CN102791869B

CN102791869B - 通过发酵的酸产生

Info

Publication number: CN102791869B
Application number: CN201180013225.5A
Authority: CN
Inventors: S·D·辛普森
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2010-03-10
Filing date: 2011-03-10
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2031-03-10
Also published as: EP2545178A4; CN102791869A; EP2545178A1; US20130109066A1; US20120040421A1; WO2011112103A1; US8900836B2

Abstract

本发明提供了通过厌氧发酵产生乳酸的方法。根据本发明的具体方法，通过厌氧发酵包括氢和一氧化碳的底物而产生乳酸。

Description

通过发酵的酸产生

技术领域

本发明涉及通过将含CO的底物进行微生物发酵产生乳酸。

背景技术

乳酸是一种具有多种应用的平台化合物。在过去的十年中，乳酸已在洗涤行业中获得了重要性。乳酸具有除垢以及抗细菌性质，因此已被用作有益环境的清洁产品。此外，乳酸是用于一些生物可降解的聚合物（如聚乙酸）的前体。由于低二氧化碳排放，这些类型的塑料可提供替代由石油生产的常规塑料的良好选择。其他应用包括乳酸酯的前体，其可替代石油化学衍生的溶剂。

乳酸通常通过发酵碳水化合物（如葡萄糖、果糖和蔗糖）来产生。虽然也使用其他细菌甚至酵母，但是最重要的市售乳酸发酵菌属是乳杆菌属（Lactobacillus）。在这类发酵中，通过糖酵解作用产生丙酮酸，丙酮酸再经还原形成乳酸。这些碳水化合物原料的成本受其作为人类食物或动物饲料的价值影响。例如，用于乳酸生产的产淀粉或蔗糖的作物的栽培不是在所有地理条件下均为在经济上可持续的。因此，人们对于开发将低成本的和/或更丰富的碳源转化成乳酸的技术有兴趣。

一氧化碳（CO）是有机材料（如煤或石油和石油衍生产物）不完全燃烧的主要副产物。虽然含碳前体的完全燃烧得到CO₂和水作为仅有的最终产物，但是一些工业过程需要高温，相对于CO₂更有利于一氧化碳的积累。一个实例是钢铁行业，其需要高温以生成所需的钢铁质量。例如，据报道，澳大利亚钢铁行业每年生成并向大气释放超过500,000吨CO。

而且，CO还是合成气的主要成分，其中通过含碳燃料的气化作用生成不同含量的一氧化碳和氢气。例如，合成气可通过裂解废弃树木和木材的有机生物质产生，以生成用于生成燃料和更复杂化学物的前体。

一氧化碳被释放到大气中可具有明显的环境影响。此外，可能需要支付排放税，增加工厂的成本。因为一氧化碳是富含反应能的分子，它可以被用作用于产生多种化学物的前体化合物。但是，这一有价值的原料目前还没有被用于生产乳酸。

本发明的目的是提供一种至少部分克服以上缺点的方法，或至少为公众提供有用的选择。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种通过将含一氧化碳的底物进行微生物发酵而产生乳酸的方法。在具体实施方案中，本发明提供了一种通过微生物发酵产生乳酸的方法，该方法包括：

a.提供含CO的底物；

b.在含有一种或多种微生物的培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物以产生乳酸。

在具体实施方案中，产生了每升发酵液至少0.05克乳酸/天。在具体实施方案中，产生了至少0.1克乳酸/升/天；或至少0.2克乳酸/升/天；或至少0.3克乳酸/升/天；或至少0.5克乳酸/升/天；或至少1.0克乳酸/升/天。

在另一方面，本发明提供了一种通过发酵提高乳酸产生效率的方法，该方法包括：

a.提供含CO的底物；

在本发明的另一方面，提供了一种通过微生物发酵产生乳酸的方法，该方法包括：

a.提供底物

b.在含有一种或多种微生物的培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物，其中一种或多种微生物包含一个或多个乳酸脱氢酶基因；

c.上调所述一个或多个乳酸脱氢酶基因，使得所述微生物产生乳酸。

在具体实施方案中，所述底物包括一氧化碳。

在多个方面的具体实施方案中，所述含一氧化碳的底物是含一氧化碳的气态底物。所述含一氧化碳的气态底物可作为工业过程的副产物获得。在一些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品制造、非铁金属产品制造、石油精炼过程、生物质气化、煤气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在一个实施方案中，所述气态底物包括从钢厂获得的气体。在另一个实施方案中，所述气态底物包括汽车尾气。

在具体实施方案中，所述含CO的底物通常包含大比例的CO，例如至少约20体积%至约100体积%的CO，40体积%至95体积%的CO，40体积%至60体积%的CO，以及45体积%至55体积%的CO。在具体实施方案中，所述底物包含约25体积%、或约30体积%、或约35体积%、或约40体积%、或约45体积%、或约50体积%、或约55体积%或约60体积%的CO。含更低浓度的CO，例如6%，的底物也可能是合适的，特别当还存在H₂和CO₂时。

在多个方面的具体实施方案中，提供了足够水平的所述含一氧化碳的底物，使得可产生乳酸。在具体实施方案中，提供CO使得维持至少0.4mmol/g/min、或至少0.5mmol/g/min、或至少0.6mmol/g/min、或至少0.7mmol/g/min、或至少0.8mmol/g/min、或至少0.9mmol/g/min、或至少1.0mmol/g/min、或至少1.2mmol/g/min、或至少1.5mmol/g/min的比摄入速率。

