CN104396597A - 一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法，包括烟草子叶苗的准备、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、灌根接种、染色观察等几个步骤。该方法只需要在人工气候箱或培养室内使用培养皿海绵加滤纸保湿即可接种疫霉，显微镜下直接观察染色、脱色后的子叶苗胚根，具有操作简便、快捷的特点，适用于烟草疫霉侵染烟草的过程观察、不同品种抗性检测。
Description
技术领域
本发明属于病菌与植物互作研究技术领域，具体涉及一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法。
背景技术
烟草黑胫病是由烟草疫霉（Phytophthora nicotianae) 引起的一种土传病害，是影响烟草产量和品质的主要病害之一。研究表明，烟草疫霉集中在距土表5厘米的范围内活动，侵染部位主要是茎基部和根。带菌的土壤、粪肥及灌溉水是烟草黑胫病的主要初侵染源，其次为带病烟苗，其产生的孢子囊和游动孢子借雨水或灌溉水传播，可通过气孔、伤口或穿透幼嫩表皮细胞的角质层侵入引起再浸染。但至目前为止，烟草疫霉侵染烟草的过程了解得并不多。因此，开发一种能解决上述问题的方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法。
本发明的目的是这样实现的，包括烟草子叶苗的准备、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、灌根接种、染色观察步骤，具体包括：
A、烟草子叶苗的准备：将烟草种子表面消毒后播种于发芽床上，于相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下培养7~10天后发芽形成子叶苗备用；
B、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，将菌丝块加入到10%V8汁液体培养基的培养皿中，每皿加菌丝块20~40片，继续于25~28℃下黑暗培养3~4天，倾去培养液，用灭菌水冲洗3~5次，每天换加灭菌水1~3次，连续2~3天诱导游动孢子囊的产生，当每平方厘米菌丝块游动孢子囊在10000个以上时，5~8℃低温处理20~30min，取出置于室温15~30min诱导游动孢子囊释放游动孢子，疫霉用无菌水调节游动孢子浓度为104~6个/ml得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；
C、灌根接种；取B步骤获得的烟草疫霉游动孢子悬浮液缓慢滴加至发芽床，让其渗透到每株子叶苗的根部；
D、染色观察：接种后的子叶苗在相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下继续培养，每隔4小时取子叶苗，去除子叶及子叶相连胚根的2/3，得胚根样品，浸没到台盼蓝或苯胺蓝（trypan blue）工作液（储存液：10g 苯酚、10ml 甘油、10ml 乳酸、10ml ddH2O、0.02g trypan blue；工作液：1v储存液:2v96%乙醇。）中，沸水水浴1min，室温至少12小时过夜，取出染色子叶苗胚根放入水合三氯乙醛溶液（脱色液：1kg水合三氯乙醛 chloral hydrate溶解于400mL水）中脱色至少30分钟，纯水冲洗样品1~3次，显微观察样品细胞死亡、孢子萌发和菌丝生长情况。
本发明借助相关的病菌与寄主互作的观察方法，结合烟草疫霉侵染烟草的特点，在疫霉纯培养显微观察的基础上加以改进，提出了一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法，可望为病害的防治提供新途径。
本发明具有以下优点及效果：
一是本发明操作过程在人工气候箱/室进行，2~3天内可完成侵染观察，省空间、省时间、省劳力，具有操作简便、快捷的优点。
二是本发明技术原理明确，即利用烟草游动孢子的根部趋化性，使游动孢子富集于子叶苗的胚根，形成休止孢后直接穿透幼嫩表皮细胞的角质层侵入胚根，且在合适的温湿度环境下发病迅速、典型、稳定的特点，拨取子叶苗、剪胚根，取样简单，极大地提高了工作效率。
附图说明
图1 为本发明方法流程示意图；
图2 为烟草疫霉侵染子叶苗胚根24小时后的激光共聚焦观察结果；
