CN116746487A - 一种文冠果叶片组织培养再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种文冠果叶片组织培养再生方法，包括以下步骤：S1：采取文冠果无菌苗的叶片，至上而下第2至第10个叶片；S2：用无菌手术刀切出伤口；S3：置于再生培养基上；S4：培养条件：在25±2゜C，光照强度3000～4000Lux，16小时光照/8小时黑暗；S5：培养半个月后继代一次到新鲜的再生培养基上；S6：培养一个月后，将丛生芽转入改良的壮苗培养基中，培养一个月；S7：芽伸长后，转入生根培养基中(1/2MS+IBA 0.5mg/L+维生素C 50mg/L)；S8：生根苗移栽。通过该方法从诱导到获得可移栽的苗，周期仅仅为三个月，叶片在培养半个月后在伤口处，有愈伤和小芽点产生；培养一个月后产生丛生芽，再生的苗经壮苗培养后，在7～10天后即长根。生根率达90％以上。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养育种技术领域，具体涉及一种文冠果叶片经组织培养再生成苗的方法。
背景技术
植物组织培养技术，是应用植物细胞所具有的全能性，利用植物的任何细胞或组织在离体条件下，无菌培养，在特定培养基上重新发育成为一个完整植株的技术。植物组织培养技术被广泛地应用在优良品种的扩繁和稀有种质资源的快速繁殖保种，生产人工种子、次生代谢药物、口服疫苗等，也是遗传育种创制新品种的关键技术。
文冠果是重要的木本油料植物，种仁含油率达50％；文冠果全身含有三萜皂苷、黄酮类、香豆素类、甘遂烷萜类等多种药用成分，用于解热安神，治疗风湿，消炎，抗肿瘤等；它也是珍贵的观赏树种。文冠果目前主要分布在我国长江以北的地区，耐干旱和贫瘠，现在主要还处在半野生状态，缺乏优良品种。因其目前无法扦插生根存活，所以苗木扩繁成为推广种植的重要限制因子。
现有的文冠果组培方法，已有几篇报道和专利，有采用成熟种子诱导组培苗(CN104285816A，CN107223567B)的，也有消毒引进茎段的(CN102415338A，CN101032226A，CN104322376A)，以苗扩苗，或者用根作为外植体(CN105580732B)产生根蘖扩繁的。目前尚无应用叶片再生成丛生芽方面的相关专利和报道。
本发明，在本发明人的在先专利CN111165354A和CN111165354B基础上，利用文冠果组培苗的叶片再生，进行高效率地扩繁组培苗。目前的相关报道和专利中，存在一些不足：用种子作为组培扩繁材料，一方面占用种子资源，使其不能用于榨油；另一方面文冠果是异花授粉植物，种子之间存在遗传差异，无法保证种子来源的苗能保持母树的所有优良性状。从成熟胚诱导芽极易产生褐化问题，至少2个月才能产生小芽，到完成生根整个扩繁周期加长到5个月。以芽切段再伸长，以芽扩芽的方式，每个月的扩繁系数平均只能3～5倍。以根扩繁，根的数量有限，而且消毒过程中极易污染，不适宜作为扩繁起始材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种文冠果叶片组织培养再生方法，旨在解决所述背景技术中存在的问题。
为实现所述目的，本发明采用的技术方案是：一种文冠果叶片组织培养再生方法，包括以下步骤：
S1：采取文冠果无菌苗的叶片，至上而下第2至第10个叶片；
S2：用无菌手术刀切出伤口；
S3：置于再生培养基上，再生培养基为MS盐和维生素(Phytotech,M519#)+蔗糖20～60g/L+4-吗啉乙磺酸(MES)0.5～1.5g/L+水解酪蛋白(Casein)0.5～1.5g/L+维生素B2 1～4mg/L+6-苄基嘌呤(BA)
0.1～5mg/L+萘乙酸(NAA)0.1～3mg/L；
S4：培养条件：在25±2゜C，光照强度3000～4000Lux，16小时光照/8小时黑暗；
S5：培养半个月后继代一次到新鲜的再生培养基上；
S6：培养一个月后，将丛生芽转入改良MS+BA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+维生素B14mg/L的壮苗培养基中，培养一个月；
S7：芽伸长后，转入生根培养基中(1/2MS+IBA 0.5mg/L+维生素C50mg/L)；
S8：生根苗移栽。
进一步地，所述再生培养基的培养温度范围可以22～27゜C，本发明不额外增添设备，与其它组培材料共享空间。
进一步地，所述壮苗培养基包括：改良MS培养基，6-苄基腺嘌呤0.05～2毫克/升、萘乙酸0.01～0.5毫克/升和维生素B1 1～10毫克/升。
进一步地，所述壮苗培养基培养的时间为8～25天。
本发明的有益效果：通过采用上述技术方案，本发明的一种文冠果叶片组织培养再生方法，通过该方法从叶片诱导的丛生芽，单叶可达到当月内再生芽7～10个,单株的叶片量8～10，可以产生56～100个芽。从诱导到获得可移栽的苗，周期仅仅为三个月，叶片在培养半个月后在伤口处，有愈伤和小芽点产生；培养一个月后产生丛生芽，再生的苗经壮苗培养后，在7～10天后即长根。生根率达90％以上。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的方法流程图；
