KR102514023B1 - 알데히드:페레독신 옥시도리덕타제 활성이 변경된 미생물 및 관련 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EC 1.2.7.5에 의해 정의된 반응을 촉매하는 효소, 예를 들어 알데히드:페레독신 옥시도리덕타제(AOR)의 활성이 감소 또는 제거된 비자연적으로 생성된 박테리아를 제공한다. 선택적으로, 상기 박테리아는 EC 1.2.1.10 및/또는 EC 1.1.1.1에 의해 정의된 반응을 촉매하는 효소, 예를 들어 알데히드 디히드로게나제, 알코올 디히드로게나제 또는 이작용성 알데히드/알코올 디히드로게나제의 활성이 또한 감소 또는 제거되어 있다. 또한, 본 발명은 CO, CO₂ 및 H₂ 중 하나 이상을 함유하는 기제상 기질의 존재하에 상기 박테리아를 배양함으로써 산물을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

알데히드:페레독신 옥시도리덕타제 활성이 변경된 미생물 및 관련 방법

관련 출원의 상호참조

본 출원은 2016년 5월 14일자로 출원된 미국 가특허출원 제 62/336,639 호의 이익을 주장하며,이 가특허출원의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.

에너지와 화학 물질을 위해 화석 연료를, 이들의 원래의 한정된 특성과 맞물려, 지속적으로 추출하고 발굴함으로써 야기되는 유해 환경 영향은 지속가능한 대안을 개발하는 데 주력하게 되는 원인이다. 이와 관련하여, 가스 발효는 산업 폐기물 가스를 연료 및 화학물질로 생물학적으로 전환시키기 위한 유망한 기술로 부상하여 왔다. 그러나, 가스-발효 박테리아를 위해 현재 개발된 유전적 도구와 효소 경로가 없다는 주요한 이유 때문에, 현재까지 가스 발효를 통해 생산된 산물들이 제한되어 있다. 따라서, 연료 및 화학물질의 생산을 위한 대체 미생물 및 방법이 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 EC 1.2.7.5에 의해 정의된 반응을 촉매하는 효소의 활성이 모체 박테리아(parental bacterium)와 비교하여 감소 또는 제거된 비자연적으로 생성된 박테리아를 제공한다. 일반적으로, 상기 비자연적으로 생성된 박테리아는 EC 1.2.7.5에 의해 정의된 반응을 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자에서 적어도 하나의 파괴성 돌연변이(disruptive mutation)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 EC 1.2.7.5에 의해 정의된 반응을 촉매하는 효소는 알데히드:페레독신 옥시도리덕타제(AOR)이다.

때때로, 상기 비자연적으로 생성된 박테리아는 EC 1.2.1.10 및/또는 EC 1.1.1.1에 의해 정의된 반응을 촉매하는 적어도 하나의 효소의 활성이 모체 박테리아와 비교하여 감소 또는 제거되어 있다. 예를 들어, 상기 박테리아는 EC 1.2.1.10 및/또는 EC 1.1.1.1에 의해 정의된 반응을 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자에서 적어도 하나의 파괴성 돌연변이를 갖는다. 상기 EC 1.2.1.10 및/또는 EC 1.1.1.1에 의해 정의된 반응을 촉매하는 효소는 이작용성(bifunctional) 알데히드/알코올 디히드로게나제, 알데히드 디히드로게나제 및 알코올 디히드로게나제로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

이러한 유전자 변형은 상기 비자연적으로 생성된 박테리아가 아세틸-CoA, 아세토아세틸-CoA, 아세토아세테이트, 아세톤, 이소프로판올, 3-히드록시이소발레릴-CoA, 3-히드록시이소발레레이트, 이소부틸렌, 이소프렌, 3-히드록시부티릴-CoA, 3-히드록시부티레이트, 3-히드록시부티릴알데히드, 1,3-부탄디올, 2-히드록시이소부티릴-CoA, 2-히드록시이소부티레이트, 피루베이트, 아세토락테이트, 아세토인, 2,3-부탄디올 및 락테이트와 같은 산물들을 생산하기에 적합하게 만든다.

특정 구체예들에서, 상기 비자연적으로 생성된 박테리아는 C1-고정 박테리아, 예를 들어, CO, CO₂ 및 H₂ 중 하나 이상을 포함하는 기체상 기질을 소모하는 박테리아이다.

상기 비자연적으로 생성된 박테리아는 EC 1.2.7.5에 의해 정의된 반응을 촉매하는 효소를 포함하는 모체 박테리아, 예를 들어, 알칼리바쿨룸 바치(Alkalibaculum bacchi), 블라우티아 프로둑타(Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로로플렉서스 오란티아커스(Chloroflexus aurantiacus), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 디설포비브리오 불가리스(Desulfovibrio vulgaris), 유박테리움 리모섬(Eubacterium limosum), 지오박터 설퍼리듀슨스(Geobacter sulfurreducens), 메틸로마이크로븀 알칼리필룸(Methylomicrobium alcaliphilum), 무렐라 써모아우트로피카(Moorella thermoautrophica), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 로도스피릴룸 루브럼(Rhodospirillum rubrum), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides), 써만에어로비브리오 아시다미노보란스( Thermanaerovibrio acidaminovorans), 써만에어로비브리오 아시다미노보란스( Thermanaerovibrio acidaminovorans), 써모아나에로박터 비에겔리(Thermoanaerobacter wiegelii), 써모디설포비브리오 옐로우스토니( Thermodesulfovibrio yellowstonii), 써모디설포비브리오 옐로우스토니( Thermodesulfovibrio yellowstonii), 또는 써머스 써모필러스 (Thermus thermophilus)로부터 유래하는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 이러한 비자연적으로 생성된 박테리아를 배양함으로써 산물을 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 배양은 CO, CO₂ 및 H₂ 중 하나 이상을 포함하는 기체상 기질의 존재하에서 수행될 수 있다.

도 1은 클로스트리디움 오토에타노게눔(C.　 autoethanogenum)의 아세트산 생성 생합성 경로의 도이다. 포스포트랜스아세틸라제(Pta), 아세테이트 키나제((Ack) 및 알데히드:페레독신 옥시도리덕타제(AOR)를 이용하는 ATP-효율성 간접에탄올 경로가 맨 왼쪽에 도시되어 있다. 이작용성 알데히드/알코올 디히드로게나제(AdhE) 또는 CoA-의존성 아세트알데히드 디히드로게나제 (Ald) 및 알코올 디히드로게나제(Adh)를 이용하는 직접 에탄올 생합성 경로는 중간부분에 도시되어 있다. AlsS = 아세토락테이트 합성효소; 2,3-BDH = 2,3-부탄디올 디히드로게나제; BudA = 아세토락테이트 디카르복실라제; CODH = 일산화탄소 디히드로게나제; CoFeSP = 코리노이드 철 황 단백질; Fd_ox = 산화된 페레독신; Fd_red = 환원된 페레독신; HytABCDE = NADP-의존성 전자 분기(electron bifurcating) 히드로게나제; Nfn = 트랜스히드로게나제; Pfor = 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제; Rnf = H⁺-전좌 페레독신: NAD⁺-옥시도리덕타제.
도 2는 aor1 및 aor2 KO 균주의 선별 및 확인을 보여주는 겔 이미지들의 세트이다. (A) 엑손-스패닝 프라이머(exon-spanning primer)들을 이용한 PCR의 겔 전기영동; 레인 3 및 4 = aor1 KO 균주; 레인 7 내지 16 = aor2 KO 균주; 레인 1 및 6= 비주형 대조군; 레인 5 및 17 = WT 대조군; M = NEB 2-log DNA 래더(ladder)(kb); (B) aor1 KO 균주(레인 18 내지 20) 및 aor2 KO 균주(레인 21 내지 23)의 HindIII 절단 게놈 DNA의 서던 블롯 분석; L = Promega Lambda DNA/HindIII 마커(bp).
도 3은 adhE1a, adhE1b 및 adhE2 KO 균주의 선별 및 확인을 보여주는 겔 이미지들의 세트이다. (A) 엑손-스패닝 프라이머들을 이용한 PCR의 겔 전기영동; 레인 2 내지 4 = adhE1a KO 균주; 레인 7 내지 9 = adhE1b KO 균주; 레인 12 내지 14 = adhE2 KO 균주; 레인 1, 6 및 11 = 비주형 대조군; 레인 5, 10 및 15 = WT 대조군; M = NEB 2-log DNA 래더; (B) adhE1a KO 균주(레인 16 내지 18), adhE1b KO 균주(레인 19 및 20) 및 adhE2 KO 균주(레인 21 내지 23)의 HindIII 절단 게놈 DNA의 서던 블롯 분석. L = Promega Lambda DNA/HindIII 마커.
도 4는 pyrE가 복구된(restored) aor 이중 KO 균주의 확인을 보여주는 겔 이미지들의 세트이다. (A) △aor2 및 aor1 KO 균주의 PCR 선별; (B) 복구된 pyrE 대립유전자에 대한 우라실 자가영양 aor 이중 KO 균주의 PCR 선별; (C) aor1 KO 균주의 서던 블롯 분석. M = NEB 2-log DNA 래더; 1 내지 6 = aor2-seq-F 및 aor2-seq-R 프라이머 쌍; 7 내지 12 = aor1-559s-F 및 aor1-559s-R 프라이머 쌍; 13 내지 18 = ACE-pyrE-F 및 ACE-pyrE-R 프라이머 쌍; 1, 7 및 13 = 비주형 대조군; 6, 12, 18 및 23 = 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum) WT 게놈 DNA 대조군; 2 내지 5, 8 내지 11, 14 내지 17 = pyrE이 복구된 aor 이중 KO 균주의 클론; 19 내지 22 = aor1 KO 균주의 HindIII 절단 게놈 DNA.
도 5는 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum) adhE1mut, ΔadhE1 및 ΔadhE1+2 균주의 선별을 보여주는 겔 이미지들의 세트이다. (A) ΔadhE1mut 균주의 PCR 선별; (B) ΔadhE1 균주의 PCR 선별; 및 (C) adhE1+2 균주의 PCR 선별. 레인 5, 8, 9, 10, 15 및 16 = △adhE1mut 균주; 레인 28, 29, 32, 33 및 38 = ΔadhE1 균주; 레인 47 내지 55 = △adhE1+2 균주; 레인 1, 19 및 45 = 비주형 대조군; 레인 18, 44 및 56 = WT 게놈 DNA 대조군; M = NEB 2-log DNA 래더(kb).
도 6은 CO에서 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum) WT(원형), aor1 KO(삼각형), aor2 KO(사각형) 및 aor1+2 KO 균주(다이아몬드형)의 성장, 헤드스페이스 압력 변화 및 대사산물 프로파일들을 보여주는 그래프들의 세트이다. (A) 성장 프로파일; (B) 배양의 출발로부터 종료시까지의 헤드스페이스 압력의 변화; (C) 아세테이트 프로파일; (D) 에탄올 프로파일; (E) 2,3-부탄디올 프로파일; 및 (F) 락테이트 프로파일; 각 균주의 경우 n = 4(aor2 KO의 경우의 n = 3은 제외함); 오차 막대 = s.e.m.
도 7은 보충된(complemented) aor1 균주의 확인을 보여주는 겔 이미지들의 세트이다. (A) 엑손 스패닝 aor1 프라이머들을 이용한 aor1 보충 aor1 균주 유래의 게놈 DNA의 PCR(레인 2 내지 4); M = NEB 2-Log DNA 래더; 1 = 비주형 대조군; 5 = WT 게놈 DNA 대조군; 6 = aor1 KO 대조군; (B) 보충된 균주 유래의 구출된(rescued) 플라스미드인 pMTL83151-PacsA-aor1의 AscI 및 PmeI 제한 절단물(digest)들(레인 7 내지 12).
도 8은 200 kPa CO에서 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum ) WT, aor1 KO 및 보충 aor1 균주의 성장, 헤드스페이스 압력 및 대사산물 프로파일들을 보여주는 그래프들의 세트이다. (A) 성장 프로파일; (B) 헤드스페이스 압력의 변화; (C) 아세테이트 프로파일 프로파일; (D) 에탄올 프로파일; (E) 2,3-부탄디올 프로파일; 및 (F) 락테이트 프로파일. 원형 = WT (n = 4); 삼각형 = aor1 균주 (n = 4); 사각형 = 보충 aor1 균주 (n = 3); 오차 막대 = 평균의 표준 오차.
도 9는 프럭토오스에서 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum ) WT, aor1 KO, aor2 KO 및 aor1+2 KO 균주의 성장 및 대사산물 프로파일들을 보여주는 그래프들의 세트이다. (A) 성장 프로파일; (B) 아세테이트 프로파일; (C) 에탄올 프로파일; 및 (D) 2,3-부탄디올 프로파일. 원형 = WT (n = 4); 삼각형 = aor1 균주 (n = 3); 사각형 = aor2 균주 (n = 3); 다이아몬드형 = aor1+2 KO 균주 (n = 4); 오차 막대 = s.e.m.
도 10은 H₂+CO₂에서 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum ) WT 및 aor1+2 KO 균주의 성장, 헤드스페이스 압력 및 대사산물 프로파일들을 보여주는 그래프들의 세트이다. (A) 성장 프로파일; (B) 헤드스페이스 압력의 변화; (C) 아세테이트 프로파일; (D) 에탄올 프로파일; 원형 = WT (n = 4); 사각형 = aor1+2 KO 균주 (n = 4); 오차 막대 = s.e.m.
도 11은 60 mM 아세테이트 및 200 kPa CO의 존재하에서 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum ) WT 및 aor1+2 KO 균주의 성장, 헤드스페이스 압력 및 대사산물 프로파일들을 보여주는 그래프들의 세트이다. (A) 성장 프로파일; (B) 헤드스페이스 압력의 변화; (C) 아세테이트 프로파일; (D) 에탄올 프로파일; (E) 2,3-부탄디올 프로파일; 및 (F) 락테이트 프로파일. 원형 = WT; 사각형 = aor1+2 KO 균주; n = 3; 오차 막대 = s.e.m.
도 12는 40 mM 프로피오네이트 및 200 kPa CO의 존재하에서 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum ) WT 및 aor1+2 KO 균주의 성장, 헤드스페이스 압력 및 대사산물 프로파일들을 보여주는 그래프들의 세트이다. (A) 성장 프로파일; (B) 헤드스페이스 압력의 변화; (C) 아세테이트 프로파일; (D) 에탄올 프로파일; (E) 2,3-부탄디올 프로파일; (F) 락테이트 프로파일; (G) 프로피오네이트 프로파일; 및 (H) 1-프로판올 프로파일. 원형 = WT; 사각형 = aor1+2 KO 균주; n = 3; 오차막대 = s.e.m.
도 13은 40 mM 부티레이트 및 200 kPa CO의 존재하에서 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum ) WT 및 aor1+2 KO 균주의 성장, 헤드스페이스 압력 및 대사산물 프로파일들을 보여주는 그래프들의 세트이다. (A) 성장 프로파일; (B) 헤드스페이스 압력의 변화; (C) 아세테이트 프로파일; (D) 에탄올 프로파일; (E) 2,3-부탄디올 프로파일; (F) 락테이트 프로파일; (G) 프로피오네이트 프로파일; 및 (H) 1-프로판올 프로파일. 원형 = WT; 사각형 = aor1+2 KO 균주; n = 3; 오차 막대 = s.e.m.
도 14는 프럭토오스에서 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenu ) WT 및 adhE KO 균주의 성장 및 대사산물 프로파일들을 보여주는 그래프들의 세트이다. (A) 성장 프로파일; (B) 아세테이트 프로파일; (C) 에탄올 프로파일; 및 (D) 2,3-부탄디올 프로파일. 원형 = WT (n = 4); 삼각형 = adhE1a KO 균주 (n = 3); 역삼각형 = adhE1b KO 균주 (n = 3); 사각형 = adhE2 KO 균주 (n = 3); 오차 막대 = s.e.m.
도 15는 프럭토스에서 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum ) pyrE 및 ΔadhE1mut 균주의 성장, 대사산물 및 adhE2 전사체 프로파일들을 보여주는 그래프들의 세트이다. (A)성장 프로파일; (B) 아세테이트 프로파일; (C) 에탄올 프로파일; 및 (D) 상대적 adhE2 mRNA 프로파일. 원형 = △pyrE (n = 3); 사각형 = △adhE1mut (n = 3). 오차 막대 = s.e.m.
도 16은 CO에서 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum ) WT 및 adhE KO 균주의 성장 및 대사산물 프로파일들을 보여주는 그래프들의 세트이다. (A) 성장 프로파일; (B) 아세테이트 프로파일; (C) 에탄올 프로파일; 및 (D) 2,3-부탄디올 프로파일. 원형 = WT (n = 4); 삼각형 = adhE1a KO 균주 (n = 3); 역삼각형 = adhE1b KO 균주 (n = 2); 사각형 = adhE2 KO 균주 (n = 3); 오차 막대 = s.e.m.
도 17은 200 kPa CO에서 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenu ) △pyrE 및 △adhE1mut 균주의 성장 및 대사산물 프로파일들을 보여주는 그래프들의 세트이다. (A) 성장 프로파일; (B) 아세테이트 프로파일; (C) 에탄올 프로파일; 및 (D) 2,3-부탄디올 프로파일. 원형 = △pyrE (n = 3); 사각형 = △adhE1mut (n = 3). 오차 막대 = s.e.m.

발명의 상세한 설명

많은 미생물은 핵심 대사 기능을 지원하기 위해 산의 알데히드로의 효소적 전환에 의존한다. 알데히드:페레독신 옥시도리덕타제(AOR)(EC 1.2.7.5)는 다수의 고세균 및 박테리아에서 이러한 기능을 수행함으로써, 아세트산(아세테이트)와 같은 산과 환원된 페레독신의 반응을 촉매하여 아세트알데히드와 알데히드 및 산화된 페레독신을 형성한다.

