CN114574533A - 一种发酵生产腺苷的方法及发酵培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产腺苷的方法及发酵培养基,其中,发酵培养基包括:果葡糖浆20‑100g/L,玉米浆20‑50g/L,酵母粉4‑9g/L,硫酸镁2‑6g/L,磷酸二氢钾1‑5g/L,味精2‑6g/L,消泡剂0.1‑0.5g/L,氧载体5‑30g/L;其方法包括如下步骤:(1)将腺苷生产菌种培育制备腺苷种子液;(2)将腺苷种子液接入所述发酵培养基中发酵培养得到腺苷发酵液。本发明通过在发酵培养基中增加氧载体,减少了副产物,有效利用碳源,降低碳源代谢流的浪费;同时,设备故障率情况得到明显改善,延长了设备使用寿命;降低了生产成本。通过用果葡糖浆作为发酵底糖,有利于产苷积累,提高了糖苷转化率。
Description
技术领域:
本发明涉及微生物发酵技术领域,特别是涉及一种发酵生产腺苷的方法及发酵培养基。
背景技术:
腺苷(adenosine),化学名称为9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤,也称作腺嘌呤核苷,指由腺嘌呤的N-9与D-核糖的C-1通过β糖苷键连接而成的化合物,化学式为C10H13N5O4,其磷酸酯为腺苷酸。腺苷属于内源性嘌呤核苷类物质,遍布于人体的各个细胞,参与人体的多种重要代谢和机能调节,在生物化学上扮演着极其重要的角色。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷,可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸,参与心肌能量代谢,同时还参与扩张冠脉血管,增加血流量,是合成环腺苷酸、腺嘌呤、阿糖腺苷、三磷酸腺苷(ATP)的主要原料。此外,腺苷还是一种抑制性神经传导物,在神经传递中起重要作用。
腺苷的主要生产方法为化学合成法、酶法和发酵法。前两种成本高,污染大,大规模应用受到限制。目前,发酵法生产腺苷已进入大规模工业化生产阶段,主要以枯草芽孢杆菌为生产菌生产腺苷,但该方法依然存在以下问题:
(1)枯草芽孢杆菌为耗氧菌,实验要求发酵过程中溶氧控制在 20-50%,但是氧气在培养基中的可溶性较低,同时受发酵设备限制,搅拌转速提到电机的额定转速800转/分时,也只能勉强维持溶氧在5%以下,在低氧条件下,葡萄糖会通过糖酵解途径产生乳酸等副产物,增加了碳源代谢流的浪费;同时,长时间高转速对设备机封和轴承都造成负担,设备故障率高,使用寿命降低;同时高搅拌转速导致电能消耗高,增加生产成本。
(2)腺苷的合成需要碳源进入糖酵解途径提供中间产物和通过 TCA途径来提供能量,同时需要足够的碳源进入戊糖磷酸途径合成腺苷。传统发酵工艺底糖采用葡萄糖,但是高浓度葡萄糖会促进糖酵解途径代谢通量增加,使碳源大量进入糖酵解途径,生成乳酸、乙酸、羟基丁酮、乙偶姻等发酵副产物,而进入戊糖磷酸途径偏少;同时,高浓度葡萄糖还会抑制TCA循环,进而降低了TCA循环为菌体合成腺苷提供需要的ATP(腺苷三磷酸)产量,因此,传统工艺中高浓度葡萄糖不利于产苷积累,糖苷转化率低。
发明内容:
本发明的第一个目的在于提供一种发酵培养基,该发酵培养基用于发酵生产腺苷,能够提高糖苷转化率,降低能耗和生产成本。
本发明的第二个目的在于提供一种糖苷转化率高、能耗低、生产成本低的发酵生产腺苷的方法。
