CN114908093A - 用于c1固定菌的crispr/cas系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种使用规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)(CRISPR/Cas)系统对C1固定菌进行基因工程改造的方法。优选地，Cas蛋白处于诱导型启动子的控制之下。

Description

用于C1固定菌的CRISPR/CAS系统
本申请为分案申请，其原申请的申请日为2017年2月25日，申请号为201780021744.3(国际申请号PCT/US2017/019552)，名称为“用于C1固定菌的CRISPR/CAS系统”。
背景技术
原核生物已经进化出规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR)作为一种适应性免疫系统，用于抵抗如病毒或其它细胞外核酸的病原体感染(Marraffini，《自然(Nature)》，526：55-61，2015)。当原核生物遇到外来核酸的来源时，例如来自病毒，原核生物可以将病毒的片段复制并整合到它们的基因组中，以作为CRISPR中短回文重复序列之间的“间隔子”。在再次暴露的情况下，CRISPR间隔子允许快速鉴定病毒，并且CRISPR重复序列将特异性CRISPR相关(Cas)酶引导至该位点，在该位点处所述特异性CRISPR相关(Cas)酶拼接并使病毒核酸失效。
在过去几年中，CRISPR/Cas系统已被广泛用于医学和生物技术中(参见，例如，US8,697,359；Travis，《科学(Science)》，350：1456-1456，2015；Jinek，《科学(Science)》，337：816-821，2012)。然而，仍然需要针对例如C1固定菌的工业相关微生物的遗传修饰而优化的CRISPR/Cas系统。
发明内容
本发明提供了使用CRISPR/Cas系统对C1固定菌进行基因工程改造的方法。具体地，所述方法包括在含有包含靶序列的DNA分子的C1固定菌中引入包含一种或多种载体的经过工程改造的非天然存在的CRISPR/Cas系统，所述载体包括(a)编码与靶序列杂交的指导RNA的核苷酸序列，以及(b)在诱导型启动子控制下编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列。CRISPR/Cas系统可以进一步在一个或多个载体上包含(c)包含与靶序列上游杂交的5'同源臂和与靶序列下游杂交的3'同源臂的核苷酸序列，由此5'同源臂和3'同源臂与DNA分子杂交并发生同源重组，导致用位于5'同源臂和3'同源臂之间的DNA替换靶序列。这些元件可以位于相同或不同的载体上。
可以使用不同类型的Cas9。例如，具有催化活性的Cas9，包括其变体，如切口酶Cas9，可以用于切割DNA分子。作为另一个例子，无催化活性的Cas9可用于阻断/沉默，但不能切割DNA分子。
CRISPR/Cas系统具有多种应用，例如，缺失、插入、易位、失活或激活DNA。
CRISPR/Cas系统可以用于通过切割基因、将额外的DNA插入基因或基因的沉默/阻断，来降低基因的表达。在一个实施例中，Cas9切割编码基因的区域中的DNA分子，从而降低基因的表达。在另一个实施例中，Cas9阻断编码基因的区域中的DNA分子，从而降低基因的表达。在另一个实施例中，位于5'同源臂和3'同源臂之间的DNA破坏编码基因的区域中的DNA分子，从而降低基因的表达。
可选地或此外，CRISPR/Cas系统可用于表达外源基因。在一个实施例中，位于5'同源臂和3'同源臂之间的DNA编码外源基因，由此同源重组将外源基因插入DNA分子中。然后C1固定菌可以表达外源基因。
在特定实施例中，CRISPR/Cas系统源自于化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
CRISPR/Cas系统包含在诱导型启动子控制下的Cas9蛋白。所述诱导型启动子可以是，例如四环素诱导型启动子，如tet3no或ipl12，或乳糖诱导型启动子。
典型地，所述C1固定菌选自由以下组成的组：伍氏乙酸杆菌(Acetobacteriumwoodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、延长布劳特氏菌(Blautia producta)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、乙酸梭菌(Clostridiumaceticum)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、嗜一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、科斯卡塔梭菌(Clostridium coskatii)、德氏梭菌(Clostridiumdrakei)、甲酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii)、大梭菌(Clostridium magnum)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、银醋鼠孢菌(Sporomusasilvacetica)、类球鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)以及凯伍嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter kivui)。在一个优选实施例中，所述C1固定菌是产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)或拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)。在一个更优选的实施例中，所述C1固定菌是产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)。
附图说明
图1A和图1B是凝胶图像，示出了用于筛选产乙醇梭菌secAdh基因缺失的菌落PCR。除对照组“W”以外的所有菌落载有cas9基因，对照组“W”是野生型(未修饰的)产乙醇梭菌DSM23693。标记为“Cas9+T1_HA”的行中的菌落携带用于靶T1的间隔子，且标记为“Cas9+T2_HA”的行中的菌落携带用于靶T2的间隔子。图1C是显示具有同源臂5'HA和3'HA的secAdh基因座，用于筛选的引物SNscCR-09和OgAM58，以及secAdh基因内的间隔子靶向区域gRNA-T1和gRNA-T2的示意图。由于CRISPR/Cas9系统的活性而被删除的secAdh片段被标记(在5'和3'同源臂之间)。
图2A是质粒pLZipl12-cas9的图谱，其中cas9基因的表达受强四环素诱导型启动子Pipl12的控制。指导RNA和靶基因的同源臂被引入至位于第二质粒上的产乙醇梭菌DSM23693。图2B是携带针对2,3-bdh基因的指导RNA的实例质粒以及2,3-bdh基因的同源臂的图谱。
图3A是凝胶图像，示出了使用引物Og33f和Og34r筛选产乙醇梭菌2,3-bdh基因缺失的菌落PCR。野生型(未修饰的)产乙醇梭菌DSM23693“W”，产乙醇梭菌DSM23693携带的cas9基因只有“C1”，产乙醇梭菌DSM23693携带指导RNA和同源臂用于靶向位于2,3-bdh基因“C2”上的区域T1，以及产乙醇梭菌DSM23693携带指导RNA和同源臂用于靶向位于2,3-bdh基因‘C3’上的区域T2。在2,3-bdh基因(标记为1-8的泳道)中对携带具有cas9的两个质粒的8个菌落和携带用于靶向区域T2的指导RNA和同源臂进行缺失筛选。图3B是显示具有同源臂5'HA和3'HA的2,3-bdh基因座，用于筛选的引物Og33f和Og34r，以及2,3-bdh基因内的间隔子靶向区域gRNA-T1和gRNA-T2的示意图。由于CRISPR/Cas9系统的活性而缺失的2,3-bdh片段位于同源臂之间。
图4是pLZipl12-D10A-all3质粒的图谱。
