CN101085996B - 外源添加因子促进微生物合成2,3-丁二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了外源添加因子促进微生物合成2，3-丁二醇的方法，属于生物化工技术领域，本发明包括：培养基制备，种子培养及发酵产2，3-丁二醇的步骤；其中：在进行发酵培养前向发酵培养基中加入外源添加因子；或者，在进行发酵合成2，3-丁二醇的过程中，在菌体生长的指数期添加外源添加因子；所述的外源添加因子为柠檬酸、α-酮戊二酸、富马酸以及L-苹果酸中的一种或几种。本发明的方法可提高底物转化率，显著提高目标产物2，3-丁二醇的浓度和生产强度；操作简单，不增加额外的人工和设备，仅通过较低的附加投入，就可以提高目标产物合成浓度和转化率，从而降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，涉及外源添加因子促进微生物合成2，3-丁二醇的方法。
背景技术
2，3-丁二醇广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域(Syu M J.ApplMicrobiol Biotechnol，2001，55(1)：10-18)。其脱水产物甲乙酮是一种低沸点的溶剂，可应用于涂料、粘结剂、润滑剂、染料、油墨等行业，同时又能用作有机合成香料、抗氧剂等的中间体；酯化后的脱水产物1，3-丁二烯是一种重要的石油化工基础有机原料和合成橡胶单体；同甲乙酮浓缩脱氢后形成的辛烷异构体，可用来生产高级航空用油；其高值衍生物3-羟基丁酮(乙偶姻)和丁二酮广泛应用于食品、香料以及化妆品等行业；同时因其热值较高(27,200kJ/kg)，同乙醇(29,100kJ/kg)相当，可作为燃料添加剂使用(Garg S，Jain A.Bioresour Technol，1995，51(2)：103-109)。
目前化学法生产2，3-丁二醇，主要是以石油裂解时产生的四碳类的碳氢化合物(主要成分是77％的丁烯和23％的丁烷和异丁烷的混合物)为原料，混合物中的丁烯经过HClO的氧化及NaOH的作用后，在高温高压下水解得到几种不同种类的丁二醇(2，3-丁二醇和1，2-丁二醇等)，然后再通过减压分馏的方法分离获得。而自然界中的某些细菌具有产2，3-丁二醇的能力，主要包括克雷伯氏菌属(Klebisella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)等(Afschar A S，Vaz Rossell C E，Jonas R，et al.J Biotechnol，1993，27(3)：317-329)。在这些细菌中，克雷伯氏菌属的产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca和芽孢杆菌属的多粘芽孢杆菌Bacillus polymyxa显示出较高的生产2，3-丁二醇的潜力，尤其是前者，因为具有宽广的底物范围以及对培养条件具有很好的适应能力等优点，所以经常用于生物合成2，3-丁二醇的研究(Jansen N B，Flickinger M C，Tsao G T.BiotechnolBioeng，1984，26(4)：362-369)。2，3-丁二醇的化学合成方法的成本同生物法相比要高得多，而且同生物法相比，化学法过程繁琐，不易操作，所以一直很难实现大规模工业化生产，其用途也没有得到充分的开发。用生物法来制备2，3-丁二醇既符合绿色化工的要求，又可以克服化学法生产的困难，同时可以实现人类社会生产由传统的以不可再生化石资源为原料的石油炼制向以可再生生物质资源为原料的生物炼制转型(Ragauskas A J，Williams C K，Davison B H，et al.Sci，2006，311(5760)：484-498)，逐渐减少对日益枯竭的石油资源的依赖。近年来，随着石油价格的日益攀升，用微生物发酵法生产2，3-丁二醇，并对其系列衍生物进行开发应用逐渐引起了人们的关注(Syu M J.Appl MicrobiolBiotechnol，2001，55(1)：10-18)。
细菌生物合成2，3-丁二醇经由一种混合酸途径，发酵的终产物中除了2，3-丁二醇外还有乙醇、乙酸、乳酸和甲酸等副产物(Syu M J.Appl Microbiol Biotechnol，2001，55(1)：10-18)。其中2，3-丁二醇生成代谢支路中，1摩尔葡萄糖经糖酵解途径(EMP)转化为2摩尔丙酮酸，然后2摩尔丙酮酸由α-乙酰乳酸合成酶(ALS)催化合成1摩尔α-乙酰乳酸，1摩尔α-乙酰乳酸再经α-乙酰乳酸脱羧酶(ADC)催化转化为1摩尔3-羟基丁酮(乙偶姻)，最后，1摩尔3-羟基丁酮在2，3-丁二醇脱氢酶(BDH)的作用下生成1摩尔2，3-丁二醇，即最大理论转化率为0.5g 2，3-丁二醇/g葡萄糖；但是在实际生物转化过程中，因副产物的积累造成底物转化率较低，并且副产物的生成还会抑制菌体的生长，延长了生产周期，从而导致生产强度较低，因而其生产成本相对较高，为了降低微生物发酵法生产2，3-丁二醇的成本，目前主要有以下几种方法：