本发明的第一个目由如下技术方案实施:一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基,其包括如下组分:果葡糖浆20-100g/L,玉米浆 20-50g/L,酵母粉4-9g/L,硫酸镁2-6g/L,磷酸二氢钾1-5g/L,味精 2-6g/L,消泡剂0.1-0.5g/L。
所述的一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基还包括有氧载体5-30g/L。
进一步的,所述氧载体为对细胞无害,比水具有更高溶氧量,且与水不互溶的有机化合物。
进一步的,所述氧载体为油酸甘油酯、三油酸甘油酯、软脂精或三硬脂酸甘油酯中的任意一种或一种以上的组合。
进一步的,所述果葡糖浆为F90型果葡糖浆、F42型果葡糖浆或 F55型果葡糖浆中的任意一种或一种以上的组合。
进一步的,所述果葡糖浆为F90型果葡糖浆。
本发明的第二个目由如下技术方案实施:利用上述所述的发酵培养基发酵生产腺苷的方法,包括如下步骤:
(1)将腺苷生产菌种培育制备腺苷种子液;
(2)将腺苷种子液接入所述发酵培养基中发酵培养得到腺苷发酵液;发酵过程控制溶氧在20-50%。
进一步的,所述步骤(1)具体包括:将腺苷生产菌种接种至种子培养基中,制备成发酵种子液;将所述发酵种子液接入种子罐中进行种子培养得到腺苷种子液;其中,培养温度为30-36℃,pH为6.5-7.0,罐压为0.05-0.1Mpa。
进一步的,所述种子培养基包括如下组分:葡萄糖20-40g/L,玉米浆20-50g/L,酵母粉3-8g/L,硫酸镁2-5g/L,磷酸二氢钾2-5g/L,味精1-5g/L,消泡剂0.15-0.3g/L。
进一步的,所述腺苷生产菌种为枯草芽孢杆菌。
进一步的,所述步骤(2)具体包括:将所述腺苷种子液以13-18%接种量接入所述发酵培养基中,培养温度为30-38℃,pH为6.4-7.0,罐压为0.05-0.1Mpa;当所述发酵培养基中残糖水平低于20g/L时,开始流加葡萄糖溶液,将残糖维持在15-35g/L,总发酵时间为36-44h,制备得到腺苷发酵液。
本发明的优点:
1、本发明通过在发酵培养基中增加氧载体,氧载体比水有更高的溶氧量,且与发酵液不互溶,可以减少气-液两相之间的传氧阻力,提高了发酵溶氧效果,改善溶氧环境,发酵罐搅拌只需要低转速便可满足溶氧要求。溶氧满足要求后,减少了通过糖酵解途径产生乳酸等副产物,有效利用碳源,降低碳源代谢流的浪费;同时,发酵罐搅拌转速降低,一方面降低了电耗,另一方面降低了对设备机封和轴承的负担,设备故障率情况得到明显改善,延长了设备使用寿命;降低了生产成本。
2、本发明通过用果葡糖浆作为发酵底糖,代替碳源葡萄糖,一方面,通过果糖进入糖酵解途径维持生物量增长;另一方面,减少对 TCA循环的抑制,为菌体合成腺苷提供大量的ATP,减少发酵副产物的生成,有利于产苷积累,提高了糖苷转化率。
具体实施方式:
下面将结合本发明实施例,对本发明技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基,其包括如下组分:F90型果葡糖浆30g/L,玉米浆35g/L,酵母粉4g/L,硫酸镁4g/L,磷酸二氢钾2.4g/L,味精4g/L,消泡剂0.2g/L,油酸甘油酯5g/L。
实施例2:利用实施例1中的发酵培养基发酵生产腺苷的方法,其包括如下步骤:
(1)将腺苷生产菌种培育制备腺苷种子液;具体包括:将腺苷生产菌种接种至种子培养基中,制备成发酵种子液;将所述发酵种子液接入种子罐中进行种子培养得到腺苷种子液;其中,培养温度为 31℃,pH为6.5-6.6,罐压为0.05-0.1Mpa;其中,种子培养基包括如下组分:葡萄糖20g/L,玉米浆20g/L,酵母粉3g/L,硫酸镁2g/L,磷酸二氢钾2g/L,味精2g/L,消泡剂0.15g/L;本实施例中,腺苷生产菌种为枯草芽孢杆菌。种子罐培养基灭菌温度为123℃,时间25min。
