CN116024280A - 一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法，其包括如下步骤：(1)培养大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的种子液；(2)培养大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的种子液；(3)发酵培养得到色氨酸发酵液。本发明在培养高产色氨酸的大肠杆菌菌株的同时，按照一定比例加入高产色氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株进行共培养，利用谷氨酸棒状杆菌将二糖、三糖等大肠杆菌改造菌不易代谢的糖成分，转化成色氨酸，达到提高发酵转化率，简化提取操作的目的。同时，在发酵后期流加含有适量甜菜碱、磷酸二氢钾、硫酸镁的营养补充液，补充营养的同时，提高甜菜碱的利用率，起到进一步提高发酵转化率的作用。
Description
技术领域：
本发明属于发酵法生产氨基酸技术领域，特别涉及一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法。
背景技术：
L-色氨酸(L-Tryptophan)是人和动物体内的八种必需氨基酸之一，在人和动物体内的新陈代谢中起着重要作用。L-色氨酸在生物体内可以经过一系列化学反应转化为吲哚乙酸、酶、色素、生物碱等一些激素和活性物质，这些活性物质在生命体的各项生理活动当中扮演着特定且重要的角色。
目前，国内用于生产L-色氨酸的高产菌种主要是大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌，其中大肠杆菌属的L-色氨酸高产菌株的转化能力相对要更强，这些菌株大多携带质粒，在经过代谢工程手段改造后，往往存在不易代谢、甚至不代谢除单糖以外的糖成分的性状，这部分没有被完全代谢掉的糖成分(包括二糖、三糖等)对发酵生产就意味着浪费，影响转化率，对提取则增加了除杂压力，导致工艺复杂等问题。
发明内容：
针对上述问题，本发明提供一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法。在培养高产色氨酸的大肠杆菌(大肠埃希氏菌)菌株的同时，按照一定比例加入高产色氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株进行共培养，利用谷氨酸棒状杆菌将二糖、三糖等大肠杆菌改造菌不易代谢的糖成分，转化成色氨酸，达到提高发酵转化率，简化提取操作的目的。同时，在发酵后期流加含有适量甜菜碱、磷酸二氢钾、硫酸镁的营养补充液，补充营养的同时，提高甜菜碱的利用率，起到进一步提高发酵转化率的作用。
本发明由如下技术方案实施：一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法，其包括如下步骤：(1)培养大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的种子液；(2)培养大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的种子液；(3)发酵培养得到色氨酸发酵液；其中，
(1)培养大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的种子液：将大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌分别接种到对应的大肠杆菌种子培养基和谷氨酸棒状杆菌种子培养基中进行培养，得到大肠杆菌种子液和谷氨酸棒状杆菌种子液；
(2)将大肠杆菌种子液和谷氨酸棒状杆菌种子液接种到发酵培养基中：首先按照10-20％的比例将大肠杆菌种子液接种到发酵培养基中，接着将谷氨酸棒状杆菌种子液也接种到发酵培养基中，谷氨酸棒状杆菌种子液的接种量是大肠杆菌种子液接种量的10-20％；
大肠杆菌本身缺少高效同化单糖以外糖分的代谢能力，因此单独培养大肠杆菌，在发酵结束时就会有较多的二糖、三糖等糖分残留，造成浪费，而谷氨酸棒状杆菌本身就能高效同化任何糖分，但在色氨酸生产能力方面，大肠杆菌高于谷氨酸棒状杆菌，本发明将大肠杆菌与谷氨酸棒状杆菌进行混菌发酵，发酵培养过程中，大肠杆菌的菌体量对谷氨酸棒状杆菌的菌体量能有绝对优势，通过共培养少量的谷氨酸棒状杆菌，可以在几乎不影响大肠杆菌高产色氨酸的同时，将残留的二糖、三糖等糖分消耗掉，已达到优势互补的目的，提高糖酸转化率。
(3)发酵培养得到色氨酸发酵液：发酵培养基中接种大肠杆菌种子液和谷氨酸棒状杆菌种子液后发酵培养至放罐，发酵周期为36-40h。
进一步的，所述步骤(3)中，在运行20-24h时，开始按照0.1-0.3L/h的速度，匀速流加营养补充液，所述营养补充液中含有4-8g/L甜菜碱、16-20g/L磷酸二氢钾、16-20g/L硫酸镁。