1、采用廉价碳源，如木质纤维素(木材、玉米芯等)经过预处理后的水解液、糖蜜等作为发酵底物，从而降低碳源原料成本(Yu E K C，Levitin N，Saddler J N.BiotechnolLett，1982，4(11)：741-746；Afschar A S，Bellgardt K H，Rossell C E，et al.Appl MicrobiolBiotechnol，1991，34(5)：582-585；Cao N，Xia Y，Gong C S，et al.Appl Biochem Biotechnol，1997，63/64/65：129-139)。
2、采用廉价氮源，避免使用成本相对较高的有机氮源如酵母膏、蛋白胨、牛肉膏以及麦芽浸膏等，而是采用尿素、铵盐、磷酸盐等辅以某些金属离子如Fe2+和Mn2+等来替代有机氮源，从而降低氮源原料成本(Sivakumar A，Swaminathan T，Baradarajan A.Bioproc Biosyst Eng，1995，13(1)：49-50；Laube V M，Groleau D，Martin S M.BiotechnolLett，1984，6(8)：535-540；Qin J Y，Xiao Z J，Ma C Q，et al.Chin J Chem Eng，2006，14(1)：132-136)。
3、开发新型发酵生产装置与工艺，如采用固定化细胞的方法在填充床反应器中实现2，3-丁二醇的连续生产(Lee H K，Maddox I S.Enzyme Microb Technol，1986，8(7)：409-411)以及在新型细胞循环反应器中利用细胞回用技术提高2，3-丁二醇的生产强度(Zeng A P，Biebl H，Deckwer W D.Appl Microbiol Biotechnol，1991，34(4)：463-468)等，从而降低生产成本。
但是上述几种方法，虽然从原料上降低了成本，但是却没有从源头上降低2，3-丁二醇的生产成本，即进一步提高微生物菌株生物合成2，3-丁二醇的潜力，尤其是通过改善其代谢过程以促进微生物合成2，3-丁二醇，目前的研究中还未有通过外源添加因子促进微生物合成2，3-丁二醇的报道。
发明内容
本发明针对细菌生物合成2，3-丁二醇过程中底物转化率低的问题，提供了一种生物合成2，3-丁二醇的改进方法，即在初始发酵培养基或在发酵过程中向发酵液中添加适量的外源添加因子，以提高底物转化率以及2，3-丁二醇的发酵水平，降低生产的成本。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
外源添加因子促进微生物合成2，3-丁二醇的方法，其步骤包括制备用于产酸克雷伯氏菌的发酵培养基，并往上述发酵培养基中接入产酸克雷伯氏菌种子培养液，进行发酵合成2，3-丁二醇，其中：在进行发酵培养前向发酵培养基中加入外源添加因子；或者，在进行发酵合成2，3-丁二醇的过程中，在菌体生长的指数期添加外源添加因子；所述的外源添加因子为柠檬酸、α-酮戊二酸、富马酸以及L-苹果酸中的一种或几种。
所述的方法，其中：在进行发酵培养前向发酵培养基中加入外源添加因子时，外源添加因子在发酵培养基中的初始浓度为0.05～0.75g/L；在菌体生长的指数期添加外源添加因子时，外源添加因子在发酵液中的初始浓度为0.05～0.75g/L；
所述的方法在促进产酸克雷伯氏菌合成2，3-丁二醇中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过外源添加因子改善产酸克雷伯氏菌的代谢过程，实现2，3-丁二醇生物合成过程中代谢流向2，3-丁二醇生物合成支路的定向调控，从而提高2，3-丁二醇的生物合成水平。这种方法的益处在于可提高底物转化率，显著提高2，3-丁二醇终浓度和生产强度；而且本发明操作简单，不需要额外的人工和设备，仅通过较低的附加投入，就可以提高底物的转化率和目标产物2，3-丁二醇的浓度，从而降低生产成本。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
一般性说明：
菌种：