(2)将腺苷种子液接入所述发酵培养基中发酵培养得到腺苷发酵液;具体包括:将腺苷种子液以15%接种量接入发酵培养基中,培养温度为31℃,pH为6.4-6.5,罐压为0.05-0.1Mpa;当发酵培养基中残糖水平低于20g/L时,开始流加葡萄糖溶液,将残糖维持在 15-25g/L,总发酵时间为40h,制备得到腺苷发酵液;搅拌转速为 400-600转/分,发酵过程控制溶氧在20-50%。发酵培养基包括如下组分:果葡糖浆30g/L,玉米浆35g/L,酵母粉4g/L,硫酸镁4g/L,磷酸二氢钾2.4g/L,味精4g/L,消泡剂0.2g/L,氧载体5g/L。本实施例所用氧载体为油酸甘油酯;果葡糖浆为F90型果葡糖浆,即果葡糖浆中含果糖的质量百分比浓度为90%。
按本实施例方法重复3次,测定发酵液中的腺苷含量,发酵指标见下表1。
实施例3:一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基,其特征在于,其包括如下组分:F42果葡糖浆100g/L,玉米浆50g/L,酵母粉9g/L,硫酸镁6g/L,磷酸二氢钾5g/L,味精6g/L,消泡剂0.5g/L,软脂精 30g/L。
实施例4:利用实施例3中的发酵培养基发酵生产腺苷的方法,其包括如下步骤:
(1)将腺苷生产菌种培育制备腺苷种子液;具体包括:将腺苷生产菌种接种至种子培养基中,制备成发酵种子液;将所述发酵种子液接入种子罐中进行种子培养得到腺苷种子液;其中,培养温度为 36℃,pH为6.5-6.6,罐压为0.05-0.1Mpa;其中,种子培养基包括如下组分:葡萄糖40g/L,玉米浆50g/L,酵母粉8g/L,硫酸镁5g/L,磷酸二氢钾5g/L,味精5g/L,消泡剂0.3g/L;本实施例中,腺苷生产菌种为枯草芽孢杆菌。种子罐培养基灭菌温度为123℃,时间25min。
(2)将腺苷种子液接入所述发酵培养基中发酵培养得到腺苷发酵液;具体包括:将所述腺苷种子液以18%接种量接入发酵培养基中,培养温度为38℃,pH为6.4-6.5,罐压为0.05-0.1Mpa;当发酵培养基中残糖水平低于20g/L时,开始流加葡萄糖溶液,将残糖维持在15-35g/L,总发酵时间为44h,制备得到腺苷发酵液;搅拌转速为400-600转/分,发酵过程控制溶氧在20-50%。发酵培养基包括如下组分:果葡糖浆100g/L,玉米浆50g/L,酵母粉9g/L,硫酸镁6g/L,磷酸二氢钾5g/L,味精6g/L,消泡剂0.5g/L,氧载体30g/L。本实施例所用氧载体为软脂精;果葡糖浆为F42型果葡糖浆,即果葡糖浆中含果糖的质量百分比浓度为42%。
按本实施例方法重复3次,测定发酵液中的腺苷含量,发酵指标见下表1。
实施例5:一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基,其特征在于,其包括如下组分:F55型果葡糖浆70g/L,玉米浆40g/L,酵母粉7g/L,硫酸镁2g/L,磷酸二氢钾4g/L,味精2g/L,消泡剂0.1g/L,三硬脂酸甘油酯20g/L。
实施例6:利用实施例5中的发酵培养基发酵生产腺苷的方法,其包括如下步骤:
(1)将腺苷生产菌种培育制备腺苷种子液;具体包括:将腺苷生产菌种接种至种子培养基中,制备成发酵种子液;将所述发酵种子液接入种子罐中进行种子培养得到腺苷种子液;其中,培养温度为 34℃,pH为6.5-6.6,罐压为0.05-0.1Mpa;其中,种子培养基包括如下组分:葡萄糖30g/L,玉米浆35g/L,酵母粉5g/L,硫酸镁3g/L,磷酸二氢钾3g/L,味精4g/L,消泡剂0.25g/L;本实施例中,腺苷生产菌种为枯草芽孢杆菌。种子罐培养基灭菌温度为123℃,时间25min。