具体实施方式
本发明人在发现现有的依赖于在组成型启动子控制下的Cas9的系统对此类细菌有毒后，开发了一种适用于C1固定菌的新型CRISPR/Cas系统。特别地，在天然组成型表达的磷酸转乙酰酶-乙酸激酶(Ppta-ack)启动子的控制下，用携带cas9的质粒转化C1固定菌，即产乙醇梭菌，的尝试是不成功的。本发明的CRISPR/Cas系统利用诱导型启动子而不是组成型启动子，这使其适用于C1固定菌。
在大多数真核生物中，通过非同源末端连接方法(NHEJ)修复双链断裂(DSB)(Mali，《科学(Science)》，339：823-826，2013；Cong，《科学(Science)》，339：819-823，2013)。然而，在原核生物中，修复是通过同源重组进行的，并且由DNA修复或模板或同源臂(HA)介导。CRISPR/Cas9介导的基因组修饰已经在多种微生物系统中展示，包括糖分解梭菌(Xu，《应用与环境微生物学(Appl Environ Microbiol)》，81：4423-4431，2015；Wang，《生物技术杂志(J Biotechnol)》，200：1-5，2015)，但不是在C1固定菌中，这是由于，如发明人所发现的，C1固定菌需要对CRISPR/Cas9工具的设计进行显著修改，例如cas9的受控表达。
术语“非天然存在的”或“工程改造的”可互换地使用并且表明人工的参与。例如，与非工程改造或天然存在的微生物相比，基因工程微生物可包含已经被修饰(例如，缺失，突变，插入，阻断，沉默或过表达)的基因组或其它核酸。作为另一个示例，工程改造的CRISPR/Cas系统可包含指导RNA或诱导型启动子，其不存在于非工程改造或天然存在的CRISPR/Cas系统中。
术语“多核苷酸”，“核苷酸”，“核苷酸序列”，“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用。它们是指任何长度的聚合形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区，由连锁分析定义的基因座(基因座)，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转移RNA，核糖体RNA，短干扰RNA(siRNA)，短发夹RNA(shRNA)，微RNA(miRNA)，核酶，cDNA，重组多核苷酸，支链多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可包含一种或多种修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸或核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后执行对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。
在本发明的多个方面，术语“嵌合RNA”、“嵌合指导RNA”、“指导RNA”、“单指导RNA”以及“合成指导RNA”是可互换地使用的并且是指包括指导序列、tracr序列以及tracr配对序列的多核苷酸序列。术语“指导序列”是指在指定靶位点的指导RNA内约20bp的序列，并且可与术语“指导”或“间隔子”互换地使用。术语“tracr配对序列”也可与术语“同向重复”互换地使用。
如本文使用的“表达”是指藉此从DNA模板转录成多核苷酸(如转录成mRNA或其它RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后藉此翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。“改变表达”是指改变基因产物的表达，例如，与未修饰的或亲本的微生物相比，增加、减少或消除基因产物的表达。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换地使用，是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物；这些修饰例如二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵，如与标记组分的结合。如本文使用的术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。
“突变”是指本发明微生物中的核酸或蛋白质相比于本发明微生物来源于的野生型或亲本微生物而言已经被修饰。在一个实施例中，突变可以是编码酶的基因的删除、插入或取代。在另一个实施例中，突变可以是酶中的一种或多种氨基酸的删除、插入或取代。
具体地，“破坏性突变”是降低或消除(即“破坏”)基因或酶的表达或活性的突变。破坏性突变可以使基因或酶部分失活、完全失活，或删除基因或酶。破坏性突变可以是基因敲除(KO)突变。破坏性突变可以是降低、防止或阻断通过酶产生的产物的生物合成的任何突变。破坏性突变可包括例如，编码酶的基因中的突变、参与编码酶的基因的表达的基因调节元件中的突变、产生降低或抑制酶的活性的蛋白的核酸的引入或抑制酶的表达的核酸(例如反义RNA、siRNA、CRISPR)或蛋白的引入。
与源自本发明微生物的亲本微生物相比，破坏性突变的引入导致本发明的微生物不产生基因产物或基本上不产生基因产物或减少基因产物的量。例如，本发明的微生物可以不产生基因产物或产生至少比亲本微生物少约1％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的基因产物。
“内源性”或“同源性”是指在本发明的微生物来源的野生型或亲本微生物中存在或表达的核酸或蛋白质。例如，内源性基因是天然存在于本发明的微生物来源的野生型或亲本微生物中的基因。在一个实施例中，内源性基因的表达可以通过，如外源性启动子，的外源性调节元件控制。
“外源性”或“异源性”是指不存在于本发明微生物来源于的野生型或亲本微生物中的核酸或蛋白质。在一个实施例中，外源性基因或酶可以来源于异源(即不同)菌株或物种并且被引入到本发明微生物中或在本发明微生物中表达。在另一实施例中，外源性基因或酶可以人工方式或以重组方式形成并且引入本发明微生物中或在本发明微生物中表达。
“密码子优化”指用于在特定菌株或物种中优化或提高核酸翻译的，例如编码Cas蛋白如Cas9的基因的核酸的突变。密码子优化可以带来更快的翻译速率或更高的翻译准确度。在优选实施例中，本发明的基因经密码子优化以在梭菌属，尤其产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌，中表达。在另一优选实施例中，本发明的基因经密码子优化以在产乙醇梭菌LZ1561(保藏在DSMZ登录号DSM23693下)中表达。
“过表达”是指相比于本发明微生物来源于的野生型或亲本微生物，本发明微生物中的核酸或蛋白质的表达增加。
“互补性”是指核酸与另一个核酸序列借助于传统的沃森-克里克碱基配对或其它非传统类型形成一个或多个氢键的能力。互补百分比表示一个核酸分子中可与一个第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、80％、90％以及100％互补)。“完全互补”表示一个核酸序列的所有连续残基与一个第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文使用的“基本上互补”是指在一个具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补程度，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。