在多个方面的一些实施方案中，所述方法包括使用一种或多种一氧化碳营养微生物经Wood-Ljungdahl途径进行微生物发酵。在具体实施方案中，所述微生物是梭菌，例如自产乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum）。

在另一方面，本发明提供了一种通过微生物发酵产生乳酸的方法，该方法包括：

a.提供底物

b.在包括自产乙醇梭菌培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物以产生乳酸。

在具体实施方案中，所述底物是一种或多种碳水化合物，例如果糖。或者，所述底物是含一氧化碳的底物，更优选为如上文所述的含一氧化碳的气态底物。

在本发明的另一方面，提供了一种前述方面任一项的方法，其中所述方法还包括捕获或回收所述乳酸的步骤。

在另一方面，提供了通过前述方面任一项的方法产生的乳酸。

本发明从广义上说还可以单独或综合地包括在本申请说明书中提及或指出的部分、要素或特征，其以两个或多个所述部分、要素或特征的任意或所有组合，并且当本文提及在本发明涉及领域中具有已知等同物的具体整体时，所述已知等同物被认为如同被单独提出一样被纳入本文。

附图说明

图1的曲线图显示了根据实施例1所描述的本发明方法的乳酸产生。

图2的曲线图显示了根据实施例2所描述的本发明方法的乳酸产生。

图3的曲线图显示了根据实施例3所描述的本发明方法的乳酸产生。

图4的曲线图显示了根据实施例4所描述的本发明方法的乳酸产生。

图5a、图5b和图5c的曲线图示出了实施例5中所描述的不同乳酸盐浓度对细胞生长和代谢物产生的影响。图5c中的图例也适用于图5a和图5b。

具体实施方式

下面是以总括的形式给出的对本发明的描述，包括本发明的优选实施方案。在下文中的标题“实施例”下所给出的公开内容中对本发明进一步举例说明，所述实施例提供了支持本发明的实验数据、本发明各方面的具体实例和实施本发明的方式。

术语“乳酸（lactic acid）”和“乳酸盐（lactate）”在本文中可互换使用，二者包括2-羟基丙酸的所有立体异构体，包括(R)式、（S）式和消旋式。

术语“生物反应器（bioreactor）”包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵装置，所述发酵装置包括连续搅拌釜反应器（CSTR）、固定化细胞反应器（ICR）、滴流床反应器（TBR）、鼓泡塔、气升发酵罐、静态混合器、或其他适于气-液接触的其他容器或装置。如下文所述，在一些实施方案中，所述生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当提到加入底物，例如含一氧化碳的底物，到所述生物反应器或发酵反应中时，如果合适，应该理解为包括加入到这些反应器之一或两个中。

术语“含一氧化碳的底物”及类似术语应理解为包括其中一氧化碳可被一株或多株细菌利用进行例如生长和/或发酵的任何底物。

“含一氧化碳的气态底物”包括包含某一水平一氧化碳的任何气体。所述气态底物通常包含大比例的CO，优选地至少约15体积%至约95体积%的一氧化碳。

除非上下文另外要求，本文所使用的短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等意在包括所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段。

本发明人惊奇地表明，乳酸可以通过对含一氧化碳的底物进行微生物发酵来产生。令人吃惊地表明，乳酸可以由一氧化碳营养细菌通过发酵含CO的底物来产生。发明人已发现，发酵可产生数种产物，因此乙醇和乳酸是重要取代物。以前乳酸并没有被鉴定为是含CO的底物发酵的产物。根据本发明的方法，还令人惊奇地证明，乳酸可以由自产乙醇梭菌从含CO的底物尤其是含CO的气态底物产生。以前在发酵过程中使用气态碳源尤其是含CO的气态碳源没有导致乳酸产生。

在本发明的具体实施方案中，乳酸产生的效率可以通过以使得乳酸可产生的足够水平提供底物来提高。已经认识到，增加提供至微生物培养物的底物量可增加所述培养物产生的乳酸的量。

在本发明的具体实施方案中，以足够水平提供含CO的底物，使得乳酸可产生。已经表明，含自产乙醇梭菌的微生物培养物可以最高达约1.0至2mmol/g微生物细胞干重/min的速率摄入一氧化碳（比CO摄入）。在本发明的具体实施方案中，向含自产乙醇梭菌的微生物培养物提供含CO的底物，使得比摄入基本维持在或至少0.4mmol/g/min、或至少0.5mmol/g/min、或至少0.6mmol/g/min、或至少0.7mmol/g/min、或至少0.8mmol/g/min、或至少0.9mmol/g/min、或至少1.0mmol/g/min、或至少1.2mmol/g/min、或至少1.5mmol/g/min。在这些实施方案中，乳酸是至少0.05g/L、或至少0.1g/L、或至少0.2g/L、或至少0.3g/L、或至少0.4g/L、或至少0.5g/L的重要发酵产物。在具体实施方案中，乳酸以至少0.5g/L/天或至少1g/L/天的速率产生。

在本发明的具体实施方案中，用于执行本发明方法的装置能够测量和/或控制参数，如CO供应、CO摄入、生物质水平、pH、乳酸产生。例如，可从生物反应器中取样以测定一个或多个上述参数并任选地调节所述生物反应器状态以促进乳酸产生。例如，在生物反应器中，其中所述微生物培养物没有产生乳酸或产生少量乳酸，可以提高CO供应，使得乳酸产生。