AOR은 에탄올-생산 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 미생물에서 특히 중요하다. 환원성 아세틸-CoA 경로라고도 알려져 있는 우드-륭달 경로는 아세틸-CoA에 대한 유일한 선형 CO₂　고정(fixation) 경로이고(Drake, Ann NY Acad Sci, 1125: 100-128, 2008), 가장 효율적인 비광합성 탄소 고정 기작인 것으로 간주된다(Fast, Curr Opin Chem Eng, 1: 380-395, 2012). 간략히 말해서, 우드-륭달 경로는 두개의 분지(branch), 즉, 메틸(Eastern) 및 카르보닐(Western) 분지로 구성된다(도 1). 상기 메틸 분지에서는, CO₂가 환원되어 포름에이트를 형성한다. 다음에, 상기 포름에이트는 테트라히드로폴레이트(THF)와의 축합을 통해 활성화되어 포르밀-THF를 형성함으로써, 1 분자의 ATP를 소모한다. 여러 반응에 걸쳐서, 포리밀-THF는 메틸-THF로 환원된다. 상기 메틸 분지의 최종 단계에서는, 메틸기는 코리노이드 철-황 함유 단백질(CoFeSP)에 전달된 다음 카르보닐 분지 유래의 CO 분자에 융합되어 이작용성 일산화탄소 디히드로게나제/아세틸-CoA 합성효소(CODH/ACS) 복합체를 통해 아세틸-CoA를 형성한다. CO에서 자가영양적으로 성장하는 경우, 상기 메틸 분지에 필요한 CO₂는 CODH-촉매된 물-가스 이동 반응을 통해 발생된다. 마찬가지로, CO₂ 상에서의 자가영양 성장 동안, 상기 CO는 카르보닐 분지에서 CODH에 의해 CO₂로 부터 형성된다.

특히, 아세트산 생성(acetogenic) 에탄올 생산균(producer)의 에탄올 생합성 경로는 하기와 같은 두 개의 주요 경로들을 포함한다(도 1): (i) 대장균을 비롯한 다른 에탄올 생산 박테리아에서 확인되는 바와 같은 이작용성 알데히드/알코올 디히드로게나제(AdhE) 또는 알데히드 디히드로게나제(Ald) 및 알코올 디히드로게나제(Adh)를 이용한 아세트알데히드를 통한 아세틸-CoA의 에탄올로의 직접적인 2단계 순차적 환원(Membrillo-Hernandez, J Bacteriol, 181: 7571-7579, 1999); 및 (ii) 아세테이트를 통해 진행되고 Adh를 통한 에탄올 합성 전에 아세테이트를 아세트알데히드로 우선 환원시키기 위해 알데히드:페레독신 옥시도리덕타제(AOR)를 이용하는 간접적인 경로(K

pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010; Mock, J Bacteriol, 197: 2965-2980, 2015).

상기 두개의 에탄올 생합성 경로들 사이의 하나의 중요한 차이는 상기 간접 경로는, 산물의 수율을 제한하고 높혀진 농도에서 독성이 있는 것으로 알려져 있기 때문에 공업적 발효에서 원치않는 부산물로서 일반적으로 간주되는 아세테이트를 환원시킨다는 것이다. 천연에서 분리한 아세트산 생성 세균(acetogen)들은 모두 기질 수준 인산화(SLP)를 통한 아세테이트 1몰 당 하나의 ATP의 보존을 통해 이점을 제공하는 아세테이트를 형성하고, 이는 자가영양 성장의 ATP-제한 조건하에서 중요하게 된다. 열역학적 및 화학양론적 분석 결과, H₂ + CO₂ 에서 클로스트리디움 오토에타노게눔(C.　autoethanogenum)의 아세트산 생성 성장(acetogenic growth) 동안, ATP 수율은 에탄올로의 아세테이트 환원을 통해서는 1.2 ATP/mol 에탄올인 것과 비교하여, 아세트알데히드로의 아세틸-CoA 환원을 통해서는 겨우 0.5 ATP/mol 에탄올인 것으로 추정되었다(Mock, J Bacteriol, 197: 2965-2980, 2015).

따라서, AOR을 통한 간접적인 에탄올 생산은 알데히드 디히드로게나제 및 알코올 디히드로게나제를 통한 직접적인 에탄올 생산과 비교하여, 에너지 보존 및 아세테이트 환원 모두에 관련된 이점들을 제공한다. 이러한 효소는 물질대사에서 위와 같이 중요한 역할을 하기 때문에, AOR의 파괴는 예전에 어떠한 박테리아 종에서도 입증된 적이 없다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명자들은 박테리아를 유전적으로 변형시켜서 AOR 활성을 감소 또는 제거하면 그 박테리아는 특정 유형의 산물들의 생산에 더욱 적당하게 된다는 것을 확인했다.

특히, AOR 활성을 감소 또는 제거하면, 에탄올로의 탄소 흐름(flux)이 감소하고 다른 비에탄올 산물로의 탄소 흐름이 증가한다. 예를 들어, 본 발명의 미생물은 아세틸-CoA, 아세토아세틸-CoA, 아세토아세테이트, 아세톤, 이소프로판올, 3-히드록시이소발레릴-CoA, 3-히드록시이소발레레이트, 이소부틸렌, 이소프렌, 3-히드록시부티릴-CoA, 3-히드록시부티레이트, 3 히드록시부티릴알데히드, 1,3-부탄디올, 2-히드록시이소부티릴-CoA, 2 히드록시이소부티레이트, 피루베이트, 아세토락테이트, 아세토인, 2,3-부탄디올 및 락테이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 산물을 생산하는데 사용될 수 있다.

정의 및 배경

미생물과 관련하여 사용될 때 "자연 발생적이지 않은"이란 용어는 그 미생물이 인위적으로 변형되었고, 기준이 되는 종의 자연 발생적인 균주에서 확인되지 않는, 즉, 기준이 되는 종들 중 야생형 균주에서 확인되지 않는 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는다는 것을 의미하기 위해 사용된다.

용어 "유전자 변형", "유전자 변경" 또는 "유전자 조작"은 미생물의 게놈 또는 핵산의 조작을 일반적으로 의미한다. 마찬가지로, 용어 "유전적으로 조작된"은 조작된 게놈 또는 핵산을 포함하는 미생물을 의미한다. 유전자 변형 방법들로는, 예를 들어, 이종 유전자 발현, 유전자 또는 프로모터 삽입 또는 결실, 핵산 돌연변이, 변경된 유전자 발현 또는 불활성화, 효소 조작, 지시된 진화(directed evolution), 이론 기반 디자인(knowledge-based design), 무작위 돌연변이유발 방법, 유전자 뒤섞음(gene shuffling), 및 코돈 최적화가 있다.

"재조합"은 핵산, 단백질 또는 미생물이 유전자 변형, 조작 또는 재조합의 생성물인 것을 가리킨다. 일반적으로, 용어 "재조합"은 미생물의 둘 이상의 상이한 균주들 또는 종들과 같은 다수의 출처로부터 유래한 유전자 물질을 함유하거나 그에 의해 암호화되는 핵산, 단백질 또는 미생물을 의미한다. 본 원에서 사용되는 용어 "재조합"은 돌연변이된 형태의 내인성 핵산 또는 단백질을 비롯한 돌연변이된 핵산 또는 단백질을 포함하는 미생물을 설명하기 위해 사용될 수도 있다.

"야생형"은 돌연변이 또는 변이 형태와 다르게 천연에서 발생하는 생물, 균주, 유전자 또는 특징들의 대표적인 형태를 의미한다.

"내인성(endogenous)"은 본 발명의 미생물이 유래되는 야생형 또는 모체 미생물(parental microorganism)에서 존재하거나 발현되는 핵산 또는 단백질을 의미한다. 예를 들어, 내인성 유전자는 본 발명의 미생물이 유래되는 야생형 또는 모체 미생물에서 본래 존재하는 유전자이다. 일 구체예에서, 내인성 유전자의 발현은 외인성 프로모터와 같은 외인성 조절 요소에 의해 조절될 수 있다.

"외인성(exogenous)"은 본 발명의 미생물이 유래되는 야생형 또는 모체 미생물에서 존재하지 않는 핵산 또는 단백질을 의미한다. 일 구체예에서, 외인성 유전자 또는 효소는 본 발명의 미생물에 도입되거나 그 미생물에서 발현되는 이종기원의(즉, 상이한) 균주 또는 종에서 유래될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 외인성 유전자 또는 효소는 인위적으로 또는 재조합적으로 생성되고 본 발명의 미생물에 도입 또는 그 미생물에서 발현될 수 있다. 외인성 핵산은 본 발명의 미생물의 게놈에 통합되도록 또는 본 발명의 미생물에서 염색체외 상태(extra-chromosomal state), 예를 들어, 플라스미드로 잔류하도록 개조될 수있다.

용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오디트 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이거나 이들의 유사체인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 삼차원적 구조를 가질 수 있고, 알려져 있거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기의 것들은 폴리뉴클레오티드늬 비제한적인 예들이다: 유전자 또는 유전자 단편의 암호화 또는 비암호화 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌(locus), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은-헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체와 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조의 변형은 그 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 뉴클레오티드가 아닌 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 표지 성분과의 접합을 통해서 중합 후에 추가로 변형될 수 있다.

본 원에서 사용되는 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예를 들어 mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 나중에 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 전사체 및 암호화된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"이라고 할 수 있다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산들의 중합체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비아미노산(non-amino acid)에의해 중단(interrupted)될 수 있다. 또한, 상기 용어들은, 예를 들어 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 다른 임의의 조작을 통해 변형된 아미노산 중합체도 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 및/또는 비천연 합성 아미노산들(글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 모두를 포함), 및 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱스(peptidomimetics)를 포함한다.

"효소 활성" 또는 간단히 "활성"은 효소의 활성, 효소의 양, 또는 반응을 촉매하기 위한 효소의 이용성을 포함하나 이에 제한되지 않는 효소적 활성을 일반적으로 의미한다. 따라서, 효소 활성을 "증가시키는 것"은 효소의 활성을 증가시키거나, 효소의 양을 증가시키거나, 반응을 촉매하기 위한 효소의 이용성(availability)을 증가시키는 것을 포함한다. 마찬가지로, 효소 활성을 "감소시키는 것"은 효소의 활성을 감소시키거나, 효소의 양을 감소시키거나, 반응을 촉매하기 위한 효소의 이용성을 감소시키는 것을 포함한다.

"돌연변이된"은 본 발명의 미생물이 유래되는 야생형 또는 모체 미생물과 비교하여 본 발명의 미생물에서 변형되어진 핵산 또는 단백질을 의미한다. 일 구체예에서, 돌연변이는 효소를 암호화하는 유전자에서의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 돌연변이는 효소에서의 하나 이상의 아미노산들의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다.

특히, "파괴성 돌연변이(disruptive mutation)"는 유전자 또는 효소의 발현 또는 활성을 감소 또는 제거하는(즉, "파괴하는") 돌연변이이다. 상기 파괴성 돌연변이는 유전자 또는 효소를 부분적으로 불활성화시키거나, 완전히 불활성화시키거나, 또는 결실시킬 수 있다. 상기 파괴성 돌연변이는 녹아웃(KO) 돌연변이일 수 있다. 상기 파괴성 돌연변이는 효소에 의해 생산되는 산물의 생합성을 감소, 방지 또는 차단하는 임의의 돌연변이일 수 있다. 다수의 아형(isoform)의 효소를 갖는 미생물에 있어서, 상기 효소의 하나의 아형, 둘 이상의 아형, 또는 모든 아형들의 발현 또는 활성을 감소 또는 제거하기 위해 하나 이상의 파괴성 돌연변이가 도입될 수 있다. 상기 파괴성 돌연변이는 예를 들어, 효소를 암호화하는 유전자 내의 돌연변이, 효소를 암호화하는 유전자의 발현에 관여하는 유전자 조절 요소 내의 돌연변이, 효소의 활성을 감소 또는 억제하는 단백질을 생산하는 핵산의 도입, 또는 효소의 발현을 억제하는 핵산(예를 들어, 안티센스 RNA, siRNA, CRISPR) 또는 단백질의 도입을 포함할 수 있다. 상기 파괴성 돌연변이는 당업계에 알려진 임의의 방법을 이용히여 도입될 수 있다.

파괴성 돌연변이를 도입하면, 본 발명의 미생물이 유래되는 모체 미생물과 비교하여 아세트알데히드 및/또는 에탄올을 전혀 생산하지 않거나 아세트알데히드 및/또는 에탄올을 실질적으로 생산하지 않거나 감소된 양의 아세트알데히드 및/또는 에탄올을 생산하는 본 발명의 미생물이 얻어진다. 예를 들어, 본 발명의 미생물은 아세트알데히드 및/또는 에탄올을 전혀 생산하지 않거나 모체 미생물보다 적어도 약 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 더 적은 아세트알데히드 및/또는 에탄올을 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 미생물은 약 0.001, 0.01, 0.10, 0.30, 0.50 또는 1.0 g/L 미만의 아세트알데히드 및/또는 에탄올을 생산할 수 있다.

용어 "변이체(variants)"는 종래 기술에서 개시되었거나 본원에서 예시된 기준 핵산 및 단백질의 서열과 같은 기준 핵산 및 단백질의 서열과 비교하여 그의 서열이 변화하는 핵산 및 단백질을 포함한다. 본 발명은 기준 핵산 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 변이 핵산 또는 단백질을 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 변이 단백질은 기준 단백질과 실질적으로 동일한 기능 또는 실질적으로 동일한 반응을 수행할 수 있다. 변이 유전자는 기준 유전자와 동일하거나 실질적으로 동일한 단백질을 암호화할 수 있다. 변이 프로모터는 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하기 위한 능력이 기준 프로모터와 실질적으로 동일할 수 있다.

"미생물"은 미시적인 생물, 특히 박테리아, 고세균, 바이러스 또는 진균류(fungus)이다. 본 발명의 미생물은 일반적으로는 박테리아이다. 본원에서 사용되는 "미생물"의 언급은 박테리아를 포함하도록 취해져야 한다.

"모체 미생물(parental microorganism)"은 본 발명의 미생물을 발생하기 위해 사용된 미생물이다. 상기 모체 미생물은 자연 발생적인 미생물(즉, 야생형 미생물)이거나 이미 변형되어진 미생물(즉, 돌연변이 또는 재조합 미생물)일 수 있다. 본 발명의 미생물은 모체 미생물에서 발현 또는 과발현되지 않은 하나 이상의 효소를 발현하도록 변형될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 미생물은 모체 미생물에 포함되지 않은 하나 이상의 유전자를 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 미생물은 모체 미생물에서 발현된 하나 이상의 효소를 더욱 작은 양으로 발현하도록 변형될 수 있다.

본 발명의 미생물은 기능적 및/또는 구조적인 특징에 따라 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 미생물은 C1-고정 미생물, 혐기성 미생물, 아세트산 생성 미생물(acetogen), 에탄올 생성 미생물(ethanologen), 일산화탄소 영양 미생물(carboxydotroph) 및/또는 메탄 영양 미생물(methanotroph)일 수 있거나 그로부터 유래될 수 있다. 하기 표 1은 그들의 기능적 및 구조적인 특징들을 확인하는 미생물들의 대표적인 목록을 제공한다.

"C1"은 탄소가 하나인 분자(one-carbon molecule), 예를 들어, CO, CO₂, CH₄, 또는 CH₃OH를 의미한다. "C1-옥시게네이트"는 적어도 하나의 산소 원자를 또한 포함하는 탄소가 하나인 분자, 예를 들어, CO, CO₂, 또는 CH₃OH를 의미한다. "C1-탄소원"은 본 발명의 미생물을 위하여 부분적이거나 단독 탄소원으로 이용되는 탄소가 하나인 분자를 의미한다. 예를 들어, C1-탄소원은 CO, CO₂, CH₄, CH₃OH 또는 CH₂O₂ 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게, C1-탄소원은 CO 및 CO₂ 중 하나 또는 모두를 포함한다. "C1-고정 미생물"은 C1-탄소원으로부터 하나 이상의 산물을 생산하는 능력을 갖는 미생물이다. 일반적으로, 본 발명의 미생물은 C1-고정 박테리아이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 상기 표 1에서 확인된 C1-고정 미생물에서 유래된다."혐기성 미생물"은 성장을 위해 산소를 필요로 하지 않는 미생물이다. 혐기성 미생물은 산소가 특정 임계값 이상으로 존재하는 경우 부정적으로 작용할 수 있거나 심지어는 죽을 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 미생물은 혐기성 미생물이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 상기 표 1에서 확인된 혐기성 미생물에서 유래된다.

"아세트산 생성 미생물"은 혐기성 호흡의 생성물로서 아세테이트 (또는 아세트산)을 생산하거나 생산할 수 있는 미생물이다. 일반적으로, 아세트산 생성 미생물은 에너지 보존 및 아세틸-CoA 및 아세틸-CoA-유래 산물(예, 아세테이트)의 합성을 위한 그의 주요 기작으로서 우드-륭달 경로를 이용하는 절대 혐기성 박테리아이다(Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). 아세트산 생성 미생물은 (1) CO₂로부터 아세틸-CoA의 환원적 합성을 위한 기작, (2) 말단 전자를 수용하는 에너지 보존 과정, (3) 셀 탄소(cell carbon)의 합성에서 CO₂의 고정(동화)을 위한 기작으로서 아세틸-CoA 경로를 이용한다(Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3^rd edition, p. 354, New York, NY, 2006). 모든 자연발생적인 아세트산 생성 미생물들은 C1-고정, 혐기성, 자가영양 및 비메탄영양 미생물이다. 일반적으로, 본 발명의 미생물은 아세트산 생성 미생물이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 상기 표 1에서 확인된 아세트산 생성 미생물에서 유래된다.

