CN107114242A

CN107114242A - 一种黄精的组织培养方法

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Publication number: CN107114242A
Application number: CN201710322658.8A
Authority: CN
Inventors: 王华磊; 赵致; 刘红昌; 罗春丽; 李金玲; 罗夫来; 黄明进; 张雪
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2017-05-09
Filing date: 2017-05-09
Publication date: 2017-09-01
Anticipated expiration: 2037-05-09
Also published as: CN107114242B

Abstract

本发明公开了一种黄精的组织培养方法，包括以下步骤：A.愈伤诱导培养，B.愈伤增值培养，C.丛生芽诱导培养，D.生根培养。本发明方法可使黄精长势好，诱导率高达为54.76%，愈伤增值倍数为6.67、愈伤平均体积2.99mL、愈伤平均重量为2.17g、致密个数占33.33%、长势极好的占40%、愈伤组织颜色大都为绿白色；平均出芽率高达86.11%、平均丛生芽个数为18.6、平均芽高为1.7cm。平均生根率达到66.67%、平均根数高达30条以上、平均根长0.45以上cm、平均根粗1.0mm以上。

Description

一种黄精的组织培养方法

技术领域

本发明涉及一种黄精的组织培养方法，特别是一种长势好的黄精的组织培养方法。

技术背景

黄精为我国常用的中药材，是百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)多年生草本植物根茎的总称。黄精化学成份主要有糖类、黄酮及蒽醌类化合物、甾体皂苷、生物碱、强心苷、木脂素、维生素和多种对人体有用的氨基酸及微量元素等；药理研究认为，黄精具有延长寿命、抗衰老、影响心血管系统、提高免疫能力、抗炎、抗病原微生物、抗疲劳、提高学习记忆力、抑制肿瘤细胞等作用，且安全无毒、无致突变性。临床应用研究报道，黄精及其制剂对呼吸系统、心血管系统、消化系统以及白细胞减少症、糖尿病、结核病、老年痴呆、外生殖器感染、足癣甲癣、蛲虫病、慢性肝炎、秃发、习惯性流产和不育症、慢性荨麻疹、痛风性关节炎、瘰疠等疾病均有明显疗效。另外，黄精还可用于制饮料、做蜜饯、加工保健品和护肤品、充当猪饲料添加剂以及作蔬菜和观赏花卉等。可见其用途非常广泛。

黄精用途广泛，用量不断增加，除了药用外，还用于保健品、开发化妆品、作为观赏园林植物等。近年来，野生黄精资源不断减少，市场供不应求，而人工栽培技术还处于野生变家种阶段，运用块茎或种子培育黄精种苗，存活率低，繁殖所需要的时间长，繁殖种苗生长慢，难以达到快速大量繁殖、大批量生产的要求。

黄精的繁殖方式有有性和无性繁殖两种。目前黄精生产上种子繁殖面临的问题是种子发芽率不高，且发芽时间较长，无性繁殖以根茎移栽为主，但其繁殖成本较高；组织培养技术在植物快速繁殖中的应用既可以短时间内生产大量种苗又可降低繁殖的成本，同时建立优良无性系的快速繁殖体系，有利于种质资源的保护及GAP基地的建立，但是到目前为止，关于黄精组织培养的研究较少，多是以腋芽或休眠芽为外植体进行，与叶片相比，腋芽和休眠芽的数量较少，不易获取。

发明内容：

本发明的目的在于，提供一种黄精的组织培养方法。本发明以容易大量获取的叶片为外植体，筛选出来较高愈伤组织诱导、愈伤组织增殖、丛生芽诱导和生根诱导培养基，可使黄精的平均生根率达到66.67％、平均根数高达30条以上、平均根长0.45以上cm、平均根粗1.0mm 以上。可在短时间内为生产提供黄精组培苗。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案实现：

一种黄精的组织培养方法，包括以下步骤：A.愈伤诱导培养，B.愈伤增值培养，C.丛生芽诱导培养，D.生根培养。

前述的黄精的组织培养方法中，所述步骤A.愈伤诱导培养为：取黄精无菌苗叶片，将其剪为0.5cm*0.5cm的大小的小块，于愈伤诱导培养基中培养40-50天，得诱导出的愈伤组织颗粒；