如Phillips etal,1994,Apped Biochemistry and Biotechnology,45/46:145中所述，已经公认的是，产物例如乙酸和乙醇可经Wood-Ljungdahl途径由一氧化碳经乙酰辅酶A循环和THF循环的组合产生。但是，根据本发明的方法，令人吃惊地表明可产生乳酸，尤其在提供CO使得维持至少0.4mmol/g/min、或至少0.5mmol/g/min、或至少0.6mmol/g/min、或至少0.7mmol/g/min、或至少0.8mmol/g/min、或至少0.9mmol/g/min、或至少1.0mmol/g/min、或至少1.2mmol/g/min、或至少1.5mmol/g/min的比CO摄入速率的情况下。不希望囿于理论，发明人认为，通过提供足够的或增加的一氧化碳水平，在发酵过程中可以生成更高能量产物，例如乳酸。发明人认为，产物前体例如乳酸可作为电子受体，从而以NAD(P)H的形式减轻微生物细胞的过量还原能力，因此恢复有利的NAD(P):NAD(P)H平衡。发明人还认为，所述培养物发酵的碳水化合物也可以以相似方式转化成乳酸。

推定的具有981个碱基长度的NAD依赖型D-(-)-乳酸脱氢酶基因可在自产乙醇梭菌LZ1560（在DSMZ以登录号为19630保藏的菌株）基因组序列中被鉴定到。所述单顺反子基因与梭菌属菌株IBUN 13A（登录号Nr.GQ_180219.1）和IBUN 158B（登录号Nr.GQ_180219.1）的部分D-(-)-乳酸脱氢酶基因ldhA显示了高同源性（74%同一性（486/656），E-值为2e-55）。

核苷酸序列：

ATGAAAGTTTTGGCATATAGTCATAGACAAGATGAAACTGAATATTTCAAAAAATTCAGTAAA

AAATACGACGTGGAGGTTGTATTGTGTGATGATCCACCAACTATGGAAAATGCAGACTTGGCC

AAGGGATTTGACTGCATCAGCATTATCACAACTAAAATTTCAGATAAATTAGTAGAAAAATTTC

ATGAAATTGGAGTAAAATTTATATCTACAAGAACAATAGGATATGACCATATAGACATAAAAA

AGGCAAAAGAGCTAGGTGTCCATATAGGCAATGTAAACTATTCACCAAATAGTGTAGCCGATT

ATACAATTATGATGATTCTTATG GCTATAAGAAAAACGAAAGCTATTATAGAACGAAGTAATG

TACAGGATTATTCTTTAAAAGGTGTTCAAGGTAAAGAGCTTCACAATTTAACTGTAGGTGTTAT

TGGTACAGGAAGAATTGGCCGTGCAGTTATAAGTCGCTTAAGTGGATTTGGCTGCAAAATATT

AGCTTATGATTTATATGAGAATGAAGAAATAAAGAAGTATGTTACATATGTTACACTAGAAGA

TCTCTTTAAAAACAGTGACATTATTACAATGCATGCACCTGCAACAGATGACAATTATCACATG

ATAAATAAGGATTCCATAGCACTTATGAAAGATGGTACATTTATTATCAATATAGCCCGAGGCT

CACTTATCAATACTGAAGATCTTATAGATGCCATTGAAAATAAAAAAATTGGTGGTGCAGCTA

TAGACGTTATTGAAAATGAATTCGGACTTTGCTATAACGATTTAAAATGTGAGATACTAGATA

AAAGGGAAATGGCAATTTTAAAATCTTTTCCAAATGTAATTGTAACACCTCACACAGCTTTTTA

TACAGATCAAGCTGTAAGTGATATGGTAGAACATTCTATTTTAAGTTGTGTTTTATTCATGGAA

GGCAAAGAAAATCCATGGCAAATTGAATAA

所述基因编码具321氨基酸的蛋白质，其与其他梭菌菌种（见表1）的α-酮酸脱氢酶（例如具有完全相同长度的丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）的乳酸脱氢酶）具有高度的同源性。COG（蛋白质的直系同源组聚类（Clusters of Orthologous Groups of proteins））分析将该蛋白分配至“乳酸脱氢酶及相关脱氢酶”功能组（COG1052）。

蛋白质序列：

MKVLAYSHRQDETEYFKKFSKKYDVEVVLCDDPPTMENADLAKGFDCISIITTKISDKLVEKFHEIGV

KFISTRTIGYDHIDIKKAKELGVHIGNVNYSPNSVADYTIMMILMAIRKTKAIIERSNVQDYSLKGVQ

GKELHNLTVGVIGTGRIGRAVISRLSGFGCKILAYDLYENEEIKKYVTYVTLEDLFKNSDIITMHAPAT

DDNYHMINKDSIALMKDGTFIINIARGS LINTED LIDAIENKKIGGAAIDVIENEFGLCYNDLKCEILD

KREMAIL KSFPNVIVTPHTAFYTDQAVSDMVEHSILSCVLFMEGKENPWQIE*

进一步的证据来自于对PROSITE数据库（Hulo N,et al,(2008)‘The20years of PROSITE’Nucleic Acids Res 36:D245-249)和Pfam数据库(Finn et al (2010)‘The Pfam protein families database’Nucleic Acids Res38:D211-222)进行的结构域搜索。PROSITE搜索得到对“D-异构体特异性2-羟酸脱氢酶NAD-结合标志”的两项强搜索结果（PS00065和PS00671），而从Pfam搜索鉴定了“D-异构体特异性2-羟酸脱氢酶，催化结构域”和“D-异构体特异性2-羟酸脱氢酶，NAD结合结构域”，分别具有8.1e-72和2.1e-30的高E-值。