图3 为烟草疫霉侵染子叶苗胚根的过程图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的烟草疫霉侵染过程的实时观察方法，包括烟草子叶苗的准备、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、灌根接种、染色观察步骤，具体包括：
A、烟草子叶苗的准备：将烟草种子表面消毒后播种于发芽床上，于相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下培养7~10天后发芽形成子叶苗备用；
B、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，液体培养诱导产生游动孢子囊、低温促进游动孢子囊释放游动孢子疫霉，用无菌水调节游动孢子浓度为104~6个/ml得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；
C、灌根接种；取B步骤获得的烟草疫霉游动孢子悬浮液缓慢滴加至发芽床，让其渗透到每株子叶苗的根部；
D、染色观察：接种后的子叶苗在相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下继续培养，每隔4小时取子叶苗，去除子叶及子叶相连胚根的2/3，得胚根样品，浸没到台盼蓝或苯胺蓝（trypan blue）工作液（储存液：10g 苯酚、10ml 甘油、10ml 乳酸、10ml ddH2O、0.02g trypan blue；工作液：1v储存液:2v96%乙醇。）中，沸水水浴1min，室温至少12小时过夜，取出染色子叶苗胚根放入水合三氯乙醛溶液（脱色液：1kg水合三氯乙醛 chloral hydrate溶解于400mL水）中脱色至少30分钟，纯水冲洗样品1~3次，显微观察样品细胞死亡、孢子萌发和菌丝生长情况。
A步骤中所述的表面消毒是50~55℃温汤浸种8~10分钟，或1%硫酸铜或0.1%硝酸银溶液浸种10~15分钟。
所述的发芽床是由海绵和滤纸做成。
B步骤中所述的OA培养基配方为：燕麦片30克、自来水1000毫升。
B步骤中所述的10%V8汁液体培养基配方为：用自来水稀释V8汁至10%（w/w）、再加0.1%（w/w）的碳酸钙。
B步骤中所述的菌丝块的大小为2mm×2mm。
B步骤中所述的液体培养诱导产生游动孢子囊是将菌丝块加入到10%V8汁液体培养基的培养皿中，每皿加菌丝块20~40片，继续于25~28℃下黑暗培养3~4天，倾去培养液，用灭菌水冲洗3~5次，每天换加灭菌水1~3次，连续2~3天诱导游动孢子囊的产生，直至每平方厘米菌丝块游动孢子囊在10000个以上时停止诱导。
B步骤中所述的低温促进游动孢子囊释放游动孢子是将产生游动孢子的菌丝块5~8℃低温处理20~30min，取出置于室温15~30min诱导游动孢子囊释放游动孢子。
C步骤中所述的烟草疫霉游动孢子悬浮液滴加量为10~15毫升。
实施例1
本实施例用烟草疫霉0号生理小种（中华人民共和国烟草行业标准YC/T39-1996）为实验菌株，用抗病品种RBST和感病品种红花大金元作为实验烟草品种。
结合流程图1，具体操作如下：
（1）烟草子叶苗的准备：抗病品种RBST和感病品种红花大金元烟草种子表面消毒后，10×10方阵点播于海绵和滤纸做成的培养皿发芽床上，在相对湿度80%-85%、光照强度1000Lx-2000Lx、温度25℃-28℃的人工气候箱内培养7-10天后发芽形成子叶苗，备用；
（2）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，液体培养诱导产生游动孢子囊、低温促进游动孢子囊释放游动孢子疫霉，用无菌水调节游动孢子浓度为104个/mL、105个/mL、106个/mL，共3个浓度梯度烟草疫霉游动孢子悬浮液；
（3）灌根接种：将10~15 mL步骤（2）获得的游动孢子液用移液枪从发芽床滤纸的四周缓慢滴加，尽可能让游动孢子悬浮液渗到每株子叶苗的根部，每浓度接种1皿为1个处理，重复3次；
（4）染色观察：接种后的子叶苗在步骤（1）的条件下继续培养，每隔4小时取子叶苗，去除子叶及子叶相连胚根的2/3，得胚根样品，浸没到台盼蓝或苯胺蓝（trypan blue）工作液（储存液：10g 苯酚、10ml 甘油、10ml 乳酸、10ml ddH2O、0.02g trypan blue；工作液：1v储存液:2v96%乙醇。）中，沸水水浴1min，室温至少12小时过夜，取出染色子叶苗胚根放入水合三氯乙醛溶液（脱色液：1kg水合三氯乙醛 chloral hydrate溶解于400mL水）中脱色至少30分钟，纯水冲洗样品1~3次，显微观察样品细胞死亡、孢子萌发、菌丝生长情况。
