CN117925502A - 一种文冠果组织培养液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组织培养液技术领域，具体地说，涉及一种文冠果组织培养液。其包括以下组分Trp‑NMN‑α培养基75‑85重量份、外源激素调节剂6‑12重量份、酸度调节剂1‑5重量份和碳源3‑8重量份；Trp‑NMN‑α培养基通过0.8～1.6g/L浓度的色氨酸与0.2～0.5mg/L浓度的烟酰胺单核苷酸的混合液，对MS培养基进行改性制备得到，且Trp‑NMN‑α培养基还包括抗氧化剂。采用色氨酸与烟酰胺单核苷酸改性MS培养基得到的Trp‑NMN‑α培养基，烟酰胺单核苷酸通过补救合成途径提高细胞内NAD+水平，进一步增强吲哚乙醛氧化酶的活性，从而加快色氨酸向吲哚乙酸的转化效率，可提高植物组织对养分的吸收利用效率，并降低对外源激素的依赖性。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养液技术领域，具体地说，涉及一种文冠果组织培养液。
背景技术
在植物组织培养技术中，文冠果组织培养液是一种专为文冠果组织培养设计的特殊营养液，包含了多种有机物和无机物的复杂混合物，能够满足文冠果细胞、组织或器官在体外生长发育所需的全部营养条件。
在文冠果组织培养液中，为了降低文冠果组织的培育周期，通常会使用赤霉素、吲哚-3-乙酸或6-苄基氨基嘌呤等外源激素调节剂调控植物组织的生长、分化和发育，加速文冠果组织细胞的增殖和扩大，但长期暴露于外源激素调节剂下，文冠果组织会产生适应性反应，激素受体钝化、代谢途径改变，进而影响文冠果组织对养分的有效摄取和利用，甚至导致组织退化的问题，鉴于此，我们提出一种文冠果组织培养液。
发明内容
本发明的目的在于提供一种文冠果组织培养液，以解决上述背景技术中提出的文冠果组织长期暴露于外源激素调节剂下，文冠果组织会产生适应性反应，激素受体钝化、代谢途径改变，进而影响文冠果组织对养分的有效摄取和利用，甚至导致组织退化的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种文冠果组织培养液，包括以下组分：Trp-NMN-α培养基75-85重量份、外源激素调节剂6-12重量份、酸度调节剂1-5重量份和碳源3-8重量份；
其中，所述Trp-NMN-α培养基通过0.8～1.6g/L浓度的色氨酸与0.2～0.5mg/L浓度的烟酰胺单核苷酸的混合液，对MS培养基进行改性制备得到，且Trp-NMN-α培养基还包括抗氧化剂；
所述外源激素调节剂为吲哚-3-乙酸、α-萘乙酸和6-苄基氨基嘌呤的混合物，且吲哚-3-乙酸、α-萘乙酸和6-苄基氨基嘌呤的混合比例为1～3：1：0.3；
所述MS培养基中包括190～210mg/L浓度的甘氨酸、0.5～1.2mg/L浓度的盐酸吡哆醛、0.4～0.8mg/L浓度的硫胺素、80～120mg/L浓度的肌醇、6～9g/L浓度的琼脂、0.4～1.0mg/L浓度的吡哆醇、无机盐和微量元素。
作为优选，所述Trp-NMN-α培养基的具体制备步骤为：
S1.1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为0.8～1.6g/L色氨酸溶液；
将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.2～0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；
S1.2、将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:1～3的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在130-150rpm搅拌速度下，搅拌8-12min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；
S1.3、取80-85重量份MS培养基，将0.8-1.2重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在30-70rpm搅拌速度下，搅拌3-5min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入1-5重量份酸度调节剂，调节其pH至5.7-5.9。
S1.4、待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在80-120rpm搅拌速度下，搅拌8-15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
作为优选，所述抗氧化剂为抗坏血酸、维生素E、L-半胱氨酸和谷胱甘肽中的任一种。
作为优选，所述酸度调节剂为氢氧化钠、磷酸二氢钾或磷酸氢二钠中的任一种。
作为优选，所述外源激素调节剂的具体制备方法为：
S2.1、分别将吲哚-3-乙酸、α-萘乙酸和6-苄基氨基嘌呤溶解至灭菌去离子水中，确保完全溶解；
S2.2、将溶解好的吲哚-3-乙酸、α-萘乙酸和6-苄基氨基嘌呤溶液以1～3：1：0.3的体积比例混合，并加入到同一个无菌容器中，使用搅拌器充分搅拌直至完全混合；
S2.3、混合后的溶液通过0.22μm滤膜进行过滤除菌处理，得到外源激素调节剂。
作为优选，所述搅拌器的搅拌速度为35-80rpm。
作为优选，所述文冠果组织培养液的具体制备步骤如下：
S3.1、取75-85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；
S3.2、取6-12重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀；
S3.3、将3-8重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使碳源在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；
S3.4、取1-5重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.6-5.8得到培养液；
S3.5、将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
作为优选，所述搅拌器的搅拌速度为160-280rpm，搅拌时间为15-20min。
作为优选，所述S3.5中，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下保持15-20min。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