根据其他NAD依赖型D-(-)-乳酸脱氢酶（EC1.1.1.28），所述蛋白质被提出可催化丙酮酸+NADH得到D-(-)-乳酸+NAD*的反应。

酮酸乳酸

表1.自产乙醇梭菌LZ1560乳酸脱氢酶的最优蛋白质BLAST(Altschulet al.,(1990)“Basic local alignment search tool”J Mol Biol 215:403-410)比对结果

发明人认为，根据本发明的方法可以上调乳酸脱氢酶。例如，当以足够水平提供一氧化碳时，乳酸脱氢酶上调。具体地，当提供CO使得微生物培养物的比CO摄入为至少0.4mmol/g/min、或至少0.5mmol/g/min、或至少0.6mmol/g/min、或至少0.7mmol/g/min、或至少0.8mmol/g/min、或至少0.9mmol/g/min、或至少1.0mmol/g/min、或至少1.2mmol/g/min、或至少1.5mmol/g/min时，乳酸脱氢酶上调。因此，通过上调乳酸脱氢酶，本发明提供了一种通过对底物进行微生物发酵而产生乳酸的方法。

发明人认为，通过发酵替代底物（如碳水化合物），产物例如乳酸可以在一氧化碳营养微生物（例如自产乙醇梭菌）中通过Wood-Ljungdahl途径产生。因此，在具体实施方案中，所述方法包括，发酵含碳水化合物（如果糖或木糖）的底物，以产生包括乳酸的产物。

发明人还认为，在乳酸的微生物产生过程中可更换为替代底物（例如碳水化合物底物和含CO的气态底物），而没有有害影响。此外，发明人考虑了，可以替换底物，例如当一种底物不可用时，提供替换底物使得所述微生物继续产生乳酸。

根据所得的结果，在本发明的一个实施方案中，乳酸通过对含碳水化合物的底物进行微生物发酵而产生。在本发明的另一个实施方案中，含一氧化碳的底物，优选含CO的气态底物，被自产乙醇梭菌转化成多种产物，包括乳酸。

发明人考虑，根据本发明所述方法产生的乳酸可使用本领域已知的分离技术容易地回收。

本文结合本发明的优选实施方案一般性地描述了本发明，所述优选的实施方案利用了自产乙醇梭菌并/或产生乳酸。但是，应该意识到，替代微生物可代替自产乙醇梭菌，如可发酵含CO的底物的替代微生物，例如杨氏梭菌（C.ljungdahlii）、拉氏梭菌（C.ragsdalei）和C.carboxydivorans。还可使用其他可经Wood Ljungdahl途径产生产物的一氧化碳营养微生物。

方法

在一个实施方案中，本发明提供了一种通过微生物发酵产生乳酸的方法。在一个优选的实施方案中，所述方法至少包括厌氧发酵含CO的底物（优选含CO的气态底物）以获得乳酸的步骤。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述方法包括步骤：

（a）提供含CO的底物，优选含CO的气态底物；

（b）在含有一种或多种微生物的培养物的生物反应器中厌氧发酵所述底物以产生乳酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过发酵提高乳酸产生效率的方法，该方法包括：

（a）提供含CO的底物；

在具体实施方案中，以足以产生大量乳酸，例如至少0.05g/L发酵培养基、或至少0.1g/L、或至少0.2g/L、或至少0.4g/L、或至少0.6g/L、或至少0.8g/L、或至少1g/L，的水平提供含CO的底物。在某些实施方案中，以足以以至少0.5g/L/天或至少1g/L/天的速率产生乳酸的水平提供CO。在具体实施方案中，提供一氧化碳，使得维持至少0.4mmol/g/min、或至少0.5mmol/g/min、或至少0.6mmol/g/min、或至少0.7mmol/g/min、或至少0.8mmol/g/min、或至少0.9mmol/g/min、或至少1.0mmol/g/min、或至少1.2mmol/g/min、或至少1.5mmol/g/min的比摄入速率。本领域技术人员应理解提供一氧化碳（尤其是气态一氧化碳）使得达到所需的摄入速率的方法。但是，例如，诸如增加发酵培养基中气体滞留等因素会增加所述微生物培养物可用于转化成产物的一氧化碳量。气体滞留通常可以通过机械方式来增加，例如增加CSTR中的搅拌。此外，以更快的速率或更高的分压提供CO也会提高发酵液中的CO可利用度。

在另一个实施方案中，所述方法包括由自产乙醇梭菌发酵含碳水化合物的底物以产生乳酸。

在本发明的某些实施方案中，所述方法还包括捕获和回收所产生的乳酸的步骤。

微生物

在本发明的实施方案中，发酵中所使用的一种或多种微生物是一种或多种一氧化碳营养微生物。在具体实施方案中，所述微生物是梭菌，例如自产乙醇梭菌。在具体实施方案中，所述微生物可经Wood-Ljungdahl途径发酵含CO的底物。在一个优选实施方案中，所述自产乙醇梭菌是具有在德国生物材料资源中心（German ResourceCentre for Biological Material；DSMZ）以鉴定保藏号19630保藏的菌株的鉴定特征的自产乙醇梭菌。在另一个实施方案中，所述自产乙醇梭菌是具有DSMZ保藏号DSMZ 10061的鉴定特征的自产乙醇梭菌。