"에탄올 생성 미생물(ethanologen)"은 에탄올을 생성하거나 생성할 수 있는 미생물이다. 특정의 구체예들에서, 본 발명의 미생물은 에탄올 생성 미생물이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 상기 표 1에서 확인된 에탄올 생성 미생물에서 유래된다. 그러나, AOR 및 AdhE가 에탄올 생합성에 관여하기 때문에, 미생물의 AOR 및/또는 AdhE를 파괴(disruption)하면, 에탄올 생산에 관한 변형된 표현형이 얻어질 수 있다.

"자가영양 미생물(autotroph)"은 유기 탄소없이 성장할 수 있는 미생물이다. 대신에, 자가영양 미생물은 CO 및/또는 CO₂와 같은 무기 탄소원을 이용한다. 일반적으로, 본 발명의 미생물은 자가영양 미생물이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 상기 표 1에서 확인된 자가영양 미생물에서 유래된다.

"일산화탄소 영양 미생물(carboxydotroph)"은 단일 탄소원으로 CO를 이용할 수 있는 미생물이다. 일반적으로, 본 발명의 미생물은 일산화탄소 영양 미생물이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 상기 표 1에서 확인된 일산화탄소 영양 미생물에서 유래된다.

"메탄 영양 미생물(methanotroph)"은 단일 탄소원 및 에너지원으로 메탄을 이용할 수 있는 미생물이다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 미생물은 메탄 영양 미생물이거나 메탄 영양 미생물에서 유래된다. 다른 구체예들에서, 본 발명의 미생물은 메탄 영양 미생물이 아니거나 메탄 영양 미생물에서 유래되지 않는다.

본 발명의 미생물이 유래되는 모체 미생물은 EC 1.2.7.5에 의해 정의된 반응을 촉매하는 효소를 일반적으로 포함한다. 이러한 효소는 산을 이의 상응하는 알데히드로 전환하는 역할을 한다. 더욱 구체적으로, 이러한 효소는 carboxylate + 2 H⁺ + 2 환원 페레독신의 알데히드 + H₂O + 2 산화 페레독신으로의 전환을 촉매한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 반응을 촉매하는 효소는 AOR이다.

아세트산 생성 미생물에서, AOR의 활성은 산화 CO에 결합되거나(CO 디히드로게나제를 통해, EC 1.2.7.4) 또는 수소에 결합되어(페레독신-의존성 히드로게나제를 통해, EC 1.12.7.2 또는 1.12.1.4) 환원된 페레독신을 생성한다(K

pke, Curr Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K

pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). 예를 들어, 클로스트리디움 오토에타노게눔(C.　 autoethanogenum)의 게놈은, 나란히 나타나고 잠재적으로 유전자 복제의 결과인 두 개의 aor 아형(CAETHG_0092 및 0102) 및 두 개의 adhE 유전자(CAETHG_3747 및 3748)를 암호화한다(Brown, Biotechnol Biofuels, 7: 1-18, 2014). 동일한 배열이 클로스트리디움 륭달리이(C.　ljungdahlii)에서도 확인된다(K

pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010; Leang, Appl Environ Microbiol, 79: 1102-1109, 2013).

바람직하게는, 상기 모체 미생물은 알칼리바쿨룸 바치(Alkalibaculum bacchi), 블라우티아 프로둑타(Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로로플렉서스 오란티아커스(Chloroflexus aurantiacus), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 디설포비브리오 불가리스(Desulfovibrio vulgaris), 유박테리움 리모섬(Eubacterium limosum), 지오박터 설퍼리듀슨스(Geobacter sulfurreducens), 메틸로마이크로븀 알칼리필룸(Methylomicrobium alcaliphilum), 무렐라 써모아우트로피카(Moorella thermoautrophica), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 로도스피릴룸 루브럼(Rhodospirillum rubrum), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides), 써만에어로비브리오 아시다미노보란스( Thermanaerovibrio acidaminovorans), 써만에어로비브리오 아시다미노보란스( Thermanaerovibrio acidaminovorans), 써모아나에로박터 비에겔리(Thermoanaerobacter wiegelii), 써모디설포비브리오 옐로우스토니( Thermodesulfovibrio yellowstonii), 써모디설포비브리오 옐로우스토니( Thermodesulfovibrio yellowstonii), 및 써머스 써모필러스 (Thermus thermophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 박테리아이다.

바람직한 구체예에서, 상기 모체 미생물은 부다페스트 조약의 조건에 따라 2010년 6월 7일자로 독일 D-38124 브라운슈바이크(Braunschwieg) Inhoffenstraß 7B에 소재한 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ))에 2010년 6월 7일자로 기탁되었고 기탁번호(accession number) DSM23693를 부여받은 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium　autoethanogenum) LZ1561이다.

용어 "에서 유래된"는 핵산, 단백질 또는 미생물이 새로운 핵산, 단백질 또는 미생물을 생성하도록 상이한(예를 들어, 모체 또는 야생형) 핵산, 단백질 또는 미생물로부터 변형 또는 개조되는 것을 의미한다. 일반적으로, 이러한 변형 또는 개조는 핵산 또는 유전자의 삽입, 결실, 돌연변이 또는 치환을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 미생물은 알칼리바쿨룸 바치(Alkalibaculum bacchi), 블라우티아 프로둑타(Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로로플렉서스 오란티아커스(Chloroflexus aurantiacus), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 디설포비브리오 불가리스(Desulfovibrio vulgaris), 유박테리움 리모섬(Eubacterium limosum), 지오박터 설퍼리듀슨스(Geobacter sulfurreducens), 메틸로마이크로븀 알칼리필룸(Methylomicrobium alcaliphilum), 무렐라 써모아우트로피카(Moorella thermoautrophica), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 로도스피릴룸 루브럼(Rhodospirillum rubrum), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides), 써만에어로비브리오 아시다미노보란스(Thermanaerovibrio acidaminovorans), 써만에어로비브리오 아시다미노보란스(Thermanaerovibrio acidaminovorans), 써모아나에로박터 비에겔리(Thermoanaerobacter wiegelii), 써모디설포비브리오 옐로우스토니(Thermodesulfovibrio yellowstonii), 써모디설포비브리오 옐로우스토니(Thermodesulfovibrio yellowstonii), 및 써머스 써모필러스 (Thermus thermophilus)로 이루어진 군에서 선택된 모체 미생물에서 유래한다. 일 구체예에서, 본 발명의 미생물은 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium　autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii ), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei ), 또는 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii)에서 유래된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 DSMZ 기탁 번호 DSM23693호로서 기탁되어 있는 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium　autoethanogenum) LZ1561에서 유래된다.

하기의 표는 AOR 유전자/효소들을 포함하는 미생물들의 예시적인 목록을 제공한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum ), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei ) 및 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii ) 종을 포함하는 클로스트리디움 강(cluster)에서 유래된다. 이러한 종들은 Abrini (Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994) (Clostridium autoethanogenum), Tanner (Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993) (Clostridium ljungdahlii), 및 Huhnke (WO　2008/028055 (Clostridium ragsdalei))에 의해 최초로 보고되었고 특성 규명되었다.이러한 종들은 많은 유사성을 가지고 있다. 특히, 이러한 종들은 모두 클로스트리디움 속의 C1-고정, 혐기성, 아세트산 생성, 에탄올 생성 및 일산화 탄소 영양 멤버들이다. 이러한 종들은 유사한 유전자형 및 표면형 및 유사한 에너지 보존 및 발효 대사 모드를 가지고 있다. 또한, 이러한 종들은 동일성이 99% 초과인 16S rRNA DNA를 갖는 클로스트리움 rRNA 상동(homology) 그룹 I에 모여있고(clustered), 약 22 내지 30 mol%의 DNA G　+　C 함량을 갖고, 그램-양성이고, 유사한 형상 및 크기를 갖고(0.5 내지 0.7 x 3 내지 5 μm의 대수 성장 세포), 중온성이고(30 내지 37℃에서 최적으로 성장함), 약 4 내지 7.5의 유사한 pH 범위를 갖고(약 5.5 내지 6의 최적 pH를 가짐), 사이토크롬이 없고, Rnf 복합체를 통해 에너지를 보존한다. 또한, 카르복시산들의 이들의 해당하는 알코올로의 환원이 이러한 종들에서 확인되었다(Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). 중요한 것은 이러한 종들은 모두 CO-함유 기체 상에서 강한 자가영양 성장을 또한 나타내고, 주요 발효 생성물로서 에탄올 및 아세테이트(또는 아세트산)을 생산하고, 특정 조건하에서 소량의 2,3-부탄디올 및 락트산을 생산한다.

그러나, 이러한 종들은 다수의 차이를 또한 갖는다. 이러한 종들은 서로다른 출처로부터 분리되었는데, 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)는 토끼 창자로부터, 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii)는 닭장 쓰레기로부터, 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei)는 담수 퇴적물로부터 분리되었다. 이러한 종들은 여러 당(예, 람노오스, 아리비노스), 산(예, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예, 아르기닌, 히스티딘) 및 다른 기질(예, 베타인, 부탄올)의 이용에 차이가 있다. 또한, 이러한 종들은 특정 비타민(예, 티아민, 비오틴)에 대한 영양요구성에 차이가 있다. 이러한 종들은 우드-륭달 경로 유전자 및 단백질의 핵산 및 아미노산 서열에 차이가 있지만, 이러한 유전자 및 단백질들의 일반적인 조직(organization) 및 수는 모든 종들에서 동일한 것으로 확인되었다(K

pke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011).

따라서, 요약하면, 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii ), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei ) 및 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii)의 특성들 중 많은 것들은 그 종들에 특이적이기 보다는, 클로스트리디움 속의 C1-고정, 혐기성, 아세트산 생성, 에탄올 생성 및 일산화탄소 영양 멤버들의 이러한 집단에 대한 일반적인 특성이다. 그러나, 이러한 종들은 사실상 구별되기 때문에, 이러한 종들 중 하나의 유전자 변형 및 조작은 이러한 종들 중 또 다른 것에서 동일한 효과를 가질 수 없다. 예를 들어, 성장, 성능 또는 산물 생산량의 차이가 관찰될 수 있다.

또한, 본 발명의 미생물은 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii ), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei ) 또는 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii)의 분리물(isolate) 또는 돌연변이체로부터 유래될 수 있다. 클로스트리디움 오토에타노게눔의 분리물 또는 돌연변이체로는 JA1-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), LBS1560 (DSM19630) (WO　2009/064200), 및 LZ1561 (DSM23693)이 있다. 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii )의 분리물 또는 돌연변이체로는 ATCC 49587 (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), PETCT (DSM13528, ATCC 55383), ERI-2 (ATCC 55380) (US　5,593,886), C-01 (ATCC 55988) (US　6,368,819), O-52 (ATCC 55989) (US　6,368,819), 및 OTA-1 (Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010)가 있다. 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei)의 분리물 또는 돌연변이체로는 PI 1 (ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826) (WO　2008/028055)가 있다.

부가적으로 또는 택일적으로, 본 발명의 미생물이 유래되는 모체 미생물은 EC 1.2.1.10 / EC 1.1.1.1에 의해 정의된 반응을 촉매하는 효소, 예를 들어 AdhE를 포함할 수 있다. 본 발명의 미생물은 EC 1.2.1.10 및/또는 EC 1.1.1.1에 의해 정의된 반응을 촉매하는 적어도 하나의 효소의 활성이 모체 박테리아와 비교하여 감소 또는 제거될 수 있는데, 예를 들어, 본 발명의 미생물은 EC 1.2.1.10 및/또는 EC 1.1.1.1에 의해 정의된 반응을 촉매하는 효소를 암호화하는 효소에서 적어도 하나의 파괴성 돌연변이를 가질 수 있다. 상기 EC 1.2.1.10 및/또는 EC 1.1.1.1에 의해 정의된 반응을 촉매하는 효소는 이작용성 알데히드/알코올 디히드로게나제, 알데히드 디히드로게나제, 및 알코올 디히드로게나제로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 이러한 효소들 중 하나 이상의 발현을 저해하면, 추가로 탄소 흐름이 에탄올로부터 이격되고 비에탄올 생성물을 향해 지시될 수 있다.

"기질"은 본 발명의 미생물을 위한 탄소원 및/또는 에너지원을 의미한다. 일반적으로, 상기 기질은 기체상이고 C1-탄소원, 예를 들어, CO, CO₂ 및/또는 CH₄를 포함한다. 바람직하게는, 상기 기질은 CO 또는 CO + CO₂의 C1-탄소원을 포함한다. 상기 기질은 H₂, N₂ 또는 전자와 같은 다른 비탄소 성분을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 기질은 글루코스 또는 리그노셀룰로오스와 같은 탄수화물을 포함할 수도 있다.

일반적으로, 상기 기질은 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mol% CO와 같이 적어도 어느 정도 양의 CO를 포함한다. 상기 기질은 약 20 내지 80, 30 내지 70, 또는 40 내지 60 mol% CO와 같이 일정 범위의 CO를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 기질은 약 40 내지 70 mol% CO (예를 들어, 제강 공장 또는 용광로 가스), 약 20 내지 30 mol% CO (예를 들어, 기본 산소로(basic oxygen furnace) 가스), 또는 약 15 내지 45 mol% CO (예를 들어, 합성가스)를 포함한다. 몇몇 구체예들에서, 상기 기질은 약 1 내지 10 또는 1 내지 20 mol% CO와 같이 비교적 적은 양의 CO를 포함할 수 있다. 본 발명의 미생물은 일반적으로 상기 기질 내의 CO의 적어도 일부분을 생성물로 전환한다. 몇몇 구체예들에서, 상기 기질은 CO를 전혀 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다(< 1 mol%).

상기 기질은 어느 정도 양의 H₂를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 기질은 약 1, 2, 5, 10, 15, 20 또는 30 mol% H₂를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예들에서, 상기 기질은 약 60, 70, 80 또는 90 mol% H₂와 같이 비교적 많은 양의 H₂를 포함할 수 있다. 추가의 구체예들에서, 상기 기질은 H₂를 전혀 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다(< 1 mol%).

상기 기질은 어느 정도 양의 CO₂를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 기질은 1 내지 80 또는 1 내지 30 mol% CO₂를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예들에서, 상기 기질은 약 20, 15, 10 또는 5 mol% 미만의 CO₂를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 기질은 CO₂를 전혀 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다(< 1 mol%).

상기 기질은 일반적으로는 기체상이지만, 상기 기질은 다른 형태로 제공될 수도 있다. 예를 들어, 상기 기질은 미세기포 분산 발생기를 이용하여 CO-함유 기체가 포화된 액체에 용해될 수 있다. 추가의 예로서, 상기 기질은 고체 지지체 상에 흡착될 수 있다.

상기 기질 및/또는 C1-탄소원은 공업적 공정의 부산물로서 얻어지거나 자동차 배기 가스 또는 바이오매스 가스화와 같은 몇몇의 다른 출처로부터 얻어진 폐가스일 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 공업적 공정은 제강과 같은 철금속 제품의 제조, 비철 제품의 제조, 석유 정제, 석탄 가스화, 전력 생산, 카본 블랙 제조, 암모니아 제조, 메탄올 제조, 및 코크스 제조로 이루어진 군에서 선택된다. 이러한 구체예들에서, 상기 기질 및/또는 C1-탄소원은 대기로 배출되기 전에 임의의 통상적인 방법을 사용하여 상기 공업적 공정으로부터 포착될 수 있다.

상기 기질 및/또는 C1-탄소원은 석탄 또는 정제 잔류물의 가스화, 바이오매스 또는 리그노셀룰로오스 물질의 가스화 또는 천연 가스의 개질에 의해 얻은 합성가스와 같은 합성가스일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 합성 가스는 도시 고체 폐기물 또는 공업적 고체 폐기물의 가스화로부터 얻어질 수 있다.

상기 기질의 조성은 반응의 효율 및/또는 비용에 유의한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 산소(O₂)의 존재는 혐기성 발효 공정의 효율을 감소시킬 수 있다. 상기 기질의 조성에 따라, 독소, 바람직하지 않은 성분 또는 분진 입자들을 제거하고/하거나 바람직한 성분들의 농도를 증가시키기 위해 상기 기질을 처리, 세정 또는 여과하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 미생물은 한 종 이상의 생성물을 생산하기 위해 배양될 수 있다. 예를 들어, 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)은 에탄올(WO　2007/117157), 아세테이트(WO　2007/117157), 부탄올(WO　2008/115080 및 WO 2012/053905), 부티레이트(WO　2008/115080), 2,3-부탄디올(WO　2009/151342), 락테이트(WO　2011/112103), 부텐(WO　2012/024522), 부타디엔(WO　2012/024522), 메틸에틸 케톤(2-부타논)(WO　2012/024522 및 WO　2013/185123), 에틸렌(WO　2012/026833), 아세톤(WO　2012/115527), 이소프로판올(WO　2012/115527), 지질(WO　2013/036147), 3-히드록시프로피오네이트(3-HP)(WO　2013/180581), 이소프렌 및 다른 테르펜(WO　2013/180584), 메발론산(WO　2013/180584), 지방산(WO　2013/191567), 2-부탄올(WO　2013/185123), 1,2-프로판디올(WO　2014/0369152), 및 1-프로판올(WO　2014/0369152), 파라-히드록시벤조산(WO　2016/191625), 살리실레이트(WO　2016/191625), 2-아미노벤조에이트(WO　2016/191625), 디히드록시벤조에이트(WO　2016/191625), 4-히드록시시클로헥산 카르복시산(WO　2016/191625), 3-히드록시부티레이트(WO　2017/066498), 1,3-부탄디올(WO　2017/066498), 2-히드록시이소부티레이트(WO　2017/066498), 아디프산(WO　2017/066498), 1,3-헥산디올 (WO　2017/066498), 3-메틸-2-부탄올(WO　2017/066498), 2-부텐-1-올(WO　2017/066498), 이소발레레이트(WO　2017/066498), 또는 이소아밀 알코올(WO　2017/066498)을 생산하거나 생산하도록 조작될 수 있다. 이러한 산물들 중 한 종 이상 외에도, 본 발명의 미생물은 에탄올, 아세테이트, 및/또는 2,3-부탄디올을 생산할 수도 있다. 특정 구체예들에서, 미생물 바이오매스 그 자체가 산물로 간주될 수 있다.

