KR101643429B1

KR101643429B1 - 혐기성 미생물 발효에 의한 부탄디올의 생산 방법

Info

Publication number: KR101643429B1
Application number: KR1020117000650A
Authority: KR
Inventors: 션 데니스 심슨; 푸옹 로안 트란; 크리스토프 다니엘 미할세아; 제니퍼 몬 이 풍; 풍민 류
Original assignee: 란자테크 뉴질랜드 리미티드
Priority date: 2008-06-09
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2016-07-27
Also published as: KR20110033193A; EP2307556A1; ZA201008795B; WO2009151342A1; BRPI0915017A2; CN102317463B; US20130177955A1; US8658408B2; CN102317463A; AU2009258344B2; ES2824838T3; EA018720B1; PT2307556T; JP2011522563A; EP2307556B1; CA2727549A1; NZ589632A; EP2307556A4; AU2009258344A1; JP5618995B2

Abstract

본 발명은 혐기성 발효법에 의하여 2,3-부탄디올을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 방법에 따르면, 탄수화물과 일산화탄소를 포함하는 기질의 혐기성 발효에 의하여 2,3-부탄디올이 생성된다.

Description

혐기성 미생물 발효에 의한 부탄디올의 생산 방법 {PRODUCTION OF BUTANEDIOL BY ANAEROBIC MICROBIAL FERMENTATION}

본 발명은 미생물 발효에 의한 부탄디올의 생산 방법, 특히 CO를 포함하는 기질의 미생물 발효에 의한 2,3-부탄디올의 생산 방법에 관한 것이다.

운송용 바이오 연료는 가솔린에 대한 매력적인 대체제로서, 저농도 혼합물로서 연료 시장에 신속하게 침투하고 있다. 천연 식물 원료로부터 유래한 바이오 연료는 화석 연료 (가령, 가솔린)에서 유래한 것보다 훨씬 친환경적이므로, 연료 연소의 결과로서 대기 중에 방출되는 소위 석탄 이산화탄소 (CO₂)의 양을 낮추어 준다. 뿐만 아니라, 바이오 연료는 다수의 지역에서 지역적으로 생산될 수 있어서, 수입된 화석 에너지 자원에 대한 의존성을 낮추는 역할을 할 수도 있다. 이러한 바이오 연료로서 사용하기에 적합한 알콜로는 그 중에서도 특히 에탄올, 부탄올 및 2,3-부탄디올이 있다.

에탄올은 전세계적으로 사용되는 주요 수소 풍부 운송용 액체 연료가 되었다. 에탄올의 전세계적 소모량은 2002년에만 108억 갤론으로 추산된다. 에탄올 연료 산업에 대한 전세계 시장은 추후에도 급속히 성장될 것으로 예상되는데, 이는 유럽, 일본 및 미국과 몇개국의 개발 도상국에서의 에탄올의 증가된 이익에 기인한다.

1,2-부탄디올, 1,3-부탄디올, 1,4-부탄디올 및 2,3-부탄디올을 비롯한 부탄디올은 에탄올에 비하여 여러 가지 장점을 가진 것으로 파악될 수 있다. 에탄올과 마찬가지로, 부탄디올은 자동차 연료 첨가제로서 직접적으로 사용될 수 있다. 이들은 또한 고급 및/또는 고에너지 제품으로 비교적 용이하게 전환될 수 있다. 예를 들어, 2,3-부탄디올은 활성화 연료로서 사용될 수 있는 8가 탄소 다이머로 2단계에 걸쳐 용이하게 전환될 수 있다.

2,3-부탄디올은 이의 이작용성 (di-functional) 백본으로부터 다양하게 유도체화될 수 있는데, 즉, 2개의 하이드록실기가 C 원자의 근접 부위에 위치하여, 부타디엔, 부타디온, 아세토인, 메틸에틸 케톤 등의 물질로 용이하게 전환될 수 있도록 하여 준다. 이들 화합물은 산업적으로 생산되는 다양한 화학 제품의 제조에서 기제 (base)로서 사용된다.

더욱이, 2,3-부탄디올은 내부 연소 엔진의 연료로서 사용될 수 있다. 이는 에탄올보다는 더 가솔린과 유사하게 작용한다. 환경적으로 허용 가능한 연료의 생산 및 응용에서의 이해 관계가 강화됨에 따라, 생물학적 공정으로 2,3-부탄디올 (종종 바이오-부탄올로 불림)을 생산하는 것의 이점이 증가되고 있는 추세이다.

2,3-부탄디올은 탄수화물 함유 원료의 미생물 발효법에 의하여 생성될 수 있다 (Syu MJ, Appl Microbiol Biotechnol 55:10-18 (2001), Qin et al., Chinese J Chem Eng 14(1):132-136 (2006)). 2,3-부탄디올은 슈가 비트, 옥수수, 밀 및 사탕 수수 등의 곡물로부터의 바이오매스의 미생물 발효법에 의하여 생성될 수 있다. 그러나, 이들 탄수화물 공급 원료의 비용은 인류의 식품 또는 동물의 먹이로서의 이들의 가치에 의하여 영향을 받으며, 2,3-부탄올 생산을 위한 녹말 또는 수크로스 생성 곡류의 재배가 모든 지역에서 경제적으로 가능한 것은 아니다. 그러므로, 부탄올 연료를 더욱 낮은 비용 및/또는 더욱 풍부한 탄소 급원인 2,3-부탄디올로 전환시키기 위한 기술을 개발하는 것이 요구되고 있다.

일산화탄소 (CO)는 석탄 또는 석유 및 석유 유래 제품 등의 유기 물질의 불완전 연소의 주요 부산물이다. 탄소 함유 전구체의 완전 연소는 CO₂와 물을 최종 생성물로서 생성하지만, 일부의 산업 공정에서는 CO₂보다 일산화 탄소의 생성을 더욱 순조롭게 하기 위하여 승온을 요구하기도 한다. 한 가지 예로, 제강 산업이 있는데, 여기에서는 희망하는 제강 품질을 생성시키기 위하여 고온이 요구된다. 예컨대, 호주의 제강 산업은 CO를 연간 500,000톤 이상 생성하여 대기 중으로 방출하는 것으로 보고되어 있다.

더욱이, CO는 신가스 (syngas)의 주요 성분인데, 신가스는 탄소 함유 연료의 기체화에 의하여 CO 및 H₂를 다양한 양으로 생성한다. 예컨대, 신가스는 폐기 목재 및 팀버의 유기 바이오매스를 크래킹하여, 연료 및 더욱 복잡한 화학 물질의 생성을 위한 전구체를 생성시킴으로써 제조될 수 있다.

CO가 대기로 방출되는 것은 환경에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, 방출세를 내야할 필요가 있으므로, 산업 공장에 대한 비용을 증가시킨다. CO는 비교적 반응성 고에너지 분자이기 때문에, 각종 화학 물질의 제조를 위한 전구체 화합물로서 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 가치 있는 원료가 2,3-부탄디올을 제조하기 위하여 사용된 적은 없었다.

본 발명의 목적은 전술한 단점을 극복하는 방향을 제시하는 방법을 제공하거나, 최소한 유용한 선택 사항을 공중에 제공하려는 것이다.

한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 일산화탄소를 포함하는 기질의 미생물 발효에 의하여 부탄디올을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시 상태에 있어서, 본 발명은 미생물 발효에 의하여 부탄디올을 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은

a. CO를 포함하는 기질을 제공하는 단계와,

b. 1종 이상의 미생물의 배양액을 함유하는 생물 반응기 내에서 상기 기질을 혐기성 발효시켜 부탄디올을 생성시키는 단계를 포함한다.

특정 실시 상태에 있어서, 부탄디올은 2,3-부탄디올이다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 발효법에 의하여 2,3-부탄디올 생산 효율을 증가시키는 방법에 관한 것인데, 여기서 이 방법은

a. CO를 포함하는 기질을 제공하는 단계와,

b. 1종 이상의 미생물의 배양액을 함유하는 생물 반응기 내에서 상기 기질을 혐기성 발효시켜 2,3-부탄디올을 생성시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명은 미생물 발효법에 의하여 2,3-부탄디올을 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은

a. 기질을 제공하는 단계와,

b. 1종 이상의 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제 유전자를 포함하는 1종 이상의 미생물의 배양액을 함유하는 생물 반응기 내에서 상기 기질을 혐기성 발효시키는 단계와,

c. 2,3-부탄디올이 미생물에 의하여 생성되도록 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제 유전자를 상향 조절하는 단계를 포함한다.

구체적인 실시 상태에 있어서, 이 기질은 CO를 포함한다.

다양한 측면의 구체적인 실시 상태에 있어서, 일산화탄소를 포함하는 기질은 일산화탄소를 포함하는 기체상 기질이다. 일산화탄소를 포함하는 기체상 기질은 산업 공정의 부산물로서 얻을 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 산업 공정은 철금속 제품 제조, 비철금속 제품 제조, 석유 제련 공정, 바이오매스 기체화, 석탄 기체화, 전력 생산, 카본 블랙 생성, 암모니아 생성, 메탄올 생성 및 코크 제조로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 기체상 기질은 제강 공장에서 입수한 기체를 포함한다. 다른 실시 상태에 있어서, 이 기체상 기질은 자동차 배기 가스를 포함한다.

특정 실시 상태에 있어서, CO 함유 기질은 높은 비율의 CO를 함유하는데, 예컨대, 약 20 내지 약 100 부피%, 약 40 내지 약 95 부피%, 40 내지 60 부피%, 45 내지 55 부피%의 CO를 함유한다. 특정 실시 상태에 있어서, 기질은 약 25 부피%, 또는 약 30 부피%, 또는 약 35 부피%, 또는 약 40 부피%, 또는 약 45 부피%, 또는 약 50 부피%, 또는 약 55 부피%, 또는 약 60 부피%의 CO를 포함한다. 가령 6% 등의 낮은 농도의 CO를 함유하는 기질도 H₂ 및 CO₂가 존재하는 경우에 특히 적합할 수 있다.

