CN104498523B

CN104498523B - 一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用

Info

Publication number: CN104498523B
Application number: CN201410834675.6A
Authority: CN
Inventors: 周胜; 秦启伟; 黄友华; 俞也频; 尼松伟
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: CN104498523A

Abstract

本发明公开了一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用。本发明利用基因同源重组、基因插入失活的方法敲除产1,3-丙二醇的野生型菌株中的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因，从而得到甲酸代谢途径被阻断的基因工程菌。用本发明的工程菌进行1,3-丙二醇的发酵生产，副产物甲酸合成大幅度降低，使得甲酸对细胞的毒害作用降低，1,3-丙二醇浓度、生产强度与底物转化率提高。实验证明，将本发明的工程菌按常规方法发酵32小时，甲酸合成量降低90％以上，1,3-丙二醇浓度可达72g/L以上。本发明将促进微生物发酵法生产1,3-丙二醇技术进步，具有应用价值。

Description

一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用。

背景技术：

1,3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，有多种重要用途。它可用来合成杂环、药物中间体、聚酯、润滑剂、染料、油墨、防冻剂等，其主要用途是合成聚酯-聚对苯二甲酸丙二醇脂(PTT)。PTT是继50年代聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)之后实现工业规模的新的可成纤聚酯高分子材料，是一种极有发展前途的新型聚酯材料。1998年PTT被美国评为六大石化新产品之一。PTT与PET、PBT相比除具有聚酯的耐化学性外，还具有其它一些更优良的特性。如尼龙的弹性恢复性；在全范围无需添加特殊化学药品即能呈现良好的连续印染特性；抗紫外、臭氧和氮氧化合物的着色性；抗内应力；低水吸附、低静电以及良好的可生物降解性；可循环利用性等。由于PTT的具有以上优良特性，它在地毯工业、服装材料、工程热塑料以及其它众多领域有着很广泛的应用。

Dupont和Shell两家跨国公司曾采用化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生产PDO。化学合成法生产PDO的缺点是副产物多，选择性和产率较低，操作条件需要高温高压，设备投资巨大，原料不可再生；同时由于产量有限，长期以来PDO售价偏高。目前1,3-丙二醇的生产方法主要是微生物发酵法。与化学合成法相比，微生物发酵法生产1,3-丙二醇具有显著的优点：1、利用成本较低的可再生资源(如甘油、玉米、淀粉)为原料；2、生产条件温和，操作简便，不需贵重金属催化剂；3、选择性好，副产物较少，易于分离纯化；4、环境污染小。微生物发酵法是以生物技术为特征的“绿色工业”向传统石油化工提出的强有力的挑战，具有重要的现实意义，因而越来越受到重视。

微生物发酵法生产1,3-丙二醇是利用微生物歧化甘油产生。至今所有被发现的1,3-丙二醇生产菌种均为细菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreudii)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)具有较高的1,3-丙二醇转化率和1,3-丙二醇生产强度，具有较高的开发前景，从而得到了较多关注。

目前被用来生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌主要分离自土壤环境中。克雷伯氏菌只能利用甘油产生1,3-丙二醇。在发酵产生1,3-丙二醇的过程中，甘油发生岐化反应。还原途径包括两步反应：第一步，由依赖于辅酶B₁₂的甘油脱水酶催化甘油脱水生成3-羟基丙醛；第二步，由1,3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛还原生成1,3-丙二醇，此过程消耗1摩尔还原力。还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1,3-丙二醇。氧化途径中的产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的ATP，在氧化产物形成的同时释放还原力NADH。氧化途径中甘油先被氧化生成丙酮酸；丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰CoA和甲酸，甲酸容易分解为CO₂和H₂。乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸的过程中生成过量的ATP，而在经乙醛形成乙醇的反应中要消耗2摩尔还原力；丙酮酸也可能转化为2,3-丁二醇,乳酸和琥珀酸，生成乳酸的过程要消耗1摩尔还原力，而生成琥珀酸的过程要消耗2摩尔还原力。

克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇，从代谢途径分析可知，甘油被转化为主产物1,3-丙二醇的同时，产生多种副产物：甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、2,3-丁二醇和乙醇等。副产物有机酸往往对发酵产生抑制作用。有文献报道甲酸、乙酸、乳酸等对微生物菌体生长及利用底物存在抑制作用。甲酸抑制作用大于乙酸，1g/L甲酸即明显抑制底物利用及菌体生长，2g/L乙酸开始对发酵产生较明显影响，而乳酸的抑制浓度较高。甲酸可能对克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇产生抑制作用。副产物有机酸的生成不但抑制细胞生长，还会造成底物甘油的浪费。例如，乳酸的产生导致1,3-丙二醇产量降低。研究报道敲除乳酸代谢途径关键编码基因乳酸脱氢酶基因，可以使乳酸合成大幅度减少，1,3-丙二醇生产能力得到增强。