"네이티브 산물(native product)"은 유전자 변형되지 않은 미생물에 의해 생산된 산물이다. 예를 들어, 에탄올, 아세테이트 및 2,3-부탄디올은 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum ), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii ), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei) 및 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii)의 네이티브 산물이다. "비네이티브 산물(non-native product)"은 유전자 변형된 미생물이 유래되는 유전자 변형되지 않은(예를 들어, 모체) 미생물에 의해 생산되는 것이 아니라 유전자 변형된 미생물에 의해 생산되는 산물이다. 비네이티브 산물을 생산하기 위한 경로 및 효소는 위에서 언급한 것들과 같은 기술에서 확인될 수 있다.

"선택도(selectivity)"는 미생물에 의해 생산된 모든 발효 산물들의 생산량에 대한 원하는 산물의 생산량의 비율을 의미한다. 본 발명의 미생물은 특정 선택도 또는 최소 선택도에서 산물들을 생산하도록 조작될 수 있다. 일 구체예에서, 원하는 산물은 본 발명의 미생물에 의해 생산된 모든 발효 산물의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% 또는 75%를 차지한다. 일 구체예에서, 원하는 산물은 본 발명의 미생물에 의해 생산된 모든 발효 산물의 적어도 10%를 차지함으로써, 본 발명의 미생물은 원하는 산물에 대하여 적어도 10%의 선택도를 가진다. 또 다른 구체예에서, 원하는 산물은 본 발명의 미생물에 의해 생산된 모든 발효 산물의 적어도 30%를 차지함으로써, 본 발명의 미생물은 원하는 산물에 대하여 적어도 30%의 선택도를 가진다.

"효율을 증가시키는 것", "증가된 효율" 등은 성장 속도, 산물 생산 속도 또는 체적, 소모된 기질의 체적당 산물 체적, 또는 산물 선택도를 증가시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 효율은 본 발명의 미생물이 유래되는 모체 미생물의 성능을 기준으로 측정될 수 있다.

일반적으로, 배양은 생물반응기에서 수행된다. 용어 "생물반응기"는 연속 교반식 탱크 반응기(CSTR), 고정화 균체 반응기(ICR), 트리클 베드 반응기(TBR), 버블 칼럼, 기체 상승 발효기(gas lift fermenter), 정적 혼합기, 또는 기액 접촉에 적당한 다른 용기 또는 다른 장치와 같은, 하나 이상의 용기, 탑(tower) 또는 배관 장치로 구성되는 배양/발효 장치를 포함한다. 몇몇 구체예들에서, 생물반응기는 제 1 성장 반응기 및 제 2 배양/발효 반응기를 포함할 수 있다. 기질은 이러한 반응기들 중 하나 또는 모두에게 제공될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "배양" 및 "발효"는 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어들은 배양/발효 과정의 성장 단계 및 산물 생합성 단계를 포함한다.

일반적으로, 배양은 미생물의 성장을 가능하게 하기에 충분한 영양물, 비타민 및/또는 미네랄을 함유하는 수성 배지에서 유지된다. 바람직하게는, 상기 배지는 최소 혐기성 미생물 성장 배지와 같은 혐기성 미생물 성장 배지이다.

상기 배양/발효는 원하는 산물의 생산에 적절한 조건하에서 수행되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 상기 배양/발효는 혐기성 조건하에서 수행된다. 고려하여야 할 반응 조건으로는 압력(또는 부분압), 온도, 기체 유속, 액체 유속, 배지의 pH, 배지의 산화-환원 전위, 교반 속도(연속 교반식 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종물 수준(incolumn level), 액상 내의 기체가 제한되지 않도록 하는 최대 기체 기질 농도, 산물 억제를 회피하기 위한 최대 산물 농도가 있다. 특히, 산물들은 기체가 제한된 조건하에서 소모될 수 있기 때문에, 기질의 도입 속도는 액상 내의 기체의 농도가 제한되지 않도록 조절될 수 있다.

높혀진 압력에서 생물반응기를 조작하면, 기상에서 액상으로의 기체 물질 전달 속도를 증가시키는 것이 가능하다. 따라서, 대기압을 초과하는 압력에서 배양/발효를 수행하는 것이 일반적으로 바람직하다. 또한, 소정의 기체 전환 속도는 부분적으로는 기질 체류 시간의 함수이고 체류 시간은 생물 반응기의 필요한 부피를 지시하므로, 가압된 시스템을 사용하면 필요한 생물반응기의 부피가 크게 감소될 수 있고, 따라서 배양/발효 설비의 자본 비용이 크게 감소될 수 있다. 이는 곧 생물반응기가 대기압을 초과하는 온도에서 유지되는 경우, 생물반응기 내의 액체 부피를 입력 기체 유속으로 나눈 값으로 정의되는 체류 시간(retention time)이 감소될 수 있다는 것을 의미한다. 최적 반응 조건은 사용되는 특정의 미생물에 부분적으로 의존하게 된다. 그러나, 일반적으로, 대기압을 초과하는 압력에서 발효를 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 소정의 기체 전환 속도는 부분적으로는 기질 체류 시간의 함수이고 원하는 체류 시간을 달성하는 것은 곧 생물반응기의 필요한 부피를 지시하므로, 가압된 시스템을 사용하면 필요한 생물반응기의 부피가 크게 감소될 수 있고, 따라서 배양/발효 설비의 자본 비용이 크게 감소될 수 있다.

특정 구체예들에서, 상기 발효는 빛의 부재하에서 수행되거나 또는 광합성 미생물의 활동 요건을 만족시키기에 불충분한 양의 빛의 존재하에서 수행된다.

산물들은 당업계에 알려진 방법들, 예를 들어, 분별 증류, 증발, 투과증발(pervaporation), 기체 스트리핑(gas stripping), 상분리, 및 추출 발효(예를 들어 액-액 추출을 포함) 중 어느 하나의 방법 또는 그 방법들의 조합을 이용하여 발효액으로부터 분리 또는 정제될 수 있다. 특정 구체예들에서, 산물들은 생물반응기로부터 발효액의 일부분을 연속적으로 제거하고, 그 발효액으로부터 미생물 세포를 분리하고(편리하게는 여과를 통해), 그 발효액으로부터 한 종 이상의 산물을 회수함으로써 그 발효액으로부터 회수될 수 있다. 알코올 및/또는 아세톤은, 예를 들어 증류에 의해 회수될 수 있다. 산은, 예를 들어 흡착 또는 활성 챠콜에 의해 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포는 생물반응기로 귀환되는 것이 바람직하다. 산물이 제거된 후에 남아있는 무세포 투과물(cell-free permeate)도 생물반응기로 귀환되는 것이 바람직하다. 무세포 투과물이 생물반응기로 귀환되기 전에 배지를 보충하기 위해 추가의 영양물(비타민 B와 같은)이 무세포 투과물에 첨가될 수 있다.

하기의 실시예들은 본 발명의 추가로 예시하지만, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다는 것은 물론이다.

실시예 1

이 실시예는 클로스트리디움 오토에타노게눔(C.　 autoethanogenum) 내의 AOR 및 알코올 디히드로게나제에 파괴성 돌연변이가 성공적으로 도입된 것을 입증한다.

1.1 박테리아 균주 및 성장조건

이 실시예에서 사용된 박테리아 균주들은 하기 표 2에서 기재되어 있다.

일반적인 플라스미드 증식, 클로닝 및 접합을 위해 사용된 대장균(Escherichia coli) 균주들은 항생제(25 μg/mL 클로람페니콜, 100 μg/mL 스펙티노마이신)의 존재하에서 LB 배지에서 37℃로 배양하였다. 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum) DSM 10061는 독일 브라운슈바이크에 소재한 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH)로부터 구입하였고 엄격한 혐기성 조건하에서 CaGM에서 일상적으로 배양하였다.성장 배지 CaGM는 1 L 당 0.25 g NH₄Cl, 0.1 g KCl, 0.2 g KH₂PO₄, 0.2 g MgSO₄·7 H₂O, 0.02 g CaCl₂·2H₂O, 1 g 효모 추출물, 0.5 ml의 2 g/L 레자주린(resazurin), 20 g 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 0.05 g Fe(SO₄)₂·7H₂O, 0.25 g 아세트산나트륨·3H₂O, 0.05 g 니트릴로트리아세트산(NTA) 및 10 g의 프럭토스(타가영양 성장의 경우만), 10 mL 미량 원소 용액(TSE) 및 10 mL의 Wolfe's 비타민 용액을 함유했다. 상기 TSE 용액의 조성(1 L 당)은 다음과 같았다: 2 g NTA, 1 g MnSO₄·H₂O, 0.8 g Fe(SO₄)₂(NH₄)₂·6H₂O, 0.2 g CoCl₂·6H₂O, 0.2 mg ZnSO₄·7H₂O, 0.02 g CuCl₂·2H₂O, 0.02 g NaMoO₄·2H₂O, 0.02 g Na₂SeO₃, 0.02 g NiCl₂·6H₂O 및 0.02 g Na₂WO₄·2H₂O. 상기 비타민 용액의 조성(1 L 당)은 다음과 같았다: 2 mg 비오틴, 2 mg 엽산, 10 mg 피리독신 히드로클로라이드, 5 mg 티아민 HCl, 5 mg 리보플라빈, 5 mg 니코틴산, 5 mg 칼슘 판토테네이트, 0.1 mg 비타민 B₁₂, 5 mg p-아미노벤조산 및 5 mg 티옥트산. 상기 배지는 혐기적으로 제조하였고, 그 배지의 pH는 멸균 전에 5.8로 조절하였다. 접종 전에, 100 mL의 CaGM 배지는 1 mL의 환원제 1 (100 mL 물 당 4g 시스테인) 및 1 mL의 환원제 2 (100 mL 물 당 7.64 g NTA, 5.33 g Na₂CO₃, 및 8.5 mL TiCl₃)를 이용하여 환원시켰다.

액체 배지에서의 세포 성장은 600 nm (OD600)에서 분광광도계로 모니터했다. 헤드스페이스 압력의 변화는 Rugged Digital Pressure Gauge DPG120 (Omega Engineering사)를 이용하여 측정했다. 아가 플레이트 상에서의 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum)의 성장을 위해, 적절한 경우 항생제(7.5 μg/mL 티암페니콜, 6 μg/mL 클라리트로마이신)가 첨가된 YTF 고체 배지(10 g/L 프럭토스, 10 g/L 효모 추출물, 16 g/L 트립토판, 0.2 g/L 염화나트륨, 15 g/L 세균용 아가(oxoid), pH 5.8)를 사용했다. 모든 돌연변이 유발 작업은 37℃의 혐기성 워크스테이션(Don Whitley Scientific Ltd사) 내에서 수행했다. 균주 비교를 위하여, 오토에타노게눔(C. autoethanogenum) 야생형(WT) 또는 재조합 균주를 함유하는 3 내지 4 개의 복제물을, 10 g/L 프럭토스, 200 kPa CO 또는 150 kPa H2 + 50 kPa CO₂를 성장 기질로서 갖는 50 mL CaGM 배지를 함유하는 250 mL 혈청 병(serum bottle)에서 성장시켰다. New Brunswick Innova 교반기(Eppendorf사) 내에서 교반하면서 37℃에서 배양을 수행했다. 표준화된 0.5 OD600 당량의 기하급수적으로 성장하는 배양액을 접종물로 사용했다.

1.2 DNA 조작

DNA 조작 및 클로닝은 Sambrook의 기법(Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)에 따라 수행하였다. 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum)의 게놈 DNA는 PCR 진단용 DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen사)를 이용하여 분리했다. 서던 블롯 분석을 위하여, 클로스트리디움 오토에타노게눔의 게놈 DNA를 Bertram 및 Durre(Bertram, Arch Microbiol, 151: 551-557, 1989)에 따라 분리했다. 클로스트리디움 오토에타노게눔의 플라스미드 DNA는, 20 mg/mL 치킨 리소자임을 용해 완충액에 보충하고 하류측 과정으로 진행하기 전에 30 분간 37℃에서 배양하면서 QIAprep Spin Miniprep 키트(Qiagen사)를 이용하여 분리했다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 Phusion DNA 폴리머라제(NEB) 또는 Q5 DNA 폴리머라제(NEB)를 이용하여 수행했다. 이 실시예에서 사용된 프라이머들은 하기 표 3에서 나열되어 있다. 프라이머들은 Geneious (Biomatters사)를 이용하여 디자인되고 Sigma-Aldrich사 또는 Eurofins사에 의해 합성되었다. 플라스미드 및 앰플리콘의 Sanger 서열분석은 Source Bioscience Plc사(Nottingham, 영국)에 의해 수행되었다.

1.3 플라스미드 벡터 및 대립유전자-교환 카세트이 실시예에서 사용된 모든 플라스미드들(표 4)은 모듈식의 대장균-클로스트리움 셔틀 벡터의 pMTL80000 시리즈에서 유래된 것이다(Heap, J Microbiol Meth, 78: 79-85, 2009).

ClosTron 돌연변이유발 및 인트론-재표적(retargeting) 도구는 가장 널리 사용되는 클로리스트리디움 돌연변이 유발원들 중 하나를 일반적으로 대표한다. 이는 삽입을 통해 표적 유전자를 파괴하는 이동성 그룹 II 인트론을 이용한다(Heap, J Microbiol Meth, 80: 49-55, 2010; Heap, J Microbiol Meth, 70: 452-464, 2007). 여기서, ClosTron는 adhE1, adhE2, aor1 및 aor2 유전자에서 안정한 KO의 분리를 통해 아세트산 생성 미생물, 특히 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum)에 성공적으로 적용될 수 있는 것으로 확인된다.플라스미드 'pMTL83151-PacsA'의 제작을 위해, 클로스트리디움 오토에타노게눔의 acsA (CAETHG_1621)의 프로모터 영역을 올리고뉴클레오티드 'PacsA-NotI-F' 및 'PacsA-NdeI-R'를 이용하여 증폭한 다음, 제한 부위 NotI 및 NdeI를 이용하여 플라스미드 pMTL83151(Heap, J Microbiol Meth, 78: 79-85, 2009)에 클로닝했다. aor1 발현 플라스미드 'pMTL83151-PacsA-aor1'를 제작하기 위하여, 제한 부위 NdeI 및 KpnI를 이용한 클로닝 전에 aor1를 프라이머를 이용하여 2개 라운드의 스플라이드-오버랩 신장(SOE-PCR)(Warrens, Gene, 186: 29-35, 1997)시켜서 2개의 간섭 NdeI 부위를 제거했다. 두 개의 간섭 부위(뉴클레오티드 975 및 1284) 모두에서, 동일한 아미노산을 유지하면서 뉴클레오티드 'CAT'를 'CTT'로 돌연변이시켰다. ClosTron 재표적 플라스미드의 제작을 위하여, adhE1, adhE2, aor1 및 aor2 내의 적절한 인트론 표적 영역들을, Perutka 알고리즘(Perutka, J Molec Biol, 336: 421-439, 2004)을 이용하여 ClosTron 웹사이트로부터 인-실리코(in silico)로 발생시켰다. 다음에, DNA 2.0 Inc.사는 344 bp 인트론 표적 영역을 합성하여 이를 제한 부위 HindIII 및 BsrGI를 이용하여 ClosTron 벡터 pMTL007C-E2(Heap, J Microbiol Meth, 80: 49-55, 2010)에 클로닝함으로써, 플라스미드 'pMTL007C-E2::adhE1a_115s' (adhE1의 상류측 Ald 도메인을 표적하는), 'pMTL007C-E2::adhE1b_541s' (adhE1의 하류측 Adh 도메인을 표적하는), 'pMTL007C-E2::adhE2_662s', 'pMTL007C-E2::aor1_361s' 및 'pMTL007C-E2::aor2_370s'를 얻었다.

'pMTL-AMH101'로 명명한 클로스트리디움 오토에타노게눔(CAETHG_1476)의 C-말단의 227 bp의 결실을 위하여 대립유전자 교환 플라스미드를 사용했다. 간략히 말해서, 이 플라스미드는 클로스트리디움 오토에타노게눔 ATCC 824 유래의 이종pyrE (cac_0027)(역선별 마커(counter selectable marker)로 이용됨)를 함유하고, 303 bp 짧은 상동 암(SHA) 및 1219 bp 큰 상동 암(GHA)을 그 사이에 lacZα를 두고서 대립유전자 교환 카세트로서 포함한다. 클로스트리디움 오토에타노게눔 adhE1, adhE1+2, 및 aor2의 인-프레임 결실(IFD) 대립 유전자 교환 카세트는 길이가 유사한(518 내지580 bp) 두 개의 상동 암들로 구성되고, SOE-PCR 및 올리고뉴클레오티드를 이용하여 조립되었다. 모든 IFD 카세트들은 5`-비번역 영역 (UTR) 및 3`-UTR에 영향을 미치지 않고 표적 유전자좌의 F출발 및 정지 코돈만을 보유했다. SOE-PCR 이후, IFD 카세트들을 SacII 및 AscI를 이용하여 절단하고 플라스미드 pMTL-AMH101에 클로닝하여 플라스미드 'pMTL84151-adhE1', 'pMTL84151-ΔadhE1+2' 및 'pMTL84151-Δaor2'를 얻었다. pyrE의 복구를 위하여, 526 bp SHA 및 1213 bp GHA를 갖는 pyrE 복구 대립유전자 교환 카세트로 구성되는 pMTL-AMH102로 명명된 플라스미드를 이용했다.