각종 측면의 특정 실시 상태에 있어서, CO를 포함하는 기질은 2,3-부탄디올이 생성되도록 하는 충분한 수준으로 제공된다. 특정 실시 상태에 있어서, CO는 0.4 mmol/g/분 이상; 0.5 mmol/g/분 이상; 또는 0.6 mmol/g/분 이상; 또는 0.7 mmol/g/분 이상; 또는 0.8 mmol/g/분 이상; 또는 0.9 mmol/g/분 이상; 또는 1.0 mmol/g/분 이상; 또는 1.2 mmol/g/분 이상; 또는 1.5 mmol/g/분 이상의 비흡수율(比吸收率)이 유지되도록 제공된다.

각종 측면의 특정 실시 상태에 있어서, 이 방법은 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 사용하는 미생물 발효를 포함한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 미생물 발효법에 의하여 2,3-부탄디올을 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은

a. 기질을 제공하는 단계와,

b. 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 배양액을 포함하는 생물 반응기 내에서 상기 기질을 혐기성 발효시켜 2,3-부탄디올을 생성시키는 단계를 포함한다.

특정 실시 상태에 있어서, 이 기질은 프럭토스 등의 1종 이상의 탄수화물이다. 또는, 기질은 일산화탄소를 포함하는 기질인데, 보통은 전술한 바와 같은 일산화탄소를 포함하는 기체상 기질이다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 제1 기질과 CO를 포함하는 제2 기질의 미생물 발효에 의한 부탄디올의 생산 방법을 제공한다. 좋기로는, 상기 부탄디올은 2,3-부탄디올이다.

특정 실시 상태에 있어서, 제1 기질은 탄수화물이다. 특정 실시 상태에 있어서, 제 1 기질은 프럭토스이다. 특정 실시 상태에 있어서, 제2 기질은 전술한 바와 같은 일산화탄소를 포함하는 기체상 기질이다.

특정 실시 상태에 있어서, 이 방법은

(a) 제1 기질을 미생물 발효시켜 2,3-부탄디올을 생성시키는 단계와,

(b) CO를 포함하는 제2 기질을 미생물 발효시켜 2,3-부탄디올을 생성시키는 단계를 포함한다.

특정 실시 상태에 있어서, (a)와 (b) 단계는 동일한 시간대에 수행할 수 있다. 또는, (a) 단계는 (b) 단계 전 또는 (b) 단계 후에 올 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 이 방법은 (a) 단계와 (b) 단계를 교대로 실시할 수 있다.

본 발명의 추가 측면에 있어서, 전술한 측면에 따르는 방법이 제공되는데, 여기서 발효는 생물 반응기 중에서 수행된다.

본 발명의 추가의 측면에 있어서, 전술한 측면에 따르는 방법이 제공되는데, 여기서 이 방법은 부탄 디올을 획득하여 회수하는 단계를 더 포함한다.

추가의 측면에 있어서, 본 발명에는 전술한 측면에 따르는 방법에 의하여 생성된 부탄디올, 좋기로는 2,3-부탄디올이 제공된다.

본 발명은 본 출원의 명세서에 개별적으로 또는 집합적으로 기재되었거나 언급된 일부, 요소 및 특징을 포함하며, 상기 일부, 요소 및 특징의 2개 이상의 임의의 또는 모든 조합에서, 특정한 정수가 언급된 것은 본 발명이 관련된 기술 분야에서 균등한 것으로 알려진 것을 언급한 것이고, 이러한 알려진 균등물은 개별적으로 언급된 경우와 같이 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다.

도 1은 세 가지 발효기 (R11, R12 및 R2) 중에서 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제 (2,3BDH)의 상대적인 유전자 발현을 나타낸다. 아세테이트를 생성하는 R2는 보정자 (calibrator)로 선택되었고, 유전자 발현은 참조 유전자로서 rpoB를 사용하여 정규화하였다. 에러 바아 = 평균의 표준 에러. N=3. 명백히, 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제는 2,3-부탄디올을 생성하는 미생물 배양액에서 상향 조절된다. R2에서 미생물 배양액의 CO 비흡수율은 약 0.3 mmol/g/분인 반면에, R12에서 배양액의 CO 비흡수율은 약 0.6 mmol/g/분이다. 배양액에 제공된 CO의 양을 증가시키면, CO 흡수와, 이에 이어 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제 유전자 발현의 증가를 초래한다. 2,3-부탄디올 데하이드로게아나제 유전자 발현의 증가는 전체적인 2,3-부탄디올 생성율의 증가를 초래한다.

이하에는, 본 발명의 상세한 설명을 제공하는데, 여기에는 일반적인 용어로 다양한 실시 상태가 제공된다. 본 발명은 아래의 "실시예"라는 제목 아래 제공된 설명에서 추가로 예시되는데, 이는 본 발명을 뒷받침하는 실험적 데이터와, 본 발명의 측면의 구체적인 실시예와, 본 발명을 실시하는 예시적인 수단을 제공한다.

본 발명에 사용된 "부탄디올"이라는 용어는 1,2-부탄디올, 1,3-부탄디올, 1,4-부탄디올 및 2,3-부탄디올을 비롯한 디올의 모든 구조 이성질체와 부분 입체 이성질체를 모두 가리킨다. "2,3-부탄디올"이라는 용어는 일부 부분 입체 이성질체적으로 순수하고 및/또는 실질적으로 부분 입체 이성질체적으로 순수한 형태인 (R,R), (S,S) 및 메소 (meso) 폼 라세미체를 비롯한 이 화합물의 모든 에난티오머 및 부분 입체 이성질체 형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

"생물 반응기"라는 용어는 1개 이상의 용기 및/또는 타워 또는 파이프 배열로 이루어지는 발효 장치를 말하며, 여기에는 연속 교반 탱크 반응기 [Continuous Stirred Tank Reactor (CSTR)], 고정 셀 반응기 [Immobilized Cell Reactor (ICR)], 트리클 베드 반응기 [Trickle Bed Reactor (TBR)], 버블 컬럼 (Bubble Column), 가스 리프트 발효기 (Gas Lift Fermenter), 고정식 혼합기 (Static Mixer), 또는 기체-액체 접촉에 적합한 기타의 용기 또는 기타 장치가 있다. 후술하는 바와 같이, 일부 실시 상태에 있어서, 생물 반응기는 제1 성장용 반응기와, 제2 발효용 반응기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 생물 반응기 또는 발효 반응기에 일산화탄소를 포함하는 기질 등의 기질을 첨가하는 것을 말할 때에는, 이는 적당한 이들 반응기 중 어느 하나, 또는 두 가지 반응기에 첨가하는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

"일산화탄소를 포함하는 기질"이라는 용어는 예컨대, 성장 및/또는 발효를 위하여 일산화탄소가 1종 이상의 세균 균주에 사용될 수 있는 임의의 기질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

"일산화탄소를 포함하는 기체상 기질"로는 일산화탄소 일정량을 함유하는 임의의 기체가 포함된다. 기체상 기질은 약 15 부피% 내지 약 95 부피% 등의 높은 비율의 CO를 함유한다.

별도로 언급하지 않은 한, 본 발명에 사용된 "발효시키는", "발효법", 또는 "발효 반응" 등의 용어는 본 발명의 방법에 의한 성장기 및/또는 생성물의 생합성기를 모두 포함시키고자 하는 것이다.

본 발명자는 놀랍게도, 2,3-부탄디올은 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 사용하는 미생물 발효법에 의하여 생성될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 발효 생성물에는 다양한 알콜이 포함되며, 이로써 에탄올 및 2,3-부탄디올은 상당한 대체물이라는 것을 발견하였다. 2,3-부탄디올은 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 사용하는 발효 생성물로서는 종전에 동정된 바가 없다. 특히, 본 발명자는 탄수화물을 포함하는 기질로부터 2,3-부탄디올 및 다른 생성물을 제조하는 데에 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 사용할 수 있음을 증명하였다. 특히, 프럭토스는 아세테이트, 에탄올 및 2,3-부탄디올을 포함하는 생성물로 전환될 수 있다. 2,3-부탄디올은 CO를 포함하는 기질로부터, 특히 CO를 포함하는 기체상 기질로부터 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)에 의하여 생성될 수 있음이 본 발명에 이르러 놀랍게도 증명되었다. 종전에는 기체상 탄소 급원, 특히 CO를 포함하는 급원을 발효 방법에 사용하여 2,3-부탄디올을 생성시킨 적이 없었다.

본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 2,3-부탄디올 생성 효율은 2,3-부탄디올이 생성될 수 있는 충분한 수준으로 기질을 제공함으로써 증가시킬 수 있다. 미생물 배양액에 제공되는 기질의 양을 증가시키면, 배양액에 의하여 생성되는 2,3-부탄디올의 양도 증가시키는 것을 알 수 있다.