所述步骤B.愈伤增值培养为：将诱导出的愈伤组织颗粒转接到愈伤增值培养基中进行增值培养50-60天，得增值的愈伤组织；

所述步骤C丛生芽诱导培养为：将增值的愈伤组织切成0.6cm*0.6cm*0.6cm的小块，小块在丛生芽诱导培养基中进行诱导丛生芽，培养35-45天，直至黄精丛生芽长至2-3cm，得黄精丛生芽；

所述步骤D生根培养为：将黄精丛生芽切开分为单芽，接入生根培养基进行生根培养， 45-55天，即可。

前述的黄精的组织培养方法中，所述愈伤诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA1.0-3.0mg、 NAA2.0-4.0mg和蔗糖15-25g制备而成。

前述的黄精的组织培养方法中，所述愈伤诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA2.0mg、 NAA3.0mg和蔗糖20g制备而成。

前述的黄精的组织培养方法中，所述愈伤诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA0.5-1中加入6-BA1.0mg、2，4-D2mg和蔗糖20g制备而成。

前述的黄精的组织培养方法中，所述愈伤增值培养基为：向1LMS中加入6-BA1.0-3.0mg、 NAA2.0-4.0mg和蔗糖15-25g制备而成；或所述愈伤增值培养基为：向1LMS中加入6-BA0.5-1.5mg、2，4-D1-3mg和蔗糖15-25g制备而成。

前述的黄精的组织培养方法中，所述丛生芽诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA1.0-3.0mg 和NAA3.5-4.5mg制备而成；或所述丛生芽诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA3.5-4.5mg和 2，4-D0.3-0.5mg制备而成。

前述的黄精的组织培养方法中，所述丛生芽诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA2.0mg和 NAA4.0mg制备而成；或所述丛生芽诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA4.0mg和2，4-D0.4mg 制备而成。

前述的黄精的组织培养方法中，所述生根培养基为：向1LMS中加入NAA0.5-1.5mg制备而成；或所述生根培养基为：向1LMS中加入中加入NAA0.4-0.6mg制备而成。

前述的黄精的组织培养方法中，所述生根培养基为：向1LMS中加入NAA1.0mg制备而成；或所述生根培养基的含量为：向1LMS中加入NAA0.5mg制备而成。

另外，发明人对黄精的组织培养方法进行了长期的大量的研究，部分研究实验如下：

实验例

一、实验方法

1实验材料

本实验所用的黄精来自贵州省贵阳市花溪区药材市场，将所购买的块茎培育出黄精无菌苗作为实验材料。无菌苗是在贵州省药用植物繁育与种植重点实验室培养出，实验用苗经贵州大学王华磊教授鉴定为百合科植物黄精(Polygonatum sibiricum)的无菌苗。

1.1愈伤诱导材料

愈伤诱导材料为无菌苗叶片，用小刀切为0.5cm*0.5cm小块进行接种。

1.2愈伤增值材料

愈伤增值材料为愈伤诱导培养中经叶片诱导出的愈伤颗粒。

1.3丛生芽诱导材料

丛生芽诱导的材料为愈伤增值培养中所培养的生长极好的愈伤组织。

1.4生根培养材料

生根培养材料为丛生芽诱导培养中生长健壮的组培苗。

1.5其他供试材料

MS培养基相关药品：上海山浦化工有限公司；α-萘乙酸(NAA)：上海山浦化工有限公司；生长素(2，4-D)：加拿大BIO BASIC公司；6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)：加拿大BIO BASIC公司；纯化琼脂粉：Beijing Solarbio Science&Technology Co.，Ltd.；蔗糖：成都金山化学试剂有限公司；香蕉汁：自制。

2.实验地点

贵州省药用植物繁育与种植重点实验室。

1.实验设计

3.1愈伤诱导培养

取黄精无菌苗叶片，将其剪为约0.5cm*0.5cm的大小，以MS为基本培养基，实验采用3 因素3水平L₉(3³)正交实验设计，见表2.1，表2.2，每个处理接种5瓶，每瓶接入6个，重复3次，培养45天后对愈伤率、长势情况进行统计。

表2.1黄精愈伤诱导因素水平表

表2.2黄精愈伤诱导试验方案L₉(3³)