对本发明方法中所用的细菌进行培养可使用本领域已知的用于使用厌氧细菌培养和发酵底物的任意数目的方法进行。示例性技术在本文“实施例”部分提供。又例如，可使用通常在以下论文中记载的使用气态底物进行发酵的那些方法：K.T.Klasson,M.D.Ackerson,E.C.Clausenand J.L.Gaddy(1991).Bioreactors for synthesis gas fermentationsresources.Conservation and Recycling,5;145-165;K.T.Klasson,M.D.Ackerson,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1991).Bioreactor design forsynthesis gas fermentations.Fuel.70.605-614;K.T.Klasson,M.D.Ackerson,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1992).Bioconversion ofsynthesis gas into liquid or gaseous fuels.Enzyme and MicrobialTechnology.14;602-608;J.L.Vega,G.M.Antorrena,E.C.Clausen andJ.L.Gaddy(1989).Study of Gaseous Substrate Fermentation:CarbonMonoxide Conversion to Acetate.2.Continuous Culture.Biotech.Bioeng.34.6.785-793;J.L.Vega,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1989).Study ofgaseous substrate fermentations:C arbon monoxide conversion to acetate.1.Batch culture.Biotechnology and Bioengineering.34.6.774-784;and,J.L.Vega,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1990).Design of Bioreactors forCoal Synthesis Gas Fermentations.Resources,Conservation andRecycling.3.149-160。在含碳水化合物的底物上培养细菌的方法也是本领域中熟知的。

底物

在本发明的一个实施方案中，乳酸通过使用自产乙醇梭菌对含碳水化合物的底物进行微生物发酵而产生。应理解，有本领域已知适于发酵的碳水化合物的许多实例和用于发酵碳水化合物底物的方法类型的许多实例。例如，合适的底物可包括，但不限于，单糖如葡萄糖和果糖；寡糖如蔗糖或乳糖；多糖如纤维素或淀粉。虽然发明人考虑，任何这些碳水化合物底物（及其混合物）适于本发明，优选的碳水化合物底物是果糖和蔗糖（及其混合物）。

本领域技术人员应理解，如例如US20070031918所记载的，可发酵的糖可通过预处理和糖化过程从纤维素和木质纤维素生物质中获得。生物质指任何纤维素或木质纤维素材料并且包括含纤维素的材料，以及任选还包括半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖。生物质包括，但不限于，生物能作物、农业废料、城市固体垃圾、工业固体垃圾、造纸泥浆、庭园垃圾、木业和林业废料。但是，在本发明的示例性实施方案中，市售可得的果糖被用作发酵用的碳源和能源。

在一个具体实施方案中，本发明方法中使用含一氧化碳的底物，优选含一氧化碳的气态底物。所述气态底物可以是作为工业过程的副产物所获得的废气，或者来自一些其他来源例如内燃机（例如汽车）废气的废气。在一些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品制造如钢厂、非铁金属产品制造、石油精炼过程、煤气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施方案中，所述含CO的气体可以使用任何常规的方法在排放入大气前从工业过程中捕获。取决于含一氧化碳的气态底物的组成，可能还需要在引入发酵之前对所述底物进行处理以除去任何不需要的杂质，如粉尘颗粒。例如，可使用已知的方法将所述气态底物进行过滤或洗涤。

在本发明的其他实施方案中，所述含一氧化碳的气态底物可来源于生物质的气化。所述气化过程包括限制供给空气或氧气使生物质进行部分燃烧。所得气体通常主要包括CO和H₂，以及少量体积的CO₂、甲烷、乙烯和乙烷。例如，在提取和加工食品（如来自甘蔗的蔗糖，或来自玉米或谷物的淀粉）过程中获得的生物质副产物，或林业中产生的非食品生物质废物，可被气化来制备适用于本发明的含一氧化碳的底物。

所述含CO的底物通常包含大比例的一氧化碳，例如至少约20体积%至约100体积%的CO、40体积%至95体积%的CO、40体积%至60体积%的CO和45体积%至55体积%的CO。在具体实施方案中，所述底物包括约25体积%、或约30体积%、或约35体积%、或约40体积%、或约45体积%、或约50体积%CO、或约55体积%CO、或约60体积%的CO。含较低浓度CO（如6%）的底物也可为合适的，尤其当还存在H₂和CO₂时。

在具体实施方案中，以足以发生乳酸生成的水平提供CO。在具体实施方案中，提供一氧化碳使得维持至少0.4mmol/g/min、或至少0.5mmol/g/min、或至少0.6mmol/g/min、或至少0.7mmol/g/min、或至少0.8mmol/g/min、或至少0.9mmol/g/min、或至少1.0mmol/g/min、或至少1.2mmol/g/min、或至少1.5mmol/g/min的比摄入速率。

本领域技术人员应理解提供CO（尤其是气态CO）使得达到所需摄入速率的方法。通过改进所述体系的质量传递可实现更高的CO摄入速率，其中溶于通常水性发酵液中的CO量增加。但是，例如，诸如增加培养基的气体滞留等因素会增加所述微生物培养物可用于转化成产物的一氧化碳量。本领域技术人员应理解增加气体滞留的方法。但是，非限制地例如，气体滞留通常通过机械方式（如增加CSTR中的搅拌）来增加。此外，以更快的速率或更高的分压提供一氧化碳也会提高发酵液中的CO可利用度。