如本文使用的对于杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的一个核酸主要与所述靶序列杂交并且基本上不杂交到非靶序列上的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且取决于多种因素而变化。一般而言，序列越长，则序列特异性地杂交到其靶序列上的温度就越高。严格条件的非限制性实例是本领域熟知的(例如，Tijssen，《生物化学和分子生物学中的实验室技术-核酸探针杂交(Laboratory techniques in biochemistry andmolecular biology-hybridization with nucleic acid probes)》，第二章，“杂交原理概述和核酸探针分析策略(“Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assay”)”，爱思唯尔(Elsevier)，纽约，1993)。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成一种复合物的反应，所述复合物经由这些核苷酸残基之间的碱基的氢键键合而稳定化。氢键键合可以借助于沃森-克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其它序列特异性方式而发生。所述复合物可包含形成一个双链体的两条链、形成多链复合物的三条或多条链、单个自杂交链或这些的任意组合。杂交反应可以构成一个更广泛的过程中的步骤，如PCR的开始、或酶对多核苷酸的切割。能够与一个给定序列杂交的序列被称为所述给定序列的“互补物”。
核酸可以使用本领域中已知的任何方法传递到本发明微生物中。例如，核酸可以裸露核酸形式传递，或者可以用一种或多种介质(例如，脂质体)一起配制。视情况，核酸可以是DNA、RNA、cDNA或其组合。在某些实施例中可以使用限制抑制剂。其它载体可包括质粒、病毒、噬菌体、粘粒和人工染色体。在优选实施例中，使用质粒将核酸传递至本发明微生物中。举例来说，转化(包括转导或转染)可以通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态、原生质体转化、前噬菌体诱导或结合来实现。在具有活性限制酶体系的某些实施例中，可能需要在将核酸引入至微生物中之前将核酸甲基化。
此外，核酸可以设计为包含调节元件，如启动子，来增加或控制特定核酸的表达。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。例如，启动子是伍德-永达尔(Wood-Ljungdahl)途径启动子、铁氧化还原蛋白启动子、丙酮酸：铁氧化还原蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合体操纵子启动子、ATP合成酶操纵子启动子或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。
典型地，在本发明的方法中，Cas 9处于诱导型启动子的控制之下。诱导型启动子可以是，例如，四环素诱导型启动子，如tet3no或ipl12，或乳糖诱导型启动子。
一般而言，“CRISPR系统”统称为转录物和参与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的其它元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(涵盖“同向重复”和在内源CRISPR系统背景下的tracrRNA加工的部分同向重复)、指导序列(在内源CRISPR系统背景下也称为“间隔子(spacer)”)、或来自CRISPR座位的其它序列和转录物。在一些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于I型、II型或III型CRISPR系统。在一些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于包含内源CRISPR系统的特殊生物，如化脓性链球菌或嗜热链球菌。一般而言，CRISPR系统的特征为促进在靶序列的位点处的CRISPR复合物(在内源CRISPR系统的背景下也称为原型间隔子)的形成的元件。在CRISPR复合物形成的背景下，“靶序列”是指一个指导序列被设计为对其具有互补性的序列，其中在靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。完全互补性不是必需的，条件是存在足够互补性以引起杂交并且促进一种CRISPR复合物的形成。一个靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。
典型地，在内源CRISPR系统的背景下，CRISPR复合物(包含杂交到靶序列上并且与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致在所述靶序列中或其附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对之内)的一条链或两条链的切割。不希望受到理论的束缚，所述tracr序列(其可以包含或由野生型tracr序列的全部或部分(例如野生型tracr序列的约20、26、32、45、48、54、63、67、85个或更多个核苷酸)组成)也可以形成CRISPR复合物的一部分，如通过沿着所述tracr序列的至少一部分杂交到与所述指导序列可操作地连接的tracr配对序列的全部或部分上。在一些实施例中，所述tracr序列与一个tracr配对序列具有足够的互补性以进行杂交，并参与一种CRISPR复合物的形成。至于所述靶序列，据信不需要完全互补性，只要足以具备功能性。在一些实施例中，当进行最佳比对时，沿着所述tracr配对序列的长度，所述tracr序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％序列互补性。在一些实施例中，将驱动CRISPR系统的一个或多个元件的表达的一个或多个载体引入到宿主细胞中，使得所述CRISPR系统的这些元件的表达在一个或多个靶位点指导CRISPR复合物的形成。例如，Cas酶、连接到tracr配对序列上的指导序列、以及tracr序列可以各自可操作地连接到在分开的载体上的分开的调节元件上。可替代地，从相同或不同调节元件表达的二个或更多个元件可以结合在单个载体中，其中提供所述CRISPR系统的任何组分的一个或多个另外的载体不包括在第一载体中。结合在单个载体中的CRISPR系统元件可以按照任何适合的取向排列，如一个元件相对于第二元件位于5'端(“上游”)或3'端(“下游”)。一个元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的同一条链或相对链上，并且取向为相同或相对的方向。在一些实施例中，单个启动子驱动编码CRISPR酶的转录物以及所述指导序列、tracr配对序列(任选地可操作地连接到所述指导序列上)和嵌入在一个或多个内含子序列之内(例如，各自在不同的内含子中，两个或更多个在至少一个内含子中，或者全部都在单个内含子中)的tracr序列中的一者或多者的表达。在一些实施例中，所述CRISPR酶、指导序列、tracr配对序列以及tracr序列可操作地连接到相同的启动子上并且从其表达。
在一些实施例中，一个载体包含一个或多个插入位点，如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施例中，一个或多个插入位点(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个插入位点)位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。在一些实施例中，一个载体包含在tracr配对序列的上游、并且任选地在可操作地连接到所述tracr配对序列上的调节元件的下游的插入位点，使得在将指导序列插入到所述插入位点中之后并且在表达时所述指导序列指导CRISPR复合物与真核细胞中的靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，一个载体包含一个或多个插入位点，每个插入位点位于两个tracr配对序列之间，从而允许在每个位点插入指导序列。在这样一种安排中，两个或更多个指导序列可以包含两个或更多个拷贝的单指导序列、两个或更多个不同的指导序列或其组合。当使用多个不同的指导序列时，可以使用单个表达构建体使CRISPR活性靶向到细胞内的多个不同的相应靶序列。例如，单个载体可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个或更多个指导序列。在一些实施例中，可以提供约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个这样的含有靶序列的载体，并且任选地将其递送到细胞中。