3.2愈伤增值培养

将诱导出的愈伤组织颗粒转接到下列培养基中进行增值培养，以MS为基本培养基，实验采用4因素3水平L₉(3⁴)正交实验设计，见表2.3，表2.4，每个处理接种5瓶，每瓶接入1个，3次重复。培养55天后对愈伤增值倍数、颜色、密度、致密疏松情况、长势情况进行统计。

表2.3黄精愈伤增值培养因素水平表

表2.4黄精愈伤增值培养试验方案L₉(3⁴)

3.3丛生芽诱导培养

将增值的愈伤组织切为小块，约0.6cm*0.6cm*0.6cm小块进行诱导丛生芽。以MS培养基为基本培养基，加入蔗糖为20g/L。添加不同浓度的6-BA、NAA、和2，4-D进行实验。实验采用3因素4水平L₁₆(4³)正交实验设计见表2.5，表2.6。每种处理接种5瓶，每瓶接种1-3 个，重复3次。培养40天左右后对出芽率、丛生芽个数、芽平均高度、长势情况进行统计。

表2.5黄精丛生芽诱导培养因素水平表

表2.6黄精丛生芽诱导培养试验方案L₁₆(4³)

3.4生根培养

当黄精丛生芽长至2-3cm时，将其切开分为单芽，接入生根培养基进行生根培养，生根基本培养基为MS+蔗糖20g/L+香蕉75g/L培养基。添加不同浓度的6-BA、NAA。试验采用2因素4水平L₁₆(4²)正交试验设计，见表2.7、表2.8。每一处理接种5瓶，每瓶接入1-2个，重复2次，培养50d后对生根率、根数、根长、根粗、根颜色、苗高、苗长势情况进行统计。

表2.7黄精生根培养因素水平表

表2.8黄精生根培养试验方案L₁₆(4²)

4培养条件

实验中所有培养基都添加琼脂7.5g/L，pH为5.8～6.0，不涉及蔗糖含量的试验中蔗糖含量均为30g/L。培养基在121℃下灭菌25min，培养温度为(25±2)℃，光照为1000-2000lx，光照时间为12h/d。

5调查指标

愈伤诱导培养试验中，对愈伤率、长势情况进行统计。

愈伤增值培养试验中，对愈伤增值倍数、颜色、密度、致密疏松情况、长势情况进行统计。

愈伤诱导丛生芽试验中，对出芽率、丛生芽个数、芽平均高度、长势情况进行统计。

丛生芽诱导生根试验中，对生根率、根数、根长、根粗、根颜色、苗高、苗长势情况进行统计。

长势情况用极好(+++)、好(++)、一般(+)表示，在愈伤诱导培养中长势极好(+++)为叶片大部分形成愈伤，愈伤为绿色；长势好(++)为叶片部分形成愈伤，大都绿白色；长势一般(+)为叶片极少或没有形成愈伤的，愈伤颜色为白色或黑色。愈伤增值培养中，长势极好(+++)为愈伤增值倍数较大，为3倍以上，颜色绿色，增值快的愈伤组织。长势好(++) 为增值倍数在2-3倍之间，颜色绿白居多；长势一般(+)为增值倍数只有1倍或无变化，愈伤颜色极少有绿色，大都黄色或黑色。在丛生芽诱导培养中，丛生芽苗数在10株以上、苗高1cm以上为长势极好(+++)；丛生芽苗数在4-10株时；记为长势好(++)；丛生芽苗数在0-4 株之间时，记为长势一般(+)。

愈伤增值倍数＝愈伤体积增大的倍数；

愈伤率(％)＝形成愈伤数/接种总数；密度(g/ml)＝重量/体积；

出芽率(％)＝出芽株数/接种总株数；

生根率(％)＝生根株数/接种总株数。

6实验数据分析软件

本试验采用Excel软件和IBM SPSS Statistics数据编辑器对实验数据进行数据处理和统计分析。

二、结果与分析

1、黄精愈伤诱导培养的研究

1.1 6-BA浓度、NAA浓度、蔗糖含量对愈伤诱导率的影响

由表3.1可知。平均诱导率最高的为处理6，即6-BA浓度为3.0mg/L、NAA浓度为4.0mg/L、蔗糖含量20g/L，平均诱导率高达54.76％。平均诱导率最低的为对照组处理1，即6-BA浓度、 NAA浓度、蔗糖含量均为0，其平均诱导率为2.22％。长势极好的有实验编号A6、A8。分别占13.33％、13.33％。