该一种文冠果组织培养液中，采用色氨酸与烟酰胺单核苷酸改性MS培养基得到的Trp-NMN-α培养基，色氨酸作为吲哚-3-乙酸生物合成的前体，在细胞内经过一系列生化反应转化为吲哚乙酸，这一过程受到高浓度NAD+的促进作用，而烟酰胺单核苷酸通过补救合成途径提高细胞内NAD+水平，进一步增强吲哚乙醛氧化酶的活性，从而加快色氨酸向吲哚乙酸的转化效率，可提高植物组织对养分的吸收利用效率，并降低对外源激素的依赖性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明涉及的一种文冠果组织培养液中，碳源优选为蔗糖、酸度调节剂优选为氢氧化钠；
其中，Trp-NMN-α培养基还包括抗氧化剂；抗氧化剂优选为抗坏血酸，抗坏血酸能够有效地清除细胞培养过程中产生的有害自由基，减少氧化应激对细胞和组织培养物的损害，维护细胞膜稳定性和细胞内酶系统的正常运作；
在植物组织培养中，抗坏血酸影响植物激素的合成与平衡，有利于外源激素调节剂的效果发挥，促进细胞分裂、伸长和组织器官的形成。
本发明实施例1-12、对比例1-3中，所使用的MS培养基中，每1L的MS培养基包括190mg/L浓度的甘氨酸、0.8mg/L浓度的盐酸吡哆醛、0.6mg/L浓度的硫胺素、120mg/L浓度的肌醇、6g/L浓度的琼脂、0.8mg/L浓度的吡哆醇、剩余组分为无机盐和微量元素；
优选的，无机盐包括硝酸铵1780mg、硝酸钾2100mg、磷酸二氢钾260mg、硫酸镁620mg和氯化钙530mg；
微量元素包括碘化钾83mg、硼酸62mg、硫酸锰22.4mg、硫酸锌8.9mg、钼酸钠0.26mg和硫酸铜0.05mg。
本发明实施例1-12、对比例1-3中，所使用的外源激素调节剂为吲哚-3-乙酸、α-萘乙酸和6-苄基氨基嘌呤的混合物；其中，外源激素调节剂的具体制备方法为：
S2.1、分别将吲哚-3-乙酸、α-萘乙酸和6-苄基氨基嘌呤溶解至灭菌去离子水中，确保完全溶解；
S2.2、将溶解好的吲哚-3-乙酸、α-萘乙酸和6-苄基氨基嘌呤溶液以1～3：1：0.3的体积比例混合，并加入到同一个无菌容器中，使用搅拌器在45rpm速度下充分搅拌直至完全混合；
S2.3、混合后的溶液通过0.22μm滤膜进行过滤除菌处理，得到外源激素调节剂。
其中，外源激素调节剂中，吲哚-3-乙酸、α-萘乙酸和6-苄基氨基嘌呤的混合比例优选为2：1：0.3。
实施例1
一种文冠果组织培养液的制备方法如下：
S1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为1.2g/L色氨酸溶液；将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:1的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在140rpm搅拌速度下，搅拌10min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；取80重量份MS培养基，将0.8重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在45rpm搅拌速度下，搅拌3min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入2重量份酸度调节剂，调节其pH至5.8；待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在90rpm搅拌速度下，搅拌15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
S2、取85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；取6重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀，其中，搅拌器在210rpm的搅拌速度下，搅拌15min；
将6重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使蔗糖在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；取3重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.7得到培养液；将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下，保持20min进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
实施例2
一种文冠果组织培养液的制备方法如下：
S1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为1.2g/L色氨酸溶液；将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:2的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在140rpm搅拌速度下，搅拌10min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；取80重量份MS培养基，将0.8重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在45rpm搅拌速度下，搅拌3min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入2重量份酸度调节剂，调节其pH至5.8；待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在90rpm搅拌速度下，搅拌15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
S2、取85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；取6重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀，其中，搅拌器在210rpm的搅拌速度下，搅拌15min；
将6重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使蔗糖在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；取3重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.7得到培养液；将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下，保持20min进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
实施例3
一种文冠果组织培养液的制备方法如下：