气态底物不需要包含任何氢气，但是这并不被认为对乳酸产生是有害的。所述气态底物还可包含一些CO₂，例如，约1体积%至约80体积%，或1体积%至约30体积%。在一个实施方案中，所述气态底物包含约5体积%至约10体积%的二氧化碳。在另一个实施方案中，所述气态底物包含约20体积%的CO₂。

通常，一氧化碳以气态形式加入到所述发酵反应中。但是，本发明不应被认为限于以该状态添加所述底物。例如，一氧化碳可以液态提供。例如，液体可用含一氧化碳的气体饱和，随后将该液体加入生物反应器中。这可使用标准方法实现。例如，可以使用微气泡分散发生器（Hensirisak et.al.Scale-up of microbubble dispersion generator foraerobic fermentation;Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101,Number 3/October,2002）。

培养基

应理解，为了进行细菌的生长和底物发酵成乳酸，除了所述底物，还需要将合适的营养培养基进料至生物反应器。营养培养基将包含足以使所使用微生物生长的组分，如维生素和矿物质。适于一氧化碳营养梭菌（如自产乙醇梭菌）生长的厌氧型培养基在本领域是已知的，如例如Abrini等人(Clostridium autoethanogenum，sp.Nov.,An AnaerobicBacterium That Produces Ethanol From Carbon Monoxide;Arch.Microbiol.,161:345-351(1994))所述。下文中“实施例”部分提供了合适的培养基的其他实例。

发酵条件

所述发酵应需要在用于发生底物到乳酸的发酵的合适条件下进行。应考虑的反应条件包括温度、培养基流速、pH、培养基氧化还原电位、搅拌速率（如果使用连续搅拌罐反应器）、接种量、最大底物浓度和底物引入生物反应器的速率以确保底物水平不成为限制性的，以及最大产物浓度以避免产物抑制。适于厌氧发酵含一氧化碳的底物的发酵条件的实例详细记载于WO2007/117157、WO2008/115080、WO2009/022925和WO2009/064200，其所公开内容以参引的方式纳入本文。应认为，本文中所报道的发酵条件可根据本发明的方法容易地调整。

本发明人已经确定的是，在一个实施方案中，如果不控制pH，则不会出现对乳酸产生的有害影响。

生物反应器

发酵反应可在本文中前述的任何合适的生物反应器中进行。在本发明的一些实施方案中，所述生物反应器可包括其中培养微生物的第一生长反应器，和第二发酵反应器，所述生长反应器的培养液被供料至所述发酵反应器中，并在其中产生大多数发酵产物（例如乳酸）。

产物回收

发酵反应会导致发酵液包含乳酸和可能的一种或多种副产物，例如乙醇或乙酸，以及液态培养基中的细菌细胞。乳酸盐或乳酸可通过任何已知方法从通常的水性发酵液中取出。例如，常规的发酵方法产生乳酸钙沉淀，其可被收集并被重新酸化。

或者，膜技术例如电渗析法可被用于分离乳酸。通过向整个选择性离子透性膜施加合适的电位，低浓度的乳酸可从发酵液中分离出来。其他适合的技术包括纳米过滤，其中一价离子可在压强下选择性地通过膜。

其他需要的产物例如乙酸和/或乙醇可利用本领域已知的任何回收方法例如记载于WO2007/117157的方法从发酵液中取出，WO2007/117157以参引的方式全文纳入本文。

现将参照以下非限制性实施例更加详细地描述本发明。

实施例

材料和方法

制备Na₂S_x

在500mL烧瓶中加入Na₂S(93.7g,0.39mol)和200mL H₂O。搅拌所述溶液至所述盐溶解，随后在恒定氮气流下加入硫（25g,0.1mol）。在室温下搅拌2小时后，所述“Na₂S_x”溶液（对于[Na]为约4M，对于[S]为约5M）现为澄清红棕色液体，将其转移至氮气冲洗的血清瓶中，以铝箔包覆。

制备Cr(II)溶液

将1L三颈烧瓶配有气密性入口和出口以使得在惰性气体下操作，随后将所需产物转移至合适的储存烧瓶中。在所述烧瓶中加入CrCl₃·6H₂O(40g,0.15mol)、锌粒[20目](18.3g,0.28mol),汞(13.55g,1mL,0.0676mol)和500mL蒸馏水。用氮气冲洗一小时后，将所述混合液升温至约80℃以起始反应。在恒定氮气流下搅拌2小时后，将所述混合物冷却至室温并继续搅拌48小时，至此反应混合物已变成深蓝色溶液。将该溶液转移至氮气冲洗的血清瓶中并贮存于冰箱中备用。

细菌：

在一个优选实施方案中，所述自产乙醇梭菌是具有在德国生物材料资源中心（German Resource Centre for Biological Material；DSMZ）以鉴定保藏号10061保藏的菌株的鉴定特征的自产乙醇梭菌。在另一个实施方案中，所述自产乙醇梭菌是具有DSMZ保藏号DSMZ 23693的鉴定特征的自产乙醇梭菌。

取样和分析方法

以每隔最长10天的时期的间隔从所述CSTR反应器中取培养基样品。每次均对培养基小心取样以确保不使得气体进入或逸出所述反应器。

HPLC：

HPLC系统为Agilent 1100系列。流动相：0.0025N硫酸。流速与压力：0.800mL/min。柱：Alltech IOA；目录号9648，150×6.5mm，粒度5μm。柱温：60℃。检测器：折射率。检测器温度：45℃。