(2)将腺苷种子液接入所述发酵培养基中发酵培养得到腺苷发酵液;具体包括:将所述腺苷种子液以13%接种量接入发酵培养基中,培养温度为35℃,pH为6.4-6.5,罐压为0.05-0.1Mpa;当发酵培养基中残糖水平低于20g/L时,开始流加葡萄糖溶液,将残糖维持在15-25g/L,总发酵时间为36h,制备得到腺苷发酵液;搅拌转速为 400-600转/分,发酵过程控制溶氧在20-50%。发酵培养基包括如下组分:果葡糖浆70g/L,玉米浆40g/L,酵母粉7g/L,硫酸镁2g/L,磷酸二氢钾4g/L,味精2g/L,消泡剂0.1g/L,氧载体20g/L。本实施例所用氧载体为三硬脂酸甘油酯;果葡糖浆为F55型果葡糖浆,即果葡糖浆中含果糖的质量百分比浓度为55%。
按本实施例方法重复3次,测定发酵液中的腺苷含量,发酵指标见下表1。
实施例7:一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基,与实施例1不同在于没有添加油酸甘油酯,其他组分及含量与实施例1完全相同。
实施例8:利用实施例7中的发酵培养基发酵生产腺苷的方法,与实施例2不同在于没有添加油酸甘油酯,搅拌转速提到电机的额定转速800转/分时,也只能勉强维持溶氧在5%以下。其他操作步骤、相关参数及组分、含量与实施例2完全相同。
按本实施例方法重复3次,测定发酵液中的腺苷含量,发酵指标见下表1。
实施例9:一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基,与实施例1不同在于:本实施例用葡萄糖30g/L代替实施例1中的F90型果葡糖浆 30g/L,其他组分及含量与实施例1完全相同。
实施例10:利用实施例9中的发酵培养基发酵生产腺苷的方法,与实施例2不同在于:本实施例用葡萄糖30g/L代替实施例1中的F90 型果葡糖浆30g/L,搅拌转速400-600转/分,发酵过程控制溶氧在 20-50%。其他操作步骤、相关参数及组分、含量与实施例2完全相同。
按本实施例方法重复3次,测定发酵液中的腺苷含量,发酵指标见下表1。
对比实施例:传统发酵生产腺苷的工艺,包括如下步骤:
(1)将腺苷生产菌种培育制备腺苷种子液;具体包括:将枯草芽孢杆菌菌种接种至种子培养基中,制备成发酵种子液;将发酵种子液接入种子罐中进行种子培养得到腺苷种子液;其中,培养温度为 31℃,pH为6.5-6.6,罐压为0.05-0.1Mpa;其中,种子培养基包括如下组分:葡萄糖20g/L,玉米浆20g/L,酵母粉3g/L,硫酸镁2g/L,磷酸二氢钾2g/L,味精2g/L,消泡剂0.15g/L;种子罐培养基灭菌温度为123℃,时间25min。
步骤2)发酵培养:将腺苷种子液以15%接种量接入发酵培养基中,培养温度31℃,PH为6.4-6.5,罐压0.05-0.1Mpa。当培养基中残糖水平低于20g/L时,开始流加葡萄糖溶液,控制残糖15-25g/L,总发酵时间40h,制备得到腺苷发酵液;搅拌转速提到电机的额定转速800转/分时,也只能勉强维持溶氧在5%以下。发酵培养基包括如下组分:葡萄糖30g/L,玉米浆35g/L,酵母粉4g/L,硫酸镁4g/L,磷酸二氢钾2.4g/L,味精4g/L,消泡剂0.2g/L。
按本对比实施例方法重复3次,测定发酵液中的腺苷含量,发酵指标见下表1。
表1对比实施例与实施例2、4、6、8、10指标对比