表3.1黄精愈伤诱导率计算表

由表3.2可知，6-BA浓度、NAA浓度及蔗糖含量的F值都小于a＝0.05，即F＜F_{(0.05，2，2})， P＞0.05。表明6-BA浓度、NAA浓度及蔗糖含量各水平平均诱导率差异不显著。此时，可从表3.1中选择平均诱导率最大的组合为最优水平组合，即实验编号为A6，6-BA浓度为3.0mg/L、 NAA浓度为4.0mg/L、蔗糖含量20g/L。

表3.2黄精愈伤诱导率方差分析表

2黄精愈伤增值培养的研究

2.0不同6-BA浓度、2，4-D浓度、NAA浓度、蔗糖含量对愈伤增值倍数的影响

由下表3.3可知，愈伤平均增值倍数最大的为实验号B7，即6-BA浓度2.0mg/L，NAA浓度为3.0mg/L蔗糖浓度为20g/L其增值倍数达到7.87。另外，愈伤增值倍数达到6.67的为试验号B6，即6-BA浓度为1.0mg/L，2，4-D浓度为2.0mg/L，蔗糖浓度为20g/L。愈伤增值倍数最小的为对照处理组，试验号B1，其6-BA浓度为0.0mg/L、2，4-D浓度为0.0mg/L、NAA浓度为0.0mg/L、蔗糖浓度为0g/L，其增值倍数为1.27，愈伤基本不变化，未增值。由表3.3所示，可知实验编号为B6的愈伤平均重量最大，为2.17g，其次为B7培养的，平均重量为2.1g.平均体积最大的为B7培养，其体积达到3.17mL，其次为B6，体积为2.99。总的来说，愈伤平均重量和平均体积较大的为B6和B7。其组合为较好组合，可获得较好较大的愈伤组织。同样，由表3.3可知，致密个数最多的为试验号B4、B6，约占46.67％，其次为试验号B7，占33.33％，其余所占比例较小。同时，致密个数少的疏松所占个数就多。致密疏松的判断根据愈伤增值培养后的重量和体积计算而得。

表3.3黄精愈伤增值培养计算表

注：致密疏松的判断为其密度(g/mL)＞1计为致密，＜1计为疏松。

由下表3.4可知，因为6-BA浓度的F值介于F_{(0.05，2，3)}与F_{(0.01，2，3)}之间、即0.01＜P＜0.05，2，4-D 浓度、NAA浓度的F＜F_{(0.05，2，3)}、P＞0.05，蔗糖含量的F＞F_{(0.01，2，3})、P＜0.01。表明6-BA浓度大小各水平的愈伤增值倍数差异显著(0.01＜P＜0.05)，2，4-D浓度、NAA浓度大小各水平的愈伤增值倍数差异不显著(P＞0.05)，蔗糖含量各水平对愈伤增值倍数差异极显著(P＜0.01)。对6-BA 浓度大小、蔗糖含量各水平平均愈伤增值倍数进行多重比较，如下表3.5。表明6-BA浓度为 2.0mg/L、1.0mg/L的愈伤平均增值倍数大于6-BA浓度为0.0mg/L的增值倍数。浓度为2.0mg/L、 1.0mg/L的平均愈伤增值倍数差异不显著(P＞0.05)。蔗糖含量为20g/L、30g/L和0g/L之间的平均愈伤增值倍数差异显著(0.01＜P＜0.05)，含量为20g/L与含量为0g/L之间平均愈伤增值倍数差异极显著(P＜0.01)。