1.4 클로스트리디움 오토에타노게눔내로의 플라스미드 전달

플라스미드들을 대장균 공여(donor) 균주 CA434(접합 플라스미드인 R702를 함유하는 HB101)에 형질전환한 다음, 예전에 확립된 방법(Mock, J Bacteriol, 197: 2965-2980, 2015; Purdy, Molec Microbiol, 46: 439-452, 2002; Williams, J Gen Microbiol, 136: 819-826, 1990)을 이용한 접합(conjugation)을 통해 클로스트리디움 오토에타노게눔내로 전달했다. 티암페니콜(7.5 μg/mL)을 이용하여 catP-기반 플라스미드에 대한 선별을 실시했다. 트리메토프림(10 μg/mL)을 이용하여 접합 후 대장균 CA434에 대한 역선별을 실시했다. 플라스미드 보충 균주들의 확인을 위하여, 클로스트리디움 오토에타노게눔 트랜스접합체(transconjugant)들로부터 플라스미드들을 분리한 다음 대장균 세포에 형질전환한 후, '구출된'(rescued) 플라스미드에 대한 제한 절단물(restriction digest) 분석을 수행했다. 또한, 올리고뉴클레오티드 'univ-0027-F' 및 'univ-1492-R'를 이용하여 트랜스접합체의 게놈 DNA로부터 16s rRNA 유전자를 증폭한 다음, 확인의 목적을 위해 Sanger 서열분석했다.

1.5 클로스트리디움 오토에타노게눔 ClosTron 균주의 제작

클로스트리디움 오토에타노게눔 내로 ClosTron 재표적 플라스미드들을 접합한 후, 티암페니콜 및 트리메토프림 저항성 콜로니들을, 표적 유전자좌에의 인트론의 삽입을 선별하기 위하여 6 μg/mL 클래리트로마이신이 첨가된 고체 YTF 배지 상에 전달하고, 플라스미드 손실이 티암페니콜이 첨가된 배지에서 성장할 수 있는 능력의 상실로 명백히 입증될 때까지 동일한 선별 배지 상에 반복적으로 스트리킹(streaking)했다. 클래리트로마이신 저항성 콜로니들로부터 게놈 DNA를 추출하고, 유전자좌-특이적 측면 프라이머들을 이용하여 PCR 선별하여, WT 대조군보다 1.8 kb 더 큰 앰플리콘(특정한 DNA 유전자좌에의 ClosTron 삽입을 나타냄)을 생성한 클론들을 확인했다(도 2 및 도 3). ClosTron 삽입의 위치를 확인하기 위해 ClosTron 앰플리콘의 Sanger 서열분석을 수행했다. 최종 확인으로서, 디그옥시게닌(DIG) High-Prime DNA 표지 및 검출 키트(Roche사)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 서던 블롯 분석을 수행하여, 오직 하나의 ClosTron 삽입만이 각각의 돌연변이에서 발생하였는 지를 확인했다(도 2 및 도 3).

1.6 대립유전자 교환 과정

1.6.1 pyrE 균주의 발생

ClosTron 돌연변이 유발은 신속하고 재현가능하지만, 몇몇의 한계가 있다. 가장 주목할만한 것은 인트론 삽입이 하류측 유전자들에 대하여 극성 영향을 미칠 수 있다는 것이다, 여기서, IFD를 만들 수 있는 클로스트리디움 오토에타노게눔에 대한 대립유전자 교환 방법은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)의 오로테이트 포스포리보실트랜스퍼라제(pyrE) 유전자로 구성된 플라스미드-암호화 역선별 마커 및 유사-자살(pseudo-suicide) 벡터의 사용에 기반하여 개발되었다. 이는 유사-자살 녹아웃 플라스미드의 단일 크로스오버 염색체 구성성분(integrant)들이 티암페니콜이 첨가된 배지 상에서 더욱 신속한 성장(더욱 큰 콜로니)에 기반하여 검출되는 클로스트리움 디피실(Clostridium difficile)(Ng, Expending the repertoire of gene tools for precise manipulation of the Clostridium difficile genome, PLOS One, 8, 2013) 및 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)(Ehsaan, Biotechnol Biofuels, 9: 1-20, 2016)에서 취해진 것과 대등한 접근방법이다. 유사-자살 플라스미드들은 복제-결함 플라스미드(이 경우 플라스미드 pMTL84151의 리플리콘)를 이용하므로 딸 세포들 사이에서 불충분하게 구분되어 항생제의 존재하에서 세포 집단의 성장을 제한한다. 따라서, 단일 크로스오버 구성물들은 성장의 측면에서 이점을 갖고, 역선별제인 5-플로루오오로틱산(FOA)에의 도말에 의해 이중 크로스오버 플라스미드 절제(excision) 유도체들을 선별하기 위해 사용될 수 있다. 후자는 프라스미드-암호화 PyrE 효소의 작용을 통해 고독성 화합물인 5-플루오로우라실로 대사된다. 플라스미드 절제 후 pyrE 유전자를 잃는 세포들만이 생존할 수 있다. 절제하면, 본래의 WT 대립유전자 또는 원하는 돌연변이 IFD 대립유전자를 갖는 세포가 얻어진다. 상기 두 집단들은 적절한 PCR 선별을 통해 구별될 수 있다.

pyrE을 역선별 마커로서 이용하기 위하여, 숙주는 pyrE 음성 균주이어야 한다. 이러한 숙주는 대립유전자-결합 교환(ACE) (Heap, Nucleic Acids Res, 40: e59, 2012)을 통해 비교적 용이하게 제조된다. 따라서, pMTL-YN18 (Ng, Expending the repertoire of gene tools for precise manipulation of the Clostridium difficile genome, PLOS One, 8, 2013)에 상응하는 ACE 벡터를 제조하여, 네이티브 pyrE 유전자의 3`-말단(227 bp)이 결실된 클로스트리디움 오토에타노게눔 유도체(CAETHG_1476)를 발생하는데 사용했다. 우선, 유전자 aor1를 이러한 pyrE 균주에서 ClosTron 돌연변이 유발을 이용하여 불활성화시킨 다음, pyrE-기반 KO 벡터(pMTL84151-Δaor2)를 이용한 대립유전자 교환 및 FOA를 이용한 역선별에 의해 aor2의 IFD를 수행했다. aor1+2 KO 균주의 발생 후, 클로스트리움 디피실의 pMTL-YN1와 유사하게, 특수하게 제작된 ACE 보정 벡터를 이용하여 돌연변이 pyrE 대립유전자를 WT(우라실 자가영양)로 복귀시켰다(Ng, Expending the repertoire of gene tools for precise manipulation of the Clostridium difficile genome, PLOS One, 8, 2013).

채택된 과정은 예전에 기재된 바와 같았다(Heap, Nucleic Acids Res, 40: e59, 2012). 양성 및 음성 선별 마커로서 pyrE를 이용하여 adhE1, adhE1+2 및 aor2의 추가의 IFD를 위한 숙주로서 작용하는 pyrE 균주의 제작을 위하여, 플라스미드인 pMTL84151-ΔpyrE를 접합을 통해 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum)에 형질전환하였다. 그 트랜스접합체를 트리암페니콜 및 트리메토프림이 첨가된 YTF 고체 배지 상에 다시 스트리킹하여 신속하게 성장하는 단일 크로스오버 구성물 클론들을 농축 및 확인했다. 게놈 DNA를 분리하고, 적절한 유전자좌-특이적 측면(flaking) 프라이머들과 함께 플라스미드 특이적 서열들로 어닐링되는 두 개의 상이한 프라이머(ACE-플라스미드-F 및 ACE-플라스미드-R)을 이용하여 PCR 분석했다. DNA 단편의 존재는 실제로 단일 크로스오버 구성성분이었다는 것을 나타내고, 그 크기는 상동 암에서 재조합이 일어났다는 것을 나타냈다. PCR에 의해 확인된 단일 크로스오버 구성성분을 10 g/L 프럭토스 및 티암페니콜이 첨가된 CaGM 액체 배지에 접종하고, 혐기성 워크스테이션 내에서 2일간 성장시킨 다음, 계대 희석하여 도말했다. 드문 제 2의 재조합 이벤트의 선별을 촉진하기 위하여, CaGM 고체 배지는 1 g/L 효모 추출물이 1 g/L 카제인 산 가수분해물로 교체되었고 1.5 mg/mL 플루오로오로틱산(FOA) 및 5 μg/mL 우라실이 첨가되었다. 혐기성 워크스테이션 내에서 37℃에서 배양을 수행했고, 2 내지 3일 내에 나타나는 FOA-저항성 콜로니들을 동일한 선별 배지상에 다시 스트리킹한 다음, 유전자좌-특이적 측면 프라이머들을 이용한 PCR 선별을 수행하여 야생형 복귀 돌연변이 클론으로부터 이중-크로스오버 재조합 클론들을 구별했다. Sanger 서열분석을 이용하여 예상된 유전자형을 확인했다(도 4).

1.6.2 △ adhE1, ΔadhE1mut 및 ΔadhE1+2 균주의 발생

adhE1 및 adhE1 + adhE2의 두 도메인들의 결실의 결과를 분석하기 위하여, 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum)의 적절한 인-프레임 결실 돌연변이를 pyrE-지시 대립유전자 교환을 이용하여 조사했다. adhE1 균주를 발생하는 첫 번째 시도에 있어서는, 균주 ΔadhE1mut가 얻어졌다. 이 균주의 PCR 선별 및 Sanger 서열분석 결과, 클로스트리디움 오토에타노게눔의 adhE1가 결실되었고 adhE2의 프로모터 영역에서 84 bp의 의도하지 않은 결실이 있는 것으로 확인되었다(도 5). WT 서열 내의 이러한 프로모터 영역을 조사한 결과, 84 bp 결실의 측면에 두 개의 9 bp 반복체(repeat)가 존재하는 것이 확인되었다(도 5). 상기 84 bp 서열은 추정적인 종결서열 및 adhE2 프로모터의 -10 및 -35 박스를 포함한다. 상기 의도하지 않은 84 bp 결실이 없이 adhE1의 '순수한' IFD 균주를 발생하기 위한 두 번째 시도는 성공적이었고 균주 adhE1를 산출했다(도 5). 그러나, 이러한 균주는 이러한 플라스미드들의 균주를 치유하기 위한 반복된 시도에도 불구하고 IFD를 발생하기위해 사용된 플라스미드들을 끈질기게 보유했다. adhE1 및 adhE2 이중 IFD 균주(adhE1+2)의 발생을 PCR 선별(도 5) 및 Sanger 서열분석을 통해 확인한 결과, 두 유전자들은 모두 adhE1의 5`-UTR 및 adhE2의 3-`UTR에서 문제없이 성공적으로 결실된 것으로 확인되었다. IFD 후, 균주 △adhE1+2의 티암페니콜 민감성 클론들은 얻어질 수 없었다. 상기 ΔadhE1 및 ΔadhE1+2 균주들은 IFD 균주들을 발생하기 위해 사용된 플라스미드들을 보유하여 유전적으로 볼안정했기 때문에 추가로 특성규명하지 않았다.

플라스미드의 상실이 티암페니콜 저항성의 상실을 통해 입증된 후, pyrE 균주는 각각 △adhE1 및 △adhE1+2 균주의 제작을 위한 접합을 통해 플라스미드 pMTL84151-ΔadhE1 및 pMTL84151-ΔadhE1+2의 수령을 위한 숙주로서 이용될 수 있었다. 단일-크로스오버 구성성분 및 이중-크로스오버 FOA-저항성 우라실 영양요구 클론들을 두 표적에 대하여 얻었다(상기의 ΔpyrE 균주와 동일한 방법). 첫 번째 시도에서, Sanger 서열분석 결과, adhE1의 IFD외에도 의도하지 않은 84 bp 결실이 adhE2의 프로모터 영역에서 발생한 것으로 확인되었다. 또한, 'ΔadhE1mut'로 명명한 이러한 균주는 플라스미드 상실이 티암페니콜 저항성의 상실을 통해 입증되었다. 의도하지 않은 84 bp 결실이 없이 '순수한' 'ΔadhE1' 균주를 발생하기 위한 두 번째 시도는 성공적이었지만, 플라스미드(끈질긴 티암페니콜 저항성에 의해 확인됨)를 상실하기 위한 반복된 시도는 성공적이지 못했다. Sanger 서열분석 결과, adhE1의 5`-UTR 및 adhE2의 3`-UTR에서 문제없이 adhE1 및 adhE2의 성공적인 결실이 확인되었다. 그러나, 이러한 균주의 경우 반복된 재스트리킹은 티암페니콜 민감성 콜로니를 분리할 수 없었다.

1.6.3 aor1+2 이중 KO 균주의 발생

aor1+2 이중 녹아웃 균주(본원에서는 'aor1+2 KO'로 명명함)의 제작을 위하여, 우선 aor1 유전자좌를 pyrE 균주에서 ClosTron 플라스미드 pMTL007C-E2::aor1_361s를 이용하여 불활성화했다. 플라스미드의 상실 후, IFD 플라스미드 pMTL84151-Δaor2를 형질전환하고, 단일-크로스오버 구성성분 및 이중-크로스오버 재조합 클론들의 분리를 전술한 바와 같이 수행했다. 이러한 aor1 및 aor2 이중 KO 이지만 우라실 영양요구성인 클론들을 플라스미드 pMTL-AMH102로 형질전환하여 우라실 원영양체로 복귀시켰다. 빠르게 성장하는 티암페니콜-저항성 콜로니들을, 10 g/L 프럭토스가 첨가되었지만 1 g/L 효모 추출물이 보충이 없이 1 g/L 카제인 산 가수분해물로 교체된 CaGM 고체 배지 상에 도말했다. 최종 확인으로서, PCR 선별 및 그 이후의 Sanger 서열분석을 측면 프라이머들을 이용하여 수행하여 aor1에의 ClosTron 삽입, aor2의 IFD 및 pyrE의 복구를 확인했다. 티암페니콜 감수성의 형태의 플라스미드 상실이 추가로 입증되었다.

1.7 유전자 발현 분석을 위한 세포의 회수

10 g/L 프럭토스가 첨가된 200 mL CaGM을 각각 함유하는 500 mL 압력 + 실험용 병(Duran사)들의 3배로 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum) 재조합 균주들을 배양했다. 균주 pyrE 및 ΔadhE1mut의 경우, 10 μg/mL 우라실이 첨가되었다. 플라스미드 pMTL83151-PacsA 및 pMTL83151-PacsA-aor1를 갖는 클로스트리디움 오토에타노게눔에서 플라스미드들을 유지하기 위하여, 7.5 μg/mL의 티암페니콜을 첨가했다. 약 12의 OD600 값을 갖는 세포들을 4℃ 및 3,220 x g에서 10 분간의 원심분리를 통해 여러 성장 단계에서 회수했다. 상등액을 제거하고 세포 펠릿들을 1 mL RNAlater 안정화 용액(Ambion사)에 피페팅을 통해 재현탁했다. 4℃에서 밤새 정치한 후, 그 세포 현탁액을 3,220 x g 및 4℃에서 10 분간 원심분리하고 상등액을 버린 다음, RNA 추출시까지 -80℃에서 보관했다.

1.8 총 RNA 추출 및 cDNA 합성

1.5 mL 차가운 TRIzol (Ambion사)의 첨가 후, 1 g의 dnature 0.1 mm 직경 지르코니아/실리카 비드(dnature Ltd사)를 함유하는 미리냉각된 2 mL 원심분리 튜브내로 해동된 세포 펠릿을 옮겼다. 사이클들 사이에 얼음위에서 1 분간 냉각하면서 Mini Beadbeater-16 (dnature Ltd사)를 이용하여 1분의 비드 비팅(beating)을 3 사이클 수행하여 세포 파쇄를 수행했다. 20,238 x g 및 4℃에서 1 분간의 원심분리 후, 상등액을 회수하고 100 μL의클로로포름을 첨가하고, 20초간 볼텍싱한 다음, 실온에서 15분간 가끔씩 혼합하면서 정치했다. 20,238 x g (4℃)에서 15분간 원심분리한 후, 수성상을 모으고 0.7배 체적의 이소프로판올을 첨가했다. 그 시료를 실온에서 10분간 정치한 다음, 20,238 x g (4℃)에서 10분간 원심분리했다. 상등액을 제거하고 DNA 펠릿을 700 μL의 얼음 냉각 70% (v/v) 에탄올로 세척한 다음, 20,238 x g (4℃)에서 10 분간 원심분리했다. 상등액의 제거 후, RNA 펠릿을 15 분간 공기 건조한 다음, 100 μL의 RNase이 없는 물 및 1 μL의 RNaseOUT (Invitrogen사)에 재현탁했다.

TURBO DNase enzyme (Ambion사)의 첨가 및 37℃에서 30분간의 정치를 통해 게놈 DNA를 제거했다. 그 DNase-처리된 RNA를 RNA Clean and Concentrator Kit (Zymo Research사)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 정제한 다음 -80℃에서 보관했다. 분리된 RNA의 농도 및 순도는 Nanodrop (Thermo Scientific사)를 이용하여 분광광도계로 분석했다. 분리된 RNA에 잔류 게놈 DNA가 확실히 존재하지 않도록 하기 위하여, 1 μL의 각각의 RNA 시료를 프라이머쌍 "adhE2-662s-F" 및 "adhE2-662s-R"를 이용하여 PCR 분석했다. RNA의 양은 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies사)를 이용하여 측정하였고, 7 초과의 RNA 무결 지수(RIN)를 갖는 RNA 시료를 cDNA 합성에 사용했다. 20 μL SuperScript III Reverse Transcriptase 반응물(Invitrogen사)당 2 μg의 총 total RNA를 사용했고 qPCR 분석전에 RNase이 없는 물을 이용하여 10배 희석했다.