样品制备的方法：

将400μL样品和50μL 0.15M ZnSO₄和50μL 0.15M Ba(OH)₂加载于Eppendorf离心管中。将所述管在12,000rpm、4℃下离心10min。将200μL上清液转移至HPLC小瓶，并将5μL注入HPLC仪中。

气相色谱：

气相色谱HP 5890系列II使用火焰离子检测器（Flame IonizationDetector）。毛细管气相色谱柱：EC1000-Altech EC100030m×0.25mm×0.25μm。所述气相色谱以分流模式进行操作，氢气总流速为50mL/min，5mL吹洗气流（1:10分流），柱头压10PIS导致45cm/sec的线性速度。温度程序是以60℃开始，保持1mim，然后以每分钟30℃渐变至215℃，然后保持2min。注入器温度为210℃，检测器温度为225℃。

样品制备的方法：

将500μL样品在12,000rpm、4℃下离心10min。将100μL上清液转移至含200μL水和100μL内标掺加溶液（10g/L丙-1-醇、5g/L异丁酸、135mM盐酸）的GC小瓶，将1μL的所述溶液注入GC仪中。

细胞密度：

细胞密度通过对在确定等份的发酵液中细菌细胞计数而确定。或者，样品的吸光度在600nm（分光光度计）下测量，干重根据所公开的方法经计算确定。

实施例1：CSTR中的分批发酵

将1.5升培养基溶液A在无菌且无氧下转移至2L CSTR容器中，并且连续通入氮气。一旦被转移至所述发酵容器，所转移的培养基的还原状态和pH可以经探针直接测量。将所述培养基加热至37℃，以400rpm搅拌并加入刃天青（2g/L）。加入2.25mL 85%H₃PO₄，得到30mM溶液，并用NH₄OH将pH调至5.3。随后通过加入0.3M二氯化铬溶液将所述培养基进一步还原至-150mV。

将多硫化物溶液（4.5M）加入至所述溶液中，用NH₄OH将pH调至5.5。在加入所述多硫化物溶液后向所述溶液中连续通入氮气。根据溶液B加入金属离子，并加入15mL溶液C。

在接种之前，先将气体换成预先混合的50%CO、2%H₂、19%CO₂和29%N₂的混合物，该混合物在整个实验过程中连续通入所述发酵液中。将活跃生长的自产乙醇梭菌培养物以大约5%（v/v）的水平接种到CSTR中。在这些实验过程中，由调节器经自动加入缓冲液（0.5M NaOH或2N H₂SO₄）来调节和/或维持pH。代谢物产生和微生物生长可见于图1。图1显示，包括乙醇的典型代谢物在整个微生物生长阶段都产生。此外，乳酸通过由自产乙醇梭菌发酵CO产生。但是，当提供底物使得比摄入维持在大于0.5mmol/g生物质/min时，微生物培养物产生乳。

实施例2：CSTR中的分批发酵

将1.5升所述培养基溶液A在无菌且无氧下转移至2L CSTR容器中，并连续通入氮气。一旦被转移至所述发酵容器，所转移的培养基的还原状态和pH可以经探针直接测量。将所述培养基加热至37℃，以400rpm搅拌并加入刃天青（2g/L）。加入2.025mL 85%H₃PO₄，得到30mM溶液，并用NH₄OH将pH调至5.3。随后通过加入0.3M二氯化铬溶液将所述培养基进一步还原至-150mV。

将多硫化物溶液（3.5M）加入至所述溶液中。在加入所述多硫化物溶液后向所述溶液中连续通入氮气。在接种之前，先将气体换成预先混合的54%CO、3%H₂、20%CO₂和23%N₂的混合物，该混合物在整个实验过程中连续通入所述发酵液中。加入150mL溶液D并加入13.5mL溶液C。将活跃生长的自产乙醇梭菌培养物以大约5%（v/v）的水平接种到CSTR中。在这些实验过程中，由调节器经自动加入缓冲液（0.5MNaOH或2N H₂SO₄）来调节和/或维持pH。

代谢物产生和微生物生长可见于图2。图2显示，包括乙醇的典型代谢物在整个微生物生长阶段都产生。但是，当提供底物使得比摄入维持在大于0.5mmol/g生物质/min时，微生物培养物产生乳酸。在约1.0到1.5天之间，乳酸产生的速率为至少1.0g/L/天。

实施例3：CSTR中的连续发酵

将1升培养基溶液在无菌且无氧下转移至1L CSTR容器中，并且连续通入氮气。一旦被转移至发酵容器，所转移的培养基的还原状态和pH可经探针直接测量。将所述培养基加热至37℃并且以400rpm搅拌。加入1.2mL 85%H₃PO₄，得到30mM溶液，并用NH₄OH将pH调至5.3。加入8mL溶液C。随后通过加入0.3M二氯化铬溶液将所述培养基进一步还原至-150mV。加入刃天青（2g/L）。

将多硫化物溶液（6M）加入至所述溶液中。在加入所述多硫化物溶液后向所述溶液中连续通入氮气。在接种之前，先将气体换成预先混合的70%CO、1%H₂、15%CO₂和14%N₂的混合物，该混合物在整个实验过程中连续通入所述发酵液中。加入80mL溶液E。将活跃生长的自产乙醇梭菌培养物以大约5%（v/v）的水平接种到CSTR中。在这些实验过程中，由调节器经自动加入缓冲液（0.5M NaOH或2N H₂SO₄）来调节和/或维持pH。