本发明实施例中所用的菌种为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ME-303，来自申请号为200710021641.5、名称为“一种产酸克雷伯氏菌及其应用”的专利申请文献中保藏的菌种，该菌种在中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO：M 207023。
培养基：
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0～7.2
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，琼脂15，pH 7.0～7.2
基础发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，MgSO4·7H2O 0.25，FeSO4·7H2O 0.05，ZnSO4·7H2O 0.001，MnSO4·H2O 0.001，CaCl2 0.01，K2HPO4·3H2O 13.7，KH2PO42.0，(NH4)2HPO43.3，(NH4)2SO46.6
以上各种培养基均在115～121℃下灭菌15～20min(其中发酵培养基中葡萄糖单独灭菌，灭菌后再与其它组分混匀)
检测方法：
发酵液中残留底物葡萄糖、产物2，3-丁二醇和各种副产物如乙醇、乳酸和乙酸等采用DIONEX summit P680高效液相色谱仪测定。色谱柱为Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad)，柱温为60℃，检测器为SHODEX RI-101折光示差检测器，流动相为0.005mol/L H2SO4，流速为0.2mL/min，进样量为20μL。
发酵过程：
步骤1：菌种活化
甘油管保藏的菌种Klebsiella oxytoca ME-303转接至LB固体培养基斜面，37℃下活化12h后，再挑取一环菌苔接入LB固体培养基平板，37℃培养12h后获得单菌落。
步骤2：种子培养
种子培养在250mL三角瓶中进行，装液量为50mL。从步骤1获得的LB固体培养基平板上挑取一个单菌落接种于预先灭菌的装有50mL培养基的250mL三角瓶中，置于温度为37℃，转速为200r/min的摇床中培养12h，得种子液。
步骤3：发酵合成2，3-丁二醇
发酵在5L全自动发酵罐中进行，发酵培养基装液量3L，接种量5％(即每3L发酵液接种150mL种子液，接种时的种子液总是取指数生长期(培养时间约为12h，OD600＝0.6)的种子液，其浓度是一定的)，发酵温度37℃，转速为200r/min，供氧速率0.7vvm。
实施例1
向基础发酵培养基中添加柠檬酸并使其初始浓度为0.05g/L，得到改进的发酵培养基，以基础发酵培养基为对照，发酵48h后，利用HPLC检测得到基础发酵培养基和改进的发酵培养基中残留葡萄糖浓度均为0g/L，其中产物2，3-丁二醇的浓度分别为25.23g/L和26.16g/L。添加0.05g/L柠檬酸后目标产物2，3-丁二醇的终浓度比对照组提高了3.56％。
下述4组实验为仅改变发酵培养基中柠檬酸的浓度，其它条件不变，实验结束后得到如表1所示的5组数据，其中对照是指在同等条件下，以不添加柠檬酸的基础发酵培养基的发酵结果。
表1
| 添加量 | 对照 | 0.05g/L | 0.25g/L | 0.5g/L | 0.75g/L |
| 2，3-丁二醇浓度(g/L) | 25.23 | 26.16 | 31.21 | 30.99 | 27.45 |
| 增加比例 | / | 3.56％ | 19.16％ | 18.59％ | 8.09％ |
实施例2
采取的是在初始基础发酵培养基中不添加柠檬酸，而是选择在发酵过程中菌体生长达到指数期(约培养12h后，OD600＝0.6)时向发酵液中添加柠檬酸，其它条件同实施例1，结果如表2所示。
表2
| 添加量 | 对照 | 0.05g/L | 0.25g/L | 0.5g/L | 0.75g/L |
| 2，3-丁二醇浓度(g/L) | 25.23 | 27.31 | 32.40 | 31.54 | 28.31 |
| 增加比例 | / | 7.62％ | 22.13％ | 20.01％ | 10.88％ |
从表2可以看出，选择在发酵过程中菌体生长达到指数期时向发酵液中添加柠檬酸，当柠檬酸的浓度为0.05～0.75g/L时，目标产物2，3-丁二醇的终浓度可以提高7.62％～22.13％。
实施例3
向基础发酵培养基中添加α-酮戊二酸并使其初始浓度为0.05g/L，得到改进的发酵培养基，以基础发酵培养基为对照，发酵48h后，利用HPLC检测得到基础发酵培养基和改进的发酵培养基中残留葡萄糖浓度均为0g/L，其中产物2，3-丁二醇的浓度分别为25.23g/L和25.85g/L。添加0.05g/Lα-酮戊二酸后目标产物2，3-丁二醇的终浓度比对照组提高了2.40％。