S1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为1.2g/L色氨酸溶液；将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:3的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在140rpm搅拌速度下，搅拌10min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；取80重量份MS培养基，将0.8重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在45rpm搅拌速度下，搅拌3min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入2重量份酸度调节剂，调节其pH至5.8；待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在90rpm搅拌速度下，搅拌15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
S2、取85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；取6重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀，其中，搅拌器在210rpm的搅拌速度下，搅拌15min；
将6重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使蔗糖在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；取3重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.7得到培养液；将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下，保持20min进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
实施例4
一种文冠果组织培养液的制备方法如下：
S1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为1.2g/L色氨酸溶液；将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:1的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在140rpm搅拌速度下，搅拌10min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；取80重量份MS培养基，将0.8重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在45rpm搅拌速度下，搅拌3min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入2重量份酸度调节剂，调节其pH至5.8；待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在90rpm搅拌速度下，搅拌15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
S2、取85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；取8重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀，其中，搅拌器在210rpm的搅拌速度下，搅拌15min；
将6重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使蔗糖在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；取3重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.7得到培养液；将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下，保持20min进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
实施例5
一种文冠果组织培养液的制备方法如下：
S1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为1.2g/L色氨酸溶液；将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:2的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在140rpm搅拌速度下，搅拌10min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；取80重量份MS培养基，将0.8重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在45rpm搅拌速度下，搅拌3min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入2重量份酸度调节剂，调节其pH至5.8；待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在90rpm搅拌速度下，搅拌15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
S2、取85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；取8重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀，其中，搅拌器在210rpm的搅拌速度下，搅拌15min；
将6重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使蔗糖在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；取3重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.7得到培养液；将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下，保持20min进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
实施例6
一种文冠果组织培养液的制备方法如下：