发明内容：

本发明的目的是提供一种生产1,3-丙二醇的工程菌—敲除甲酸代谢途径基因的工程菌及其构建方法和应用。

本发明的敲除甲酸代谢途径基因的工程菌，是通过以下方法构建的，将产1，3-丙二醇的野生型菌株的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除后获得的工程菌。

所述的1,3-丙二醇的野生型菌株优选为克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌，进一步优选为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)。

所述的将克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除，优选通过以下方法敲除：

a、PCR扩增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列，将其与自杀载体相连，然后再导入杂交供体菌株中；

b、将步骤a获得的携带有丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列与自杀载体的供体菌与克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组、基因插入失活，经筛选后获得丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被失活的敲除乙酸代谢途径基因的克雷伯氏菌。

所述的步骤a的PCR扩增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列是丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的哪一部分序列并不重要，只要是该基因的部分同源序列即可。当所述的产1,3-丙二醇的野生型菌株为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)时，所述的步骤a的PCR扩增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列优选为是以肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以上游引物pflB-F：taggtacctgaaagacaaattcgcccag与下游引物pflB-R：gagagctccatgcgatccattacttcgt组成的引物进行PCR扩增后的序列。

所述的自杀载体可为自杀载体pGPCm，可从试剂公司购买。

所述的将携带有丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因部分同源序列的自杀载体导入杂交供体菌株中，可以通过热激法、电转化法、接合转化法等常规方法转化杂交供体菌。

所述的杂交供体菌可以为大肠杆菌SM10(λpir)。通过双亲本杂交，使丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列与产l,3-丙二醇的目的菌株发生同源重组，从而使产1,3-丙二醇的野生型菌株中的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因插入失活，从而获得敲除甲酸代谢途径基因的工程菌。

本发明还提供了敲除甲酸代谢途径基因的工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用。

本发明利用同源重组、基因插入失活的方法使产1,3-丙二醇的野生型菌株中的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因沉默，从而得到甲酸代谢途径被阻断的基因工程菌。用本发明的工程菌进行1,3-丙二醇的发酵生产，甲酸生产大幅度降低，使得副产物甲酸对细胞的毒害作用大大减少，1,3-丙二醇生产浓度、速率提高，另外，由于减少甲酸的代谢分流作用，提高了底物转化率。实验证明，将本发明的工程菌按常规方法发酵32小时，1,3-丙二醇浓度可达72g/L以上，甲酸合成减少90％以上。本发明在微生物发酵法生产1,3-丙二醇具有实用价值，可促进微生物发酵生产1,3-丙二醇水平提高。

附图说明：

图l是回收并纯化PCR扩增的pflB基因目的片段图

图2是载体pGPCm的物理图谱

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：甲酸代谢途径关键基因—丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株的构建。

(l)、克隆丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB部分序列

设计PCR扩增部分丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因序列的引物，引物序列如下：上游引物pflB-F：taggtacctgaaagacaaattcgcccag与下游引物pflB-R：gagagctccatgcgatccattacttcgt。以野生型肺炎克雷伯氏菌(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2011075)基因组DNA为模板，在引物pflB-F和pflB-R的引导下，PCR扩增丙酮酸甲酸裂解酶pflB的部分序列，PCR扩增条件为：先95℃3min；然后94℃1min，50℃1min，72℃1min，共32个循环；最后72℃10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化约850bp的目的基因片段(图1)，将其克隆入载体pMD18-T(TaKaRa公司)中，将重组质粒转化大肠杆菌Dh5α感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，测序验证，用限制性内切酶kpnI和sacI进行酶切鉴定，获得插入序列正确的重组质粒，命名为pT-pflB质粒。

(2)、构建丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB自杀载体pGP-pflB

用限制性内切酶kpnI和sacI酶切pT-pflB质粒，回收并纯化长度约为850bp的pflB基因DNA片段，再将其与经kpnI和sacI酶切的载体pGPCm(其物理图谱如图2所示)用DNA连接酶进行连接，将连接产物转入大肠杆菌SM10(λpir)感受态细胞，筛选阳性转化子，培养，提取质粒，kpnI和sacI酶切验证，得到含有丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB的部分序列的重组自杀载体pGP-pflB，即将丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB的部分同源序列与自杀载体pGPCm相连。

(3)、构建丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被敲除的肺炎克雷伯氏菌突变株

将步骤(2)的携带有载体pGP-pflB的大肠杆菌SM10(λpir)(供体菌)和野生型肺炎克雷伯氏菌(CCTCCM2011075)(受体菌)进行双亲本杂交，具体方法为：在含有氯霉素的LB液体培养基中过夜培养混合后的供体菌和受体菌；供体菌和受体菌按数量比3:1比例混合后，涂布于氯霉素抗性LB平板上，37℃培养12小时；用挑选培养基上的氯霉素抗性菌落克隆，梯度稀释后再次涂布于氯霉素抗性平板上，37℃培养进行筛选，得到具有氯霉素(Cm)抗性的重组菌株，即为甲酸代谢途径关键基因—丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被插入失活的肺炎克雷伯氏菌突变株(敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突变株)。