下述4组实验为仅改变发酵培养基中α-酮戊二酸的浓度，其它条件不变，实验结束后得到如表3所示的5组数据，其中对照是指在同等条件下，以不添加α-酮戊二酸的基础发酵培养基的发酵结果。
表3
| 添加量 | 对照 | 0.05g/L | 0.25g/L | 0.5g/L | 0.75g/L |
| 2，3-丁二醇浓度(g/L) | 25.23 | 25.85 | 27.50 | 30.06 | 28.21 |
| 增加比例 | / | 2.40％ | 8.25％ | 16.07％ | 10.56％ |
实施例4
采取的是在初始基础发酵培养基中不添加α-酮戊二酸，而是选择在发酵过程中菌体生长达到指数期(约培养12h后，OD600＝0.6)时向发酵液中添加α-酮戊二酸，其它条件同实施例3，结果如表4所示。
表4
| 添加量 | 对照 | 0.05g/L | 0.25g/L | 0.5g/L | 0.75g/L |
| 2，3-丁二醇浓度(g/L) | 25.23 | 26.03 | 27.91 | 30.76 | 29.31 |
| 增加比例 | / | 3.07％ | 9.60％ | 17.98％ | 13.92％ |
从表4可以看出，选择在发酵过程中菌体生长达到指数期时向发酵液中添加α-酮戊二酸，当α-酮戊二酸的浓度为0.05～0.75g/L时，目标产物2，3-丁二醇的终浓度可以提高3.07％～17.98％。
实施例5
向基础发酵培养基中添加富马酸并使其初始浓度为0.05g/L，得到改进的发酵培养基，以基础发酵培养基为对照，发酵48h后，利用HPLC检测得到基础发酵培养基和改进的发酵培养基中残留葡萄糖浓度均为0g/L，其中产物2，3-丁二醇的浓度分别为25.23g/L和26.65g/L。添加0.05g/L富马酸后目标产物2，3-丁二醇的终浓度比对照组提高了5.33％。
下述4组实验为仅改变发酵培养基中富马酸的浓度，其它条件不变，实验结束后得到如表5所示的5组数据，其中对照是指在同等条件下，以不添加富马酸的基础发酵培养基的发酵结果。
表5
| 添加量 | 对照 | 0.05g/L | 0.25g/L | 0.5g/L | 0.75g/L |
| 2，3-丁二醇浓度(g/L) | 25.23 | 26.65 | 28.46 | 31.23 | 30.82 |
| 增加比例 | / | 5.33％ | 11.35％ | 19.21％ | 18.14％ |
实施例6
采取的是在初始基础发酵培养基中不添加富马酸，而是选择在发酵过程中菌体生长达到指数期(约培养12h后，OD600＝0.6)时向发酵液中添加富马酸，其它条件同实施例5，结果如表6所示。
表6
| 添加量 | 对照 | 0.05g/L | 0.25g/L | 0.5g/L | 0.75g/L |
| 2，3-丁二醇浓度(g/L) | 25.23 | 26.81 | 28.77 | 31.54 | 31.03 |
| 增加比例 | / | 5.89％ | 12.30％ | 20.01％ | 18.69％ |
从表6可以看出，选择在发酵过程中菌体生长达到指数期时向发酵液中添加富马酸，当富马酸的浓度为0.05～0.75g/L时，目标产物2，3-丁二醇的终浓度可以提高5.89％～20.01％。
实施例7
向基础发酵培养基中添加L-苹果酸并使其初始浓度为0.05g/L，得到改进的发酵培养基，以基础发酵培养基为对照，发酵48h后，利用HPLC检测得到基础发酵培养基和改进的发酵培养基中残留葡萄糖浓度均为0g/L，其中产物2，3-丁二醇的浓度分别为25.23g/L和27.32g/L。添加0.05g/LL-苹果酸后目标产物2，3-丁二醇的终浓度比对照组提高了7.65％。
下述4组实验为仅改变发酵培养基中L-苹果酸的浓度，其它条件不变，实验结束后得到如表7所示的5组数据，其中对照是指在同等条件下，以不添加L-苹果酸的基础发酵培养基的发酵结果。
表7
| 添加量 | 对照 | 0.05g/L | 0.25g/L | 0.5g/L | 0.75g/L |
| 2，3-丁二醇浓度(g/L) | 25.23 | 27.32 | 29.17 | 30.83 | 29.22 |
| 增加比例 | / | 7.65％ | 13.51％ | 18.16％ | 13.66％ |
实施例8
采取的是在初始基础发酵培养基中不添加L-苹果酸，而是选择在发酵过程中菌体生长达到指数期(约培养12h后，OD600＝0.6)时向发酵液中添加L-苹果酸，其它条件同实施例7，结果如表8所示。
表8
| 添加量 | 对照 | 0.05g/L | 0.25g/L | 0.5g/L | 0.75g/L |