S1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为1.2g/L色氨酸溶液；将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:3的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在140rpm搅拌速度下，搅拌10min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；取80重量份MS培养基，将0.8重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在45rpm搅拌速度下，搅拌3min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入2重量份酸度调节剂，调节其pH至5.8；待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在90rpm搅拌速度下，搅拌15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
S2、取85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；取8重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀，其中，搅拌器在210rpm的搅拌速度下，搅拌15min；
将6重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使蔗糖在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；取3重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.7得到培养液；将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下，保持20min进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
实施例7
一种文冠果组织培养液的制备方法如下：
S1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为1.2g/L色氨酸溶液；将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:1的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在140rpm搅拌速度下，搅拌10min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；取80重量份MS培养基，将0.8重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在45rpm搅拌速度下，搅拌3min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入2重量份酸度调节剂，调节其pH至5.8；待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在90rpm搅拌速度下，搅拌15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
S2、取85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；取10重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀，其中，搅拌器在210rpm的搅拌速度下，搅拌15min；
将6重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使蔗糖在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；取3重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.7得到培养液；将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下，保持20min进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
实施例8
一种文冠果组织培养液的制备方法如下：
S1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为1.2g/L色氨酸溶液；将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:2的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在140rpm搅拌速度下，搅拌10min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；取80重量份MS培养基，将0.8重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在45rpm搅拌速度下，搅拌3min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入2重量份酸度调节剂，调节其pH至5.8；待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在90rpm搅拌速度下，搅拌15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
S2、取85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；取10重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀，其中，搅拌器在210rpm的搅拌速度下，搅拌15min；
将6重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使蔗糖在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；取3重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.7得到培养液；将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下，保持20min进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
实施例9
一种文冠果组织培养液的制备方法如下：