图2为本发明的文冠果叶片的再生芽的过程图；
图3为本发明的再生芽扩繁图；
图4为本发明的再生芽生根图；
图5为本发明的生根苗移栽图；
图6为本发明的转基因文冠果中A.报告基因GUS表达和GUS染色和B.红色荧光蛋白mCherry基因表达和荧光显示示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
如图1～6所示，本发明实施例提供了一种文冠果叶片组织培养再生方法，包括以下步骤：
S1：采取文冠果无菌苗的叶片，至上而下第2至第10个叶片；
S2：用无菌手术刀切出伤口；
S3：置于再生培养基上，再生培养基为MS盐和维生素(Phytotech,M519#)+蔗糖20～60g/L+4-吗啉乙磺酸(MES)0.5～1.5g/L+水解酪蛋白(Casein)0.5～1.5g/L+维生素B2 1～4mg/L+6-苄基嘌呤(BA)0.1～5mg/L+萘乙酸(NAA)0.1～3mg/L；
S4：培养条件：在25±2゜C，光照强度3000～4000Lux，16小时光照/8小时黑暗；
S5：培养半个月后继代一次到新鲜的再生培养基上；
S6：培养一个月后，将丛生芽转入改良MS+BA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+维生素B14mg/L的壮苗培养基中，培养一个月；
S7：芽伸长后，转入生根培养基中(1/2MS+IBA 0.5mg/L+维生素C50mg/L)；
S8：生根苗移栽。
在本实施例中，叶片在培养半个月后在伤口处，有愈伤和小芽点产生；培养一个月后产生丛生芽(图2B)，再生的苗经壮苗培养后，在7～10天后即长根。生根率达90％以上，通过该方法从叶片诱导的丛生芽，单叶可达到当月内再生芽7～10个,单株的叶片量8～10，可以产生56～100个芽。从诱导到获得可移栽的苗，周期仅仅为三个月。
应用场景：场景1文冠果优良品系扩繁(图3，4)。以无菌苗叶片为扩繁材料，快速大量地扩繁优良株系。
场景2叶片作为转化起始材料，依托于叶片的再生体系，用农杆菌遗传转化方法创制基因编辑新种质(图6)，本发明人已经建立报告基因GUS基因，mCherry基因等的文冠果遗传转化体系，具体方法在后续其它专利中呈现。
再生培养基中可变量：
①蔗糖浓度：最佳方案是蔗糖40g/L,较优地是30～35g/L
②MES浓度：最佳方案是1g/L,较佳的是0.8～1.2mg/L
③Casein浓度：最佳方案是1g/L,较佳的是0.7～1.2mg/L
④BA浓度：最佳方案是2mg/L,较佳的是1.5～3.5mg/L
⑤NAA浓度：最佳方案是0.5mg/L,较佳的是0.2～2mg/L
⑥维生素B2浓度：最佳方案是1.5mg/L,较佳的是1.4～2.5mg/L
本发明中涉及的MS培养基，为常规培养基。MS盐混合物+MS有机混合物+蔗糖3％或8％，固体培养基加结冷胶0.5％，pH5.8.经121゜C,20min,灭菌后使用；其中MS培养基盐类及有机物混合物：
培养温度范围可以22～27゜C，本发明不额外增添设备，与其它组培材料共享空间。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (4)
1.一种文冠果叶片组织培养再生方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：采取文冠果无菌苗的叶片，至上而下第2至第10个叶片；
S2：用无菌手术刀切出伤口；
S3：置于再生培养基上，再生培养基为MS盐和维生素(Phytotech,M519#)+20～60g/L蔗糖+4-吗啉乙磺酸(MES)0.5-～1.5g/L+水解酪蛋白(Casein)0.5～1.5g/L+维生素B2 1～4mg/L+6-苄基嘌呤(BA)
0.1～5mg/L+萘乙酸(NAA)0.1～3mg/L；
S4：培养条件：在25±2゜C，光照强度3000-4000Lux，16小时光照/8小时黑暗；
S5：培养半个月后继代一次到新鲜的再生培养基上；
S6：培养一个月后，将丛生芽转入MS+BA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+维生素B1 4mg/L的壮苗培养基中，培养一个月；
S7：芽伸长后，转入生根培养基中(1/2MS+IBA 0.5mg/L+维生素C50mg/L)；
S8：生根苗移栽。
2.根据权利要求1所述的一种文冠果叶片组织培养再生方法，其特征在于：所述再生培养基的培养温度范围可以22～27゜C，本发明不额外增添设备，与其它组培材料共享空间。
3.根据权利要求1所述的一种文冠果叶片组织培养再生方法，其特征在于：所述壮苗培养基包括：改良MS培养基，6-苄基腺嘌呤0.05～2毫克/升、萘乙酸0.01～0.5毫克/升和维生素B1 1～10毫克/升。
4.根据权利要求1所述的一种文冠果叶片组织培养再生方法，其特征在于：所述壮苗培养基培养的时间为8～25天。
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