多重比较结果表明，6-BA浓度为2.0mg/L与1.0mg/L结果较好。蔗糖含量为20g/L为最优水平。另外，由表3.4可知，2，4-D浓度、NAA浓度大小各水平的愈伤增值倍数差异不显著(P＞0.05)，不必对其进行多重比较。此时，可从表3.3中选择平均愈伤增值倍数最大的水平，即2，4-D浓度为0mg/L、NAA浓度3mg/L。因此，6-BA浓度为2.0mg/L、2，4-D浓度为0mg/、NAA浓度3mg/L、蔗糖含量为20g/L即实验处理B7为最优水平组合其愈伤增值倍数达到7.87，其次为B6，6-BA浓度为1.0mg/L、2，4-D浓度为2mg/、NAA浓度0mg/L、蔗糖含量为20g/L，其愈伤增值倍数为6.67。

表3.4愈伤增值培养增值倍数方差分析表

表3.5 6-BA浓度、蔗糖含量各水平平均愈伤增值倍数多重比较表(SSR法)

注：*表示差异显著，**表示差异极显著。小写字母表示不同处理在0.05水平上的差异显著性，大写字母表示不同处理在0.01水平上的差异显著性,下表同。

2.2不同6-BA浓度、2,4-D浓度、NAA浓度、蔗糖含量对愈伤长势情况的影响

由下表3.6可知，愈伤增值培养中长势情况长势极好最多的为编号B6，占40％。而对照组编号B1，长势极好的为0。

表3.6愈伤增值培养中愈伤长势情况表

3.黄精丛生芽诱导培养的研究

3.1不同6-BA浓度、NAA浓度、2,4-D浓度对出芽率的影响

根据下表3.7，实验编号为C7的平均出芽率最高，其6-BA浓度为2.0mg/L、NAA浓度为4.0mg/L、2,4-D浓度为0mg/L,平均出芽率值高达86.11％；平均出芽率最低的为对照组处理1，实验编号为C1，其6-BA浓度为0.0mg/L、NAA浓度为0.0mg/L、2,4-D浓度为0mg/L，平均出芽率只有18.89％。同时，由表3.7可知，平均丛生芽个数最多的为C7，即6-BA浓度为2.0mg/L、NAA浓度为4.0mg/L、2,4-D浓度为0.0mg/L，平均丛生芽个数高达18.6个。其次平均丛生芽个数较多的为C16，即6-BA浓度为4.0mg/L、NAA浓度为0.0mg/L、2,4-D浓度为0.4mg/L，平均丛生芽个数为11.27个。平均芽高最高的为2.4cm,实验处理号为C14，即 6-BA浓度为4.0mg/L、NAA浓度为3.0mg/L、2,4-D浓度为0.0mg/L。实验结果表明，实验处理C7和C16利于丛生芽个数的增值。实验处理C14利于芽的增长。

表3.7丛生芽诱导培养平均出芽率计算表

由下表3.8可知，6-BA浓度、NAA浓度及2,4-D浓度的F值都小于a＝0.05，即F<F_(0.05,3,6)， P>0.05。表明6-BA浓度、NAA浓度及2,4-D浓度各水平平均诱导率差异不显著。此时，可从表3.7中选择平均诱导率最大的组合为最优水平组合，即实验编号为C7，6-BA浓度为 2.0mg/L、NAA浓度为4.0mg/L、2,4-D浓度为0mg/L，此时的平均出芽率最高，为86.11％，其次为C16，6-BA浓度为4.0mg/L、NAA浓度为0.0mg/L、2,4-D浓度为0.4mg/L，此时的平均出芽率为80％。

表3.8丛生芽诱导培养平均出芽率方差分析表

3.2不同6-BA浓度、NAA浓度、2,4-D浓度对丛生芽长势情况的影响

由下表3.9可知，不同6-BA浓度、NAA浓度、2,4-D浓度对丛生芽长势情况长势极好最多的为处理3、处理13和处理14。此外处理7有2/3为长势好，其余长势一般。

表3.9不同6-BA浓度、NAA浓度、2,4-D浓度对丛生芽长势情况表

4黄精丛生芽生根培养的研究

4.1不同6-BA浓度、NAA浓度对黄精芽生根率的影响

根据下表3.10所示，平均生根率最大的为处理3和处理12，即6-BA浓度为0.0mg/L，NAA浓度为1.0mg/L，其平均生根率高达66.67％。平均生根率最小的为对照组处理1，即6-BA浓度为0.0mg/L，NAA浓度为0.0mg/L，其平均生根率只有12.50％。