S1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为1.2g/L色氨酸溶液；将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:3的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在140rpm搅拌速度下，搅拌10min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；取80重量份MS培养基，将0.8重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在45rpm搅拌速度下，搅拌3min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入2重量份酸度调节剂，调节其pH至5.8；待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在90rpm搅拌速度下，搅拌15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
S2、取85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；取10重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀，其中，搅拌器在210rpm的搅拌速度下，搅拌15min；
将6重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使蔗糖在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；取3重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.7得到培养液；将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下，保持20min进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
实施例10
一种文冠果组织培养液的制备方法如下：
S1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为1.2g/L色氨酸溶液；将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:1的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在140rpm搅拌速度下，搅拌10min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；取80重量份MS培养基，将0.8重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在45rpm搅拌速度下，搅拌3min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入2重量份酸度调节剂，调节其pH至5.8；待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在90rpm搅拌速度下，搅拌15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
S2、取85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；取12重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀，其中，搅拌器在210rpm的搅拌速度下，搅拌15min；
将6重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使蔗糖在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；取3重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.7得到培养液；将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下，保持20min进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
实施例11
一种文冠果组织培养液的制备方法如下：
S1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为1.2g/L色氨酸溶液；将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:2的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在140rpm搅拌速度下，搅拌10min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；取80重量份MS培养基，将0.8重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在45rpm搅拌速度下，搅拌3min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入2重量份酸度调节剂，调节其pH至5.8；待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在90rpm搅拌速度下，搅拌15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
S2、取85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；取12重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀，其中，搅拌器在210rpm的搅拌速度下，搅拌15min；
将6重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使蔗糖在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；取3重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.7得到培养液；将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下，保持20min进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
实施例12
一种文冠果组织培养液的制备方法如下：