在一些实施例中，载体包含可操作地连接到编码CRISPR酶(如Cas蛋白)的酶编码序列上的调节元件。Cas蛋白的非限制性实例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，化脓性链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可见于SwissProt数据库登录号Q99ZW2下。在一些实施例中，未修饰的CRISPR酶(如Cas9)具有DNA切割活性。在一些实施例中，所述CRISPR酶是Cas9，并且可以是来自化脓性链球菌，嗜热链球菌或肺炎链球菌的Cas9。在一些实施例中，所述CRISPR酶指导在靶序列位置处(例如在所述靶序列之内和/或在所述靶序列的互补物之内)的一条链或两条链的切割。在一些实施例中，所述CRISPR酶指导距离靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对之内的一条链或两条链的切割。在一些实施例中，一个载体编码相对于相应的野生型酶被突变的CRISPR酶，使得所述突变的CRISPR酶缺乏切割含有一个靶序列的靶多核苷酸的一条链和两条链的能力。例如，在来自化脓性链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸到丙氨酸取代(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化成切口酶(切割单条链)。致使Cas9为切口酶的其它突变实例包括而不限于H840A、N854A和N863A。在本发明的一些方面，切口酶可用于通过同源重组进行基因组编辑。
作为另外的实例，Cas9的两个或更多个催化结构域(RuvC I、RuvC II和RuvC III)可以被突变为产生实质上缺乏所有DNA切割活性的突变的Cas9。在一些实施例中，D10A突变与H840A、N854A或N863A突变的一者或多者相组合，以便产生实质上缺乏所有DNA切割活性的Cas9酶。在一些实施例中，当所述突变的CRISPR酶的DNA切割活性比它的非突变形式低约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或更少时，则所述酶被考虑为实质上缺乏所有DNA切割活性。其它突变可能是有用的；其中Cas9或其它CRISPR酶是来自除化脓性链球菌外的物种，可产生相应氨基酸的突变以实现类似效果。
一般而言，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以便与所述靶序列杂交并且指导CRISPR复合物与所述靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施例中，当使用适合的比对算法进行最佳比对时，指导序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高。可以使用用于比对序列的任何适合的算法来确定最佳比对，其非限制性实例包括史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法、尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法、基于伯罗斯-惠勒变换(Burrows-Wheeler Transform)的算法(例如伯罗斯-惠勒比对工具(Burrows Wheeler Aligner))、ClustalW、ClustalX、BLAT、Novoalign(Novocraft技术公司)、ELAND(亿明达公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、SOAP以及Maq。在一些实施例中，一个指导序列在长度上为约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个或更多个核苷酸。在一些实施例中，一个指导序列在长度上为少于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个或更少的核苷酸。可以通过任何适合的测定法来评估指导序列指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力。例如，足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组分，包括有待测试的指导序列在内，可以例如通过用编码所述CRISPR序列的组分的载体进行转染而被提供到具有相应靶序列的宿主细胞中，随后通过如本文所述的测量员测定来评估在所述靶序列之内的优先切割。类似地，通过提供所述靶序列、包括有待测试的指导序列在内的CRISPR复合物的组分和不同于所述测试指导序列的对照指导序列，并且比较在所述测试指导序列与所述对照指导序列反应之间的靶序列处的结合或切割率，可以在一个试管中评估靶多核苷酸序列的切割。本领域技术人员可想到的其它测定法也是可能的。
一般而言，tracr配对序列包括与tracr序列具有足够互补性以促进下列一项或多项的任何序列：(1)在含有相应tracr序列的细胞中的侧翼为tracr配对序列的指导序列的切除；以及(2)在靶序列处的CRISPR复合物的形成，其中所述CRISPR复合物包含杂交到tracr序列上的tracr配对序列。通常，互补程度是就tracr配对序列与tracr序列沿着这两个序列的较短者的长度的最佳比对而言。可以通过任何适合的比对算法来确定最佳比对，并且可以进一步对二级结构做出解释，如在所述tracr序列或tracr配对序列之内的自我互补性。在一些实施例中，在进行最佳比对时，在所述tracr序列与tracr配对序列之间沿着这两者的较短者的长度的互补程度是约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更高。在一些实施例中，所述tracr序列在长度上为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个或更多个核苷酸。在一些实施例中，所述tracr序列和tracr配对序列被包含在单个转录物中，使得在这两者之间的杂交产生具有如发夹的二级结构的转录物。
“同源重组”是一种遗传重组，其中核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分子之间交换。特别地，同源重组可用于替换位于载体构建体上的同源臂之间的DNA，其中DNA位于宿主细胞中的同源臂靶之间。同源臂优选与宿主细胞中的靶区域具有100％的互补性。然而，同源臂可以与宿主细胞中的靶区域具有小于100％的互补性，只要它们具有足够的互补性以允许同源重组。
“微生物”是微观生物，尤其为细菌、古细菌、病毒或真菌。本发明微生物通常是细菌。如本文所使用，“微生物”的叙述应被认为涵盖“细菌”。
“亲本微生物”是用于产生本发明微生物的微生物。亲本微生物可以是天然产生的微生物(即野生型微生物)或已经经过预先修饰的微生物(即突变或重组微生物)。本发明微生物可以经修饰以表达或过度表达在亲本微生物中不表达或过度表达的一种或多种酶。类似地，本发明微生物可以经修饰以含有亲本微生物所没有的一种或多种基因。还可以修饰本发明的微生物以不表达或表达在亲本微生物中表达的较低量的一种或多种酶。在一个实施例中，亲本微生物是自产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌。在一优选实施例中，亲本微生物是产乙醇梭菌LZ1561，其于2010年6月7日依据布达佩斯条约的条款保藏于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，位于德国布伦瑞克(Braunschwieg)市的Inhoffenstraβ7B，D-38124，登记号为DSM23693。
