CN106489740A - 一种以鸡头黄精鳞茎为外植体的种苗快速繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用组织培养技术进行鸡头黄精种苗快速繁殖的方法，包括外植体的选择、消毒、处理、启动培养、鳞茎球的分化、增殖、鳞茎分蘖苗的诱导、试管苗的生根培养、温室炼苗和移栽等步骤，建立了鸡头黄精快速繁殖技术体系，其中鳞茎球增殖系数达6.7，试管苗生根率达98％,温室移栽成活率达90％以上，本发明的技术方案是一种高效、快捷的繁殖技术，短时期内即可实现规模化种苗生产，在一定程度解决了鸡头黄精种苗资源短缺的问题。

Description

一种以鸡头黄精鳞茎为外植体的种苗快速繁殖方法
技术领域
本发明涉及一种以鸡头黄精鳞茎为外植体的种苗快速繁殖方法。
背景技术
黄精(Polygonatum sibiricum Delar.ex Redoute)别名鸡头黄精、鸡头参，属百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)多年生草本植物，主要分布于宁夏六盘山地区，是药食兼用的大宗中药材，在我国已有2000多年的药用历史。黄精以干燥根茎入药，味甘性平，用于胃阴不足，脾胃气虚，体倦乏力，口干食少，肺虚燥咳，精血不足，痨嗽咳血，腰膝酸软，须发早白，内热消渴等功效(中华人民共和国药典2010)。
随着现代市场经济的发展，对黄精药理作用的认识不断深入，黄精药材的需求量不断增加，同时对黄精多种功能的深入研究，天然保健与功能食品的开发研制，黄精的市场需求量逐年增加，采集野生黄精不但不能满足市场需求，更破坏了生态环境和黄精野生资源。目前，黄精繁殖方式主要为有性繁殖(种子)和无性繁殖(根茎)两种方式，采用根茎繁殖，品种更新速度慢、易感染病毒病，多代繁殖后品种退化严重；同时用种量大，每公顷需黄精2250kg，需要大量采挖野生黄精，对种源和环境破坏严重。采用种子繁殖，存在生长周期长(从播种到采收需4～5年)，且种子发芽、成苗率低等问题。无法大批量的生产种苗，常规繁殖方法已不适应黄精产业迅速发展的需求。组织培养技术是现代先进的植物离体繁殖技术，它不仅克服了种子繁殖中存在的诸多问题，还克服了常规无性繁殖速度慢、繁殖率低的缺点，且组织培养不受季节、气候等因素制约，组织获得的种苗生长均一，可以在室内稳定进行周年培养生产。
但目前还未见到关于鸡头黄精人工快速繁育的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种以宁夏产鸡头黄精鳞茎为外植体的种苗快速繁殖方法，是一种高效、快捷的繁殖技术，短时期内即能够实现规模化种苗生产，在一定程度解决了鸡头黄精种苗资源短缺的问题。
一种以鸡头黄精鳞茎为外植体的种苗快速繁殖方法，其特别之处在于，包括如下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：选择秋季新鲜、成熟的当年生鸡头黄精鳞茎球，除去基部残余的老根，先用流水冲洗30min，然后投到体积份数为2％的次氯酸钠溶液中浸泡20min，再用清水冲洗干净，接着转入超净工作台，在超净工作台上先用75％的乙醇浸泡20s，然后用无菌水冲洗3-4遍，再转入0.1％的升汞溶液中浸泡8min，该升汞溶液每升含0.1mL吐温20，然后用无菌水冲洗4-5次后备用；
(2)材料的处理：将即步骤(1)得到的的鳞茎球用无菌滤纸吸干表面的水分，在超净工作台内用刀刮去栓皮层，然后将鳞茎球先横切为2块，保留有萌动芽的上半部分，再将下半部分纵切为3-5mm的2块，将这3块鳞茎作为外植体备用；