S1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为1.2g/L色氨酸溶液；将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:3的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在140rpm搅拌速度下，搅拌10min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；取80重量份MS培养基，将0.8重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在45rpm搅拌速度下，搅拌3min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入2重量份酸度调节剂，调节其pH至5.8；待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在90rpm搅拌速度下，搅拌15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
S2、取85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；取12重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀，其中，搅拌器在210rpm的搅拌速度下，搅拌15min；
将6重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使蔗糖在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；取3重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.7得到培养液；将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下，保持20min进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
对比例1
采用实施例8的方法，采用未改性的MS培养基。
对比例2
采用实施例8的方法，将Trp-NMN-α培养基中的色氨酸去除。
对比例3
采用实施例8的方法，将外源激素调节剂去除。
本发明制备的文冠果组织培养液可提高植物组织对养分的吸收利用效率，并降低对外源激素的依赖性；文冠果组织培养液的性能测试方法为：
对上述实施例1-12和对比例1-3制备的文冠果组织培养液，根据地方标准DB21/T3859-2023规定的《文冠果组织培养育苗技术规程》，并基于上述实施例，根据每个实施例制备相应的实验组，将文冠果组织移栽至制备的文冠果组织培养液中，通过定期观察文冠果组织的生长情况，并进行数据记录，根据培养基的颜色、浑浊度以及植物生长状况，3周更换一次培养基，对培养液剩余量以及文冠果组织的生长数据进行记录，当文冠果丛茎秆长度达到70mm时，将其切割成单个丛芽，再接种至新的培养基中，以维持旺盛的生长态势，进行继代培养；
观察文冠果组织培养出的幼苗主茎的长度和评估每个外植体上产生新芽的数量，来评估生长状况；得到文冠果组织的生长数据，如表1所示。
表1 实施例1-12和对比例1-3的文冠果组织的生长数据
| 实施例 | 培养液剩余量% | 茎秆长度mm | 芽分化数量/株 |
| 实施例1 | 16.09 | 48.97 | 2 |
| 实施例2 | 17.18 | 61.28 | 4 |
| 实施例3 | 19.26 | 69.49 | 6 |
| 实施例4 | 17.13 | 49.12 | 2 |
| 实施例5 | 18.76 | 61.87 | 4 |
| 实施例6 | 20.18 | 69.86 | 6 |
| 实施例7 | 18.26 | 49.69 | 2 |
| 实施例8 | 19.64 | 62.13 | 4 |
| 实施例9 | 21.36 | 70.06 | 6 |
| 实施例10 | 19.39 | 49.97 | 2 |
| 实施例11 | 20.45 | 62.83 | 5 |
| 实施例12 | 22.13 | 70.61 | 7 |
| 对比例1 | 13.26 | 39.49 | 2 |
| 对比例2 | 14.74 | 42.34 | 2 |
| 对比例3 | 7.61 | 62.15 | 4 |
以上数据，充分地显示了实施例1-12相比于对比例1-3的文冠果组织的生长状况的区别；其中，培养液剩余量用于表示文冠果组织对于文冠果组织培养液的吸收情况，由于Trp-NMN-α培养基可用于提高植物组织对养分的吸收利用效率，并降低对外源激素的依赖性，在实施例1-12中文冠果组织培养液含量相同的情况下，且Trp-NMN-α培养基的含量固定，因此，培养液剩余量可从侧面反应文冠果组织对外源激素调节剂的吸收情况，即培养液剩余量可用于表示剩余的外源激素调节剂的含量。
具体如下：
通过实施例1-3、实施例4-6、实施例7-9、实施例10-12，均可以看出：随着色氨酸含量的增加，文冠果组织的茎杆长度和芽分化数量均得到显著的提升；
其中，色氨酸是生长素(IAA）的生物合成前体，色氨酸在文冠果组织中经过氧化脱氨作用形成吲哚丙酮，然后吲哚丙酮进一步脱羧转变为吲哚乙醛，高浓度的NAD+可以促进吲哚乙醛更快地被氧化为吲哚乙酸，吲哚乙醛在吲哚乙醛氧化酶的催化下被氧化为吲哚乙酸，即IAA；
而烟酰胺单核苷酸作为辅酶NAD+（即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的前体物质，通过补救合成途径增加植物细胞内辅酶NAD+的水平，烟酰胺单核苷酸通过烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶（NMNAT）催化反应，将NMN与腺嘌呤核糖核苷酸（ATP）结合，生成辅酶NAD+和磷酸；NAD+作为辅酶参与色氨酸通过一系列生化反应转化为IAA的过程，吲哚乙醛氧化酶催化吲哚乙醛转化为吲哚乙酸，这个过程中NAD+作为氧化还原反应的辅助因子；
提高NAD+水平可能增强这一代谢通路的效率，可促进IAA的生物合成，进而改善文冠果组织的生长状况；充足的NAD+水平有利于细胞保持正常的代谢活力，增强对营养物质的吸收和利用效率，使文冠果组织在一定程度上减少对外源激素的依赖，在内源激素平衡状态下，文冠果组织自身的生长调节能力得以加强；
由此可知，由于文冠果组织的茎杆长度和芽分化数量均得到显著的提升，从侧面表明Trp-NMN-α培养基可有效促进文冠果组织对文冠果组织培养液的吸收率。
进一步的，分别对比实施例1-3、实施例4-6、实施例7-9、实施例10-12，可知当外源激素调节剂添加量相同时，随着Trp-NMN-α培养基中，色氨酸含量的增加，培养液剩余量均明显增加；且当外源激素调节剂含量增加时，培养液剩余量明显增加，可从侧面验证文冠果组织对外源激素的依赖性降低。