表3.10丛生芽生根培养生根率计算表

由下表3.11可知，因为6-BA浓度的F<F_(0.05,3,9)、P>0.05，NAA浓度的F值介于F_(0.05,3,9)与F_(0.01,3,9)之间、即0.01<P<0.05。表明6-BA浓度大小各水平的平均生根率差异不显著(P>0.05)， NAA浓度大小各水平的平均生根率差异显著(0.01<P<0.05)。对NAA浓度大小各水平平均生根率进行多重比较，如下表3.12。表明NAA浓度为0.5mg/L、1.0mg/L的平均生根率大于 NAA浓度为0.0mg/L、1.5mg/L的平均生根率。多重比较结果表明，NAA浓度为0.5mg/L与 1.0mg/L结果较好。另外，由表3.11可知，6-BA浓度大小各水平的平均生根率差异不显著 (P>0.05)，不必对其进行多重比较。此时，可从表3.10中选择平均生根率最大的水平，即 6-BA浓度为0mg/L。因此，6-BA浓度为0.0mg/L、NAA浓度1.0mg/L、即实验处理D3为最优水平组合，其平均生根率达到66.67％，其次为D2，6-BA浓度为0.0mg/L、NAA浓度0.5mg/L, 其平均生根率为50％。

表3.11丛生芽生根培养生根率方差分析表

表3.12 NAA浓度各水平平均生根率多重比较表(SSR法)

4.2不同6-BA浓度、NAA浓度对生根状况的影响

由表3.13可知，根数最多的为处理2，即6-BA浓度为0.0mg/L，NAA浓度为0.5mg/L，其平均根数高达18.7条；根数最少的为对照组处理1，即6-BA浓度为0.0mg/L，NAA浓度为0.0mg/L，其平均根数为0.3条，大部分未长根。根生长最长的为处理3，其根长达到0.46cm。根粗最大为处理3，实验编号为D3，其平均根粗达1.1mm。

表3.13不同6-BA浓度、NAA浓度对生根状况影响统计表

由表3.14可知，因为显著性P>0.05说明几组数据之间没有显著差异，P<0.05说明几组数据之间有显著差异，在6-BA不同浓度对生根状况影响中，由方差分析可知，6-BA不同浓度处理对平均根数、平均根长、平均根粗的显著性P值分别为0.169、0.575、0.797，P>0.05，因此6-BA不同浓度处理对平均根数、平均根长、平均根粗无显著差异。在NAA不同浓度对生根状况影响中，由方差分析可知，NAA不同浓度处理对平均根数、平均根长、平均根粗的显著性P值分别为0.360、0.052、0.020，其中NAA不同浓度处理对平均根数、平均根长的显著性P>0.05，无显著差异。而NAA不同浓度处理对平均根粗的P<0.05，因此有显著差异。

表3.14 6-BA浓度、NAA浓度对生根状况影响方差分析表

三、结论

1.黄精愈伤诱导培养的适宜培养基

6-BA浓度为3.0mg/L、NAA浓度为4.0mg/L、蔗糖含量20g/L时诱导黄精愈伤组织的诱导率最大，为54.76％，即采用黄精无菌苗叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为 MS+6-BA3.0mg/L+NAA4.0mg/L，蔗糖含量为20g/L。

2.黄精愈伤增值培养的适宜培养基

通过本次正交实验，6-BA浓度为2.0mg/L、2,4-D浓度为0mg/、NAA浓度3mg/L、蔗糖含量为20g/L,为最优水平组合其愈伤增值倍数达到7.87、愈伤平均体积3.17mL、愈伤平均重量为2.1g、致密个数占46.67％、长势极好的占26.67％、愈伤组织颜色大都为绿色。其次，6-BA浓度为1.0mg/L、2,4-D浓度为2mg/L、NAA浓度0mg/L、蔗糖含量为20g/L时，其愈伤增值倍数为6.67、愈伤平均体积2.99mL、愈伤平均重量为2.17g、致密个数占33.33％、长势极好的占40％、愈伤组织颜色大都为绿白色。因此，黄精愈伤增值培养的适宜培养基为 MS+6-BA2.0mg/L+NAA3.0mg/L+蔗糖20g/L和MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D2mg/L+蔗糖20g/L。