| 2，3-丁二醇浓度(g/L) | 25.23 | 27.53 | 29.67 | 31.01 | 29.68 |
| 增加比例 | / | 8.35％ | 14.96％ | 18.64％ | 14.99％ |
从表8可以看出，选择在发酵过程中菌体生长达到指数期时向发酵液中添加L-苹果酸，当L-苹果酸的浓度为0.05～0.75g/L时，目标产物2，3-丁二醇的终浓度可以提高8.35％～18.64％。
实施例9
向基础发酵培养基中添加柠檬酸、α-酮戊二酸、富马酸和L-苹果酸的混合物(0.2g/L柠檬酸，0.1g/L α-酮戊二酸，0.1g/L富马酸，0.1g/L L-苹果酸)，得到改进的发酵培养基，以基础发酵培养基为对照，发酵48h后，利用HPLC检测得到基础发酵培养基和改进的发酵培养基中残留葡萄糖浓度均为0g/L，其中产物2，3-丁二醇的浓度分别为25.23g/L和31.64g/L，比对照组提高了20.26％。
下述4组实验为仅改变发酵培养基中柠檬酸、α-酮戊二酸、富马酸和L-苹果酸的浓度配比(总浓度仍为0.50g/L)，其它条件不变，实验结束后得到如表7所示的5组数据，其中对照是指在同等条件下，以不添加外源因子的基础发酵培养基的发酵结果。
表9
| 添加量 | 对照 | 0.2g/L柠檬酸0.1g/Lα-酮戊二酸0.1g/L富马酸0.1g/L L-苹果酸 | 0.1g/L柠檬酸0.2g/Lα-酮戊二酸0.1g/L富马酸0.1g/L L-苹果酸 | 0.1g/L柠檬酸0.1g/Lα-酮戊二酸0.2g/L富马酸0.1g/L L-苹果酸 | 0.1g/L柠檬酸0.1g/Lα-酮戊二酸0.1g/L富马酸0.2g/L L-苹果酸 |
| 2，3-丁二醇浓度(g/L) | 25.23 | 31.64 | 30.87 | 31.09 | 30.64 |
| 增加比例 | / | 20.26％ | 18.27％ | 18.85％ | 17.66％ |
实施例10
采取的是在初始基础发酵培养基中不添加任何外源因子，而是选择在发酵过程中菌体生长达到指数期(约培养12h后，OD600＝0.6)时向发酵液中添加柠檬酸、α-酮戊二酸、富马酸和L-苹果酸的混合物，其它条件同实施例9，结果如表10所示。
表10
| 添加量 | 对照 | 0.2g/L柠檬酸0.1g/Lα-酮戊二酸0.1g/L富马酸0.1g/L L-苹果酸 | 0.1g/L柠檬酸0.2g/Lα-酮戊二酸0.1g/L富马酸0.1g/L L-苹果酸 | 0.1g/L柠檬酸0.1g/Lα-酮戊二酸0.2g/L富马酸0.1g/L L-苹果酸 | 0.1g/L柠檬酸0.1g/Lα-酮戊二酸0.1g/L富马酸0.2g/L L-苹果酸 |
| 2，3-丁二醇浓度(g/L) | 25.23 | 32.06 | 30.98 | 31.76 | 31.05 |
| 增加比例 | / | 21.30％ | 18.56％ | 20.56％ | 18.74％ |
从表10可以看出，选择在发酵过程中菌体生长达到指数期时向发酵液中添加柠檬酸、α-酮戊二酸、富马酸和L-苹果酸的混合物，不同配比条件下，当其总浓度为0.50g/L时，目标产物2，3-丁二醇的终浓度可以提高18.56％～21.30％。
本发明中，外源添加因子还可以是采取添加柠檬酸、α-酮戊二酸、富马酸和L-苹果酸中的任意2种或3种的方式，其总浓度为0.05～0.75g/L。
Claims (3)
1.外源添加因子促进微生物合成2，3-丁二醇的方法，其步骤包括制备用于产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的发酵培养基，并往上述发酵培养基中接入产酸克雷伯氏菌种子培养液，进行发酵合成2，3-丁二醇，其特征在于，在进行发酵培养前向发酵培养基中加入外源添加因子；或者，在进行发酵合成2，3-丁二醇的过程中，在菌体生长的指数期添加外源添加因子；所述的外源添加因子为柠檬酸、α-酮戊二酸、富马酸以及L-苹果酸中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在进行发酵培养前向发酵培养基中加入外源添加因子时，外源添加因子在发酵培养基中的初始浓度为0.05～0.75g/L；在菌体生长的指数期添加外源添加因子时，外源添加因子在发酵液中的初始浓度为0.05～0.75g/L。
3.权利要求1所述的方法在促进产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)合成2，3-丁二醇中的应用。
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