综合考虑，将实施例8作为最优实施例，通过实施例1-12与对比例1-3对比可以看出：
当采用未通过改性的MS培养基时，文冠果组织的茎杆长度和芽分化数量均得到显著的降低，培养液剩余量变化明显，表明文冠果组织对外源激素调节剂吸收率升高，Trp-NMN-α培养基对文冠果组织的茎杆长度和芽分化数量具有显著的影响；
当将Trp-NMN-α培养基中的色氨酸去除时，培养液剩余量明显降低，表明文冠果组织对外源激素调节剂吸收率升高，文冠果组织的茎杆长度和芽分化数量均明显降低，表明色氨酸在Trp-NMN-α培养基，对文冠果组织的培养具有显著的促进作用；
当去除外源激素调节剂时，将对比例3与实施例8进行对比，可以看出文冠果组织的茎杆长度和芽分化数量变化并不明显，培养液剩余量变化明显，表明，在去除外源激素调节剂后，文冠果组织对文冠果组织培养液的吸收率较高，进而导致对比例3的培养液剩余量相对于实施例8明显降低，说明文冠果组织对外源生长调节剂的依赖性较低。
进一步的，由于色氨酸和烟酰胺单核苷酸可促进细胞生长和分化，通过提供色氨酸，植物利用自身的代谢途径转化为所需的生长素，有助于优化养分利用；
烟酰胺单核苷酸主要参与NAD+生物合成途径，它是细胞能量代谢的重要辅酶成分，不直接影响细胞分裂或分化等具体发育过程，而是通过提高细胞内的NAD+水平间接改善细胞生理状态和增强代谢活力，从而有利于组织培养过程中的细胞增殖和再生。
色氨酸和烟酰胺单核苷酸不同于直接添加生长素、细胞分裂素等植物激素来调控植物组织的发育进程，而是作为营养补充剂，对于植物的生长发育至关重要，尤其在细胞伸长、根尖与茎尖分生组织活动、器官形态建成等方面起着调控作用。植物可以通过色氨酸代谢途径中的特定步骤合成生长素，而非依赖外部添加；
烟酰胺单核苷酸在植物中主要与能量代谢和氧化还原状态相关联，可转化为NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），作为参与多种生物氧化还原反应的关键辅酶，色氨酸代谢与烟酰胺单核苷酸的作用则属于植物内部代谢网络的一部分，通过调整这些代谢通路间接影响植物的生长状态和适应性，在植物组织培养中更多地起到支持基础代谢和提供合成激素或其他重要化合物所需前体的作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (9)
1.一种文冠果组织培养液，其特征在于，包括以下组分：Trp-NMN-α培养基75-85重量份、外源激素调节剂6-12重量份、酸度调节剂1-5重量份和碳源3-8重量份；
其中，所述Trp-NMN-α培养基通过0.8～1.6g/L浓度的色氨酸与0.2～0.5mg/L浓度的烟酰胺单核苷酸的混合液，对MS培养基进行改性制备得到，且Trp-NMN-α培养基还包括抗氧化剂；
所述外源激素调节剂为吲哚-3-乙酸、α-萘乙酸和6-苄基氨基嘌呤的混合物，且吲哚-3-乙酸、α-萘乙酸和6-苄基氨基嘌呤的混合比例为1～3：1：0.3；
所述MS培养基中包括190～210mg/L浓度的甘氨酸、0.5～1.2mg/L浓度的盐酸吡哆醛、0.4～0.8mg/L浓度的硫胺素、80～120mg/L浓度的肌醇、6～9g/L浓度的琼脂、0.4～1.0mg/L浓度的吡哆醇、无机盐和微量元素。
2.根据权利要求1所述的文冠果组织培养液，其特征在于，所述Trp-NMN-α培养基的具体制备步骤为：
S1.1、将色氨酸缓慢加入蒸馏水中，采用恒温水浴法，在40-50℃温度下加速色氨酸溶解，制备得到浓度为0.8～1.6g/L色氨酸溶液；
将烟酰胺单核苷酸缓慢加入去离子水中，直至其完全溶解，制备得到浓度为0.2～0.5mg/L的烟酰胺单核苷酸溶液；
S1.2、将色氨酸溶液缓慢倒入至烟酰胺单核苷酸溶液中，并将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液以1:1～3的比例混合，使用搅拌器将烟酰胺单核苷酸溶液与色氨酸溶液在130-150rpm搅拌速度下，搅拌8-12min，直至其完全混合，制备得到色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液；
S1.3、取80-85重量份MS培养基，将0.8-1.2重量份抗氧化剂加入到MS培养基中，使用搅拌器，将MS培养基在30-70rpm搅拌速度下，搅拌3-5min，直至抗氧化剂与MS培养基混合均匀，加入1-5重量份酸度调节剂，调节其pH至5.7-5.9；
S1.4、待MS培养基pH稳定后，在无菌条件下将色氨酸-烟酰胺单核苷酸混合液加入至MS培养基中，使用搅拌器在80-120rpm搅拌速度下，搅拌8-15min，直至搅拌均匀，对MS培养基进行改性，得到Trp-NMN-α培养基。
3.根据权利要求1所述的文冠果组织培养液，其特征在于，所述抗氧化剂为抗坏血酸、维生素E、L-半胱氨酸和谷胱甘肽中的任一种。
4.根据权利要求1所述的文冠果组织培养液，其特征在于，所述酸度调节剂为氢氧化钠、磷酸二氢钾或磷酸氢二钠中的任一种。
5.根据权利要求1所述的文冠果组织培养液，其特征在于，所述外源激素调节剂的具体制备方法为：
S2.1、分别将吲哚-3-乙酸、α-萘乙酸和6-苄基氨基嘌呤溶解至灭菌去离子水中，确保完全溶解；
S2.2、将溶解好的吲哚-3-乙酸、α-萘乙酸和6-苄基氨基嘌呤溶液以1～3：1：0.3的体积比例混合，并加入到同一个无菌容器中，使用搅拌器充分搅拌直至完全混合；
S2.3、混合后的溶液通过0.22μm滤膜进行过滤除菌处理，得到外源激素调节剂。
6.根据权利要求5所述的文冠果组织培养液，其特征在于，所述搅拌器的搅拌速度为35-80rpm。
7.根据权利要求1所述的文冠果组织培养液，其特征在于，所述文冠果组织培养液的具体制备步骤如下：
S3.1、取75-85重量份Trp-NMN-α培养基，加入预先加热至45-50℃的去离子水中完全溶解；
S3.2、取6-12重量份外源激素调节剂缓慢加入到Trp-NMN-α培养基中，并使用搅拌器搅拌混合均匀；
S3.3、将3-8重量份蔗糖作为碳源，利用热水浴方式，在45-60℃范围下使碳源在蒸馏水中完全溶解，然后加入到Trp-NMN-α培养基中；
S3.4、取1-5重量份酸度调节剂将Trp-NMN-α培养基的pH调至5.6-5.8得到培养液；
S3.5、将调节好pH的培养液分装入已灭菌的培养皿中，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，待培养液自然冷却至室温，得到最终的文冠果组织培养液。
8.根据权利要求7所述的文冠果组织培养液，其特征在于，所述搅拌器的搅拌速度为160-280rpm，搅拌时间为15-20min。
9.根据权利要求7所述的文冠果组织培养液，其特征在于，所述S3.5中，培养液在高压蒸汽灭菌锅的温度120～122℃、压力103kpa下保持15-20min。
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