术语“来源于”表示核酸、蛋白质或微生物从不同的(例如亲本或野生型)核酸、蛋白质或微生物经过修饰或调适，从而产生新的核酸、蛋白质或微生物。这类修饰或调适通常包括核酸或基因的插入、删除、突变或取代。一般来说，本发明微生物来源于亲本微生物。在一个实施例中，本发明微生物来源于产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌。在优选实施例中，本发明微生物来源于产乙醇梭菌LZ1561，保藏在DSMZ登记号DSM23693下。
本发明微生物可以根据功能特性进一步分类。例如，本发明微生物可以是或可以来源于C1固定微生物、厌氧生物、产乙酸菌、产乙醇菌、一氧化碳营养菌和/或甲烷营养菌。表1提供微生物的代表性列表以及鉴别他们的功能特性。
Figure BDA0003644747150000161
Figure BDA0003644747150000171
1伍氏醋酸杆菌可由果糖而非由气体产生乙醇。
2尚未研究大梭菌是否能够在CO上生长。
3已报告热醋穆尔氏菌、穆尔氏菌属HUC22-1中的一个菌株由气体产生乙醇。
4尚未研究卵形鼠孢菌是否能够在CO上生长。
5尚未研究土壤醋酸鼠孢菌是否能够在CO上生长。
6尚未调查类球鼠孢菌是否能够在CO上生长。
“C1”是指一个碳分子，例如CO、CO2、CH4或CH3OH。“C1含氧物”是指还包含至少一个氧原子的一个碳分子，例如CO、CO2或CH3OH。“C1碳源”是指充当针对本发明微生物的部分或唯一碳源的一个碳分子。例如，C1碳源可包含CO、CO2、CH4、CH3OH或CH2O2中的一种或多种。优选地，C1碳源包含CO和CO2中的一种或两种。“C1固定微生物”是具有能够由C1碳源产生一种或多种产物的微生物。通常，本发明微生物是C1固定菌。在一优选实施例中，本发明微生物来源于表1中所鉴别的C1固定微生物。
“厌氧生物”是生长不需要氧气的微生物。如果氧气以高于特定阈值存在，则厌氧菌可能发生不利反应或甚至死亡。通常，本发明微生物是厌氧生物。在一优选实施例中，本发明微生物来源于表1中所鉴别的厌氧生物。
“产乙酸菌”是产生或能够产生乙酸盐(或乙酸)作为厌氧呼吸的产物的微生物。通常，产乙酸菌是使用伍德-永达尔途径作为其能量守恒和合成乙酰CoA与乙酰CoA衍生物(如乙酸盐)的主要机制的绝对厌氧细菌(Ragsdale，《生物化学与生物物理学学报(BiochimBiophys Acta)》，1784：1873-1898，2008)。产乙酸菌使用乙酰CoA途径作为(1)从CO2还原合成乙酰CoA的机制，(2)终端电子接收、节能程序，(3)CO2在细胞碳的合成中的固定(同化)机制(《原核生物(The Prokaryotes)》第3版，第354页，纽约市，纽约州，2006中：Drake，《产乙酸原核生物(Acetogenic Prokaryotes)》。所有天然存在的产乙酸菌是C1固定、厌氧性、自养性和非甲烷氧化性的。通常，本发明微生物是产乙酸菌。在优选实施例中，本发明微生物来源于表1中所鉴别的产乙酸菌。
“产乙醇菌”是产生或能够产生乙醇的微生物。通常，本发明微生物是产乙醇生物。在优选实施例中，本发明微生物源自于在表1中所鉴别的产乙醇微生物。
“自养生物”是能够在不存在有机碳的情况下生长的微生物。相反，自养生物使用无机碳源，如CO和/或CO2。通常，本发明微生物是自养生物。在选实施例中，本发明微生物源自于表1中所鉴别的自养生物。
“一氧化碳营养菌”是能够利用CO作为唯一碳源的微生物。通常，本发明微生物是一氧化碳营养菌。在优选实施例中，本发明微生物源自于表1中所鉴别的一氧化碳营养生物。
“甲烷营养菌”是能够利用甲烷作为唯一碳源和能量来源的微生物。在特定实施例中，本发明微生物源自于甲烷营养菌。在其它实施方案中，本发明的微生物不是甲烷氧化菌或不源自于甲烷氧化菌。
更广泛地说，本发明微生物可以源自于表1中所鉴别的任何属或种类。
在优选实施例中，本发明微生物源自于包含产乙醇梭菌、永达尔梭菌和拉氏梭菌种类的梭菌属的集群。这些种类首先由Abrini，《微生物学档案(Arch Microbiol)》，161：345-351，1994(产乙醇梭菌)、Tanner，《国际系统细菌学杂志(Int J System Bacteriol)》，43：232-236，1993(永达尔梭菌)，和Huhnke，WO 2008/028055(拉氏梭菌)报道和表征。
这三个种类有许多相似性。具体地说，所有这些种类都是梭菌属的C1固定、厌氧性、产乙酸性、产乙醇性和一氧化碳营养型成员。这些种类具有相似的基因型和表现型以及节能和发酵代谢模式。此外，这些种类丛集于梭菌rRNA同源第I族与16S rRNA DNA(其超过99％相同)中，具有约22到30mol％的DNA G+C含量，为革兰氏阳性，具有相似形态和大小(0.5到0.7×3到5μm之间的细胞的对数生长)，为嗜温性(在30℃到37℃下最佳地生长)，具有约4到7.5的相似pH值范围(具有约5.5到6的最佳pH值)，缺乏细胞色素，并且经由Rnf复合体节能，另外，在这些种类中已显示羧酸还原为其对应的醇(Perez，《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)》，110：1066-1077，2012)。重要的是，所有这些种类还展示在含CO气体上的强自养生长，产生乙醇和醋酸(或乙酸)作为主要发酵产物，并且在某些条件下产生少量的2,3-丁二醇和乳酸。
然而，这三个种类还具有多处不同。这些种类从不同源分离：产乙醇梭菌从兔肠中分离、永达尔梭菌从养鸡场废弃物中分离，而拉氏梭菌从淡水沉积物中分离。这些种类不同在于各种糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡糖酸、柠檬酸)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如甜菜碱、丁醇)的利用。此外，这些种类不同在于某些维生素(例如硫胺、生物素)营养缺陷。尽管发现所有种类中的这些基因和蛋白质在总体组织和数量上相同，但这些种类在伍德-永达尔途径基因和蛋白质的核序列和氨基酸序列上仍存在差异(
Figure BDA0003644747150000191
《生物技术前沿观点(Curr Opin Biotechnol)》，22：320-325，2011)。
因此，总的来说，产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌的多种特征并不特定于所述种类，但是梭菌属的C1固定、厌氧性、产乙酸性、产乙醇性和一氧化碳营养型成员的这一集群的一般特征却特定于所述种类。然而，由于这些种类实际上是不同的，所以这些种类中的一种的基因修饰或操作在这些种类的另一种中可能不具有相同的作用。举例来说，可观察到生长、性能或产物制造的不同。
本发明微生物还可以源自于产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌的分离物或突变体。产乙醇梭菌的分离物和突变体包括JA1-1(DSM10061)(Abrini，《微生物学档案(ArchMicrobiol)》，161：345-351，1994)、LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200)和LZ1561(DSM23693)。永达尔梭菌的分离物和突变体包括ATCC 49587(Tanner，《国际系统细菌学杂志(Int J Syst Bacteriol)》，43：232-236，1993)、PETCT(DSM13528，ATCC 55383)、ERI-2(ATCC 55380)(US 5,593,886)、C-01(ATCC 55988)(US 6,368,819)、O-52(ATCC 55989)(US6,368,819)和OTA-1(Tirado-Acevedo，《使用永达尔梭菌由合成气体制造生物乙醇(Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii)》，博士论文，北卡罗来纳州立大学(North Carolina State University)，2010)。拉氏梭菌的分离物和突变体包括PI 1(ATCC BAA-622，ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)。