본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, CO를 포함하는 기질은 2,3-부탄디올이 생성되도록 충분한 양으로 제공된다. 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 포함하는 미생물 배양액은 약 1.5 내지 2 mmol/미생물 세포의 건조 중량 g/분의 속도 [CO 비흡수율]로 CO를 흡수할 수 있는 것으로 나타났다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, CO를 포함하는 기질은 비흡수율이 실질적으로 0.4 mmol/g/분 또는 그 이상으로 유지되도록, 또는 0.5 mmol/g/분 또는 그 이상, 또는 0.6 mmol/g/분, 또는 0.7 mmol/g/분 그 이상, 또는 0.8 mmol/g/분 또는 그 이상, 또는 0.9 mmol/g/분 또는 그 이상, 또는 1.0 mmol/g/분 또는 그 이상, 또는 1.2 mmol/g/분 또는 그 이상, 또는 1.5 mmol/g/분 또는 그 이상으로 유지되도록 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 포함하는 미생물 배양액에 제공된다. 이러한 실시 상태에 있어서, 2,3-부탄디올은 0.5 g/L 이상, 또는 1 g/L 이상, 또는 2 g/L 이상, 또는 5 g/L 이상의 주요 발효 생성물이다. 특정 실시 상태에 있어서, 2,3-부탄디올은 0.5 g/L/1일 이상, 또는 1 g/L/1일 이상의 속도로 생성된다.

본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 본 발명의 방법을 수행하기 위하여 사용되는 장치는 CO 공급, CO 흡수, 바이오매스 수준, 2,3-부탄디올 생성 등의 측정 및/또는 파라미터의 조절을 가능하도록 한다. 예를 들어, 시료를 생물 반응기로부터 취하여, 상기 파라미터 중 1가지 이상을 측정하여 2,3-부탄디올 생성을 개선시키도록 생물 반응기 조건을 임의로 조정할 수 있다. 예를 들어, 생물 반응기에서, 미생물 배양액이 2,3-부탄디올을 아예 생성하지 않거나, 상당량이지 않은 양으로 생성한다면, 2,3-부탄디올이 생성되도록 CO 공급량을 증가시킬 수 있다.

문헌 [Phillips, J.R, et al, 1994, Applied Biochemistry and Biotechnology, 45/46: 145]에 기재된 바와 같이, 아세틸-CoA 사이클 및 THF 사이클의 조합을 통하여 CO로부터 아세테이트 및 에탄올 등의 생성물이 생성될 수 있다는 것은 받아들여지고 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 따르면, 0.4 mmol/g/분 이상, 또는 0.5 mmol/g/분 이상, 또는 0.6 mmol/g/분 이상, 또는 0.7 mmol/g/분 이상, 또는 0.8 mmol/g/분 이상, 또는 0.9 mmol/g/분 이상, 또는 1.0 mmol/g/분 이상, 또는 1.2 mmol/g/분 이상, 또는 1.5 mmol/g/분 이상의 CO 비흡수율이 유지되도록 CO가 제공되는 곳에서 2,3-부탄디올이 생성될 수 있다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 하기 이론으로 구속시킬 의도는 없지만, CO의 충분량 또는 증가량을 제공함으로써, 발효 동안에 2,3-부탄디올 등의 고에너지 생성물이 생성될 수 있는 것으로 사료된다. 2,3-부탄디올 등의 생성물의 전구체는 NAD(P)H 형태로 과량의 환원력의 미생물 세포를 방출하기 위한 전자 수용체로서 작용하여, 순조로운 NAD(P):NAD(P)H 평형을 회복하는 것으로 사료된다. 또한, 배양액에 의하여 발효되는 탄수화물이 유사한 방식으로 2,3-부탄디올로 전환될 수 있는 것으로 사료된다.

클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)에서, 다음과 같은 유전자가 추정 동정되어 있다. α-아세토락테이트 신타아제 (ALS), α-아세토락테이트 데카르복실라아제 (ALDC) 및 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제 (2,3BDH). 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) (DSMZ에 기탁 번호 19630으로 기탁된 균주)의 추정되는 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제 유전자 (ORF 1283)는 아미노산 상동성 73% (262/357) 및 포지티브 84% (300/357)의 클로스트리듐 노비이 (Clostridium novyi) (NT01CX_0344)의 2,3BDH와 강한 상동성을 나타내었다. ORF 1283은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)의 유전자 YdjL (bdhA)와 유의한 상동성을 나타내었다 (47% 아미노산 동일성, 63% 포지티브 및 3e-89의 E-밸류). LZ1560의 ORF 1283은 2,3BDH라는 추가의 증거는 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cervisiae) (E=2e-53)의 2,3BDH (YAL060W)에 대한 상동성으로부터 기인한다.

하기 이론으로 국한시킬 의도는 없지만, 2,3-부탄디올은 다음과 같이 (아세틸 coA로부터 혐기성 환경에서 생성된 중간체로서) 피루베이트로부터 생성되는 것으로 사료된다.

클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)에서의 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제의 실시간 PCR 연구 결과, 2,3-부탄디올의 상당량이 생성되는 배양액에서 이는 실질적으로 상향 조절됨을 나타내고 있다. 그러므로, 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제는 본 발명의 방법에 따라 상향 조절될 수 있다. 예를 들어, CO가 충분한 수준으로 공급되는 경우에, 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제는 상향 조절된다. 특히, 미생물 배양액에 의한 CO 비흡수율이 0.4 mmol/g/분 이상, 또는 0.5 mmol/g/분 이상, 또는 0.6 mmol/g/분 이상, 또는 0.7 mmol/g/분 이상, 또는 0.8 mmol/g/분 이상, 또는 0.9 mmol/g/분 이상, 또는 1.0 mmol/g/분 이상, 또는 1.2 mmol/g/분 이상, 또는 1.5 mmol/g/분 이상이도록 CO가 공급되는 경우에, 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제는 상향 조절된다. 이와 같이, 본 발명은 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제를 상향 조절함에 의한 기질의 미생물 발효에 의한 2,3-부탄디올 생산 방법을 제공한다.

본 발명자는 탄수화물 기질과, CO를 포함하는 기체상 기질 등의 상이한 기질이 유해 효과없이 2,3-부탄디올의 미생물 생성 동안에 상호 교환될 수 있다는 것을 추가로 증명하였다. 더욱이, 이들은 기질이 대체될 수 있다는 것을, 예컨대, 한 가지 기질이 사용 불가능한 경우에도, 2,3-부탄디올을 계속 생성할 수 있다는 것을 예상하였다.

얻어진 결과에 따르면, 본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 2,3-부탄디올은 탄수화물을 포함하는 기질의 미생물 발효에 의하여 생성된다. 본 발명의 다른 실시 상태에 있어서, 일산화탄소를 포함하는 기질, 좋기로는, 일산화 탄소를 포함하는 기체상 기질은 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)에 의하여 2,3-부탄디올을 포함한 각종 생성물로 전환된다.

본 발명의 다른 실시 상태에 있어서, 탄수화물 (좋기로는 프럭토스)을 포함하는 제1 기질은 발효 반응의 초기 단계에 사용할 수 있고, 이어서 기질이 완전히소모되면, 기질을 CO를 포함하는 제2 기질로 교환할 수 있다. 다시 말하지만, 본 발명자는 탄수화물을 포함하는 제1 기질이 단독 탄소 급원인 초기 단계에서 2,3-부탄디올이 생성되고, CO를 포함하는 기질이 단독 탄소 급원인 그 후의 단계에서도 또 생성될 수 있다는 것을 놀랍게도 증명한 바 있다.

본 발명자는 아세테이트 완충액 및 시트레이트 완충액 등의 대안적인 완충액 용액을 함유하는 배지를 비롯한 여러 가지 조건 하에서 2,3-부탄디올이 생성됨을 증명하였다. 본 발명자는 pH를 조절하지 않고 다양하게 한 조건 하에서도 2,3-부탄디올이 여전히 생성되는 실시 상태도 제출하였다. 원하는 발효를 수행하기에 적합한 배지의 예는 후술하는 실시예 단락에 기재된다.

본 발명자는 이러한 공정에서 생성된 2,3-부탄디올은 이 기술 분야에 공지된 분리 기술을 사용하여 용이하게 회수될 수 있다는 것도 예상하였다. 더욱이, 2,3-부탄디올은 부타디엔, 부타디온, 아세토인, 메틸에틸 케톤 등의 기질로 용이하게 전환될 수 있다는 것도 예상하였다. 이러한 화합물은 상당 비율의 모든 화학 공정 제품을 제조하는 데 사용되는 가치 있는 기제 (base) 물질이다. 그러므로, 본 발명자는 본 발명에 기재된 방법에서 생성된 2,3-부탄디올이 잘 알려져 있는 폭넓은 산업 제품의 제조에 사용될 수 있을 것으로 예상한다.

본 발명은 일반적으로 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 사용하고 그리고/또는 2,3-부탄디올을 생성하는 본 발명의 양호한 실시 상태와 관련되어 본 발명에서 일반적으로 서술한다. 그러나, 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum ) 대신에 대체적인 미생물을 사용할 수 있다는 것도 잘 알 것이다. 마찬가지로, 이 방법은 2,3-부탄디올 대신에 다른 부탄디올을 생성 및 회수하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 별도로 지적하지 않는 한, "2,3-부탄디올"이라는 용어는 "부탄디올"과 치환될 수 있다.

방법

한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명은 미생물 발효에 의한 부탄디올 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명은 CO를 포함하는 기질, 좋기로는 CO를 포함하는 기체상 기질을 혐기성 발효시켜 2,3-부탄디올을 얻는 단계를 포함한다.

본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 이 방법은

(a) CO를 포함하는 기질, 좋기로는, CO를 포함하는 기체상 기질을 제공하는 단계와,

(b) 1종 이상의 미생물 배양액을 함유하는 생물 반응기 내에서 상기 기질을 혐기성 발효시켜, 2,3-부탄디올을 생성시키는 단계

를 포함한다.

다른 실시 상태에 있어서, 본 발명은 발효에 의하여 2,3-부탄디올 생성 효율을 증가시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은

(a) CO를 포함하는 기질을 제공하는 단계와,

를 포함한다.