甜菜碱是一种生物碱，是高渗透压耐受的主要效应物，能促进菌体高速有效的生长，保持菌体细胞形态。甜菜碱是各种发酵工艺里常用的添加剂，但往往都是添加到初始培养基中，本发明研究发现，同等量的甜菜碱，流加效果比添加到初始培养基里的效果明显要好，可能是因为一部分的甜菜碱在菌体生长期被细胞吸收分解掉了，真正在产酸期起作用的甜菜碱已经不多，所以出现明显的差异。
磷酸二氢钾是常用的P、K补充剂，有助于ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)、NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)等的合成，调节渗透压，促进糖的代谢。
硫酸镁能提供Mg元素，是多种酶的激活剂。
在发酵后期流加含有适量甜菜碱、磷酸二氢钾、硫酸镁的营养补充液，补充营养的同时，提高甜菜碱的利用率，起到进一步提高发酵转化率的作用。
进一步的，其特征在于，所述步骤(1)中，当大肠杆菌的种子液OD600数为25～30时停止培养，当SMW005谷氨酸棒状杆菌的种子液OD562数为35～40时停止培养。
进一步的，其特征在于，所述大肠杆菌种子培养基为：葡萄糖30～50g/L，酵母粉2～5g/L，豆粕水解液10～15g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，七水硫酸镁1～5g/L，硫酸铵5～10g/L，生物素0.1～5mg/L，维生素B1 0.1～2mg/L。
进一步的，其特征在于，所述大肠杆菌种子液培养条件为：温度35～37℃，氨水调pH值6.5～7.5，溶氧30～60％。
进一步的，所述谷氨酸棒状杆菌种子培养基为：葡萄糖40～60g/L，玉米浆50～70g/L，玉米浆水解液15～25g/L，氯化钾1～5g/L，七水硫酸镁1～5g/L，生物素0.1～5mg/L，维生素B1 0.1～2mg/L。
进一步的，所述谷氨酸棒状杆菌种子液培养条件为：温度32～35℃，氨水调pH值6.5～7.5，溶氧30～60％。
进一步的，所述发酵培养基为：葡萄糖20～30g/L，玉米浆30～50g/L，酵母粉2～7g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，硫酸铵10～15g/L，七水硫酸镁0.5～3g/L，七水硫酸亚铁0.1～0.5g/L，生物素0.1～5mg/L，维生素B1 0.1～5mg/L。
进一步的，发酵培养条件为：温度35～37℃，转速300～800r/min，罐内通无菌空气保压0.06～0.08Mpa，风量0.5～1v/vm，溶氧10％以上，用氨水持续调节pH值为6.5～7.5。
本发明的优点：
(1)本发明在培养高产色氨酸的大肠杆菌(大肠埃希氏菌)菌株的同时，按照一定比例加入高产色氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株进行共培养，利用谷氨酸棒状杆菌将二糖、三糖等大肠杆菌改造菌不易代谢的糖成分，转化成色氨酸，达到提高发酵转化率，简化提取操作的目的。
(2)本发明在发酵后期流加含有适量甜菜碱、磷酸二氢钾、硫酸镁的营养补充液，补充营养的同时，提高甜菜碱的利用率，起到进一步提高发酵转化率的作用。
具体实施方式：
下面将结合本发明实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例所用到的大肠杆菌菌株为廊坊梅花生物技术开发有限公司赠送的，该菌株的保藏编号为CGMCC No.19056；谷氨酸棒状杆菌由梅花生物科技股份有限公司菌种中心赠送。
实施例1：
将大肠杆菌接种于7L种子培养罐中进行培养，种子培养基为：葡萄糖40g/L，酵母粉3g/L，豆粕水解液10g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水硫酸镁2g/L，硫酸铵10g/L，生物素1mg/L，维生素B1 1mg/L。培养条件为：温度37度，氨水调pH值6.5～7.5，溶氧30～60％，控制种子液OD600数为25～30，得到大肠杆菌种子液。
将谷氨酸棒状杆菌接种于7L种子培养罐中进行培养，种子培养基为：葡萄糖50g/L，玉米浆70g/L，玉米浆水解液15g/L，氯化钾2g/L，七水硫酸镁2g/L，生物素1mg/L，维生素B1 1mg/L，氨水调pH值到6.5～7.5。培养条件为：温度33度，氨水调pH值6.5～7.5，溶氧30～60％，控制种子液OD562数为35～40，得到谷氨酸棒状杆菌种子液。
先将大肠杆菌种子液按20％的接种比接入50L发酵罐中，再将谷氨酸棒状杆菌种子液按4％的接种比例接入50L发酵罐中，进行发酵。发酵培养基为：葡萄糖30g/L，玉米浆50g/L，酵母粉3g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵15g/L，七水硫酸镁3g/L，七水硫酸亚铁0.5g/L，生物素1mg/L，维生素B1 2mg/L。培养条件：温度37℃，转速300～800r/min，罐内通无菌空气保压0.06～0.08Mpa，风量0.5～1v/vm，溶氧10％以上，用氨水持续调节pH值为6.5～7.5，发酵时间40h。