“底物”是指本发明微生物的碳源和/或能量源。通常，底物是气态的并且包含C1碳源，例如CO、CO2和/或CH4。优选地，底物包含CO或CO+CO2的C1碳源。底物可更包含其它非碳组分，如H2、N2或电子。
底物一般包含至少一定量的CO，如约1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mol％CO。底物可包含一定范围的CO，如约20-80、30-70或40-60mol％CO。优选地，底物包含约40-70mol％CO(例如钢铁厂或高炉气体)、约20-30mol％CO(例如氧气顶吹转炉气体(basic oxygen furnace gas))或约15-45mol％CO(例如合成气)。在一些实施例中，底物可包含相对较低量的公司，如约1-10或1-20mol％CO。本发明微生物通常将底物中的至少一部分CO转化为产物。在一些实施例中，底物不包含或基本不包含(<1mol％)CO。
底物可包含一定量的H2。例如，底物可包含约1、2、5、10、15、20或30mol％H2。在一些实施例中，底物可包含相对较高量的H2，如约60、70、80或90mol％H2。在其它实施例中，底物基本上不含(<1mol％)H2。
底物可包含一定量的CO2。举例来说，底物可包含约1-80或1-30mol％CO2。在一些实施例中，底物可包含小于约20、15、10或5mol％CO2。在另一个实施例中，底物基本上不含(<1mol％)CO2。
虽然底物通常是气态的，但是底物也可以按替代形式提供。例如，底物可溶解于使用微泡分布发生器经含CO气体饱和的液体中。作为另一个实例，底物可吸附到固体载体上。
底物和/或C1碳源可为以工业工艺的副产物形式获得或来自一些其它来源，诸如来自汽车废气或生物质气化的废气。在某些实施例中，工业工艺选自由以下组成的群组：含铁金属产品制造(如钢铁厂制造)、非铁产品制造、石油精炼工艺、煤炭气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产以及焦炭制造。在这些实施例中，底物和/或C1碳源可在其被发射于大气中之前使用任何适宜方法从工业工艺采集。
底物和/或C1碳源可为合成气，诸如通过煤炭或精炼厂残留物的气化、生物质或木质纤维素材料的气化、或天然气的重整获得的合成气。在另一个实施方案中，合成气可以从城市固体废物或工业固体废物的气化中获得。
底物的组成会对反应效率和/或成本产生显著影响。例如，举例来说，氧气(O2)的存在会降低厌氧发酵工艺的效率。取决于底物的组成，可能需要处理、洗涤或过滤底物以去除任何不合需要的杂质，如毒素、不合需要的组分或尘粒，和/或增加期望组分的浓度。
本发明微生物可以经过培养而产生一种或多种产物。举例来说，产乙醇梭菌产生或可经过工程改造而产生乙醇(WO 2007/117157)、乙酸盐(WO 2007/117157)、丁醇(WO2008/115080和WO 2012/053905)、丁酸盐(WO 2008/115080)、2,3-丁二醇(WO 2009/151342)、乳酸盐(WO 2011/112103)、丁烯(WO 2012/024522)、丁二烯(WO 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(WO 2012/024522和WO 2013/185123)、乙烯(WO 2012/026833)、丙酮(WO2012/115527)、异丙醇(WO 2012/115527)、脂质(WO 2013/036147)、3-羟基丙酸盐(3-HP)(WO 2013/180581)、异戊二烯(WO 2013/180584)、脂肪酸(WO 2013/191567)、2-丁醇(WO2013/185123)、1，2-丙二醇(WO 2014/0369152)和1-丙醇(WO 2014/0369152)。
实例
以下实例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实例1
本实例示范产乙醇梭菌DSM23693的培养。
产乙醇梭菌DSM23693(DSM10061的衍生物)来源于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)，Inhoffenstraβe 7 B，38124布伦瑞克(Braunschweig)，德国)。使用标准厌氧技术，使菌株在37℃下的PETC培养基中生长(Hungate，《微生物学方法(Meth Microbiol)》，3B：117-132，1969；Wolfe，《微生物生理学进展(Adv Microbiol Physiol)》，6：107-146，1971)。使用化学限定的不含酵母提取物的PETC培养基。30psi的气体混合物(44％CO，32％N2，22％CO2，2％H2)作为底物以用于自养生长。对于固体培养基，添加1.2％bacto琼脂(BD，伯根湖(Franklin Lakes)，新泽西州(NJ)07417，美国)。
Figure BDA0003644747150000231
Figure BDA0003644747150000232
Figure BDA0003644747150000241
痕量金属溶液 每1.0L溶液
次氮基三乙酸 2g
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 1g
Fe(SO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O 0.8g
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O 0.2g
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.2mg
CuCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.02g
NaMoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.02g
Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub> 0.02g
NiCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O 0.02g
Na<sub>2</sub>WO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.02g
蒸馏水 至1.0L
还原剂溶液 每100mL溶液
NaOH 0.9g
半胱氨酸·HCl 4g
Na<sub>2</sub>S 4g
蒸馏水 至100mL
实例2
此实例表明产醇梭菌DSM23693中使用CRISPR/Cas9的仲醇脱氢酶基因(secondaryalcohol dehydrogenase gene，secAdh)的缺失。
来自于化脓性链球菌的cas9基因(NC_002737.2核酸序列；NP_269215.1氨基酸序列)被编码适于产醇梭菌DSM23693，并克隆到pLZtet3no载体的NdeI和HindIII限制性核酸内切酶位点之间以形成pLZtet3no-cas9载体。cas9的表达被置于诱导型启动子的控制下。