특정 실시 상태에 있어서, CO를 포함하는 기질은 가령, 0.5 g/L 이상의 발효 배지 또는 1 g/L 이상의 발효 배지, 또는 2 g/L 이상의 발효 배지, 또는 5 g/L 이상의 발효 배지와 같은 충분량의 2,3-부탄디올을 생성하기에 충분한 수준으로 제공된다. 특정 실시 상태에 있어서, CO는 0.5 g/L/1일 또는 1g/L/1일 이상의 속도로 2,3-부탄디올을 생성하기에 충분한 양으로 제공된다. 특정 실시 상태에 있어서, 0.4 mmol/g/분 이상, 또는 0.5 mmol/g/분 이상, 또는 0.6 mmol/g/분 이상, 또는 0.7 mmol/g/분 이상, 또는 0.8 mmol/g/분 이상, 또는 0.9 mmol/g/분 이상, 또는 1.0 mmol/g/분 이상, 또는 1.2 mmol/g/분 이상, 또는 1.5 mmol/g/분 이상의 비흡수율이 유지되도록 CO가 제공된다. 이 기술 분야의 숙련자는 원하는 흡수율이 달성될 수 있도록 CO, 특히 기체상 CO를 공급하는 방법을 잘 알 것이다. 그러나, 예시하자면, 발효 배지 중의 기체 체류를 늘리는 것 등의 인자는 미생물 배양에 의하여 생성물로 전환시키기 위하여 사용 가능한 CO의 양을 늘리게 될 것이다. 기체 체류는 CSTR에서의 진탕을 증가시키는 것 등의 기계적 수단에 의하여 보통 증가된다. 더욱이, 더 빠른 속도로 또는 더 높은 분압으로 CO를 공급하는 것은 발효액 중의 CO의 이용 가능성을 증가시키게 될 것이다.

다른 실시 상태에 있어서, 이 방법은 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )에 의하여 탄수화물을 포함하는 기질을 발효시켜 부탄디올, 좋기로는, 2,3-부탄디올을 생성하는 것을 포함한다.

다른 실시 상태에 있어서, 본 발명의 방법은

특정 실시 상태에 있어서, 제1 기질은 탄수화물이고, 일부 실시 상태에 있어서, 이 기질은 프럭토스이다. 좋기로는, 제2 기질은 CO를 포함하는 기체상 기질이다. 특정 실시 상태에 있어서, (a) 단계와 (b) 단계는 동시에 진행될 수 있다. 또는, (a) 단계는 (b) 단계 전 또는 후에 실질적으로 진행될 수 있다. 좋기로는, 이 방법은 (a)와 (b) 단계간을 교대로 진행할 수 있다.

본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 이 방법은 생성된 2,3-부탄디올을 포획 또는 회수하는 단계를 더 포함한다.

미생물

본 발명의 실시 상태에 있어서, 발효에 사용되는 1종 이상의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )이다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )은 기탁 번호 19630으로 독일 미생물 기탁 센터 [German Resource Centre for Biological Material (DSMZ)]에 수탁되어 있는 균주의 특징을 갖는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )이다. 다른 실시 상태에 있어서, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )은 기탁 번호 DSMZ 10061로서 DSMZ에 수탁되어 있는 균주의 특징을 갖는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)이다.

본 발명의 방법에 사용된 세균의 배양은 혐기성 세균을 사용하여 기질을 배양 및 발효시키기 위하여 이 기술 분야에 공지되어 있는 다수의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예시적인 기술은 아래의 "실시예" 단락에 제공한다. 자세히 설명하자면, 이러한 방법들은 일반적으로 발효를 위한 기체상 기질을 사용하는 다음의 문헌 등[K. T. Klasson, M. D. Ackerson, E. C. Clausen and J. L. Gaddy (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165; K. T. Klasson, M. D. Ackerson, E. C. Clausen and J. L. Gaddy (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614; K. T. Klasson, M. D. Ackerson, E. C. Clausen and J. L. Gaddy (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; J. L. Vega, G. M. Antorrena, E. C. Clausen and J. L. Gaddy (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; J. L. Vega, E. C. Clausen and J. L. Gaddy (1989). Study of gaseous substrate fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; and, J. L. Vega, E. C. Clausen and J. L. Gaddy (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160]에 개괄적으로 기재되어 있다. 탄수화물을 포함하는 기질 상에서 세균을 배양하기 위한 방법도 이 기술 분야에 잘 알려져 있다.

기질

본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 2,3-부탄디올은 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )을 사용하여 탄수화물을 포함하는 기질의 미생물 발효에 의하여 생성된다. 이 기술 분야에서는 발효에 적합한 탄수화물의 예가 여러 가지 알려져 있고, 탄수화물 기질을 발효시키기 위하여 사용되는 방법의 유형의 여러 가지 예가 있다는 것을 잘 알 것이다. 예컨대, 적당한 기질로는 글루코스 및 프럭토스 등의 단당류, 수크로스 또는 락토스 등의 올리고당류, 셀룰로스 또는 녹말 등의 다당류가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 탄수화물 기질 (및 이의 혼합물)이 본 발명의 방법에 적합할 것으로 예상되지만, 양호한 탄수화물 기질은 프럭토스 및 수크로스 (및 이들의 혼합물)이다.

이 기술 분야의 숙련자는 예컨대, US20070031918에 기재된 바와 같이, 발효 가능한 당은 전처리 및 당화 과정에 의하여 셀룰로스 및 리그노셀룰로스 바이오매스로부터 얻을 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 바이오매스란 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 재료를 말하는 것이고, 셀룰로스와, 임의로는 추가로 헤미셀룰로스, 리그닌, 녹말, 올리고당 및/또는 단당류를 포함하는 재료를 포함한다. 바이오매스로는, 바이오에너지 곡물, 잔여 농산물, 지자체의 고형 폐기물, 산업용 고체 페기물, 종이 제조로부터 나오는 슬러지, 야드 폐기물, 목재 및, 임업 폐기물이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 본 발명의 예시적인 실시 상태에 있어서, 상업적으로 입수 가능한 프럭토스는 발효를 위한 탄소 및 에너지 급원으로서 사용된다.

특정 실시 상태에 있어서, 일산화탄소를 포함하는 기질, 좋기로는, 일산화탄소를 포함하는 기체상 기질이 본 발명의 방법에 사용된다. 기체상 기질은 산업 공정의 부산물로서 얻어진 폐기물이거나, 또는 엔진 연소 (예컨대, 자동차) 배기 가스 등의 다른 급원으로부터의 폐기물일 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 산업 공정은 제강 공정 등의 철 금속 생성물 제조, 비철 생성물 제조, 석유 제련 공정, 석탄의 기체화, 전력 생산, 카본 블랙 제조, 암모니아 제조, 메탄올 제조 및 코크 제조로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 이들 실시 상태에 있어서, CO를 함유하는 기질은 대기로 방출되기 전에 편리한 방법을 사용하여 산업 공정으로부터 포획할 수 있다. CO를 함유하는 기체상 기질의 조성에 따라서, 이는 발효에 도입하기 전에 먼지 입자 등의 임의의 바람직하지 않은 불순물을 제거하기 위하여 전처리하는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대, 기체상 기질을 기지의 방법으로 여과 또는 스크러빙할 수 있다.

본 발명의 다른 실시 상태에 있어서, CO를 함유하는 기체상 기질은 바이오매스의 기체화로부터 유래할 수도 있다. 기체화 방법은 공기 또는 산소의 제한된 공급량 하에서 바이오매스를 불완전 산화시키는 것을 포함한다. 생성된 기체는 보통 주로 CO와 H₂를 함유하고, 미량의 CO₂, 메탄, 에틸렌 및 에탄을 함유한다. 예컨대, 사탕 수수로부터 설탕, 또는 옥수수 또는 곡물로부터 녹말 등의 음식물의 추출 및 가공 중에 얻는 바이오매스 부산물, 또는 임업에 의하여 생성된 음식물이 아닌 바이오매스를 기체화하여, 본 발명에 사용하기에 적합한 CO를 함유하는 기체를 생성하는 것이 가능하다.

CO를 함유하는 기질은 약 20 내지 약 100 부피%, 40 내지 95 부피%, 40 내지 60 부피%, 45 내지 55 부피%의 CO 등과 같이, CO를 높은 비율로 함유한다. 특정 실시 상태에 있어서, 이 기질은 약 25 부피%, 또는 약 30 부피%, 약 35 부피%, 또는 약 40 부피%, 또는 약 45 부피%, 또는 약 50 부피%, 또는 약 55 부피%, 또는 약 60% 부피%의 CO를 포함한다. H₂와 CO₂가 모두 존재하는 경우, 더 낮은 농도, 가령, 6%의 CO를 함유하는 기질도 적합할 수 있다.

특정 실시 상태에 있어서, CO는 2,3-부탄디올의 생성이 발생하도록 하는 충분한 수준으로 공급된다. 특정 실시 상태에 있어서, CO는 0.4 mmol/g/분 이상, 또는 0.5 mmol/g/분 이상, 또는 0.6 mmol/g/분 이상, 또는 0.7 mmol/g/분 이상, 또는 0.8 mmol/g/분 이상, 또는 0.9 mmol/g/분 이상, 또는 1.0 mmol/g/분 이상, 또는 1.2 mmol/g/분 이상, 또는 1.5 mmol/g/분 이상의 CO 비흡수율이 유지되도록 제공된다. 이 기술 분야의 숙련자는 필요한 흡수 속도가 달성될 수 있도록 CO, 특히 기체상 CO를 공급하는 방법을 잘 알고 있다. 그러나, 예시적으로, 발효 매질 중 기체 체류를 증가시키는 등의 인자는 미생물 배양액에 의한 생성물로의 전환에 사용 가능한 CO의 양을 증가시키게 될 것이다. 이 기술 분야의 숙련자는 기체 체류를 늘리는 방법을 잘 알고 있다. 그러나, 비제한적인 방식으로 설명하자면, 기체 체류는 보통 CSTR에서 진탕시키는 것을 늘리는 등의 기계적 수단에 의하여 증가된다. 더욱이, 더욱 빠른 속도로 또는 더욱 높은 분압으로 CO를 공급하는 것은 발효액 중의 CO의 사용 가능성을 증가시키게 된다.