3.黄精丛生芽诱导培养的适宜培养基

通过本次正交实验，当6-BA浓度为2.0mg/L、NAA浓度为4.0mg/L、2,4-D浓度为0mg/L，此时的平均出芽率最高，为86.11％、平均丛生芽个数为18.6、平均芽高为1.7cm、长势好的占2/3，其次当6-BA浓度为4.0mg/L、NAA浓度为0.0mg/L、2,4-D浓度为0.4mg/L，此时的平均出芽率为80％、平均丛生芽个数为11.27、平均芽高为1.2cm、长势好的占1/2。因此，黄精丛生芽诱导培养的适宜培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA4.0mg/L和 MS+6-BA4.0mg/L+2,4-D0.4mg/L。

4.黄精丛生芽生根培养的适宜培养基

通过本次实验，当6-BA浓度为0.0mg/L、NAA浓度1.0mg/L为最优水平组合，其平均生根率达到66.67％、平均根数高达31条、平均根长0.46cm、平均根粗1.1mm，其次当6-BA 浓度为0.0mg/L、NAA浓度0.5mg/L时,其平均生根率为50％、平均根数为18.7条、平均根长0.4cm、平均根粗0.809mm。由此，黄精丛生芽诱导生根的最适宜培养基为MS+NAA1.0mg/L 和MS+NAA0.5mg/L。

现有技术相比，本发明方法可使黄精长势好，诱导率高达为54.76％，愈伤增值倍数为6.67、愈伤平均体积2.99mL、愈伤平均重量为2.17g、致密个数占33.33％、长势极好的占40％、愈伤组织颜色大都为绿白色；平均出芽率高达86.11％、平均丛生芽个数为18.6、平均芽高为 1.7cm。平均生根率达到66.67％、平均根数高达30条以上、平均根长0.45以上cm、平均根粗 1.0mm以上。

下面结合实施例对发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

具体实施方式：

实施例1.

一种黄精的组织培养方法，具体包括以下步骤：

A.愈伤诱导培养：取黄精无菌苗叶片，将其剪为0.5cm*0.5cm的大小的小块，于愈伤诱导培养基中培养45天，得诱导出的愈伤组织颗粒；所述愈伤诱导培养基为：向1LMS中加入 6-BA2.0mg，NAA3.0mg和蔗糖20g制备而成；

B.愈伤增值培养：将诱导出的愈伤组织颗粒转接到愈伤增值培养基中进行增值培养55天，得增值的愈伤组织；所述愈伤增值培养基为：向1LMS中加入6-BA2.0mg、NAA3.0mg和蔗糖 20g制备而成；

C.丛生芽诱导培养：将增值的愈伤组织切成0.6cm*0.6cm*0.6cm的小块，小块在丛生芽诱导培养基中进行诱导丛生芽，培养40天，直至黄精丛生芽长至2-3cm，得黄精丛生芽；所述丛生芽诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA2.0mg和NAA4.0mg制备而成；

D.生根培养：将黄精丛生芽切开分为单芽，接入生根培养基进行生根培养，50天，即可；所述生根培养基的为：向1LMS中加入NAA1.0mg制备而成。

实施例2.

一种黄精的组织培养方法，具体包括以下步骤：

A.愈伤诱导培养：取黄精无菌苗叶片，将其剪为0.5cm*0.5cm的大小的小块，于愈伤诱导培养基中培养50天，得诱导出的愈伤组织颗粒；所述愈伤诱导培养基为：向1LMS中加入 6-BA3.0mg、NAA4.0mg和蔗糖25g制备而成；

B.愈伤增值培养：将诱导出的愈伤组织颗粒转接到愈伤增值培养基中进行增值培养60天，得增值的愈伤组织；所述愈伤增值培养基为：向1LMS中加入6-BA3.0mg、NAA4.0mg和蔗糖 25g制备而成；

C.丛生芽诱导培养：将增值的愈伤组织切成0.6cm*0.6cm*0.6cm的小块，小块在丛生芽诱导培养基中进行诱导丛生芽，培养45天，直至黄精丛生芽长至2-3cm，得黄精丛生芽；所述丛生芽诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA1.0mg和NAA3.5mg制备而成；

D.生根培养：将黄精丛生芽切开分为单芽，接入生根培养基进行生根培养，55天，即可；所述生根培养基的为：向1LMS中加入NAA1.5mg制备而成。

实施例3.