1.9 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)

표적 유전자(adhE2) 및 하우스키핑 유전자(gyrA 및 rho)(표 5)에 대한 프라이머 및 프로브 세트들을 Custom TaqMan Assay Design Tool을 이용하여 디자인하고 Applied Biosystems사로부터 Single-Tube Custom TaqMan Gene Expression Assays로서 구입했다. gyrA (CAETHG_2130; DNA 자이레이즈 서브유닛 A를 암호화) 및 rho (CAETHG_2327; 전사 종결 인자를 암호화)를 하우스키핑 유전자로 선택하였는데, 이들은 밀접한 관련이 있는 아세트산 생성 미생물인 클로스트리디움 륭달리이(C. ljungdahlii) DSM 13528에서 서로 다른 탄소원 및 응력에서 가장 안정한 유전자 발현 수준을 나타냈기 때문이다(Liu, J Biosci Bioeng, 116: 460-464, 2013). TaqMan 프로브 및 프라이머들의 증폭 효율은 계대 희석된 cDNA를 주형으로 이용하여 표준 곡선을 작성함으로써 94.2%와 99.7%의 사이(R2 = 0.998)인 것으로 경험적으로 결정되었다(데이터 미도시).

모든 qRT-PCR 반응은 96-웰 Microseal PCR 플레이트(Bio-Rad Laboratories사)에 설치하고, 1 μL 희석된 cDNA, 1 μL의 20x Custom TaqMan Gene Expression Assay, 10 μL의 2x TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems사) 및 8 μL 뉴클레아제가 없는 물을 함유하는 20 μL 부피의 3배로 수행했다. 비주형(non-template) 대조군(NTC)은 각각의 TaqMan 프로브 및 프라이머 qRT-PCR 마스터 혼합물에 대하여 포함되었다. 각각의 qRT-PCR 과정은 95℃에서 12분의 초기 변성 및 중합효소 활성화, 그 이후 95℃에서 15초의 변성 및 60℃에서 60초의 어닐링 및 신장을 1 사이클로하여 40 사이클로 구성되었다. CFX connect Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories사)를 이용하여 PCR 플레이트 내의 각각의 벽 내의 신호의 축적을 기록하고, 그에 구비된 CFX Manager Software를 이용하여 정규화된 유전자 발현 분석을 수행했다.

1.10 분석 화학

대사산물의 분석은 30℃에서 작동하는 RID (Refractive Index Detector) 및 30℃에서 유지되는 Aminex HPX-87H 칼럼(1300 x 7.8 mm, 입자 크기 9 μm) (Bio-Rad Laboratories사)를 구비한 Varian ProStar HPLC 시스템을 이용하여 수행했다. 약간 산성화된 물을 0.5 mL/min의 유속으로 이동상으로 사용했다(0.005 M H2SO4). 단백질 및 다른 세포 잔류물을 제거하기 위하여, 시료를 20,238 x g에서 5분간 원심분리하고 그 상등액을 Spartan 13/0.2 RC 필터를 이용하여 여과했다. 다음에, 10 μL의 상등액을 분석을 위해 HPLC에 주입했다.

1.11 데이터 분석 및 프리젠테이션

통계 분석 및 그래프로 나타낸 결과를 GraphPad Prism을 이용하여 얻었다. 양측분포(Two-tailed), 쌍을 이루지 않은(unpaired), 파라메트릭 스튜던트 t-검정을 이용하여 평균을 비교했다.

1.12 간접 에탄올 경로의 대사 조작

클로스트리디움 오토에타노게눔(C.　 autoethanogenum)과 같은 아세트산 생성 미생물에 대한 화학양론 및 열역학적 분석 결과, 자가영양 성장 조건하에서 ATP는 제한되고, 아세테이트 형성 및 이후의 AOR의 작용을 통한 아세트알데히드로의 전환의 초기의 ATP-발생 단계없이 매우 소량의 에탄올이 형성될 수 있는 것으로 예측되었다(Fast 및 Papoutsakis, 2012; Mock 등, 2015). AOR 활성에 필요한 환원된 페레독신은 CO의 산화(일산화탄소 디히드로게나제에 의해) 또는 H₂의 산화(전자 분기 및 NADP-의존성 [FeFe]-히드로게나제에 의해)로부터 발생될 수 있다(Wang 등, 2013)). 클로스트리디움 오토에타노게눔의 게놈은 aor의 두 개의 아형, 즉, aor1 (CAETHG_0092) 및 aor2 (CAETHG_0102)를 암호화한다.

단일 유전자 aor 돌연변이체의 자가영양 성장: WT의 세포 밀도의 겨우 절반인 세포 밀도(p-값 <0.0001)를 궁극적으로 달성하는 연장된 유도기(lag phase)(10일)까지 CO에서 aor1 KO 균주의 혈청병 성장을 특성규명했다(도 6). 그러나, 그 균주에 의해 제조된 아세테이트의 농도는 WT의 것과 유사했다. 대조적으로, aor1 KO 균주는 WT에 의해 생산된 에탄올 양의 단지 43%(p-값 = 0.019) 및 2,3-부탄디올의 양의 23%(p-값 <0.0001)을 나타냈다(도 6). aor1 KO 균주는 2.6 mM 락테이트를 합성하였는데, 이는 WT의 값보다 11배 더 높았다(p-값 = 0.001)(도 6). 성장 속도 및 세포 밀도의 측면에서, aor2 KO 균주는 aor1 KO 균주와 매우 유사하게 거동하였지만, 이러한 경우 성장 유도기는 25 일까지 연장되었다(도 6). 그러나, WT를 기준으로, aor2 균주는 170% 많은 에탄올 (p-값 = 0.009), 36% 적은 아세테이트 (p-값 = 0.0001), 및 유사한 수준의 2,3-부탄디올 및 락테이트를 생성했다(도 6).

aor1 KO를 보충하기 위한 시도로서, 이러한 균주에 플라스미드 pMTL83151-PacsA-aor1를 형질전환했다(도 7). 성장 유도기의 측면에서, 그 보충된 균주는 WT 처럼 거동했다. 그 배양물은 aor1 KO 균주에 의해 달성된 0.85(p-값 = 0.010)와 비교하여 1.28의 OD600의 최종 세포 밀도에 도달하지 않았다(도 8). 대조적으로, 생산된 에탄올 및 락테이트의 수준은 보충된 균주의 경우 WT 수준으로 복귀되었다(도 8).

단일 유전자 aor 돌연변이체의 타가영양 성장: 타가영양 성장(heterotrophic growth)에 대한 aor 불활성화의 영향을 평가하기 위하여, WT와 함께 aor1 KO 및 aor2 KO 균주를 탄소원으로서 프럭토스에서 성장시켰다. 도 9에서 도시된 바와 같이, 두 aor KO 균주들은 WT에 상응하는 유사한 세포 밀도에 도달했다. WT와 비교하여, aor1 KO 균주는 21% 많은 아세테이트(통계적으로 유의하지 않음), 33% 적은 에탄올(p-값 = 0.014) 및 61% 적은 2,3-부탄디올(p-value = 0.018)을 생성했다(도 9). 이와 대조적으로, aor2 KO 균주는 WT와 유사한 양의 아세테이트 및 2,3-부탄디올을 합성하였지만, 47% 많은 에탄올(p-값 = 0.003)을 합성했다(도 9). HPLC 결과, 세 균주는 모두 제공된 프럭토스를 완전히 고갈시켰고, 락테이트는 거의 생산하지 않았다(데이터 미도시).

두 개의 AOR 이소자임의 상이한 역할: 상기 두 개의 AOR 이소자임은 동일한 길이를 갖고 78% 동일성을 갖지만, 전사체 데이터는 aor1는 CO에서의 성장 동안 5 내지 10배 더 높은 수준으로 발현되고(Mock 등, 2015) 두 개의 aor 유전자들은 모두 타가영양 성장과 비교하여 자가영양 성장 동안 더욱 높은 수준으로 발현된다는 것을 나타냈다. 발현 데이터와 일치하게, (i) 클로스트리디움 오토에타노게눔에서 더욱 높은 수준으로 발현되는 aor1의 불활성화는 CO의 존재하에서 에탄올 및 2,3-부탄디올의 성장 및 형성에 약화 영향을 미치고 (ii) aor1 KO 균주의 성장은 탄소원으로서 프럭토스에 유의한 영향을 미치지 않았지만, 에탄올 생산량이 유의하게 감소된 것으로 확인되었다. 이와 대조적으로, aor2의 불활성화는 CO 또는 프럭토스에서의 성장 동안 에탄올 생산량을 지속적으로 증가시켰다. 그 대조적인 표현형에 대한 하나의 가능한 설명은 AOR2는 아세트알데히드의 산화에서 우세하게 작용하는 반면 AOR1은 아세트산의 환원에서 우세하게 작용한다는 것이다. 그렇지 않으면, aor2의 불활성화는 높게 발현되고 아마도 더욱 효율적인 AOR1와의 기질 접근에 대한 경쟁을 감소시켜서, 에탄올 생산량을 증가시킬 수 있다. 이러한 결과들은 집합적으로, 클로스트리디움 오토에타노게눔에서의 에탄올 생산에 있어서 aor1과 aor2 사이의 대조적인 역할을 암시하여 준다.

aor1 KO 및 aor2 KO 균주 모두는 CO에서 성장하면서 지연된 성장 유도기 및 감소된 최종 세포 밀도를 나타냄으로써, CO 산화로부터 발생된 환원된 페레독신을 재이용하는데 있어서 결점이 있었다. 환원된 페레독신을 떠넘기기(offload) 위한 또 다른 방법은 acetyl-CoA 및 CO₂를 피루베이트로 전환시켜서 2,3-부탄디올 및 락테이트와 같은 피루베이트-유래 산물의 생산량을 변화시킬 수 있는 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 (PFOR)를 동반하는 반응이다(도 1). WT와 비교하여 aor1 KO 균주에 의한(aor2 KO 균주에 의한 것이 아님) 11배 더 높은 수준의 락테이트 생산량은 2,3-부탄디올 보다는 락테이트의 생산이 aor1 불활성화의 경우에 산화환원 균형을 달성하기 위한 바람직한 경로라는 것을 나타냈다. 피루베이트로부터 락테이트의 생성은 오직 하나의 효소(락테이트 디히드로게나제)를 이용하는 반면에, 2,3-부탄디올의 생합성은 3 종의 효소(아세토락테이트 합성효소, 아세토락테이트 디카르복실라제 및 2,3-부탄디올 디히드로게나제)를 이용한다(K

pke 등, 2014; K

pke 등, 2011) (도 1). 2,3-부탄디올(값어치있는 플랫폼 화학물질)이 바람직한 산물인 경우, 락테이트 디히드로게나제 (ldhA; CAETHG_1147) (K

pke 등, 2014)가 aor1 결실 균주에서 불활성화될 수 있었다.

그러나, 교란되지 않은 aor 유전자는 불활성화된 유전자와 관련된 활성의 임의의 손실을 보상할 수 있기 때문에, 클로스트리디움 오토에타노게눔에서 aor 유전자의 다양성은 단일 aor KO 균주의 표현형을 차단하는 것을 어렵게 만든다. 이 실시예에서 발생된 aor1+2 double KO 균주는, 기능적인 AOR이 전혀 없고 아세틸-CoA의 아세트알데히드를 통한 에탄올로의 직접 환원에 의존하여아 햐는 독특한 균주를 대표한다.

이중 AOR 돌연변이체의 자가영양 성장: 순수한 CO에서의 성장 동안, aor1+2 이중 KO 균주는 지연된 유도기를 나타내서, 최종적으로 WT 보다 69% 더 낮은 세포 밀도(p-값 < 0.0001)로서 WT 대조군에서의 163 kPa의 감소와 비교하여 실험의 과정 동안 101 kPa 만큼 헤드스페이스 압력을 그저 감소시킬 수 있었던 세포밀도를 달성했다(도 6). 이러한 지연된 성장 및 불충분한 기체 소모량은 성장 및 CO 이용을 지지하는데 있어서의 AOR의 중요한 역할을 강조한다.

CO로부터의 대사산물 생성의 측면에서, WT와 비교하여, 이중 KO 균주는 46% 적은 에탄올(p-값 = 0.034), 38% 적은 아세테이트(p-값 < 0.0001), 66% 적은 2,3-부탄디올(p-값 < 0.0001)을 생성하였지만 7.5배 더 높은 수준의 락테이트(p-값 < 0.0001)를 생산했다(도 6). 이러한 결과는 에탄올 역가는 AOR 불활성화의 결과로서 절반으로 감소된 반면에, 에탄올의 나머지 절반은 아세틸-CoA의 직접 환원을 통해 CO로부터 여전히 합성될 수 있었다는 것을 나타낸다. aor1+2 이중 KO 균주는 aor1 또는 aor2 단일 KO 균주와 비교하여 성장 및 에탄올 형성의 측면에서 더욱 큰 정도의 결핍을 나타내지 않았다는 것을 언급할 필요가 있다. CO에서 성장하는 aor1+2 이중 KO 균주의 표현형은 aor1 단일 KO 균주와 가장 유사하여, aor1(aor2보다는)이 CO 에서의 성장 및 에탄올 생합성을 지원하는 주요 효소라는 것이 추가로 입증되었다.

H₂+CO₂에서, aor1+2 이중 KO 균주의 성장 유도기는 약간 증가하였지만, WT와 유사한 세포 밀도까지 성장할 수 있었고, WT 대조군과 동일한 양의 헤드스페이스 압력을 감소시켰다(도 10). 몰 기준으로, 환원된 페레독신의 단지 절반의 양은 CO 보다는 H₂로부터 발생되어(도 1), 감소된 산화환원 불균형으로 이어질 수 있고 그 KO 균주가 H₂ + CO₂에 크게 영향을 미치지 않고 성장할 수 있었다는 이유를 설명한다. 아세테이트 생산은 영향을 받지 않았지만, 그 KO 균주는 WT 보다 9.2배 적은 에탄올을 생산했다(p-값 < 0.0001) (도 10). 락테이트 또는 2,3-부탄디올은 어느 균주에 의해서도 생산되지 않았다(데이터 미도시).

매우 높은 특이적인 Aor 활성이 H₂+CO₂에서 성장된 클로스트리디움 오토에타노게눔의 세포 추출물에서 검출되었고 CO 에서 성장된 세포 추출물보다 4배 더 높고 프럭토스 배양된 세포보다 5.3배 더 높았다는 확인(Mock 등, 2015)은 H₂+CO₂ 조건동안 에탄올 생합성에서 Aor의 중요성을 강조했다. 이러한 결과는 매우 소량의 에탄올이 Aor의 작용이 없이 ATP-제한 H₂+CO₂ 조건하에서 생성될 수 있다는 Fast 및 Papoutsakis (2012) 및 Mock 등(2015)의 예측을 확인시켜주었다. 우연히도, 클로스트리디움 륭달리이(K

pke 등, 2010) 및 클로스트리디움 카복시디보란스(Bruant 등, 2010)와 같은 유명한 아세트산 생성 에탄올 생산 미생물들은 Aor을 갖는 반면에, 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii)(Poehlein 등, 2012)와 같은 에탄올을 생산하지 않는 아세트산 생산 미생물은 Aor이 없다.

프럭토스에서의 ATP-충분 타가영양 성장에서, aor1+2 이중 KO 균주의 성장, 에탄올 및 2,3-부탄디올 생산은 유의한 영향을 받지 않았다(도 9). 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서, 그의 Aor 단독의 결실은 말토스에서 성장하면서 최소 에탄올 생산을 나타냈다(Basen 등, 2014).

1.13 aor1 및 aor2 모두의 완전한 파괴는 카르복실 산의 알코올로의 환원을 폐지한다

클로스트리디움 륭달리이 및 클로스트리디움 라그스달레이와 같은 Aor-함유 아세트산 생성 미생물들은 프로피온산, 부틸산, 발레르산 및 키프로산과 같은 일정 범위의 카르복실산들을 상응하는 1차 알코올들로 전자 공여제로서 CO를 이용하여 촉매적으로 환원시키는 것으로 확인되었다(Isom 등, 2015; Perez 등, 2013). 클로스트리디움 오토에타노게눔 내의 Aor이 이러한 반응을 촉매할 수 있는 지의 여부를 조사하기 위하여, WT 및 aor1+2 이중 KO 균주를, 보충된 60 mM 아세테이트, 40 mM 프로피오네이트 및 40 mM 부티레이트의 존재하에서 CO 성장시켰다.

60 mM 아세테이트(생리학적 대사산물)의 보충은 유도기가 5일에서 1일로 감소됨에 따라 클로스트리디움 오토에타노게눔의 CO 성장에 촉진적인 영향을 미쳤지만(도 11), KO 균주의 경우에는 그렇지 않았다. 초기 대수기 동안 31.3 mM까지의 아세테이트가 WT에 의해 소비되었지만, 79.1 mM 아세테이트의 순생산량이 정체기에서 기록되었다(도 11). 정체기에서, 70.8 mM 까지의 에탄올이 WT에 의해 생산되었다(도 11). 이와 대조로, aor가 결실된 균주는 성장 단계들 중 어디에서도 아세테이트를 소비할 수 없었고, 겨우 7.2 mM의 에탄올을 생산했다(도 11). 환원된 페레독신을 이용한 아세트산의 알데히드로의 환원은 매우 낮은 잠재 반응(Eo' = -580 mV)(Loach, 1976)때문에 표준 조건(ΔGo' = 35 kJ/mol) (Thauer 등, 1977)하에서는 열역학적으로 매우 불리하다. 그러나, 세포내 pH가 6.0이고 세포내 아세테이트 농도가 아세트알데히드 농도보다 1000배 더 높은 생리적 조건에서, 그 반응은 발열성이다(Mock 등, 2015). 클로스트리디움 오토에타노게눔의 대수 증식 동안 에탄올이 생산되면서 아세테이트가 소모되는 것은 그 아세트산 생성 미생물이 CO를 반응물로서 이용하여 아세트산의 환원을 촉매한다는 것을 나타낸다.