(3)启动培养：在无菌条件下将步骤(2)处理好的外植体接种到启动培养基中，每瓶接种1块，该培养基是在Ms培养基中额外添加了1.0mg/L～3.0mg/L的6-BA、0.5mg/L～1.0mg/L的NAA和10.0mg/L～20mg/L病毒唑，蔗糖30g/L，琼脂粉5.0g/L，(用NaOH，下同)调整pH值为5.8，培养温度18±1℃，置暗培养条件下培养12-15天，直至鳞茎膨大，切面少量愈伤化；
(4)鳞茎分化：将步骤(3)得到的培养的鳞茎整块转入鳞茎分化培养基，该鳞茎分化培养基以Ms培养基为基本培养基，额外添加细胞分裂素6-BA1.0mg/L～2.0mg/L、生长素NAA0.5mg/L～1.0mg/L和病毒唑5.0mg/L～10.0mg/L，蔗糖40.0g/L，琼脂粉5.0g/L，调整pH值为5.8，培养温度22±1℃，置光照培养箱中，每天光照14h，光照强度1500Lx～2000Lx，培养40-50天，直至从膨大的鳞茎块周围分化出小的鳞茎球；
(5)继代增殖培养：切取步骤(4)诱导产生的小的鳞茎球，接种到鳞茎球增殖培养基上，该鳞茎球增殖培养基以Ms培养基为基本培养基，额外添加6-BA 0.5mg/L～1.0mg/L、NAA 0.1mg/L～0.5mg/L，蔗糖40g/L，琼脂粉5.0g/L，pH值为5.8，培养温度22±1℃，置光照培养箱中，每天光照14h，光照强度1500Lx～2000Lx，培养20-30天，直至部分小鳞茎球长出分蘖小苗，此时升高培养温度至24±1℃，继续培养15-20天，直至小鳞茎基部增殖出一簇一簇的小鳞茎球；
(6)生根培养：将步骤(5)得到的长出分蘖绿苗的鳞茎球切割出来，分别接种于生根培养基中进行生根培养，该生根培养基以1/2Ms培养基为基本培养基，额外添加0.5mg/L的NAA和0.1mg/L的IBA，0.5g/L的活性炭，蔗糖30g/L，琼脂粉5.0g/L，调整pH值为5.8，培养温度24±1℃，置光照培养箱中，每天光照14h，光照强度1500Lx～2000Lx，培养25-30天，小苗长至3.0cm-4.0cm高，长出5-8条根，准备进行试管苗移栽；
(7)炼苗移栽：将步骤(6)中生根的试管苗开盖后置于温室中，保持温度23℃～26℃，湿度65％～75％，光强2000Lx～2500Lx的条件下炼苗5～7天，然后取出苗，在清水中洗掉培养基，移栽到配制好的移栽基质中，该移栽基质由草炭土、椰糠和蛭石按5:2:3的体积比例混合，置塑料小拱棚中，保持湿度75％左右，光强2000Lx～2500Lx，保持通风，培养25-30天，移去拱棚，增加光强从而使试管苗逐渐适应自然光照条件，待叶片硬化后，将鸡头黄精种苗移栽于大田即可。
本发明方法的有益效果在于：(1)本发明方法以宁夏产野生鸡头黄精的鳞茎球为外植体，建立了鸡头黄精人工种苗快速繁殖技术体系，获得了完整的鸡头黄精种苗。采用本发明技术体系，可以直接诱导鳞茎球增殖出小鳞茎，通过继代增殖培养实现鳞茎球的无限繁殖，进而通过调控培养温度、光照强度从小鳞茎长出分蘖小苗；本发明的繁殖方法具有繁殖速度快，培养周期短，繁殖率高，移栽成活率高等特点。(2)本发明方法在继代增殖过程中通过调整生长调节剂浓度、提高培养温度，促进鳞茎球分化出绿苗，缩短了培养时间。在试管苗温室炼苗中要注意保湿和和适当光照，炼苗对试管苗移栽成活率影响很大，此外移栽基质配土也很关键，既要保持一定的营养又要保湿和疏松，因此本发明采用草炭土、椰糠和蛭石按5:2:3比例混合，移栽深度以刚没过鳞茎球为宜，使试管苗移栽成活率达90％以上。
附图说明
附图1为启动培养时的状态图；
附图2为鳞茎分化培养时的状态图；
附图3为鳞茎分化培养时的状态图；
附图4为鳞茎分化培养时的状态图；
附图5为鳞茎球增殖培养时的状态图；
附图6为试管苗分化时的状态图；
附图7为试管苗生根时的状态图；
附图8为试管苗炼苗移栽时的状态图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明，以使本发明的优点和特征更利于被本领域的技术人员理解，同时对本发明的保护范围作出更为清晰明确的界定。