激光共聚焦观察所用显微镜型号为ZEISS LSM710。图2左边为感病品种红花大金元的胚根观察照片、右边为抗病品种RBST的观察照片，在紫外光的激发下部分菌丝呈绿色，在感病品种上菌丝生长量较大，而在抗病烟草品种上菌丝生长很小。
普通显微观察所用显微镜型号为ZEISS AX10。图3中左边为感病品种红花大金元的胚根观察照片、右边为抗病品种RBST的观察照片：第一排为4小时观察结果，发现烟草疫霉无论在感病、还是在抗病品种上都向根部富集；第二排为8小时观察结果，发现烟草疫霉无论在感病、还是在抗病品种上都能在根细胞内萌发、生长；第一排为24小时观察结果，发现在感病品种上菌丝生长量较大、非常长的菌丝沿着维管束的方向生长（图中箭头所示），而在抗病烟草品种上菌丝生长受到明显的限制、菌丝被局限在侵染的细胞中。
Claims (9)
1.一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法，其特征在于包括烟草子叶苗的准备、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、灌根接种、染色观察步骤，具体包括：
A、烟草子叶苗的准备：将烟草种子表面消毒后播种于发芽床上，于相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下培养7~10天后发芽形成子叶苗备用；
B、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，液体培养诱导产生游动孢子囊、低温促进游动孢子囊释放游动孢子疫霉，用无菌水调节游动孢子浓度为104~6个/ml得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；
C、灌根接种；取B步骤获得的烟草疫霉游动孢子悬浮液缓慢滴加至发芽床，让其渗透到每株子叶苗的根部；
D、染色观察：接种后的子叶苗在相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下继续培养，每隔4小时取子叶苗，去除子叶及子叶相连胚根的2/3，得胚根样品，浸没到台盼蓝或苯胺蓝工作液中，沸水水浴1min，室温至少12小时过夜，取出染色子叶苗胚根放入水合三氯乙醛溶液中脱色至少30分钟，纯水冲洗样品1~3次，显微观察样品细胞死亡、孢子萌发和菌丝生长情况。
2.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于A步骤中所述的表面消毒是50~55℃温汤浸种8~10分钟，或1%硫酸铜或0.1%硝酸银溶液浸种10~15分钟。
3.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于所述的发芽床是由海绵和滤纸做成。
4.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的OA培养基配方为：燕麦片30克、自来水1000毫升。
5.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的10%V8汁液体培养基配方为：用自来水稀释V8汁至10%、再加0.1%的碳酸钙。
6.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的菌丝块的大小为2mm×2mm。
7.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的液体培养诱导产生游动孢子囊是将菌丝块加入到10%V8汁液体培养基的培养皿中，每皿加菌丝块20~40片，继续于25~28℃下黑暗培养3~4天，倾去培养液，用灭菌水冲洗3~5次，每天换加灭菌水1~3次，连续2~3天诱导游动孢子囊的产生，直至每平方厘米菌丝块游动孢子囊在10000个以上时停止诱导。
8.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的低温促进游动孢子囊释放游动孢子是将产生游动孢子的菌丝块5~8℃低温处理20~30min，取出置于室温15~30min诱导游动孢子囊释放游动孢子。
9.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于C步骤中所述的烟草疫霉游动孢子悬浮液滴加量为10~15毫升。
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