CN104396599A - 一种烟草疫霉接种烟草的方法 - Google Patents

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陈学军
肖炳光
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Abstract

本发明公开了一种烟草疫霉接种烟草的方法，包括以下步骤：（1）烟草子叶苗的准备；（2）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备；（3）灌根接种；（4）统计发病情况，评价抗病结果。本发明的游动孢子接种子叶苗根部可以严格定量，避免了接种量过大而导致同一的品种抗感的表现差异，在抗性鉴定时更准确、有效；在实际操作中，可大批量进行，具有占用空间小、节约劳动成本、缩短实验周期的优点。因此，本发明方法适合推广应用。

Description

一种烟草疫霉接种烟草的方法
技术领域
本发明属于植物抗病鉴定技术领域，具体涉及一种烟草疫霉接种烟草的方法。
背景技术
烟草黑胫病是由烟草疫霉（Phytophthora nicotianae) 引起的一种土传病害，是影响烟草产量和品质的主要病害之一。防治该病害最安全有效的措施是利用抗病品种。抗病品种需要通过抗性鉴定验证。在品种抗性鉴定中，大田鉴定经常涉及的品种较少，适宜于规模抗性鉴定的主要以苗期鉴定为主，应用较多的是GB/T 23224描述的菌谷法接种、菌丝块创伤法接种（中国发明专利ZL 200610048658；黄成江等，抗黑胫病烤烟品种资源筛选的研究初报，云南农业大学学报，2008，23(4):565-570）。菌谷、菌丝块创伤法接种需要将待测定的烟草品种播种培育至成苗、再移栽，时间长达70~80天，每品种至少10株，在盆栽条件下占用空间较大。因此，开发一种能缩短时间、节省空间的接种方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草疫霉接种烟草的方法。
本发明的目的是这样实现的，包括烟草子叶苗的准备、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、灌根接种、统计评价步骤，具体包括：
A、烟草子叶苗的准备：将烟草种子表面消毒后播种于发芽床上，于相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下培养7~10天后发芽形成子叶苗备用；
B、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，液体培养诱导产生游动孢子囊、低温促进游动孢子囊释放游动孢子用无菌水调节游动孢子浓度为104~6个/ml得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；
C、灌根接种；取B步骤获得的烟草疫霉游动孢子悬浮液缓慢滴加至发芽床，让其渗透到每株子叶苗的根部；
D、统计发病情况，评价抗病结果：接种后的子叶苗在相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下继续培养3~5天，调查子叶苗的发病率，按发病率划分抗感性，免疫或高抗发病率为0，抗病发病率为0.1~25%，中抗发病率为25.1~45%，中感发病率为45.1~65%，感病发病率为65.1~80%，高感发病率为80.1~100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗的材料即可作为抗源。
疫霉疫霉本发明的游动孢子接种子叶苗根部可以严格定量，避免了接种量过大而导致同一的品种抗感的表现差异，游动孢子既可从根部侵入也可从下胚轴侵入，与田间自然侵入方式相同，在筛选抗源时更准确、有效；在实际操作中，可大批量进行，在人工气候箱/室进行，具有占用空间小、节约劳动成本、缩短实验周期等优点。
附图说明：
图1为本发明方法流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的烟草疫霉接种烟草的方法，包括烟草子叶苗的准备、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、灌根接种、统计评价步骤，具体包括：
A、烟草子叶苗的准备：将烟草种子表面消毒后播种于发芽床上，于相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下培养7~10天后发芽形成子叶苗备用；
B、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，液体培养诱导产生游动孢子囊、低温促进游动孢子囊释放游动孢子用无菌水调节游动孢子浓度为104~6个/ml得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；
C、灌根接种；取B步骤获得的烟草疫霉游动孢子悬浮液缓慢滴加至发芽床，让其渗透到每株子叶苗的根部；
D、统计发病情况，评价抗病结果：接种后的子叶苗在相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下继续培养3~5天，调查子叶苗的发病率，按发病率划分抗感性，免疫或高抗发病率为0，抗病发病率为0.1~25%，中抗发病率为25.1~45%，中感发病率为45.1~65%，感病发病率为65.1~80%，高感发病率为80.1~100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗的材料即可作为抗源。