实施例1：
一种以宁夏六盘山产鸡头黄精鳞茎为外植体的种苗快速繁殖方法，包括：
1、外植体的选择与消毒：选择秋季(8月末～9月初)新鲜、成熟的宁夏六盘山产当年生鸡头黄精鳞茎球，除去鳞茎球基部残余的老根，先用自来水冲洗30min，然后投到体积份数为2％的次氯酸钠溶液中浸泡20min，取出后用清水冲洗4-5次，继而转入超净工作台，在超净工作台上进行二次消毒，具体是先用75％乙醇浸泡20s，迅速用无菌水冲洗3-4遍，再转入0.1％的升汞溶液(每升含0.1mL吐温20)中浸泡8min，取出后用无菌水冲洗4-5次；
2、材料的处理：在超净工作台内将消毒好的鳞茎球用无菌滤纸吸干表面的水分，用刀刮去栓皮层，然后将鳞茎球在1/3处先横切为2块，保留有萌动芽的上半部分，将下面2/3部分纵切为2块，准备将这3块鳞茎接入启动培养基；
3、启动培养：在无菌条件下将步骤1、2处理好的3块外植体接种到启动培养基中，每瓶接种1块，启动培养基是在Ms常规培养基中额外添加了3.0mg/L的6-BA、1.0mg/L的NAA和10.0mg/L病毒唑，蔗糖30g/L，琼脂粉5.0g/L，(用NaOH，下同)调整pH值为5.8，培养温度18±1℃，置暗培养条件下培养12-15天，待鳞茎膨大，切面开始出现愈伤组织时进入下一阶段培养；
4、鳞茎分化：将步骤3启动培养的鳞茎整块转入鳞茎分化培养基，该鳞茎分化培养基以Ms培养基为基本培养基，添加细胞分裂素6-BA1.0mg/L、生长素NAA 0.5mg/L和10.0mg/L病毒唑，蔗糖40.0g/L，琼脂粉5.0g/L，调整PH值为5.8，培养温度22±1℃，置光照培养箱中，每天光照14h，光照强度1500Lx～2000Lx，培养40-50天，直至从膨大的鳞茎块周围分化出小的鳞茎球；
5、继代增殖培养：切取步骤4诱导产生的小的鳞茎球，接种到鳞茎球增殖培养基上，该增殖培养基以Ms培养基为基本培养基，额外添加6-BA1.0mg/L、NAA 0.5mg/L，蔗糖40g/L，琼脂粉5.0g/L，调整PH值为5.8，培养温度22±1℃，置光照培养箱中，每天光照14h，光照强度1500Lx～2000Lx，培养20-30天，直至小鳞茎开始抽出绿芽，此时升高培养温度至24±1℃，继续培养15-20天，直至鳞茎基部可增殖出一簇一簇的小鳞茎球，增殖系数达6.7；
6、生根培养：将步骤5中抽出绿芽的鳞茎球切割出来，分别接种于生根培养基中进行生根培养，该生根培养基以1/2Ms培养基为基本培养基，额外添加0.5mg/L的NAA和0.1mg/L的IBA，0.5g/L的活性炭，蔗糖30g/L，琼脂粉5.0g/L，调整PH值为5.8，培养温度24±1℃，置光照培养箱中，每天光照14h，光照强度1500Lx～2000Lx，培养25-30天，直至小苗长至3.0-4.0，根系长出5-8条根，根系健壮时准备试管苗移栽；
7、炼苗移栽：将步骤6中生根的试管苗开瓶后置温室中，保持温度23-25℃，湿度65～75％，光强2500～3000Lx的条件下炼苗5-7天，然后取出苗，在清水中洗掉培养基，移栽到事先配制好的移栽基质中，该移栽基质由草炭土、椰糠和蛭石按5:2:3的体积比例混合，移栽深度以刚没过鳞球茎为宜，置塑料小拱棚中，保持湿度75％，光强2000Lx～2500Lx，保持通风，培养25-30天后移去拱棚，适当增加光强，使试管苗逐渐适应自然光照条件，直至鸡头黄精种苗适应自然条件。
经过上述培养步骤，结果是鸡头黄精鳞茎球分化率达98％以上，鳞茎球平均增殖系数达6.7，再生种苗生根率达98％以上，最终大田移栽成活率达90％以上。