实施例2：丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被插入失活的肺炎克雷伯氏菌突变株的活性检测。

对实施例1的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被插入失活的肺炎克雷伯氏菌突变株进行丙酮酸甲酸裂解酶的活性检测，以野生型肺炎克雷伯氏菌为对照，具体方法包括以下步骤：

(l)将丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株接种于100mL培养基(每升水中含有甘油20g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl5g，pH7.0，120℃灭菌20min)中，在37℃下振荡培养6-12小时，每2小时取样离心收集菌体；

(2)用100mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.5)悬浮洗涤菌体2次；

(3)用2.5mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.5)悬浮菌体；

(4)超声波低温4℃破碎菌体；

(5)3000g低温离心30min，取上清测定酶活，测定方法为用紫外分光光度计测定反应体系在OD_340nm处1min内的变化值，即△A_340nm/min。反应体系为：含20mM的丙酮酸钠，0.08mMCoA，lmMNAD，2mMDTT，6mMDL苹果酸钠，1.4U/mL柠檬酸合成酶，13.8u/mL苹果酸脱氢酶，在pH为7.5，终浓度为0.03M磷酸钾缓冲溶液中进行反应。加入10uL粗酶液激活酶促反应。测定10min内NADH在340nm处吸光度的变化。酶活力单位定义为：在温度为30℃，pH为7.5条件下，每分钟内转化1umol丙酮酸所需的酶量定义为1个酶活单位。

结果显示，实施例l构建的敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突变株的丙酮酸甲酸裂解酶活性为野生型菌株的1.5％-3.6％，表明实施例l构建的敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突变株的丙酮酸甲酸裂解酶失活。

实施例3：利用敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突变株发酵生产1,3-丙二醇

(1)培养基

LB培养基(g·L^-1)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，琼脂10，调节至pH7.0，用于克雷伯氏菌菌种的短期保藏及活化。种子及发酵培养基组成见表1：

表1：培养基组成

(2)培养方式

(i)种子活化：从甘油管保藏的实施例1中的敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突变株及野生菌分别接种至LB培养基斜面活化，温度37℃下培养12小时活化种子。

(ii)种子培养：250mL三角瓶9层纱布封口，装液量100mL种子培养基，接入斜面菌苔(步骤i的活化种子)一环，摇床中进行好氧种子培养，温度30℃，转速150r·min^-1。

(iii)发酵培养：为了考察敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB对肺炎克雷伯氏菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的影响，以实施例1中的敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB的肺炎克雷伯氏菌突变株为实验组，以出发野生菌肺炎克雷伯氏菌为对照组，进行补料批式发酵，采用岛津LC-20AHPLC分析发酵液中物质组成。

在5L搅拌发酵罐中进行时，装液量4L，接种量1％，通入0.5vvm空气进行微氧发酵培养，搅拌转速为250rpm，发酵温度恒定在37℃；NaOH调节pH至6.8，发酵过程中体系pH通过流加40％的NaOH溶液调控。待菌株进入对数生长期后进行甘油补料，甘油浓度控制在1-50g/L。

(iv)发酵结果

发酵进行32小时，1,3-丙二醇及副产物生产情况结果见表2。

表2：失活丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因对肺炎克雷伯氏菌发酵甘油产1,3-丙二醇的影响

简写：CDW，生物量(细胞干重)；GLY，甘油；FOR，甲酸；SUC，丁二酸；LAC，乳酸；AC，乙酸；PDO，1,3-丙二醇；BDO，2,3-丁二醇；ETH，乙醇

从发酵结果可以得知，敲除丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因使甲酸合成代谢途径被切断，甲酸合成量大幅度降低90.2％，合成1,3-丙二醇浓度增加6.0％，1,3-丙二醇的生产强度增加6.1％，发酵生产1,3-丙二醇得率也增加5.6％。

Claims

1.敲除甲酸代谢途径基因的工程菌在生产1，3-丙二醇中的应用，其特征在于，所述的敲除甲酸代谢途径基因的工程菌是将克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除后获得的工程菌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的克雷伯氏菌属的细菌为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的将克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除，具体通过以下方法敲除：

a、PCR引物扩增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列，将其与自杀载体相连，然后再导入杂交供体菌株中；

b、将步骤a获得的携带有丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列与自杀载体的供体菌与克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组、基因插入失活，经筛选后获得丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被失活的敲除甲酸代谢途径基因的克雷伯氏菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，当所述的克雷伯氏菌属的细菌为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)时，所述的步骤a的PCR扩增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列是以肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以上游引物pflB-F：taggtacctgaaagacaaattcgcccag与下游引物pflB-R：gagagctccatgcgatccattacttcgt组成的引物对进行PCR扩增后的序列。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的自杀载体为自杀载体pGPCm，所述的杂交供体菌为大肠杆菌SM10(λpir)。