아세테이트의 보충과 유사하게, CO 배양 동안 비생리적 기질인 프로피오네이트의 첨가는 WT의 성장 유도기를 5일에서 2일로 감소시킨 반면에(도 12), aor1+2 이중 KO 균주의 성장 유도기는 변경되지 않았다. 이중 KO 균주의 경우, 0.61(보충 없음)에서 1.1(프로피오네이트 보충)로의 세포 밀도(OD600)의 증가 및 WT의 동일 수준과 비교한 헤드스페이스 압력의 감소가 관찰되었다(도 12). 이중 KO 균주의 배양물에서는 프로피오네이트 농도는 변화되지 않은 채로 유지되었고 1-프로판올이 검출되지 않았다(도 12). 이와 대조적으로, WT 균주의 배양물에서는, 24.2 mM 프로피오네이트가 소비되었고 20.9 mM의 1-프로판올이 대수증식기에서 생성되었다(도 12).

CO의 존재하에서 부티레이트 보충의 경우, aor1+2 이중 KO 균주는 WT와 유사한 OD600까지 성장했고 헤드스페이스 압력을 동일한 정도까지 감소시켰다(도 13). 상기 KO 균주는 WT와 비교하여, 17% 많은 아세테이트(p-값 = 0.019), 36% 많은 2,3-부탄디올(통계적으로 유의하지 않음), 2.8 mM 락테이트(WT에서는 생산되지 않았음)를 생산하였지만, 44% 적은 에탄올(p-값 = 0.016)을 생산하였다. 아세테이트 및 프로피오네이트를 대사하지 못하는 것과 일치하게, KO 균주는 보충된 부티레이트의 소모를 나타내지 않았고 1-부탄올을 생산하지 않았다(도 13). 이와 대조로, WT 배양물에서는, 정체 증식기 동안 7.4 mM 부티레이트가 소모되었고 6.0 mM 1-부탄올이 생산되었다(도 13).

종합하면, 이러한 결과들은 클로스트리디움 오토에타노게눔의 Aor이 카르복실산들의 이들의 상응하는 알코올로의 전환을 위해 요구된다는 것을 입증했다. 더욱 높은 비율의 산전환을 달성하기 위해서는, 혈청 병(serum bottle)의 헤드스페이스가 CO에의해 재생되어야 했다. 클로스트리디움 오토에타노게눔에서 Aor의 맹백히 넓은 기질 범위는 파이로코 커스 퓨리오서스(P. furiosus) 유래의 Aor 결정 구조가, 지방족 및 방향족 알데히드를 포함한 일정 범위의 기질들을 수용하기에 충분히 넓은 채널을 나타냈다는 확인 결과와 일치한다(Chan 등, 1995). 클로스트리디움 오토에타노게눔 유래의 Aor는 1-부탄올을 생성하기위해 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei ) (G

ssner 등, 2008), 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes ) (K

sel 등, 2000), 유박테리움 리모섬(Eubacterium limosum) (Genthner 등, 1981) 및 옥소박터 페니기이( Oxobacter pfennigii ) (Krumholz 및 Bryant, 1985)에서 이종 발현될 수 있었다.

1.14 adhE2의 불활성화는 타가영양 조건하에서 에탄올 생산을 감소시킨다

용매생성 경로의 일부로서, 이작용성 AdhE는 많은 발효 미생물들에서 널리 퍼져있다. 일반적으로, AdhE는 N-말단 아세틸화 도메인 및 그이후의 C-말단 Fe-다입 Adh 도메인으로 구성되어 있다(Extance 등, 2013; Membrillo-Hernandez 등, 2000). 알코올 형성에서의 AdhE의 중요한 역할이 클로스트리디움 륭달리이(C. ljungdahlii) (Banerjee 등, 2014; Leang 등, 2013), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum ) (Fontaine 등, 2002), 클로스트리디움 써모셀룸(C. thermocellum) (Lo 등, 2015), 대장균(Membrillo-Hernandez 등, 2000), 락토코커스 래티스(Lactococcus lactis ) (Arnau 등, 1998), 지오바실러스 서모글루코시다시어스(Geobacillus thermoglucosidasius ) (Extance 등, 2013) 및 써모아나에로박터 에타놀리커스 ( Thermoanaerobacter ethanolicus ) (Peng 등, 2008)에서 입증되었다. 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum ) 유래의 정제된 AdhE2 및 써모아나에로박터 에타놀리커스 ( Thermoanaerobacter ethanolicus ) 유래의 AdhE은 높은 Ald 활성을 나타냈지만 낮은 Adh 활성을 나타내었는데(Fontaine 등, 2002; Peng 등, 2008), 이는 많은 발효 미생물들이 다수의 adh 유전자를 갖는 이유를 설명할 수 있다. 별개의 AdhE 도메인들의 결실 연구 및 특성 규명은 Ald 및 Adh 도메인들이 기능적으로 자율적인 것을 나타내기 때문에(Arnau 등, 1998; Chen 등, 2004; Espinosa 등, 2001), 클로스트리디움 오토에타노게눔에서 adhE1의 Ald 도메인 및 Adh 도메인은 ClosTron을 이용하여 독립적으로 파괴시켜서, 균주 'adhE1a KO' 및 'adhE1b KO'를 각각 제작했다. 'adhE2' KO 균주의 경우, Ald 도메인만이 표적되었다.

프럭토스에서 adhE1a KO 및 adhE1b KO 균주의 성장은 WT보다 유도기가 약간 더 긴 특징이 있지만, 그 세포들은 결국 유사한 OD600까지 성장했다(도 14). 이와 대조로, adhE2 KO 균주의 최종 OD600은 WT보다 28% 더 낮았다(p-값 <0.0001)(도 14). 13일의 배양 후에도, adhE2 KO 균주 배양액에서는 0.92 g/L의 프럭토스가 검출된 반면에, 모든 다른 균주들은 3일 이전에 그 기질을 완전히 고갈시켰다(데이터 미도시). 세 개의 adhE KO 균주들은 모두 72.2 내지 76.5 mM의 피이크 아세테이트 수준에 도달하였는데, 이러한 수준은 WT와 비교하여 31 내지 43% 더 높았다(p-값 <0.05) (도 14). WT와 비교하여, 두 adhE1 KO 균주들은 유사한 양의 에탄올을 생산하였지만, adhE2 KO 균주는 WT 에탄올 역가의 37%를 나타냈다(p-값 = 0.0035) (도 14). 세 개의 adhE KO 균주들은 모두 WT 배양물에서 기록된 2,3-부탄디올의 절반 미만을 생산했다(p-값 <0.05) (도 14).

IFD 플라스미드를 상실한 adhE1의 유전적으로 안정한 IFD 균주(Ald 및 Adh 도메인이 모두 없음)를 이 실시예에서 제작했다. 그러나, 클로스트리디움 오토에타노게눔 △adhE1mut 균주에서 adhE1와 adhE2 사이의 유전자간 영역에서 84 bp의 의도하지 않은 결실은 adhE2의 전사 종결자 및 프로모터를 우연히 제거함으로써 균주 ΔadhE1mut를 제공했다. 모체 균주(ΔpyrE control)와 비교하여, ΔadhE1mut 균주의 성장은 유도기가 더욱 길었지만, 두 균주 모두 프럭토스의 존재하에서 유사한 최종 세포 밀도를 달성했다(도 15). 두 균주는 모두 동등한 양의 아세테이트(도 15), 에탄올(도 15) 및 2,3-부탄디올을 생산했다(데이터 미도시).

adhE1의 교란되지 않은 프로모터는 이러한 재배열의 결과로서 adhE2의 발현을 매개할 수 있는 것이 가능하다. 이러한 가설을 테스트하기 위하여, 모체 균주 및 adhE1mut 균주의 adhE2 mRNA 수준을 비교했다. 프럭토스에서 성장한 세포들은 초기 대수기, 후기 대수기 및 정체기에서 회수했다. RNA를 추출하고 cDNA를 합성했다. 유전자 발현 분석 결과, 모체 균주의 adhE2 전사 수준은 3개의 시점 모두에서 안정했다(3.2배 미만의 차이)(도 15). 이와 대조로, ΔadhE1mut 균주의 adhE2 mRNA 수준은 큰 변동을 나타냈는데, 초기 대수 성장기에서 후기 대수 성장기까지 처음에 114배 감소한 다음, 정체 성장기에서 16배 증가했다(도 15). 또한, ΔadhE1mut 균주의 adhE2 전사 수준은 3개의 시료 시점 모두에서 모체 균주의 세포보다 유의하게 높았다(15 내지 1359배)(p-값 <0.05)(도 15). H₂+CO₂에서의 자가영양 성장 동안, adhE1은 적당히 발현된 반면(61 FPKM), adhE2는 클로스트리디움 오토에타노게눔에서 거의 발현되지 않는다(0.4 FPKM) (Mock 등, 2015).

3개의 adhE1 불활성화 균주(adhE1a KO, adhE1b KO 및 △adhE1mut) 모두로부터의 에탄올 생산이 타가영양 성장 동안 저해되지 않았다는 확인 결과는, 클로스트리디움 륭달리이(C. ljungdahlii) adhE1 (adhE2가 아님)의 결실이 WT 대조군보다 6배 적은 에탄올을 생산하는 균주를 제공하였다는 Leang 등 (2013)의 확인 결과와 모순된다. 또한, 클로스트리디움 오토에타노게눔의 결과는 adhE2 불활성화가 WT보다 63% 더 낮은 에탄올 농도를 나타냈다는 것을 입증했다. 성장 실험 방법의 한 가지 차이는 본 연구에서는 10 g/L 프럭토스를 사용하지만 Leang 등 (2013)의 연구는 5 g/L 프럭토스를 사용한다는 것이다. 클로스트리디움 오토에타노게눔(Marcellin 등, 2016) 및 클로스트리디움 륭달리이(C. ljungdahlii)(Nagarajan 등, 2013; Tan 등, 2013)에 대한 RNA-서열분석 실험 결과, adhE1은 자가영양 성장과 비교하여 프럭토스에서 성장시 유의하게 더 높은 수준으로 전사되어, 이러한 유전자는 타가영양 조건하에서 중요한 것으로 확인되었다.

클로스트리디움 오토에타노게눔과 클로스트리디움 륭달리이 사이의 AdhE1 및 AdhE2의 아미노산((AA) 서열의 비교 결과, AdhE1에는 3개의 치환이 있고 AdhE2에는 8개의 치환이 있는 것으로 확인되었다. AdhE2의 AA 변화들 중 하나는 Adh 도메인의 NADH 결합 부위에서 발생한다. 이러한 치환들 중 하나는, Fe-Adh 도메인의 하나의 AA 변화로 인해 클로스트리디움 써모셀룸의 AdhE에서 NADH에서 NADPH로의 보조인자(cofactor)의 변화에 의해 입증된 바와 같이(Brown 등, 2011), 기질 및 공동인자 특이성의 변경을 초래하는 것이 가능하다. 보조인자 특이성의 변화는 전자 및 탄소 흐름에 유의한 영향을 미치는 것으로 예상될 수 있었는데, NADH는 이화 반응에서 일반적으로 사용되는 반면 NADPH는 혐기성 공정에서 반응물로 일반적으로 사용되기 때문이다(Alberts 등, 2002). 상기 모순된 표현형에 대한 또 다른 가능한 설명은 클로스트리디움 오토에타노게눔은 프럭토스 성장 동안 AdhE 활성의 손실을 보상하는 다른 에탄올생성 효소를 가질 수 있다는 것이다.

1.15 어느 adhE의 불활성화는 아세트산 생성 에탄올 생산을 지속적으로 증가시킨다

에탄올 생산을 향상하기 위한 통상적인 전략은 AdhE의 도입 또는 과발현을 일반적으로 이용한다(Peng 등, 2008; Thapa 등, 2015; Yao and Mikkelsen, 2010). 그러나, 아세트산 생성 성장 동안에 부과된 독특한 ATP-제한 조건 및 클로스트리디움 오토에타노게눔과 같은 아세톤생성 미생물에서의 에탄올생성 Aor의 존재를 고려하면, adhE의 불활성화는 탄소 및 환원 물질들을 ATP-산출 아세테이트 형성을 위해 이용될 수 있도록 하는 것으로 가정되었다. 아세트산은 아세트알데히드로 환원(Aor 및 환원된 페레독신을 통해)된 다음, NAD(P)H-의존성 Adh를 통해 에탄올로 환원될 수 있다(도 1).

순수한 CO에서의 성장 동안, 세 종의 adhE KO 균주들(adhE1a, adhE1b 및 adhE2)은 모두 지연된 유도기의 형태의 유의한 성장 겸함 및 WT보다 47 내지 55% 더 낮은 세포 밀도(p-값 <0.01)를 나타내어(도 16), 환원 물질들을 재이용하는데 있어서 비효율성을 나타냈다. 낮은 바이오매스에도 불구하고, 세 종의 adhE KO 균주들은 모두 CO에서 성장하면서 154 내지 183% 더 높은 에탄올 역가를 지속적으로 나타냈다. 구체적으로, adhE1a KO 균주는 WT보다 183% 더 많은 53.4 mM의 에탄올(p-값 = 0.0005)을 생산했다. adhE1b KO 균주는 WT보다 171% 더 많은 에탄올(통계적으로 유의하지 않음)을 생산했고 adhE2 KO 균주는 154% 더 많은 에탄올(p-값 = 0.021)을 생산했다(도 16). 이러한 에탄올 생산량의 실질적인 개선은 2,3-부탄디올 역가의 48 내지 68%의 감소(p-값 <0.004)에 의해 상쇄되었다(도 16). adhE1a KO 균주와 adhE1b KO 균주 사이의 표현형의 유사성을 고려하면, adhE1(Ald 도메인 또는 Adh 도메인에서)내의 ClosTron 삽입의 위치는 그 돌연변이체의 전체 표현형에 유의하지 않은 역할을 했다.

ΔadhE1mut 균주의 경우, 향상된 adhE2 발현은 AdhE1 활성의 손실을 보상할 수 있다. 이러한 가설과 일치하여, adhE1a 및 adhE1b KO 균주 모두와 비교시, ΔadhE1mut 균주는 더욱 약한 성장 결함을 나타냈고 순수한 CO에서 성장하면서 모체 균주와 유사한 양의 아세테이트 및 2,3-부탄디올을 생산했다(도 17). CO 조건하에서의 향상된 에탄올 생산 표현형과 일치하게, ΔadhE1mut 균주는 모체 균주보다 27% 더 많은 에탄올(통계적으로 유의하지 않음)을 생산하였는데, 이는 adhE1a 및 adhE1b KO 균주에 의해 기록된 171 내지 183% 증가보다는 덜 유의한 것이다.

CO에서 성장하면서 adhE 불활성화 균주가 나타낸 에탄올 생산량의 현저한 증가는, Aor을 이용하는 ATP-효율 간접 에탄올 형성 경로가 아세톤생성 에탄올 생합성에 더욱 유리할 수 있다는 가설과 일치한다. 추가의 증거로서, aor1+2 이중 KO 균주는 동일 조건하에서 WT에 의해 달성된 것의 겨우 54%의 에탄올을 생산했다. H₂+CO₂ 에서 성장된 클로스트리디움 오토에타노게눔에서 측정된 CoA-결합 아세트알데히드 디히드로게나제 활성은 형성되는 에탄올의 재사용을 생리적으로만 촉진한다는 것이 Mock 등 (2015)에 의해 가설되었다. 높은 에탄올 농도 및 낮은 H₂ 농도 동안, 아세틸-CoA로의 에탄올 산화는 2 CO₂의 아세테이트의 환원과 연결되는 것으로 가설된다(Mock 등, 2015). 이러한 개념을 지지하여, H₂+CO₂ 에서 성장하는 클로스트리디움 오토에타노게눔은 대수 성장 동안 10.3 mM 에탄올을 일시적으로 생산하였지만, 그 이후 정체기 동안 1.8 mM로의 급격한 감소가 있었다. 두개의 adhE 유전자 외에도, 클로스트리디움 오토에타노게눔의 게놈에는 3개의 다른 일작용성 ald 유전자(CAETHG_1819, 1830 & 3287)가 있다. 따라서, 삼중 ald KO 균주를 발생하면, 탄소 및 전자를 Aor를 통해 아세트산 합성 및 에탄을 형성을 위해 추가로 전달할 수 있다.

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참조문헌

1. Abrini, J., Naveau, H., Nyns, E. J., 1994. Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Archives of Microbiology. 161, 345-351.

2. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P., 2002. Catalysis and the use of energy by cells. Molecular Biology of The Cell. Garland Science, New York.

3. Arnau, J., Jørgensen, F., Madsen, S. M., Vrang, A., Israelsen, H., 1998. Cloning of the Lactococcus lactis adhE gene, encoding a multifunctional alcohol dehydrogenase, by complementation of a fermentative mutant of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180, 3049-3055.

4. Banerjee, A., Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., Lovley, D. R., 2014. Lactose-inducible system for metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii. Applied and Environmental Microbiology. 80, 2410-2416.

5. Basen, M., Schut, G. J., Nguyen, D. M., Lipscomb, G. L., Benn, R. A., Prybol, C. J., Vaccaro, B. J., Poole, F. L., Kelly, R. M., Adams, M. W. W., 2014. Single gene insertion drives bioalcohol production by a thermophilic archaeon. PNAS USA. 111, 17618-17623.

6. Bertram, J., Durre, P., 1989. Conjugal transfer and expression ofstreptococcal transposons in Clostridium acetobutylicum. Archives of Microbiology. 151, 551-557.