本实施例重复3次，HPLC测定停止发酵时发酵液中的色氨酸含量，见表1。
实施例2：
实施例2与实施例1不同之处在于：当发酵进行到20h时，开始按照0.2L/h的速度匀速流加营养补充液，营养补充液中含有16g/L磷酸二氢钾、16g/L硫酸镁。其他步骤及参数与实施例1完全相同。
本实施例重复3次，HPLC测定停止发酵时发酵液中的色氨酸含量，见表1。
实施例3：
实施例3与实施例1不同之处在于：当发酵进行到20h时，开始按照0.2L/h的速度匀速流加营养补充液，营养补充液中含有6g/L甜菜碱、16g/L硫酸镁。其他步骤及参数与实施例1完全相同。
本实施例重复3次，HPLC测定停止发酵时发酵液中的色氨酸含量，见表1。
实施例4：
实施例4与实施例1不同之处在于：当发酵进行到20h时，开始按照0.2L/h的速度匀速流加营养补充液，营养补充液中含有6g/L甜菜碱、16g/L磷酸二氢钾。其他步骤及参数与实施例1完全相同。
本实施例重复3次，HPLC测定停止发酵时发酵液中的色氨酸含量，见表1。
实施例5：
实施例5与实施例1不同之处在于：当发酵进行到20h时，开始按照0.2L/h的速度匀速流加营养补充液，营养补充液中含有6g/L甜菜碱、16g/L磷酸二氢钾、16g/L硫酸镁。其他步骤及参数与实施例1完全相同。
本实施例重复3次，HPLC测定停止发酵时发酵液中的色氨酸含量，见表1。
对比实施例1：
将大肠杆菌接种于7L种子培养罐中进行培养，种子培养基为：葡萄糖40g/L，酵母粉3g/L，豆粕水解液10g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水硫酸镁2g/L，硫酸铵10g/L，生物素1mg/L，维生素B1 1mg/L。培养条件为：温度37度，氨水调pH值6.5～7.5，溶氧30～60％，控制种子液OD600数为25～30，得到大肠杆菌种子液。
再将大肠杆菌种子液按20％的接种比接入50L发酵罐中，进行发酵。发酵培养基为：葡萄糖30g/L，玉米浆50g/L，酵母粉3g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵15g/L，七水硫酸镁3g/L，七水硫酸亚铁0.5g/L，生物素1mg/L，维生素B1 2mg/L。培养条件：温度37℃，转速300～800r/min，罐内通无菌空气保压0.06～0.08Mpa，风量0.5～1v/vm，溶氧10％以上，用氨水持续调节pH值为6.5～7.5，发酵时间40h。
本实施例重复3次，HPLC测定停止发酵时发酵液中的色氨酸含量，见表1。
对比实施例2：
将谷氨酸棒状杆菌接种于7L种子培养罐中进行培养，种子培养基为：葡萄糖50g/L，玉米浆70g/L，玉米浆水解液15g/L，氯化钾2g/L，七水硫酸镁2g/L，生物素1mg/L，维生素B1 1mg/L，氨水调pH值到6.5～7.5。培养条件为：温度33度，氨水调pH值6.5～7.5，溶氧30～60％，控制种子液OD562数为35～40，得到谷氨酸棒状杆菌种子液。
再将谷氨酸棒状杆菌种子液按20％的接种比接入50L发酵罐中，进行发酵。发酵培养基为：葡萄糖30g/L，玉米浆50g/L，酵母粉3g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵15g/L，七水硫酸镁3g/L，七水硫酸亚铁0.5g/L，生物素1mg/L，维生素B1 2mg/L。培养条件：温度37℃，转速300～800r/min，罐内通无菌空气保压0.06～0.08Mpa，风量0.5～1v/vm，溶氧10％以上，用氨水持续调节pH值为6.5～7.5，发酵时间40h。
本实施例重复3次，HPLC测定停止发酵时发酵液中的色氨酸含量，见表1。
对比实施例3：
对比实施例3与对比实施例1的不同之处在于：当发酵进行到20h时，开始按照0.2L/h的速度匀速流加营养补充液，营养补充液中含有6g/L甜菜碱、16g/L磷酸二氢钾、16g/L硫酸镁。其他步骤及参数与对比实施例1完全相同。
本实施例重复3次，HPLC测定停止发酵时发酵液中的色氨酸含量，见表1。
对比实施例4：
对比实施例4与实施例1的不同之处在于：
发酵培养基为：葡萄糖30g/L，玉米浆50g/L，酵母粉3g/L，磷酸二氢钾18g/L，硫酸铵15g/L，七水硫酸镁3g/L，七水硫酸亚铁0.5g/L，生物素1mg/L，维生素B1 2mg/L，6g/L甜菜碱、16g/L硫酸镁。
其他步骤及参数与实施例1完全相同。
本实施例重复3次，HPLC测定停止发酵时发酵液中的色氨酸含量，见表1。
表1实施例1-5及对比实施例1-3色氨酸含量指标汇总
由表1数据可以看出：本发明在培养高产色氨酸的大肠杆菌(大肠埃希氏菌)菌株的同时，按照一定比例加入高产色氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株进行共培养，提高了发酵转化率。