기체상 기질이 수소를 반드시 함유하여야 하는 것은 아니지만, 수소의 존재는 2,3-부탄디올의 생성에 유해한 것으로 간주되는 것은 아니다. 기체상 기질은 예컨대, 약 1 내지 약 80 부피%, 또는 약 1 내지 약 30 부피% 등의 일부 CO₂를 함유할 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 이는 약 5 내지 약 10 부피%를 함유한다. 다른 실시 상태에 있어서, 기체상 기질은 약 20 부피%의 CO₂를 함유한다.

보통은, 일산화탄소는 기체 상태로 발효 반응에 첨가된다. 그러나, 본 발명은 이러한 상태로 기질을 첨가하는 것으로 한정되는 것으로 간주되어서는 아니된다. 예컨대, 일산화탄소는 액체 상태로 제공될 수도 있다. 예를 들어, 일산화탄소를 함유하는 기체로 액체를 포화시키고, 이에 이어 이 액체를 생물 반응기에 첨가할 수 있다. 이는 표준 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 미세 기포 분산 생성기 (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October , 2002)를 사용할 수 있다.

본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명자는 제1 기질 및 제2 기질의 발효에 의하여 2,3-부탄디올이 생성될 수 있음을 증명한 바 있다. 본 발명의 한 가지 특정 실시 상태에 있어서, 2,3-부탄디올은 예컨대, 프럭토스 등의 탄수화물인 제1 기질과, 좋기로는 CO를 포함하는 기질인 제2 기질이 제공될 때 생성된다.

추가의 실시 상태에 있어서, 본 발명자는 2,3-부탄디올은 제1 기질에 의하여 생성되고, 완전히 소모된 경우, 제1 기질은 제2 기질로 치환될 수 있으며, 2,3-부탄디올은 계속 생성된다는 것을 증명하였다. 특정 실시 상태에 있어서, 제1 기질은 프럭토스이고 프럭토스가 완전히 소모되었을 때, CO를 포함하는 기질이 제공될 수 있다. 본 발명자는 놀랍게도 2,3-부탄디올이 계속 생성될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 필요한 경우 제1 기질 및 제2 기질이 서로 대체될 수 있으리라는 것을 추가로 예상하였다. 예를 들어, 제1 기질이 사용 가능하지 않은 경우에, 제1 기질의 사용 가능성이 개선될 때까지 대체 기질을 사용할 수 있다.

배지

세균 성장 및 기질에서 부탄디올로의 발효가 일어나도록 하기 위하여, 기질 외에도, 적당한 영양 배지가 생물 반응기에 공급될 필요가 있다는 것을 잘 알 것이다. 영양 배지는 사용된 미생물의 성장을 허용하기에 충분한 비타민 및 무기질 등의 성분을 함유할 것이다. 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 성장에 적합한 혐기성 배지는 이 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예컨대, 문헌 [Abrini et al (Clostridium autoethanogenum, sp. Nov., An Anaerobic Bacterium That Produces Ethanol From Carbon Monoxide; Arch . Microbiol., 161: 345-351 (1994))]에 기재된 것이 있다. 이하에 제공되는 "실시예" 란에서 적당한 배지의 추가의 예가 제공된다.

발효 조건

발효는 기질에서 부탄디올로의 발효가 발생하도록 하는 적당한 조건 하에 수행하여야 한다. 고려해야 할 반응 조건으로는 온도, 배지 유속, pH, 배지 산화 환원 전위, 진탕 속도 (연속 교반식 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종 수준, 최대 기질 농도 및 기질 양이 바닥나지 않도록 하기 위하여 반응기에 기질을 도입하는 속도와, 생성물 억제를 피하기 위한 최대 생성물 농도가 있다. CO를 포함하는 기질의 혐기성 발효에 적합한 발효 조건의 예는 WO2007/117157, WO2008/115080, WO2009/022925 및 WO2009/064200에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본 발명에 참조로서 포함된다. 여기에 보고되어 있는 발효 조건은 본 발명의 방법에 맞게 용이하게 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

본 발명자는 pH가 조절되지 않는 한 가지 실시 상태에 있어서, 2,3-부탄디올 생성에 대한 유해한 효과가 나타나지 않음을 증명하였다.

생물 반응기

발효 반응은 전술한 바와 같은 임의의 적당한 생물 반응기 중에서 수행할 수 있다. 본 발명의 일부 실시 상태에 있어서, 이 생물 반응기는 제1 반응기, 즉 미생물이 배양되는 성장용 반응기와, 제2 반응기, 즉 성장용 반응기로부터의 발효액이 공급되어 발효 생성물 (예컨대, 2,3-부탄디올) 대부분이 생성되는 발효용 반응기를 포함할 수 있다.

생성물 회수

본 발명의 방법에 따른 발효법은 희망하는 생성물 (가령 부탄디올) 및/또는 1종 이상의 부산물 (가령 에탄올, 아세테이트 및 부티레이트) 뿐만 아니라, 세균 세포도 포함하는 영양 배지를 포함하는 발효액을 생성하게 될 것이다. 양호한 실시 상태에 있어서, 발효 생성물은 2,3-부탄디올을 포함한다.

2,3-부탄디올 또는 2,3-부탄디올을 함유하는 혼합된 알콜류 및 1종 이상의 다른 알콜은 이 기술 분야에 공지되어 있는 방법, 가령 분별 증류법 또는 증발법 및 추출 발효법 등의 방법에 의하여 발효액으로부터 회수될 수 있다. 아세테이트 및 부티레이트를 비롯한 산 등의 부산물은 이 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 발효액으로부터 회수될 수 있다. 예컨대, 활성화된 차콜 필터 또는 전기 투석을 포함한 흡착 시스템을 사용할 수 있다.

본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 2,3-부탄디올 및 부산물은 생물 반응기에서 발효액의 일부를 연속 제거하는 단계와, 발효액으로부터 미생물 세포를 분리하는 단계 (편리하게는 여과법으로), 그리고 2,3-부탄디올을 회수하는 단계 및 발효액으로부터 알콜과 산을 회수하는 임의의 단계에 의하여 발효액으로부터 회수된다. 알콜은 예컨대 증류법으로 편리하게 회수될 수 있고, 산은 예컨대 활성화된 숯에 흡착시킴으로써 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포는 좋기로는 발효 생물 반응기로 돌아간다. 알콜 및 산 이후의 세포를 함유하지 않은 투과 잔류물도 역시 좋기로는 발효 생물 반응기에 되돌아 간다. 추가 영양분 (가령, 비타민 B)이 세포 무함유 투과물에 첨가되어, 생물 반응기에 되돌아 가기 전에 영양 배지에 보충될 수 있다.

또한, 발효액의 pH가 2,3-부탄디올 및/또는 부산물의 회수 동안에 조정된 경우, pH는 생물 반응기에 되돌아 가기 전에 발효용 생물 반응기 중의 발효액의 pH와 유사하게 재조정되어야 한다.

이하, 본 발명을 비제한적인 실시예를 참고로 하여 더욱 자세히 설명하고자 한다.

실시예

물질 및 방법

Na ₂ S _x 의 제조

500 ml 들이 플라스크에 Na₂S (93.7g, 0.39mol) 및 H₂O 200 ml를 넣었다. 이 용액을 염이 용해될 때까지 교반하고, 황 (25g, 0.1mol)을 일정한 N₂류 하에 첨가하였다. 실온에서 2시간 교반한 다음에, 이제 붉은 갈색을 띤 맑은 액체인 "Na ₂ S _x " 용액 ([Na]에 관하여 약 4M 및 황에 관하여 약 5M)을 알루미늄 호일로 싼 N₂로 세정한 세럼 버틀에 전달하였다.

Cr ( II ) 용액의 제조

1 리터 들이 삼목 플라스크에 기체 타이트 유입구 및 배출구를 끼워, 불활성 기체 하에 작업하고, 그에 이어 희망하는 생성물이 추후에 적당한 보관 플라스크로 들어갈 수 있도록 하였다. 플라스크에 CrCl₃.6H₂0 (40g, 0.15 mol), 아연 입자 [20 mesh] (18.3g, 0.28 mol), 수은 (13.55g, 1mL, 0.0676 mol) 및 증류수 500 mL를 채웠다. N₂를 1시간 동안 흘려보낸 후, 이 혼합물을 약 80℃로 데워 반응을 개시시켰다. 일정한 N₂류 하에 2시간 교반한 후, 이 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 48시간 더 여속 교반하였는데, 이 시간 동안에 반응 혼합물이 진한 청색 용액으로 변하였다. 이 용액을 N₂로 세정한 세럼 보틀에 넣고 나중에 사용하도록 냉장고에 보관하였다.

세균:

사용된 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )은 독일 미생물 보관 센터 (DSMZ)에 기탁 번호 19630으로 수탁된 것이었다.

샘플링 및 분석 절차:

발효 과정에 간헐적으로 발효 반응기 (예컨대, CSTR 또는 세럼 버틀)로부터 배지 샘플을 취하였다. 각 시간 대에 배지를 샘플로 취하고 반응기로부터 기체가 유입되거나 유출되지 않도록 주의를 기울였다.