7. Brown, S. D., Guss, A. M., Karpinets, T. V., Parks, J. M., Smolin, N., Yang, S., Land, M. L., Klingeman, D. M., Bhandiwad, A., Rodriguez, M., Raman, B., Shao, X., Mielenz, J. R., Smith, J. C., Keller, M., Lynd, L. R., 2011. Mutant alcohol dehydrogenase leads to improved ethanol tolerance in Clostridium thermocellum. PNAS USA. 108, 13752-7.

8. Brown, S. D., Nagaraju, S., Utturkar, S., De Tissera, S., Segovia, S., Mitchell, W., Land, M. L., Dassanayake, A., Kφpke, M., 2014. Comparison of single-molecule sequencing and hybrid approaches for finishing the genome of Clostridium autoethanogenum and analysis of CRISPR systems in industrial relevant Clostridia. Biotechnology for Biofuels. 7, 1-18.

9. Bruant, G., Levesque, M.-J., Peter, C., Guiot, S. R., Masson, L., 2010. Genomic analysis of carbon monoxide utilization and butanol production by Clostridium carboxidivorans strain P7. PloS one. 5, e13033.

10. Chan, M. K., Mukund, S., Kletzin, A., Adams, M. W., Rees, D. C., 1995. Structure of a hyperthermophilic tungstopterin enzyme, aldehyde ferredoxin oxidoreductase. Science. 267, 1463-1469.

11. Chen, M., Li, E., Stanley, S. L., Jr., 2004. Structural analysis of the acetaldehyde dehydrogenase activity of Entamoeba histolytica alcohol dehydrogenase 2 (EhADH2), a member of the ADHE enzyme family. Molecular and Biochemical Parasitology. 137, 201-5.

12. Ehsaan, M., Kuit, W., Zhang, Y., Cartman, S. T., Heap, J. T., Winzer, K., Minton, N. P., 2016. Mutant generation by allelic exchange and genome resequencing of the biobutanol organism Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Biotechnology for Biofuels. 9, 1-20.

13. Espinosa, A., Yan, L., Zhang, Z., Foster, L., Clark, D., Li, E., Stanley, S. L., Jr., 2001. The bifunctional Entamoeba histolytica alcohol dehydrogenase 2 (EhADH2) protein is necessary for amebic growth and survival and requires an intact C-terminal domain for both alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase activity. Journal of Biological Chemistry. 276, 20136-43.

14. Extance, J., Crennell, S. J., Eley, K., Cripps, R., Hough, D. W., Danson, M. J., 2013. Structure of a bifunctional alcohol dehydrogenase involved in bioethanol generation in Geobacillus thermoglucosidasius. Acta Crystallography. Section D, Biological Crystallography. vol. 69, United States, pp. 2104-15.

15. Fast, A. G., Papoutsakis, E. T., 2012. Stoichiometric and energetic analyses of non-photosynthetic CO2-fixation pathways to support synthetic biology strategies for production of fuels and chemicals. Current Opinion in Chemical Engineering. 1, 380-395.

16. Fontaine, L., Meynial-salles, I., Girbal, L., Yang, X., Croux, C., Soucaille, P., 2002. Molecular characterization and transcriptional analysis of adhE2, the gene encoding the NADH-dependent aldehyde/alcohol dehydrogenase responsible for butanol production in alcohologenic cultures of Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Journal of Bacteriology. 184, 821-830.

17. Genthner, B. R. S., Davis, C. L., Bryant, M. P., 1981. Features of rumen and sewage sludge strains of Eubacterium limosum, a methanol-utilizing and H2-CO2-utilizing species. Applied and Environmental Microbiology. 42, 12-19.

18. G

ssner, A. S., Picardal, F., Tanner, R. S., Drake, H. L., 2008. Carbon metabolism of the moderately acid-tolerant acetogen Clostridium drakei isolated from peat. FEMS Microbiology Letters. 287, 236-42.

19. Heap, J. T., Ehsaan, M., Cooksley, C. M., Ng, Y. K., Cartman, S. T., Winzer, K., Minton, N. P., 2012. Integration of DNA into bacterial chromosomes from plasmids without a counter-selection marker. Nucleic Acids Research. 40, e59.

20. Heap, J. T., Kuehne, S. a., Ehsaan, M., Cartman, S. T., Cooksley, C. M., Scott, J. C., Minton, N. P., 2010. The ClosTron: Mutagenesis in Clostridium refined and streamlined. Journal of Microbiological Methods. 80, 49-55.

21. Heap, J. T., Pennington, O. J., Cartman, S. T., Carter, G. P., Minton, N. P., 2007. The ClosTron: A universal gene knock-out system for the genus Clostridium. Journal of Microbiological Methods. 70, 452-464.

22. Heap, J. T., Pennington, O. J., Cartman, S. T., Minton, N. P., 2009. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. Journal of Microbiological Methods. 78, 79-85.

23. Humphreys, C. M., McLean, S., Schatschneider, S., Millat, T., Henstra, A. M., Annan, F. J., Breitkopf, R., Pander, B., Piatek, P., Rowe, P., Wichlacz, A. T., Woods, C., Norman, R., Blom, J., Goesman, A., Hodgman, C., Barrett, D., Thomas, N. R., Winzer, K., Minton, N. P., 2015. Whole genome sequence and manual annotation of Clostridium autoethanogenum, an industrially relevant bacterium. BMC Genomics. 16, 1-10.

24. Isom, C. E., Nanny, M. A., Tanner, R. S., 2015. Improved conversion efficiencies for n-fatty acid reduction to primary alcohols by the solventogenic acetogen "Clostridium ragsdalei". Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 42, 29-38.

25. Krumholz, L. R., Bryant, M. P., 1985. Clostridium pfennigii sp nov uses methoxyl groups of monobenzenoids and produces butyrate. International Journal of Systematic Bacteriology. 35, 454-456.

26. K

pke, M., Gerth, M. L., Maddock, D. J., Mueller, A. P., Liew, F., Simpson, S. D., Patrick, W. M., 2014. Reconstruction of an acetogenic 2,3-butanediol pathway involving a novel NADPH-dependent primary-secondary alcohol dehydrogenase. Applied and Environmental Microbiology. 80, 3394-3303.

27. K

pke, M., Held, C., Hujer, S., Liesegang, H., Wiezer, A., Wollherr, A., Ehrenreich, A., Liebl, W., Gottschalk, G., D

rre, P., 2010. Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas. PNAS USA. 107, 13087-13092.

28. K

pke, M., Mihalcea, C., Liew, F. M., Tizard, J. H., Ali, M. S., Conolly, J. J., Al-Sinawi, B., Simpson, S. D., 2011. 2,3-butanediol production by acetogenic bacteria, an alternative route to chemical synthesis, using industrial waste gas. Applied and Environmental Microbiology. 77, 5467-5475.

29. K

sel, K., Dorsch, T., Acker, G., Stackebrandt, E., Drake, H. L., 2000. Clostridium scatologenes strain SL1 isolated as an acetogenic bacterium from acidic sediments. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 50 Pt 2, 537-546.

30. Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., Lovley, D. R., 2013. A genetic system for Clostridium ljungdahlii: A chassis for autotrophic production of biocommodities and a model homoacetogen. Applied and Environmental Microbiology. 79, 1102-1109.

31. Liu, J., Tan, Y., Yang, X., Chen, X., Li, F., 2013. Evaluation of Clostridium ljungdahlii DSM 13528 reference genes in gene expression studies by qRT-PCR. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116, 460-464.

32. Lo, J., Zheng, T., Hon, S., Olson, D. G., Lynd, L. R., 2015. The bifunctional alcohol and aldehyde dehydrogenase gene, adhE, is necessary for ethanol production in Clostridium thermocellum and Thermoanaerobacterium saccharolyticum. Journal of Bacteriology. 197, 1386-93.

33. Loach, P. A., 1976. Oxidation-reduction potentials, absorbance bands and molar absorbance of compounds used in biochemical studies. In: Fasman, G. D., (Ed.), Handbook of biochemistry and molecular biology. vol. 1. CRC Press, Cleveland, pp. 122 - 130.

34. Marcellin, E., Behrendorff, J. B., Nagaraju, S., DeTissera, S., Segovia, S., Palfreyman, R., Daniell, J., Licona-Cassani, C., Quek, L.-e., Speight, R., Hodson, M. P., Simpson, S. D., Mitchell, W. P., K

pke, M., Nielsen, L. K., 2016. Low carbon fuels and commodity chemicals from waste gases - Systematic approach to understand energy metabolism in a model acetogen. Green Chemistry.

35. Membrillo-Hernandez, J., Echave, P., Cabiscol, E., Tamarit, J., Ros, J., Lin, E. C., 2000. Evolution of the adhE gene product of Escherichia coli from a functional reductase to a dehydrogenase. Genetic and biochemical studies of the mutant proteins. Journal of Biological Chemistry. 275, 33869-75.

36. Mock, J., Zheng, Y., Mueller, A. P., Ly, S., Tran, L., Segovia, S., Nagaraju, S., K

pke, M., D

rre, P., Thauer, R. K., 2015. Energy conservation associated with ethanol formation from H2 and CO2 in Clostridium autoethanogenum involving electron bifurcation. Journal of Bacteriology. 197, 2965-2980.

37. Nagarajan, H., Sahin, M., Nogales, J., Latif, H., Lovley, D., Ebrahim, A., Zengler, K., 2013. Characterizing acetogenic metabolism using a genome-scale metabolic reconstruction of Clostridium ljungdahlii. Microbial Cell Factories. 12, 118.

38. Ng, Y. K., Ehsaan, M., Philip, S., Collery, M. M., Janoir, C., Collignon, A., Cartman, S. T., Minton, N. P., 2013. Expending the repertoire of gene tools for precise manipulation of the Clostridium difficile genome: Allelic exchange using pyrE alleles. Plos One. 8.

39. Peng, H., Wu, G. G., Shao, W. L., 2008. The aldehyde/alcohol dehydrogenase (AdhE) in relation to the ethanol formation in Thermoanaerobacter ethanolicus JW200. Anaerobe. 14, 125-127.

40. Perez, J. M., Richter, H., Loftus, S. E., Angenent, L. T., 2013. Biocatalytic reduction of short-chain carboxylic acids into their corresponding alcohols with syngas fermentation. Biotechnology and Bioenginineering. 110, 1066-77.

41. Perutka, J., Wang, W., Goerlitz, D., Lambowitz, A. M., 2004. Use of computer-designed group II introns to disrupt Escherichia coli DExH/D-box protein and DNA helicase genes. Journal of Molecular Biology. 336, 421-439.

42. Poehlein, A., Schmidt, S., Kaster, A. K., Goenrich, M., Vollmers, J., Thurmer, A., Bertsch, J., Schuchmann, K., Voigt, B., Hecker, M., Daniel, R., Thauer, R. K., Gottschalk, G., M

ller, V., 2012. An ancient pathway combining carbon dioxide fixation with the generation and utilization of a sodium ion gradient for ATP synthesis. Plos One. 7.

43. Purdy, D., O'Keeffe, T. A. T., Elmore, M., Herbert, M., McLeod, A., Bokori-Brown, M., Ostrowski, A., Minton, N. P., 2002. Conjugative transfer of clostridial shuttle vectors from Escherichia coli to Clostridium difficile through circumvention of the restriction barrier. Molecular Microbiology. 46, 439-452.

44. Sambrook, J., Russell, D. W., 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

45. Tan, Y., Liu, J. J., Chen, X. H., Zheng, H. J., Li, F. L., 2013. RNA-seq-based comparative transcriptome analysis of the syngas-utilizing bacterium Clostridium ljungdahlii DSM 13528 grown autotrophically and heterotrophically. Molecular Biosystems. 9, 2775-2784.

46. Thapa, L. P., Lee, S. J., Yang, X., Lee, J. H., Choi, H. S., Park, C., Kim, S. W., 2015. Improved bioethanol production from metabolic engineering of Enterobacter aerogenes ATCC 29007. Process Biochemistry.

47. Thauer, R. K., Jungermann, K., Decker, K., 1977. Energy conservation in chemotrophic anerobic bacteria. Bacteriological Reviews. 41, 100-180.

48. Utturkar, S. M., Klingeman, D. M., Bruno-Barcena, J. M., Chinn, M. S., Grunden, A. M., K

pke, M., Brown, S. D., 2015. Sequence data for Clostridium autoethanogenum using three generations of sequencing technologies. Scientific Data. 2, 1-9.

49. Wang, S., Huang, H., Kahnt, H. H., Mueller, A. P., K

pke, M., Thauer, R. K., 2013. NADP-specific electron-bifurcating [FeFe]-hydrogenase in a functional complex with formate dehydrogenase in Clostridium autoethanogenum grown on CO. Journal of Bacteriology. 195, 4373-4386.

50. Warrens, A. N., Jones, M. D., Lechlera, R. I., 1997. Splicing by overlap extension by PCR using asymmetric amplification: an improved technique for the generation of hybrid proteins of immunological interest. Gene. 186, 29-35.

51. Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology 173:697-703.

52. Williams, D. R., Young, D. I., Young, M., 1990. Conjugative plasmid transfer from Escherichia coli to Clostridium acetobutylicum. Journal of General Microbiology. 136, 819-826.

53. Yao, S., Mikkelsen, M. J., 2010. Identification and overexpression of a bifunctional aldehyde/alcohol dehydrogenase responsible for ethanol production in Thermoanaerobacter mathranii. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 19, 123-133.

Claims (17)

1. 모체 박테리아와 비교하여, 알데히드:페레독신 옥시도리덕타제(EC 1.2.7.5)의 활성이 감소 또는 제거된 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아로서, 상기 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아는 알데히드:페레독신 옥시도리덕타제(EC 1.2.7.5)를 암호화하는 유전자에서 적어도 하나의 파괴성 돌연변이(disruptive mutation)를 포함하고, 상기 알데히드:페레독신 옥시도리덕타제(EC 1.2.7.5)를 암호화하는 유전자는 aor1 유전자인, 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아는 알데히드 디히드로게나제(EC 1.2.1.10) 및/또는 알코올 디히드로게나제(EC 1.1.1.1) 중 적어도 하나의 활성이 모체 박테리아와 비교하여 추가로 감소 또는 제거되어 있는 것을 특징으로 하는 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아는 알데히드 디히드로게나제(EC 1.2.1.10) 및/또는 알코올 디히드로게나제(EC 1.1.1.1)를 암호화하는 유전자에서 적어도 하나의 파괴성 돌연변이(disruptive mutation)를 포함하는 것을 특징으로 하는 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아.
6. 제 4 항에 있어서, 알데히드 디히드로게나제(EC 1.2.1.10) 및/또는 알코올 디히드로게나제(EC 1.1.1.1)는 이작용성 알데히드/알코올 디히드로게나제, 알데히드 디히드로게나제, 및 알코올 디히드로게나제로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아는 아세틸-CoA, 아세토아세틸-CoA, 아세토아세테이트, 아세톤, 이소프로판올, 3-히드록시이소발레릴-CoA, 3-히드록시이소발레레이트, 이소부틸렌, 이소프렌, 3-히드록시부티릴-CoA, 3-히드록시부티레이트, 3-히드록시부티릴알데히드, 1,3-부탄디올, 2-히드록시이소부티릴-CoA, 2-히드록시이소부티레이트, 피루베이트, 아세토락테이트, 아세토인, 2,3-부탄디올 및 락테이트로 이루어진 군에서 선택된 산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아는 CO, CO₂ 및 H₂ 중 하나 이상을 포함하는 기체상 기질을 소모하는 것을 특징으로 하는 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 모체 박테리아는 알칼리바쿨룸 바치(Alkalibaculum bacchi), 블라우티아 프로둑타(Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 유박테리움 리모섬(Eubacterium limosum), 무렐라 써모아우트로피카(Moorella thermoautrophica), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 및 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아.
10. CO, CO₂ 및 H₂ 중 하나 이상을 포함하는 기체상 기질의 존재하에서 제 1 항의 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아를 배양함으로써 산물을 생산하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아는 알데히드:페레독신 옥시도리덕타제(EC 1.2.7.5)를 암호화하는 유전자에서 적어도 하나의 파괴성 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
12. 삭제
13. 제 10 항에 있어서, 상기 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아는 알데히드 디히드로게나제(EC 1.2.1.10) 및/또는 알코올 디히드로게나제(EC 1.1.1.1) 중 적어도 하나의 활성이 모체 박테리아와 비교하여 추가로 감소 또는 제거되어 있는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 비자연적으로 생성된 C1-고정 박테리아는 알데히드 디히드로게나제(EC 1.2.1.10) 및/또는 알코올 디히드로게나제(EC 1.1.1.1)를 암호화하는 유전자에서 적어도 하나의 파괴성 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
15. 제 13 항에 있어서, 알데히드 디히드로게나제(EC 1.2.1.10) 및/또는 알코올 디히드로게나제(EC 1.1.1.1)는 이작용성 알데히드/알코올 디히드로게나제, 알데히드 디히드로게나제, 및 알코올 디히드로게나제로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
16. 제 10 항에 있어서, 상기 산물은 아세틸-CoA, 아세토아세틸-CoA, 아세토아세테이트, 아세톤, 이소프로판올, 3-히드록시이소발레릴-CoA, 3-히드록시이소발레레이트, 이소부틸렌, 이소프렌, 3-히드록시부티릴-CoA, 3-히드록시부티레이트, 3-히드록시부티릴알데히드, 1,3-부탄디올, 2-히드록시이소부티릴-CoA, 2-히드록시이소부티레이트, 피루베이트, 아세토락테이트, 아세토인, 2,3-부탄디올 및 락테이트로 이루어진 군에서 선택되는 아세틸-CoA-유도된 산물인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
17. 제 10 항에 있어서, 모체 박테리아는 알칼리바쿨룸 바치(Alkalibaculum bacchi), 블라우티아 프로둑타(Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 유박테리움 리모섬(Eubacterium limosum), 무렐라 써모아우트로피카(Moorella thermoautrophica), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 및 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.

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