本发明在发酵后期流加含有适量甜菜碱、磷酸二氢钾、硫酸镁的营养补充液，进一步提高了发酵转化率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)培养大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的种子液；(2)培养大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的种子液；(3)发酵培养得到色氨酸发酵液；其中，
(1)培养大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的种子液：将大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌分别接种到对应的大肠杆菌种子培养基和谷氨酸棒状杆菌种子培养基中进行培养，得到大肠杆菌种子液和谷氨酸棒状杆菌种子液；
(2)将大肠杆菌种子液和谷氨酸棒状杆菌种子液接种到发酵培养基中：首先按照10-20％的比例将大肠杆菌种子液接种到发酵培养基中，接着将谷氨酸棒状杆菌种子液也接种到发酵培养基中，谷氨酸棒状杆菌种子液的接种量是大肠杆菌种子液接种量的10-20％；
(3)发酵培养得到色氨酸发酵液：发酵培养基中接种大肠杆菌种子液和谷氨酸棒状杆菌种子液后发酵培养至放罐，发酵周期为36-40h。
2.根据权利要求1所述的一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在运行20-24h时，开始按照0.1-0.3L/h的速度，匀速流加营养补充液，所述营养补充液中含有4-8g/L甜菜碱、16-20g/L磷酸二氢钾、16-20g/L硫酸镁。
3.根据权利要求1或2所述的一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，当大肠杆菌的种子液OD600数为25～30时停止培养，当SMW005谷氨酸棒状杆菌的种子液OD562数为35～40时停止培养。
4.根据权利要求1或2所述的一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述大肠杆菌种子培养基为：葡萄糖30～50g/L，酵母粉2～5g/L，豆粕水解液10～15g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，七水硫酸镁1～5g/L，硫酸铵5～10g/L，生物素0.1～5mg/L，维生素B1 0.1～2mg/L。
5.根据权利要求4所述的一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述大肠杆菌种子液培养条件为：温度35～37℃，氨水调pH值6.5～7.5，溶氧30～60％。
6.根据权利要求1或2所述的一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌种子培养基为：葡萄糖40～60g/L，玉米浆50～70g/L，玉米浆水解液15～25g/L，氯化钾1～5g/L，七水硫酸镁1～5g/L，生物素0.1～5mg/L，维生素B1 0.1～2mg/L。
7.根据权利要求6所述的一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌种子液培养条件为：温度32～35℃，氨水调pH值6.5～7.5，溶氧30～60％。
8.根据权利要求1或2所述的一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：葡萄糖20～30g/L，玉米浆30～50g/L，酵母粉2～7g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，硫酸铵10～15g/L，七水硫酸镁0.5～3g/L，七水硫酸亚铁0.1～0.5g/L，生物素0.1～5mg/L，维生素B1 0.1～5mg/L。
9.根据权利要求8所述的一种混菌培养提高色氨酸发酵转化率的方法，其特征在于，发酵培养条件为：温度35～37℃，转速300～800r/min，罐内通无菌空气保压0.06～0.08Mpa，风量0.5～1v/vm，溶氧10％以上，用氨水持续调节pH值为6.5～7.5。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN114381477A (zh) * | 2020-10-19 | 2022-04-22 | 江苏元易邦生物科技有限公司 | 一种提高l-色氨酸发酵过程产率和糖酸转化率的方法 |
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2023
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