HPLC :

HPLC System Agilent 1100 Series. 이동상: 0.0025N 황산. 유속 및 압력: 0.800 mL/분. 컬럼: Alltech IOA; Catalog # 9648, 150 x 6.5 mm, 입자 크기 5 ㎛. 컬럼 온도: 60℃. 검출기: 굴절률. 검출기 온도: 45℃.

샘플 준비법:

샘플 400㎕와, 0.15M ZnSO₄ 50 ㎕, 0.15M Ba(OH)₂ 50 ㎕를 에펜도르프 튜브에 채워 넣었다. 이 튜브를 10분간 12,000 rpm으로, 4℃에서 원심 분리하였다. 상청액 200 ㎕를 HPLC 바이얼에 옮기고, 5 ㎕를 HPLC 장치에 주입하였다.

헤드스페이스 분석:

2개의 설치된 채널이 장착된 바리안 CP-4900 마이크로 GC [Varian CP-4900 micro GC]에서 측정을 수행하였다. 채널 1은 70℃, 200 kPa 아르곤 및 4.2초의 백플러쉬 타임 (backflush time)에서 작동하는 10m 몰-시브 컬럼 (10m Mol-sieve column)이었다. 채널 2는 90℃, 150 kPa 헬륨 및 백플러쉬 없이 작동하는 10m PPQ 컬럼이었다. 양쪽 채널에 대한 인젝터 온도는 70℃였다. 런타임은 120초로 맞추었지만, 모든 해당 피크는 100초 전에 보통 용리된다. CO 비흡수율을 세포의 g당 (건조 중량; 아래 참조) CO 소모를 계산함으로써 측정하였다.

세포 밀도:

세포 밀도는 발효액 중 규정된 분취액에서 박테리아 세포를 계수함으로써 측정하였다. 또는, 시료의 흡광도를 600 nm에서 측정하고 (스펙트로포토미터), 공개된 절차에 따라 계산함으로써 건조 중량을 측정하였다.

금속 설파이드 용액 1:

용액 A 약 950 ml를 1 L 들이 발효기에 전달하고 질소를 충전하였다. H₃PO₄ (85% 용액, 1.5mL)을 첨가하고, pH를 진한 (NH₄OH(aq) 를 사용하여 5.3으로 조정하였다. 레사주린 (Resazurin) (2g/L 용액 1 ml)를 첨가하고, 이 용액에 N₂를 충전하였다. 용액의 ORP가 약 -150 mV로 감소될 때까지 크로뮴 (II) 클로라이드를 첨가하였다. 소듐 폴리설파이드 (4.3M짜리 1.44 mL 또는 6M 짜리 1 mL)를 첨가하기 전에, 10 x 용액 C를 첨가하였고, 용액에 N₂를 충전하였다.

실시예 1A: 발효에 의한 2,3- 부탄디올의 생성

클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 사용하여 기질을 발효법으로 전환시키는 것을 2주간에 걸쳐 주기적으로 모니터링하면서 CSTR 반응기에서 수행하였다. CSTR 실험에 사용되는 배지를 표 E에 제시된 성분에 따라 제조하였다. 포스페이트 염 혼합물은 0.65 mM Na₂HPO₄와 15.3 mM NaH₂PO₄로 이루어진다. 포스포르산, 암모늄 염 및 시스테인-하이드로클로라이드 등의 다른 모든 성분을 물 800 ml에 혼합하고, 완충제 염을 용액에 첨가하였다. 이러한 방식으로 진행하는 것은, 배지 성분의 침전을 피하면서 pH를 약 6.5 이상으로 증가시키도록 해 준다. 이 용액을 1L로 희석시키고 비등할 때까지 가열하여 혐기성으로 만든 다음에, 일정하게 N₂ 기체를 공급하며 실온으로 냉각시켰다. 일단 냉각시키면, 이 용액의 최종 pH는 5.3으로 조정하였고, 비타민 B를 첨가하였다. 혐기성 조건은 실험 내내 유지하였다. 탄수화물 (5 g/L 프럭토스)을 기본 배지 조성에 첨가하였다. 배지 용액을 발효기에 도입하고, 임의로는 실험 초기로부터, 또는 이미 정해진 간격 후 각 CO를 함유하는 기체를 공급하였다. 이 실험 동안에, pH는 NaOH 수용액을 첨가하여 5.5로 유지하도록 조정하였다. 활발히 성장하고 있는 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) 배양액을 5 %(v/v)의 수준으로 반응기에 접종하였다. 반응기의 온도를 37℃로 유지하고, 진탕 속도를 400 rpm으로 유지하였다.

결과:

초기에, 발효액은 기질로서 프럭토스를 함유하였고, 이는 아세트산, 에탄올 및 2,3-부탄디올을 생성시켰다. 시간의 경과 후, 프럭토스가 소모되고 CO를 포함하는 기체류 (CO 95%, CO₂ 5%)를 배지에 충전하였다. 배지의 pH는 5.5로 유지하였다 (표 1). 탄수화물이 소모되는 경우에도 전술한 생성물은 농도가 증가되었음이 주목되는데, 이는 2,3-부탄디올을 포함한 생성물을 생성하는 데 CO가 사용되었음을 명백히 증명하는 것이다. 아래 표 1은 CSTR 반응기 중에서 시간 경과에 따라 2,3-부탄디올, 에탄올 및 아세테이트 (g/L 농도) 생성을 관찰한 결과를 나타낸다.

실시예 1B: 발효에 의한 2,3- 부탄디올의 생성

추가의 실험에 있어서, 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 사용하여 기질을 발효법으로 전환시키는 것을 10일간에 걸쳐 주기적으로 모니터링하면서 CSTR 반응기에서 수행하였다. 이 예에서, 발효기 및 배지는 실시예 1A에 따라 제조하였지만, 기질에 단독으로 유사 제강 공장 기체 (CO 70%, H₂ 1%, N₂ 14%, CO₂ 15%)를 연속 공급하고, 배지의 pH를 5.5로 일정하게 유지하였다 (표 2). 기질의 전환 결과, 아세트산, 에탄올 및 2,3-부탄디올을 생성하였는데, 이는 발효 시작시 탄수화물 기질의 부재시에도 아세트산 에탄올 및 부탄디올이 생성될 수 있음을 증명하는 것이다. 아래 표 2는 CSTR 뱃치 반응기에서 시간에 경과에 따른 2,3-부탄디올, 에탄올 및 아세테이트 (g/L 농도)의 생성을 관찰한 것을 나타낸다.

실시예 2: 발효에 의한 2,3- 부탄디올의 생성

추가의 실험에 있어서, 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 사용하여 기질을 발효법으로 전환시키는 것을 3일간에 걸쳐 주기적으로 모니터링하면서 CSTR 반응기에서 수행하였다. 이 예에서, 발효기 및 배지는 실시예 1A에 따라 제조하였지만, 기질에는 유사 제강 공장 기체 (CO 70%, H₂ 1%, N₂14%, CO₂ 15%) 및 프럭토스 (10 g/L)를 연속 공급하고, 배지의 pH를 5.5로 일정하게 유지하였다 (표 3). 기질의 전환 결과, 아세트산, 에탄올 및 2,3-부탄디올을 생성하였다. 아래 표 3은 CSTR 뱃치 반응기에서 시간에 경과에 따른 2,3-부탄디올, 에탄올 및 아세테이트 (g/L 농도)의 생성을 관찰한 것을 나타낸다.

아세테이트, 에탄올 및 2,3-부탄디올의 최종 농도를 각 실험의 말기에 실시예 1A, 1B 및 2에 개괄된 발효 실험과도 비교하였다 (주: 이들 결과는 표 1 내지 3에 있는 측정된 최종 농도에 관한 것이고, 표 4에 비교를 위하여 요약하였다). 아래 표 4는 각 실험의 종결시에 측정된 CSTR 반응기 중에서 대체적인 기질을 사용한 2,3-부탄디올 생성의 예를 나타낸다. 결과는 g/L 단위로 나타낸다.

실시예 3: 발효에 의한 2,3- 부탄디올의 생성

배지 조건이 어떻게 2,3-부탄디올의 생성에 영향을 미칠 수 있는지를 확실히 하기 위하여, 선택된 완충액을 함유하는 배지를 포함하는 세럼 버틀을 준비하여 실험 말미에 발효 생성물을 분석하였다 (표 5). 전술한 배지 (표 E) 50 ml를 각각 함유하고, 임의로는 아세테이트 완충액 (0.02M) 또는 시트레이트 완충액 (0.02M)으로 완충되고, pH 5.3으로 조정되는 234 ml 들이의 밀봉된 세럼 버틀에서 인큐베이션을 수행하였다. 각 세럼 버틀의 184 ml 헤드스페이스를 처음에는 N₂로 그 다음에는 CO 95%, CO₂ 5%, 또는 CO 70%, CO₂ 15%, N₂ 14%, H₂ 1%로 30 psi의 과압으로 채웠다. 각 버틀에 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) 배양액 2 ml를 접종하였다. 진탕 인큐베이터를 사용하였고, 온도를 37℃로 유지하였다.

다시 한번 말하지만, 2,3-부탄디올은 이 실험에서 사용된 완충액과 관계 없이 생성된다는 것이 명백하다. 더욱이, 세럼 버틀은 pH를 조정하지 않았기 때문에, 생성물은 pH 조절을 제한하여 (또는 없이도) 생성될 수 있는 것으로 보인다. 아래 표 5는 각종 배지에서 2,3-부탄디올의 생성의 예를 나타내고 있다. 세럼 버틀 중의 배지를 활발한 성장 후에 분석하였는데, 즉, 몇일 후 (4 내지 7일 후) 세포 중량의 증가를 기록하였다. 결과는 g/L 단위로 나타낸다.