A步骤中所述的表面消毒是50~55℃温汤浸种8~10分钟，或1%硫酸铜或0.1%硝酸银溶液浸种10~15分钟。
所述的发芽床是由海绵和滤纸做成。
B步骤中所述的OA培养基配方为： 燕麦片30克、自来水1000毫升。
B步骤中所述的10%V8汁液体培养基配方为：用自来水稀释V8汁至10%（w/w）、再加0.1%的碳酸钙（w/w）。
B步骤中所述的菌丝块的大小为2mm×2mm。
B步骤中所述的液体培养诱导产生游动孢子囊是将菌丝块加入到10%V8汁液体培养基的培养皿中，每皿加菌丝块20~40片，继续于25~28℃下黑暗培养3~4天，倾去培养液，用灭菌水冲洗3~5次，每天换加灭菌水1~3次，连续2~3天诱导游动孢子囊的产生，直至每平方厘米菌丝块游动孢子囊在10000个以上时停止诱导。
B步骤中所述的低温促进游动孢子囊释放游动孢子是将产生游动孢子的菌丝块5~8℃低温处理20~30min，取出置于室温15~30min诱导游动孢子囊释放游动孢子。
C步骤中所述的烟草疫霉游动孢子悬浮液滴加量为10~15毫升。
疫霉疫霉实施例1：游动孢子接种子叶苗的实验步骤及接种量
本实施例用烟草疫霉0号生理小种（中华人民共和国烟草行业标准YC/T39-1996）为实验菌株，用抗病品种RBST和感病品种红花大金元作为实验烟草品种。
具体操作如下：
（1）烟草子叶苗的准备：抗病品种RBST和感病品种红花大金元烟草种子表面消毒后，10×10方阵点播于海绵和滤纸做成的培养皿发芽床上，在相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃的人工气候箱内培养7~10天后发芽形成子叶苗，备用；
（2）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种在OA培养基平板，25~28℃恒温黑暗培养7~10天，袋菌丝长满整个平板后，将菌丝切成2mm×2mm的小块，加入到10%V8汁培养皿浅盘的液体培养基中，每皿加菌丝块20~40片，继续培养3~4天，倾去培养液，灭菌水冲洗3~5次后，每天换加灭菌水1~3次，连续2~3天诱导游动孢子囊的产生，当每平方厘米菌丝块游动孢子囊在10000个以上时，5~8℃低温处理20~30分钟，取出置于室温15~30分钟诱导游动孢子囊释放游动孢子，用无菌水调节游动孢子浓度为104个/mL、105个/mL、106个/mL，共3个浓度梯度烟草疫霉游动孢子悬浮液；
（3）灌根接种：将10~15 mL步骤（2）获得的游动孢子液用移液枪从发芽床滤纸的四周缓慢滴加，尽可能让游动孢子悬浮液渗到每株子叶苗的根部，每浓度接种1皿为1个处理，重复3次；
（4）接种效果判定：接种后的子叶苗在步骤（1）的条件下继续培养3~5天，调查子叶苗的发病率。
为验证重复性，共进行了4个批次的实验。
实验结果表明，感病品种红花大金元3天后水浸状发病症状明显，3个浓度梯度发病率在85.1~93.6%之间，而抗病品种RBST在5天后3个浓度梯度发病率在1.5~4.8%之间，4批次在2抗感品种上发病率稳定在各自的范围内，说明方法重复性符合实验要求。3个浓度可以作为合适的接种量使用，105个/mL是最适宜的接种量。
实施例2：游动孢子接种子叶苗筛选抗源
本实施例用15个材料，采用0号生理小种，具体步骤如下：
（1）烟草子叶苗的准备：烟草种子表面消毒后，10×10方阵点播于海绵和滤纸做成的培养皿发芽床上，在相对湿度80~85%、光照强度2000LX、温度28℃的人工气候箱/室内培养10天后发芽形成子叶苗，备用；
（2）烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种在OA培养基平板， 28℃恒温黑暗培养10天，待菌丝长满整个平板后，将菌丝切成2mm×2mm的小块，加入到10%V8汁培养皿浅盘的液体培养基中，每皿加菌丝块40片，继续培养3天，倾去培养液，灭菌水冲洗3~5次后，每天换加灭菌水1~3次，连续2~3天诱导游动孢子囊的产生，当每平方厘米菌丝块游动孢子囊在10000个以上时，5~8℃低温处理20~30分钟，取出置于室温15~30分钟诱导游动孢子囊释放游动孢子，用无菌水调节游动孢子浓度为105个/mL，即得烟草疫霉游动孢子悬浮液；
（3）灌根接种：将10~15 mL步骤（2）获得的游动孢子液用移液枪从发芽床滤纸的四周缓慢滴加，尽可能让游动孢子悬浮液渗到每株子叶苗的根部，每品种接种1皿为1个处理，重复3次；
（4）抗性鉴定结果的判定：接种后的子叶苗在步骤（1）的条件下继续培养3-5天，调查子叶苗的发病率，取第3、4、5天调查的平均值为该品种发病率，每重复分别统计，按发病率划分抗感性，免疫或高抗的发病率为0，抗病的发病率为0.1~25%，中抗的发病率为25.1~45%，中感的发病率为45.1~65%，感病的发病率为65.1~80%，高感的发病率为80.1~100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗的材料即可作为抗源。
实验结果见表1，实验结果表明，15个材料中免疫的有2个，抗病的有4个，中抗的有1个，中感的有4个，感病的有1个，高感的有3个。这些结果与菌谷和菌丝块接种抗性鉴定结果完全吻合。
表1  游动孢子接种子叶苗筛选抗源结果