用于产醇梭菌的仲醇脱氢酶基因(secAdh)的两个间隔子(CAETHG_0053；CP006763.1核酸序列；AGY74782.1氨基酸序列)由GenScript设计。合成间隔子并将其克隆到pMTL83557载体的NdeI和PvuII位点之间以形成pMTL83557-secAdh-T1载体和pMTL83557-secAdh-T2载体。将pMTL83557-secAdh-T1和pMTL83557-secAdh-T2中的β-内酰胺酶抗生素选择标记替换为氯霉素乙酰转移酶(catP)抗生素选择标记，以形成pMTL83157-secAdh-T1载体和pMTL83157-secAdh-T2载体。从产乙醇梭菌DSM23693的基因组DNA中，使用5-HAf3/5-HAr2引物和3-HAf2/3-HAr引物以及KAPA聚合酶(BioRad)，PCR扩增secAdh的～1kb的5'和3'同源臂。
使用Bertram，《微生物学档案(Arch Microbiol)》151：557-557,1989的改良方法分离基因组DNA。收集100ml过夜培养物(6,000×g，15min，4℃)，用磷酸钾缓冲液(10mM，pH7.5)洗涤并悬浮于1.9ml STE缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，200mM蔗糖；pH 8.0)。加入300μl溶菌酶(约100000U)，将混合物在37℃下孵育30min，然后加入280μl 10％(w/v)SDS溶液，再孵育10min。通过加入240μl EDTA溶液(0.5μM，pH 8)，20μl Tris-HCl(1M，pH 7.5)和10μl RNase A(福蒙特斯生命科学(Fermentas Life Sciences))，在室温下消化RNA。然后，加入100μl蛋白酶K(0.5U)并在37℃下进行蛋白水解1-3h。最后，加入600μl高氯酸钠(5M)，然后进行苯酚-氯仿抽提和异丙醇沉淀。用分光光度法检测DNA的数量和质量。
使用GeneArt无缝克隆试剂盒将同源臂克隆到pMTL83157-secAdh-T1载体和pMTL83157-secAdh-T2载体中。使用引物BBf2/BBr2和KAPA聚合酶，PCR扩增用于无缝克隆的载体骨架。得到的载体称为pMTL83157-secAdh-T1-HA和pMTL83157-secAdh-T2-HA。
pLZtet3no-cas9载体经连接后，被转化到产乙醇梭菌DSM23693。为此，首先使用标准热休克转化将表达载体引入连接供体菌株大肠杆菌HB101+R702(CA434)(Williams，《通用微生物学杂志(J Gen Microbiol)》，136：819-826)(供体)中。将供体细胞用SOC培养基(Sambrook，《分子克隆(Molecular cloning)》：实验室手册(A laboratory manual)，第三卷，冷泉港出版社(Cold Spring Harbour Press)，1989)在37℃下复性1h，然后接种到含有100μg/ml壮观霉素和25μg/ml氯霉素的LB培养基(Sambrook，《分子克隆(Molecularcloning)》：实验室手册(A laboratory manual)，第三卷，冷泉港出版社(Cold SpringHarbour Press)，1989)平板。将LB平板在37℃下孵育过夜。第二天，用若干供体菌落接种含有100μg/ml壮观霉素和25μg/ml氯霉素的5ml LB等分试样，并在37℃下孵育，振荡约4h，或直至培养物明显致密但尚未进入稳定期。在室温下通过微量离心管以4000rpm的速度离心2min收集1.5ml供体培养物，弃去上清液。将供体细胞轻轻重悬于2ml无菌PBS缓冲液(《分子克隆(Molecular cloning)》：实验室手册(A laboratory manual)，第三卷，冷泉港出版社(Cold Spring Harbour Press)，1989)中，并以4000rpm的速度离心5min，弃去PBS上清液。将沉淀物引入厌氧室中，并在指数期后期温和地重悬于200μl产乙醇梭菌培养物(接受者)中。将连接混合物(供体和受体细胞的混合物)点在PETC-MES琼脂平板上并使其干燥。当斑点不再明显湿润时，将板引入压力罐中，用合成气加压至25-30psi并在37℃下孵育约24h。孵育24小时后，通过使用10μl接种环从板上轻轻刮除缀合混合物。将除去的混合物悬浮在200-300μl PETC培养基中。将100μl等分试样的连接混合物接种到补充有5μg/ml克拉霉素的PETC培养基琼脂平板上，以选择携带pLZtet3no-cas9载体和10μg/ml甲氧苄啶的转化体，以计数选择大肠杆菌。
三个不同的菌落，或带有pLZtet3no-cas9载体产乙醇梭菌培养物DSM23693的菌落被接种到2mL具有5μg/ml的克拉霉素PETC-MES培养基，在37℃以100rpm的速度轨道振荡三天自养增长。一个带有pLZtet3no-cas9的产乙醇梭菌培养物DSM23693的菌落被转化如上所述的第二质粒pMTL83157-secAdh-T1_HA或pMTL83157-secAdh-T2_HA。在含有5μg/ml克拉霉素，10μg/ml甲氧苄啶和15μg/ml甲砜霉素的PETC琼脂培养基上选择转化体。将菌落在含有所有3种抗生素和32ng/μl无水四环素的PETC琼脂平板上划线以诱导cas9的表达。从得到的菌落中，使用引物SNsc-CR-09/OgAM58和KAPA聚合酶通过PCR筛选8个secAdh基因的缺失。未修饰产乙醇梭菌DSM23693将扩增出3382bp的产物，以及secAdh基因内和同源臂之间具有891bp片段缺失的突变体将扩增出2491bp的产物。
含有cas9+T1_HA的三个菌落具有截短的secAdh基因(图1A和图1B)，在基因的3'末端缺失466bp(图1C)。这通过PCR产物的桑格尔(Sanger)测序证实。没有一个含有cas9+T2_HA的菌落具有任何secAdh基因的修饰(图1A和图1B)。在本实例中，CRISPR-II/Cas9的效率使产乙醇梭菌的基因缺失率达约20％。这清楚地表明来自化脓性链球菌的CRISPR-II/Cas9系统在产乙醇梭菌中是有效的。
实例3
此实例表明产乙醇梭菌中DSM23693使用CRISPR/Cas9的2,3-丁二醇脱氢酶(2,3-bdh)基因的缺失。
为了进一步优化用于产乙醇梭菌中更高效率的CRISPR/Cas9系统，cas9基因的表达被置于更强的四环素诱导型启动子ipl12的控制之下。此外，同源臂被设计为距离Cas9切割位点100bp以内。
将来自pLZtet3no-cas9的cas9基因克隆到pLZip112质粒中NdeI和HindIII位点之间以形成pLZipl12-cas9质粒(图2A)。与pLZtet3no相比，pIPL12具有更强的四环素诱导型启动子。
用于产乙醇梭菌的2,3-丁二醇脱氢酶(CP006763.1核苷酸序列；CAETHG_0385AGY74614.1氨基酸序列)的两个间隔子由GenScript设计。所述间隔子被克隆到pMTL83557的NdeI和PvuII位点之间，以形成pMTL83557-2,3bdh-T1载体和pMTL83557-2,3bdh-T2载体。将pMTL83557-2,3bdh-T1和pMTL83557-2,3bdh-T2(图2B)中的β-内酰胺酶抗生素选择标记替换为氯霉素乙酰转移酶(catP)抗生素选择标记，以获得pMTL83157-2,3bdh-T1载体和pMTL83157-2,3bdh-T2载体。使用引物SNr05f/SNr06r和SNr07f/SNr08r以及KAPA聚合酶(BioRad)，从产乙醇梭菌DSM23693的基因组DNA中，PCR扩增2,3bdh基因的约1kb的5'和3'同源臂侧翼。同源臂距离Cas9切割位点约70bp。使用包括PmeI限制性位点的引物SNr05f/SNr08r，通过PCR结合两种PCR产物。将得到的约2kb PCR产物克隆到pMTL83157-2,3bdh-T1载体和pMTL83157-2,3bdh-T2载体的PmeI限制性位点之间，得到
Figure BDA0003644747150000281
载体和pMTL83157-2,3bdh-T2_HA载体。