실시예 4: CSTR 에서의 뱃치 발효

용액 A 약 1.3 L를 2L 들이 발효기에 넣고 여기에 질소를 충전하였다. 레사주린 (2 g/L 용액 1.35 ml)을 첨가하였다. H₃PO₄ (85% 용액, 2.025 mL)을 첨가하고, 진한 NH₄OH(aq)를 사용하여 pH를 5.3으로 조정하였다. 용액의 ORP가 약 -150 mV로 감소될 때까지 크로뮴 (II) 클로라이드를 첨가하였다. 소듐 폴리설파이드 (4.3M짜리 용액 6.07 mL)를 첨가하고 진한 HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 이 용액에 1시간 동안 N₂를 충전하고, 금속 설파이드 용액 1 (150ml) 및 용액 B (15 ml)를 첨가하였다. 이 용액에 N₂를 충전한 다음에, CO를 함유하는 기체 (H₂ 3%; N₂ 30%; CO 47%; CO₂ 20%)를 첨가하고, 이에 이어 약 5% (v/v)의 수준으로 활발하게 성장하고 있는 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum ) 배양액을 접종하였다. 기체 유속은 높은 CO 비흡수율을 유지하기 위하여 CO 중에서 미생물 배양이 제한되지 않도록 보장하도록 조정하였다. 발효 결과를 표 6에 제시한다. 아래 표 6은 CO 비흡수율을 변화시킨 뱃치 배양액 중의 2,3-부탄디올 생성율을 나타낸다.

7.5일간 축적된 총 2,3-부탄디올은 약 7.5 g/L였다. 낮은 CO 비흡수율에서 2,3-부탄디올이 낮은 수준으로 생성된다는 것을 알 수 있다. 그러나, CO 흡수 속도가 0.4 mmol/g/분 이상으로 유지되도록 공급되는 경우에 2,3-부탄디올 생성율은 상당히 증가한다. 이러한 경우, CO 흡수율은 몇 일 동안 평균 0.8 mmol/g/분으로 유지되고, 1,3-부탄디올은 1 g/L을 초과하는 속도로 생성된다.

실시예 5: CSTR 중의 뱃치 발효

용액 A 약 1.3 L를 2L 들이 발효기에 넣고 질소를 충전하였다. H₃PO₄ (85% 용액, 2.025 mL, 30 mM)를 첨가하고, 진한 NH₄OH(aq)를 사용하여 pH를 5.3으로 조정하였다. 용액 B (13.5ml)를 첨가하고, 이 용액에 N₂를 충전하였다. 용액의 ORP가 약 -150 mV로 감소될 때까지 크로뮴 (II) 클로라이드를 첨가하였다. 레사주린 (2 g/L 용액의 1.35 mL)을 첨가하였다. 소듐 폴리설파이드 (6 M 용액 2.85 ml)를 첨가하고, 이 용액에 N₂를 12시간 동안 충전한 다음에, CO를 함유하는 기체 (H₂ 1%; N₂ 14%; CO 70%; CO₂ 15%)로 바꾸었다. 진한 HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조정하고, 금속 설파이드 용액 1 (150 ml)을 첨가하였다. 이 용액에 CO를 함유하는 기체를 30분 더 충전한 다음에, 이에 이어 약 5% (v/v)의 수준으로 활발하게 성장하고 있는 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum ) 배양액을 접종하였다. 기체 유속은 높은 CO 비흡수율을 유지하기 위하여 CO 중에서 미생물 배양이 제한되지 않도록 보장하도록 조정하였다. 발효 결과를 표 7에 제시한다. 아래 표 7은 CO 비흡수율을 변화시킨 뱃치 배양액 중의 2,3-부탄디올 생성율을 나타낸다.

약 6일 후 총 2,3-부탄디올은 5 g/L였다. 다시 한번, 상승된 CO 비흡수율은 0.5 g/L/일 이상의 유의하게 더 높은 2,3-부탄디올 생성율을 초래하였다.

실시예 6: CSTR 중의 뱃치 발효

용액 A 약 1.3 L를 1.5 L 들이 발효기에 넣고 질소를 충전하였다. H₃PO₄ (85% 용액, 2.25mL)를 첨가하고, 진한 NH₄OH(aq)를 사용하여 pH를 5.3으로 조정하였다. 용액 B (15ml)를 첨가하고, 이 용액에 N₂를 충전하였다. 용액의 ORP가 약 -150 mV로 감소될 때까지 크로뮴 (II) 클로라이드를 첨가하였다. 레사주린 (2 g/L 용액의 1.5 mL)을 첨가하였다. 소듐 폴리설파이드 (3 M 용액 1.5 ml)를 첨가하고, 이 용액에 N₂를 1시간 동안 충전하였다. FeCl₂ (3.75mL), CoCl₂ (1.875mL), NiCl₂ (1.875mL), H₃BO₃ (0.375ml), Na₂MoO₄ (0.375ml), MnCl₂ (0.375ml), Na₂WO₄ (0.375ml) 및 ZnCl₂ (0.1875ml)의 0.1M 용액을 첨가하고, 이 용액에 CO를 함유하는 기체 (H₂ 50%; CO 32%; CO₂ 4%; CH₄ 32%)를 충전하였다. 진한 HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조정하고, 용액 C (150 ml)를 첨가하였다. 이 용액에 CO를 함유하는 기체를 30분 더 충전한 다음에, 이에 이어 약 5% (v/v)의 수준으로 활발하게 성장하고 있는 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum ) 배양액을 접종하였다. 기체 유속은 높은 CO 비흡수율을 유지하기 위하여 CO 중에서 미생물 배양이 제한되지 않도록 보장하도록 조정하였다. 발효 결과를 표 8에 제시한다. 아래 표 8은 CO 비흡수율을 변화시킨 뱃치 배양액 중의 2,3-부탄디올 생성율을 나타낸다.

4일 후 총 2,3-부탄디올 농도는 약 3 g/L였다. 이 속도는 전술한 발효법 (실시예 4 및 5) 이하였지만, 기질류는 수소 다량을 포함한다. 결과는, CO/H₂ 혼합 기질을 사용하였을 때 2,3-부탄디올이 생성되었음을 나타내었다.

실시예 7: 연속 교반식 탱크 반응기 내에서의 연속 발효

배지를 다음과 같이 pH 5.5로 제조하였다. 시스테인-HCl을 제외한 용액 D 중의 모든 성분을 증류수 400 ml 중에 혼합하였다. 이 용액을 비등할 때까지 가열하여 혐기성으로 만들고, CO 95%, CO₂ 기체 5%의 일정류 하에 실온으로 냉각시켰다. 일단 냉각되면, 시스테인-HCl을 첨가하고, 용액의 pH를 5.5로 조정한 다음에, 부피를 1000 ml로 되게 하였다. 혐기성 조건은 실험 내내 유지하였다.

5 리터 들이 생물 반응기에 전술한 바와 같이 제조된 LM33 배지 4.9 L를 넣었다. 이 기체를 대기압에서 CO를 함유하는 기체 (H₂ 1%; N₂ 14%; CO 70%; CO₂ 15%)로 교환한 다음에, 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum ) 배양액 100 ml를 접종하였다. 생물 반응기를 배양의 개시시에 200 rpm으로 교반하며 37℃로 유지하였다. 성장기에는, 진탕을 400 rpm으로 증가시켰다. pH를 5.5로 조정하고, 5M NaOH 자동 첨가를 지속하였다. 신선한 혐기성 배지를 생물 반응기에 연속 첨가하여, 생물 반응기 중의 규정된 바이오매스 및 아세테이트 수준을 유지하였다. 2,3-부탄디올 생성율은 표 9에 요약한다. 표 9는 연속 배양 중의 2,3-부탄디올 생성율을 나타낸다.

연속 작동의 처음 89일 동안에, 발효기를 CO 제한 조건 하에 작동시켜, 최소한의 2,3-부탄디올을 생산시켰다. 그러나, 약 88일째에, CO 비흡수율이 증가될 수 있도록 기체 유속을 증가시켰다. 이 단계에서, 2,3-부탄디올 생성율은 1.2 g/L/일 이상으로 유의하게 증가되었다. 약 92일째에, 기체 유속은, 배양액의 비흡수율이 약 0.4 mmol/g/분으로 감소되어, 2,3-부탄디올 생성율도 역시 하강하도록 감소시켰다. 그러나, 약 0.4 mmol/g/분의 평균 CO 비흡수율에서도, 2,3-부탄디올 생성율은 0.5 g/L/일 이상으로 유지되었다.

실시예 8: CSTR 중의 뱃치 발효

용액 A 약 1.3 L를 2 L 들이 발효기에 넣고 질소를 충전하였다. H₃PO₄ (85% 용액, 1.5ml)를 첨가하고, 진한 NH₄OH(aq)를 사용하여 pH를 5.3으로 조정하였다. 용액 B (15ml)를 첨가하고, 이 용액에 N₂를 충전하였다. 용액의 ORP가 약 -150 mV로 감소될 때까지 크로뮴 (II) 클로라이드를 첨가하였다. 소듐 폴리설파이드 (3 M 용액 1 ml)를 첨가하고, 이 용액에 N₂를 12시간 동안 충전하였다. FeCl₂ (3.75mL), CoCl₂ (1.875mL), NiCl₂ (1.875mL), H₃BO₃ (0.375ml), Na₂MoO₄ (0.375ml), MnCl₂ (0.375ml), Na₂WO₄ (0.375ml) 및 ZnCl₂ (0.2ml)의 0.1M 용액을 첨가하고, 이 용액에 CO를 함유하는 기체 (H₂ 1%; N₂ 14%; CO 70%; CO₂ 15%)를 충전하였다.