Claims (9)

1.一种烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于包括烟草子叶苗的准备、疫霉游动孢子悬浮液的制备、灌根接种、统计评价步骤，具体包括：
A、烟草子叶苗的准备：将烟草种子表面消毒后播种于发芽床上，于相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下培养7~10天后发芽形成子叶苗备用；
B、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，液体培养诱导产生游动孢子囊、低温促进游动孢子囊释放游动孢子用无菌水调节游动孢子浓度为104~6个/ml，得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；
C、灌根接种；取B步骤获得的烟草疫霉游动孢子悬浮液缓慢滴加至发芽床，让其渗透到每株子叶苗的根部；
D、统计发病情况，评价抗病结果：接种后的子叶苗在相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下继续培养3~5天，调查子叶苗的发病率，按发病率划分抗感性，免疫或高抗发病率为0，抗病发病率为0.1~25%，中抗发病率为25.1~45%，中感发病率为45.1~65%，感病发病率为65.1~80%，高感发病率为80.1~100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗的材料即可作为抗源。
2.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于A步骤中所述的表面消毒是50~55℃温汤浸种8~10分钟，或1%硫酸铜或0.1%硝酸银溶液浸种10~15分钟。
3.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于所述的发芽床是由海绵和滤纸做成。
4.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的OA培养基配方为： 燕麦片30克、自来水1000毫升。
5.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的10%V8汁液体培养基配方为：用自来水稀释V8汁至10%、再加0.1%的碳酸钙。
6.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的菌丝块的大小为2mm×2mm。
7.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的液体培养诱导产生游动孢子囊是将菌丝块加入到10%V8汁液体培养基的培养皿中，每皿加菌丝块20~40片，继续于25~28℃下黑暗培养3~4天，倾去培养液，用灭菌水冲洗3~5次，每天换加灭菌水1~3次，连续2~3天诱导游动孢子囊的产生，直至每平方厘米菌丝块游动孢子囊在10000个以上时停止诱导。
8.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的低温促进游动孢子囊释放游动孢子是将产生游动孢子的菌丝块5~8℃低温处理20~30min，取出置于室温15~30min诱导游动孢子囊释放游动孢子。
9.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于C步骤中所述的烟草疫霉游动孢子悬浮液滴加量为10~15毫升。
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