代谢物产生和微生物生长可见于图3。图3显示，包括乙醇的典型代谢物在整个微生物生长阶段都产生。但是，当提供底物使得比摄入维持在大于0.5mmol/g生物质/min时，微生物培养物产生乳酸。甚至当生长和乙醇产生时所述微生物培养物继续产生乳酸。但是，当比摄入跌到小于0.5mmol/g/min时，乳酸产生停止。

实施例4：CSTR中的连续发酵

将1.5升含0.407g MgCl₂·6H₂O的培养基溶液A在无菌且无氧下转移至2L CSTR容器中，并且连续通入氮气。一旦被转移至发酵容器，所转移的培养基的还原状态和pH可经探针直接测量。将培养基加热至37℃，以400rpm搅拌并加入刃天青（2g/L）。加入0.56mL 85%H₃PO₄，得到5mM溶液，并用NH₄OH将pH调至5.3。

向所述溶液中加入铁（0.1M）、镍（0.05M）和锌（0.005M），也向0.01M(B、Mn、Co、Se、Mo)和0.01M钨溶液中加入这些。还加入15mL维生素B。随后通过加入0.3M二氯化铬溶液将所述培养基进一步还原至-200mV。

在接种之前，先将气体换成预先混合的10%CO、15%H₂、75%RMG的混合物，该混合物在整个实验过程中连续通入所述发酵液中。将活跃生长的自产乙醇梭菌培养物以大约5%（v/v）的水平接种到CSTR中。在这些实验过程中，由调节器经自动加入缓冲液（0.5M NaOH或2NH₂SO₄）来调节和/或维持pH。

代谢物产生和微生物生长可见于图4。图4显示，包括乙醇的典型代谢物在整个微生物生长阶段都产生。但是，当提供底物使得比摄入维持在大于0.6mmol/g生物质/min时，微生物培养物产生乳酸。

实施例5：乳酸浓度对生长和代谢物产生的影响

使用血清瓶检查乳酸浓度对乙酸产生和生物质的影响。配制1升溶液F，加入1g/L酵母提取物。将所述培养基分成五个200mL等份，向每等份加入DL-乳酸至不同的终浓度。随后用5M NaOH将pH调至5.5。测得的浓度为0g/L、0.3g/L、0.6g/L、1g/L和5g/L。

用氮气对培养基鼓泡至少一小时，在无氧条件下以50mL等份分装到血清瓶中。将血清瓶于121℃高压灭菌30min。

将含自产乙醇梭菌的微生物培养物在所制备的培养基中于车间气顶部空间（mill gas headspace）(30psig)在37℃下培养三天或直到达到指数生长（OD600大约为0.5）。

将2.5mL培养物接种到血清瓶中，用车间气(mill gas)加压至30psig并于37℃摇晃孵育。通过每日取样监测OD600变化和代谢物产生。

以上述所讨论的相似方式进行实验安排，使用一个范围的乳酸浓度。所测试的浓度为0g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L和20g/L。

随后监测培养物7天以确定所述培养物在生物质中的生长、由所述培养物产生的乙酸的量以及被所述培养物摄取的乳酸的量。

在0.3g/L到1g/L之间的浓度，所观察到的生物质的量与无乳酸的培养物相当。2g/L到4g/L之间的浓度与零浓度乳酸相比时显示了生物质减少，在含5g/L或更多乳酸的培养物中，没有观察到生长。

相应地，具有5g/L或更高乳酸浓度的血清瓶证明了没有乙酸产生且没有乳酸摄取。

为了让读者能以不过多的实验实施本发明，本文参照一些优选的实施方案描述了本发明。本领域技术人员应了解，除这些具体描述的之外，本发明易于改变和修饰。应理解，本发明包括所有这类改变和修饰。此外，提供题目、标题等是为了增强读者对本文的理解，而不应该被解读为限制本发明的范围。

如果有的话，以上和以下所引用的所有申请、专利和出版物的全部公开内容都以引用的方式纳入本文。

本说明书对任何现有技术的引用不是、且不应被认为是承认或者以任何形式表明该现有技术构成了美国或者世界任何国家的公知常识的一部分。

在本说明书和下文的任何权利要求中，除非上下文另有要求，词语“包含（comprises）”、“含（comprising）”等应被解释为包括性含义，而非排他性的含义，也就是说，“包括但不限于”的含义。

Claims

1.一种通过微生物发酵产生乳酸的方法，所述方法包括：

a.将含CO的气态底物通入含有至少一种一氧化碳营养微生物的培养物的生物反应器中；和

b.厌氧发酵所述底物以产生乳酸；

其中提供所述含CO的气态底物，使得维持所述培养物的至少0.4mmol CO/克细菌干细胞重/分钟的CO摄入比速率，并且乳酸以大于0.05g/L/天的生产率产生，

并且其中所述至少一种一氧化碳营养微生物是自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)。

2.权利要求1的方法，其中提供所述底物，使得维持至少1.0mmolCO/g/min的比摄入速率。

3.权利要求1的方法，其中所述含CO的底物包含至少15体积％至100体积％的CO。

4.权利要求1的方法，其中所述至少一种微生物包含至少一个乳酸脱氢酶基因；并且上调该乳酸脱氢酶基因，使得所述微生物产生乳酸。

5.权利要求4的方法，其中所述含CO的底物包含至少15体积％至100体积％的CO。

6.权利要求1的方法，其中所述含CO的底物包含从工业过程作为副产物获得的气体。