레사주린 (2 g/L 용액 1 mL)을 첨가하였다. 진한 HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조정하고, 이 용액에 CO를 함유하는 기체를 30분 더 충전한 다음에, 이에 이어 약 5% (v/v)의 수준으로 활발하게 성장하고 있는 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) 배양액을 접종하였다. 표 10은 약 2주 작동 후 발효기 중의 축적된 2,3-부탄디올 생성물을 나타낸다. CO 비흡수율은 배양액의 생존성 (viability)에 대하여 보정하였다. 배양액 생존성은 본 발명에 참조로서 포함되는 WO 2009/022925에 기재되어 있는 방법을 사용하여 측정하였다. 표 10은 뱃치 발효 14일 후 축적된 2,3-부탄디올을 나타낸다.

13일 내지 14일 기간 동안 24시간에 걸쳐, CO 비흡수율은 약 0.5 mmol/g/분으로 유지되었고, 2,3-부탄디올 생성율은 0.6g/L/일이었다.

실시예 9: LZ1560 에서 2,3- 부탄디올 생성의 유전자 조절

2,3-부탄디올 생산 동안에 유전자 발현을 측정하기 위하여 세 가지 발효기로부터 시료를 취하였다. 13일째 실시예 8에 기재된 뱃치 발효법으로부터 한 가지 시료를 취하였는데, 여기에서는 에탄올 및 2,3-부탄디올을 포함하는 생성물이 생성되었다. 이 시료는 후술하는 결과에서 R12로 지정한다. 두 번째 시료는 에탄올 및 2,3-부탄디올을 모두 생성하는 뱃치 발효로부터 취하였다. 이 시료는 후술하는 결과에서 R11로 지정한다. 세번째 시료 (R2)는 1-89일째 실시예 7과 유사한 조건 하에 작동하는 연속 발효로부터 취하였다. 미생물 발효에서는 CO를 제한하였고, 발효액은 약 13 g/L의 안정한 아세테이트 농도와, 1 g/L 이하의 에탄올 농도와, 상당량의 2,3-부탄디올의 농도를 가졌다. 실시간 PCR을 사용하여 유전자가 R2에 비하여 상향 조절되었는지 또는 하향 조절되었는지를 측정하였다.

RNA 추출 및 cDNA 합성 절차:

키트 [Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit (Biorad)]를 사용하여 약 2.5 x 10⁹ 개 세균 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. 컬럼 위의 DNase를 DNAse 세트 [RNase-free DNase set (Biorad)]를 사용하여 분해하였다. 총 RNA를 분광기를 사용하여 정량하고, 이의 순도 (A_260/280 비로 측정)를 키트 [iScript Select cDNA synthesis kit (Biorad)]를 사용하여 cDNA를 합성하기 전에 측정하였다.

실시간 PCR 절차:

란자테크사 소유의 게놈 서열에 기초하여 프리웨어 Primer3을 사용하여 실시간 PCR을 위한 프라이머를 디자인하였다. 믹스 [2x SYBR Green PCR Master Mix (Biorad)] 12.5 ㎕, 1 μM 정방향 및 역방향 프라이머 각각 1.5 ㎕, 10X 희석된 cDNA 주형 5 ㎕와 증류수를 총 용적 25 ㎕가 되도록 함유하는 실시간 PCR 반응 혼합물을 만들었다. 이 혼합물을 3분간 95℃에서 가열한 다음에, 40회 사이클 (15초간 95℃에서, 15초간 55℃에서, 30초간 72℃에서) 돌렸다. 프라이머 이량체화 또는 다른 증폭된 인공물 검출을 위하여, 용융점 곡선 분석을 실시간 PCR 완료 직후 수행하였다 (1℃/초에서 58 내지 95℃의 38 사이클). 모든 반응을 3회 수행하였다. 유전자 발현의 정량을 PCR 검출기 [MyiQ Single Colour Real-Time PCR Detection System (Biorad)]를 사용하여 수행하였고, 소프트웨어 [iQ5 optical system software (Biorad)]를 사용하여 실시간 데이터를 분석하였다.

결과:

상대적인 유전자 발현 및 표준 에러와 함께 원 (raw) Ct 값을 실시간 PCR 분석으로부터 생성시켰으며, 이를 표 11에 나타낸다. DNA 폴리머라아제 베타쇄 (rpoB)를 유전자 발현을 정규화하기 위한 참조 유전자로서 선택하였다. 비교 △C_T법을 사용한 상대적 정량을 2,3BDH의 상대적 유전자 발현을 계산하기 위하여 사용하였다. 아세테이트 생성 배양액 (R2)을 모든 분석에서 보정자 (참조 기준)로 사용하였다. 아래 표 11은 원Ct 데이터로부터의 상대적 유전자 발현 값의 편차를 나타낸다. 상대적 발현은 rpoB에 의하여 정규화하였고 반응기 2를 사용하여 보정하였다.

SE = 평균의 표준 편차 (전술한 1의 상대적 발현은 상향 조절을 나타낸다).

이 연구에 제시된 실시간 PCR 데이터는 2,3-부탄디올 유전자 발현은 아세트산을 생성하는 (acetogenic) 배양액 (R2)에 비하여 용매를 생성하는 (solventogenic) 배양액 (R11/R12)에서 유의하게 더 높다는 것을 나타낸다. R12의 미생물 배양액은 세포 수확 당시 0.6g/L/1일 2,3-부탄디올을 생성하는 배양액인데, 이는 R2에 비하여 가장 높은 유전자 상향 조절을 나타내었다 (7.64 ±0.8배). 그 다음에는 R11이었는데, 이는 유전자의 4.75±1.8배의 상향 조절을 나타내었으며, 이는 세포 수확시 1.53 g/L의 총 2,3-부탄디올 생성율을 나타내었다.

본 발명은 과도한 실험을 하지 않고도 본 발명을 실시할 수 있게 하기 위하여, 특정 양호한 실시 상태를 참고하여 설명하였다. 이 기술 분야의 숙련자는 본 발명에는 상세히 기술된 것 이외의 변형 및 변화도 가능하다는 것을 잘 알 것이다. 본 발명은 이러한 변형 및 변화도 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 이 이 문헌을 독자가 이해하기 쉽도록 하기 위하여 제목, 표제 등을 제공하는데, 이것이 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

전술한 모든 출원, 특허 및 공개의 내용은 모두 참고 문헌으로서 본 발명에 포함된다.

본 명세서에 포함된 임의의 선행 기술에 대한 내용은 전 세계 어느 나라에서 통용되는 일반적인 지식의 일부로서 인식되거나 추측되는 것이 아니고, 또한 그렇게 받아들여져서는 아니된다.

본 명세서 및 첨부된 특허 청구 범위에서, 별도로 언급하지 않은 한, "포함하다", "포함하는"이라는 등의 용어는 배타적인 의미와는 반대의 뜻을 포함하는 것으로서, 즉 "~을 포함하나, 이에 한정되지는 않는"으로 해석되어야 한다.

Claims

CO를 포함하는 기체상 기질의 미생물 발효에 의한 2,3-부탄디올의 생산 방법으로서,
a. CO를 포함하는 기체상 기질을 생물 반응기에 제공하는 단계, 및
b. 1종 이상의 아세트산생성 클로스트리듐 박테리아(acetogenic Clostridium bacteria)의 배양액을 함유하는 생물 반응기 내에서 상기 CO를 포함하는 기질을 혐기성 발효시켜 2,3-부탄디올을 생성시키는 단계
를 포함하고, 상기 CO를 포함하는 기체상 기질은 배양액에 의하여 0.4 mmol CO/세균 건조 세포 중량 g/분 이상의 CO 비흡수율(比吸收率)이 유지되도록 제공되는 것인 2,3-부탄디올의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 기질은 0.6 mmol CO/g/분 이상의 CO 비흡수율이 유지되도록 제공되는 것인 방법.
a. CO를 포함하는 기질을 제공하는 단계;
b. 1종 이상의 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제 유전자를 포함하는, 1종 이상의 아세트산생성 클로스트리듐 박테리아의 배양액을 함유하는 생물 반응기 내에서 상기 기질을 혐기성 발효시키는 단계;
c. 2,3-부탄디올이 상기 박테리아에 의하여 생성되도록 2,3-부탄디올 데하이드로게나아제 유전자를 상향 조절하는 단계
를 포함하는, 미생물 발효에 의한 2,3-부탄디올의 생산 방법.
삭제
제3항에 있어서, 상기 CO를 포함하는 기질은 2,3-부탄디올이 생성되도록 충분한 양으로 제공되는 것인 방법.
제3항 또는 제5항에 있어서, 상기 CO를 포함하는 기질은 배양액에 의하여 0.4 mmol CO/세균 세포 건조 중량 g/분 이상의 CO 비흡수율이 유지되도록 제공되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 박테리아는 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)인 것인 방법.
제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 CO를 포함하는 기질은 기체상이고, 적어도 15 내지 100 부피%의 CO를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 CO를 포함하는 기질은 산업 공정으로부터의 부산물로서 얻은 기체를 포함하는 것인 방법.
a. 기질을 제공하는 단계와,
b. 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 배양액을 포함하는 생물 반응기 내에서 상기 기질을 혐기성 발효시켜 2,3-부탄디올을 생성시키는 단계
를 포함하는 미생물 발효에 의한 2,3-부탄디올의 생산 방법.
제10항에 있어서, 상기 기질은 1종 이상의 탄수화물을 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 방법은 1종 이상의 탄수화물을 포함하는 기질을 제공하는 단계의 이전, 이 단계와 동시에, 또는 이 단계의 후에 CO를 포함하는 기질을 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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