结论:如表1与对照实验例相比,实施例10底糖用果葡糖浆,实施例8增加了氧载体,实施例2同时增加了果葡糖浆和氧载体。相比改进前的对比实施例,结果表明底糖用果葡糖浆有利于增加糖苷转化率,增加氧载体油酸甘油酯有利于增加产苷,联合添加两种物质提升效果明显高于分别单独添加果葡糖浆或氧载体。实施例4、6在实施例2的基础上,考察了另外两类果葡糖浆:F42型(果糖42%)和 F55型(果糖55%),实验结果表明F90型(果糖90%)指标优于 F42(果糖42%)型和F55型(果糖55%),即使用高果糖占比的果葡糖浆更有利于提高发酵产苷和转化率。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基,其特征在于,其包括如下组分:果葡糖浆20-100g/L,玉米浆20-50g/L,酵母粉4-9g/L,硫酸镁2-6g/L,磷酸二氢钾1-5g/L,味精2-6g/L,消泡剂0.1-0.5g/L。
2.根据权利要求1所述的一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基,其特征在于,其还包括有氧载体5-30g/L。
3.根据权利要求2所述的一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基,其特征在于,所述氧载体为对细胞无害,比水具有更高溶氧量,且与水不互溶的有机化合物。
4.根据权利要求3所述的一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基,其特征在于,所述氧载体为油酸甘油酯、三油酸甘油酯、软脂精或三硬脂酸甘油酯中的任意一种或一种以上的组合。
5.根据权利要求1所述的一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基,其特征在于,所述果葡糖浆为F90型果葡糖浆、F42型果葡糖浆或F55型果葡糖浆中的任意一种或一种以上的组合。
6.根据权利要求5所述的一种用于发酵生产腺苷的发酵培养基,其特征在于,所述果葡糖浆为F90型果葡糖浆。
7.利用权利要求1-6任意所述的发酵培养基发酵生产腺苷的方法,其特征在于:其包括如下步骤:
(1)将腺苷生产菌种培育制备腺苷种子液;
(2)将腺苷种子液接入所述发酵培养基中发酵培养得到腺苷发酵液;发酵过程控制溶氧在20-50%。
8.根据权利要求7所述的发酵生产腺苷的方法,其特征在于:所述步骤(1)具体包括:将腺苷生产菌种接种至种子培养基中,制备成发酵种子液;将所述发酵种子液接入种子罐中进行种子培养得到腺苷种子液;其中,培养温度为30-36℃,pH为6.5-7.0,罐压为0.05-0.1Mpa;
所述种子培养基包括如下组分:葡萄糖20-40g/L,玉米浆20-50g/L,酵母粉3-8g/L,硫酸镁2-5g/L,磷酸二氢钾2-5g/L,味精1-5g/L,消泡剂0.15-0.3g/L。
9.根据权利要求7所述的发酵生产腺苷的方法,其特征在于:所述腺苷生产菌种为枯草芽孢杆菌。
10.根据权利要求7所述的发酵生产腺苷的方法,其特征在于:所述步骤(2)具体包括:将所述腺苷种子液以13-18%接种量接入所述发酵培养基中,培养温度为30-38℃,pH为6.4-7.0,罐压为0.05-0.1Mpa;当所述发酵培养基中残糖水平低于20g/L时,开始流加葡萄糖溶液,将残糖维持在15-35g/L,总发酵时间为36-44h,制备得到腺苷发酵液。
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