀口；
②提取大豆天然提取物：取大豆苗，清洗干净，粉碎机粉碎，碾钵碾，提取大豆天然提取物；
③制作天然提取物饲料：过滤获得的天然大豆提取物，将过滤后的提取物滴于薄膜夹中，分装；
④天然提取物饲料的保鲜：采用钴-60射线辐射处理，冷冻贮存，保鲜贮存大豆天然提取物饲料；
⑤控制蚜虫生长环境：控制温度、光照、湿度、昼/夜光照的蚜虫生长环境；
⑥检测、筛选大豆抗蚜性的抗性品种和感蚜品种，方法为：在培养室中放置蚜虫饲育膜取食器，每一个蚜虫饲育膜取食器里放一种大豆的天然提取物饲料，在取食器天然提取物饲料上接种2-4只1龄幼虫，在之后第13-15天时测定大豆蚜虫的繁殖数量，每个品种重复三次，经筛选获得抗性品系。
2.根据权利要求1所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征是，所述的大豆播种，是指：每个品种取大豆种子10-20粒，播种在沙土中，播种深度3cm-5cm，温度12℃-16℃，产生大豆次生代谢产物。
3.根据权利要求2所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征是，所述的产生大豆次生代谢产物，具体为：在大豆出苗2-4天后，使用手术刀在子叶节下0.3cm-0.5cm处形成长0.1mm-0.3mm，深0.05mm-1.00mm的刀口，促进大豆次生代谢产物的产生。
4.根据权利要求1所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征是，所述的提取大豆天然提取物，具体为：在大豆出苗8-10天时，取大豆10-20棵，清洗、冲洗，用小型粉碎机粉碎50-60秒后，放在碾钵里碾至大豆汁液出现，获得大豆天然提取物2ml-3ml。
5.根据权利要求1所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征是，所述的制作天然提取物饲料，其方法为：以过滤膜过滤得到的天然提取物，然后将过滤后的提取物以每个夹0.1ml-0.3ml的剂量滴于薄膜夹中，分装成天然提取物饲料。
6.根据权利要求5所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征是，所述的过滤，是指：用直径为50mm，过滤孔径为0.22μm-0.44μm的水系微孔过滤膜过滤。
7.根据权利要求5所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征是，所述的薄膜夹，是指：提取物在双层拉薄的Parafilm M薄膜夹中分装。
8.根据权利要求1所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征是，所述的天然提取物饲料的保鲜，其方法为：将每个天然提取物饲料分别编号，每10个分装在一个塑料袋中，采用钴-60射线照射，选择照射剂量为2.0kGy-3.0kGy，照射时间为3h-5h，然后在-20℃--50℃的低温冰箱冷冻贮存。
9.根据权利要求1所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征是，所述的控制蚜虫生长环境，其方法为：在面积为16m2-20m2的培养室内，温度保持在23℃-25℃，光照强度为300μmolm-2s-1-320μmolm-2s-1，相对湿度为70％-80％，昼/夜光照为18/6h-16/8h。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Granted publication date: 20120718 Termination date: 20150108 |
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