以上所述仅为本发明的实施例，并未限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所做的等效结构或等效流程，或直接或间接运用相关技术进行鸡头黄精人工繁殖，均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.一种以鸡头黄精鳞茎为外植体的种苗快速繁殖方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：选择秋季新鲜、成熟的当年生鸡头黄精鳞茎球，除去基部残余的老根，先用流水冲洗30min，然后投到体积份数为2％的次氯酸钠溶液中浸泡20min，再用清水冲洗干净，接着转入超净工作台，在超净工作台上先用75％的乙醇浸泡20s，然后用无菌水冲洗3-4遍，再转入0.1％的升汞溶液中浸泡8min，该升汞溶液每升含0.1mL吐温20，然后用无菌水冲洗4-5次后备用；
(2)材料的处理：将即步骤(1)得到的的鳞茎球用无菌滤纸吸干表面的水分，在超净工作台内用刀刮去栓皮层，然后将鳞茎球先横切为2块，保留有萌动芽的上半部分，再将下半部分纵切为2块，将这3块鳞茎作为外植体备用；
(3)启动培养：在无菌条件下将步骤(2)处理好的外植体接种到启动培养基中，每瓶接种1块，该培养基是在Ms培养基中额外添加了1.0mg/L～3.0mg/L的6-BA、0.5mg/L～1.0mg/L的NAA和10.0mg/L～20mg/L病毒唑，蔗糖30g/L，琼脂粉5.0g/L，调整pH值为5.8，培养温度18±1℃，置暗培养条件下培养12-15天，直至鳞茎膨大，切面少量愈伤化；
(4)鳞茎分化：将步骤(3)得到的培养的鳞茎整块转入鳞茎分化培养基，该鳞茎分化培养基以Ms培养基为基本培养基，额外添加细胞分裂素6-BA 1.0mg/L～2.0mg/L、生长素NAA0.5mg/L～1.0mg/L和病毒唑5.0mg/L～10.0mg/L，蔗糖40.0g/L，琼脂粉5.0g/L，调整pH值为5.8，培养温度22±1℃，置光照培养箱中，每天光照14h，光照强度1500Lx～2000Lx，培养40-50天，直至从膨大的鳞茎块周围分化出小的鳞茎球；
(5)继代增殖培养：切取步骤(4)诱导产生的小的鳞茎球，接种到鳞茎球增殖培养基上，该鳞茎球增殖培养基以Ms培养基为基本培养基，额外添加6-BA 0.5mg/L～1.0mg/L、NAA0.1mg/L～0.5mg/L，蔗糖40g/L，琼脂粉5.0g/L，pH值为5.8，培养温度22±1℃，置光照培养箱中，每天光照14h，光照强度1500Lx～2000Lx，培养20-30天，直至部分小鳞茎球长出分蘖小苗，此时升高培养温度至24±1℃，继续培养15-20天，直至小鳞茎基部增殖出一簇一簇的小鳞茎球；
(6)生根培养：将步骤(5)得到的长出分蘖绿苗的鳞茎球切割出来，分别接种于生根培养基中进行生根培养，该生根培养基以1/2Ms培养基为基本培养基，额外添加0.5mg/L的NAA和0.1mg/L的IBA，0.5g/L的活性炭，蔗糖30g/L，琼脂粉5.0g/L，调整pH值为5.8，培养温度24±1℃，置光照培养箱中，每天光照14h，光照强度1500Lx～2000Lx，培养25-30天，小苗长至3.0cm-4.0cm高，长出5-8条根，准备进行试管苗移栽；
(7)炼苗移栽：将步骤(6)中生根的试管苗开盖后置于温室中，保持温度23℃～26℃，湿度65％～75％，光强2000Lx～2500Lx的条件下炼苗5～7天，然后取出苗，在清水中洗掉培养基，移栽到配制好的移栽基质中，该移栽基质由草炭土、椰糠和蛭石按5:2:3的体积比例混合，置塑料小拱棚中，保持湿度75％左右，光强2000Lx～2500Lx，保持通风，培养25-30天，移去拱棚，增加光强从而使试管苗逐渐适应自然光照条件，待叶片硬化后，将鸡头黄精种苗移栽于大田即可。
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