一种黄精的组织培养方法，具体包括以下步骤：

A.愈伤诱导培养：取黄精无菌苗叶片，将其剪为0.5cm*0.5cm的大小的小块，于愈伤诱导培养基中培养40天，得诱导出的愈伤组织颗粒；；所述愈伤诱导培养基为：向1LMS中加入 6-BA1.0mg、NAA2.0mg和蔗糖15g制备而成；

B.愈伤增值培养：将诱导出的愈伤组织颗粒转接到愈伤增值培养基中进行增值培养50天，得增值的愈伤组织；所述愈伤增值培养基为：向1LMS中加入6-BA1.0mg、NAA2.0mg和蔗糖 15g制备而成；

C.丛生芽诱导培养：将增值的愈伤组织切成0.6cm*0.6cm*0.6cm的小块，小块在丛生芽诱导培养基中进行诱导丛生芽，培养35天，直至黄精丛生芽长至2-3cm，得黄精丛生芽；所述丛生芽诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA1.0mg和NAA3.5mg制备而成；

D.生根培养：将黄精丛生芽切开分为单芽，接入生根培养基进行生根培养，45天，即可；所述生根培养基的为：向1LMS中加入NAA0.5mg制备而成。

Claims

1.一种黄精的组织培养方法，其特征在于：包括以下步骤：A.愈伤诱导培养，B.愈伤增值培养，C.丛生芽诱导培养，D.生根培养。

2.如权利要求1所述的黄精的组织培养方法，其特征在于：

所述步骤A.愈伤诱导培养为：取黄精无菌苗叶片，将其剪为0.5cm*0.5cm的大小的小块，于愈伤诱导培养基中培养40-50天，得诱导出的愈伤组织颗粒；

所述步骤C丛生芽诱导培养为：将增值的愈伤组织切成0.6cm*0.6cm*0.6cm的小块，小块在丛生芽诱导培养基中进行诱导丛生芽，培养35-45天，直至黄精丛生芽长至2-3 cm，得黄精丛生芽；

所述步骤D生根培养为：将黄精丛生芽切开分为单芽，接入生根培养基进行生根培养，45-55天，即可。

3.如权利要求1所述的黄精的组织培养方法，其特征在于：所述愈伤诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA1.0-3.0mg、NAA2.0-4.0mg和蔗糖15-25g制备而成。

4.如权利要求2所述的黄精的组织培养方法，其特征在于：所述愈伤诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA2.0mg、NAA3.0mg和蔗糖20g制备而成。

5.如权利要求1所述的黄精的组织培养方法，其特征在于：所述愈伤诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA0.5-1中加入6-BA1.0mg、2,4-D2mg和蔗糖20g制备而成。

6.如权利要求1所述的黄精的组织培养方法，其特征在于：所述愈伤增值培养基为：向1LMS中加入6-BA1.0-3.0mg、NAA2.0-4.0mg和蔗糖15-25g制备而成；或所述愈伤增值培养基为：向1LMS中加入6-BA0.5-1.5mg、2,4-D1-3mg和蔗糖15-25g制备而成。

7.如权利要求1所述的黄精的组织培养方法，其特征在于：所述丛生芽诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA1.0-3.0mg和NAA3.5-4.5mg制备而成；或所述丛生芽诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA3.5-4.5mg和2,4-D0.3-0.5mg制备而成。

8.如权利要求7所述的黄精的组织培养方法，其特征在于：所述丛生芽诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA2.0mg和NAA4.0mg制备而成；或所述丛生芽诱导培养基为：向1LMS中加入6-BA4.0mg和2,4-D0.4mg制备而成。

9.如权利要求1所述的黄精的组织培养方法，其特征在于：所述生根培养基为：向1LMS中加入NAA0.5-1.5mg制备而成；或所述生根培养基为：向1LMS中加入中加入NAA0.4-0.6mg制备而成。

10.如权利要求9所述的黄精的组织培养方法，其特征在于：所述生根培养基为：向1LMS中加入NAA1.0mg制备而成；或所述生根培养基的含量为：向1LMS中加入NAA0.5mg制备而成。