载体，pLZipl12-cas9，pMTL83157-2,3bdh-T1_HA和pMTL83157-2,3bdh-T2_HA，通过上述连接转化到产乙醇梭菌DSM23693。用上述第二质粒pMTL83157-2,3bdh-T1_HA或pMTL83157-2,3bdh-T2_HA转化一个带有pLZipl12-cas9的菌落。在含有5μg/ml克拉霉素、10μg/ml甲氧苄啶和15μg/ml甲砜霉素的PETC琼脂培养基上选择转化体。仅用pLZipl12-cas9和pMTL83157-2,3bdh-T2_HA观察菌落。由此，将8个菌落在含有所有3种抗生素和32n/μl无水四环素的PETC琼脂平板上划线，以诱导Cas9基因的表达。
使用引物Og33f/Og34r和KAPA聚合酶通过PCR筛选得到的菌落在2,3-bdh基因中的缺失。未修饰产乙醇梭菌DSM23693将扩增出3512bp的产物，以及2,3-bdh基因内和同源臂之间具有967bp片段缺失的突变体将扩增出2545bp的产物。从未修饰的产乙醇梭菌DSM23693和携带pLZipl12-cas9或pMTL83157-2,3bdh-T1_HA或pMTL83157-2,3bdh-T2_HA的产乙醇梭菌DSM23693扩增3512bp片段(图3A，泳道W，C1，C2和C3)，在携带2个载体pLZipl12-cas9和pMTL83157-2,3bdh-T2_HA的8个菌落中的5个中观察到2,3-bdh基因内967bp片段的缺失(图3A，泳道1-8，和图3B)。通过PCR产物的桑格尔测序进一步证实了缺失。
使用更强的四环素诱导型启动子来驱动Cas9基因表达和3'同源臂接近在2,3-bdh的间隔子2内的Cas9剪切体，使CRISPRii-cas9系统在产乙醇梭菌中的效率提升至60％。
实例4
此实例表明使用Cas9的切口酶版本和可替代质粒设计的产醇梭菌DSM23693中2,3-丁二醇脱氢酶(2,3-bdh)基因的缺失。
为了提高CRISPR/Cas9系统的效率并将转化步骤的数量从两个(如上述实施例中)减少到一个，进一步引入了两个修饰。第一个修饰是使用cas9基因的切口酶版本。第二种修饰是在单个质粒上组装所有三种CRISPR/Cas9组分(切口酶cas9，gRNA盒和同源臂)。
Cas9核酸酶由两个核酸内切酶结构域RuvC和HNH组成。随着RuvC结构域中位置10的天冬氨酸突变为丙氨酸(D10A)，已知突变体cas9仅保留切口酶活性，导致单链断裂而不是野生型cas9酶引入的双链断裂(Jinek，《科学(Science)》，337：816-821，2012)。
在AscI位点处组装2,3-bdh-gRNA-T1和PmeI位点之间的同源臂之后，使用寡核苷酸引入pLZipl12-cas9中的D10A突变。所得的质粒，pLZipl12-D10A-all3(图4)，被引入到产乙醇梭菌DSM23693，随后诱导切口酶Cas9表达并筛选2,3-bdh基因缺失。基因缺失效率与实施例3中观察到的相似。通过这种设计，进一步减少了转化步骤和处理时间。
本文中所引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请及专利特此以引用的方式并入本文中，其引用程度就如同每一参考文献单独地并且特定地以引用的方式并入本文并在本文中整体阐述一般。在本说明书中提到任何现有技术时不承认并且不应该认为承认现有技术形成任何国家所致力领域中的公共常识的一部分。
除非本文另外指出或明显与内容相矛盾，否则在描述本发明的内容中(尤其在以下权利要求书的内容中)使用术语“一(a/an)”和“所述”和类似指示物应理解为涵盖单数与复数。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被理解为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指示，否则本文中对值的范围的叙述仅意图充当单独地提及处于所述范围内的每一个单独的值的速记方法，并且每一个单独的值并入本说明书中，如同在本文中单独地叙述一般。除非在本文中另外指出或另外明显与上下文相矛盾，否则本文所描述的所有方法可以按任何适合的顺序进行。除非另有主张，否则本文中所提供的任何和所有实例或例示性语言(例如，“如”)的使用仅意图更好地阐明本发明但不对本发明的范畴造成限制。本说明书中的任何语言都不应理解为指示任何非请求保护的要素对于实践本发明是必需的。
本文中描述了本发明的优选实施例。在阅读前文描述之后，那些优选实施例的变化形式对于本领域普通技术人员可以变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员在适当时采用这些变化形式，并且本发明人意图以与本文中具体描述不同的方式来实施本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的随附权利要求书中所引述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文中另外指出或另外明显与上下文相矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能的变化形式的任何组合。

Claims (15)

1.一种对C1固定菌进行基因工程改造的方法，其包括在含有包含靶序列的DNA分子的C1固定菌中引入包含一个或多个载体的经过工程改造的非天然存在的规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)(CRISPR/Cas)系统，所述系统包括：
(a)编码与所述靶序列杂交的指导RNA的核苷酸序列，以及
(b)在诱导型启动子控制下编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列；
其中所述诱导型启动子为ipl12。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统在所述一个或多个载体上还包括：
(c)包含与所述靶序列的上游杂交的5'同源臂和与所述靶序列的下游杂交的3'同源臂的核苷酸序列，
其中所述5'同源臂和所述3'同源臂与所述DNA分子杂交并发生同源重组，导致位于所述5'同源臂与所述3'同源臂之间的DNA替换所述靶序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述Cas9具有催化活性。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述Cas9是切口酶Cas9。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas9无催化活性。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述Cas9切割编码基因的区域中的DNA分子，从而降低所述基因的表达。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas9阻断编码基因的区域中的DNA分子，从而降低所述基因的表达。
8.根据权利要求2所述的方法，其中位于所述5'同源臂和所述3'同源臂之间的所述DNA破坏编码基因的区域中的DNA分子，从而降低所述基因的表达。
9.根据权利要求2所述的方法，其中位于所述5'同源臂和所述3'同源臂之间的所述DNA编码外源基因，其中所述同源重组将所述外源基因插入所述DNA分子中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述C1固定菌表达所述外源基因。
11.根据权利要求1所述的方法，其中(a)和(b)位于相同或不同的载体上。
12.根据权利要求2所述的方法，其中(a)、(b)以及(c)位于相同或不同的载体上。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统源自于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述C1固定菌是产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)或拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述C1固定菌是产乙醇梭菌。
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