CN103789388A - 一种以甘油为原料发酵-生物催化耦合合成体系生产3-羟基丙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以甘油为原料发酵-生物催化耦合合成体系生产3-羟基丙酸的方法，以甘油为底物，利用产1,3-丙二醇菌株(如克雷伯氏菌、重组大肠杆菌等)发酵生产1,3-丙二醇；以可选择性氧化多元醇的菌株（如醋杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌等）作为细胞催化剂将1,3-丙二醇催化合成3-羟基丙酸；利用偶联反应装置将克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）发酵和醋杆菌（Acetobacter sp.）静息细胞催化反应耦合，可提供一种NADH可持续再生的耦合1,3-丙二醇制备3-羟基丙酸的技术，具有十分广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物合成3-羟基丙酸的方法，具体是一种利用种间甘油发酵生产1,3-丙二醇耦合催化合成3-羟基丙酸的方法，属于微生物发酵技术领域和生物催化领域。
背景技术
3-羟基丙酸（3-HP）是一种新兴的平台化合物，被美国能源部列为当前世界上12种最具潜力的化工产品之一。3-羟基丙酸可以通过氧化还原反应生成1,3-丙二醇、丙二酸、丙烯酸、丙烯腈和丙烯酰胺等，这些化合物是生产粘胶剂、高分子材料、纤维、塑料和树脂等所必需的；3-羟基丙酸聚合生成的聚3-羟基丙酸，具有强度高、拉伸性好、生物降解性好等优点，在环境、化学等领域具有广泛应用前景。此外，3-羟基丙酸还可用于生产涂料、胶黏剂和水处理化学品等。由于3-羟基丙酸自身和潜在的巨大的开发价值，使其受到越来越多的关注。
3-羟基丙酸的合成方法主要分为化学法和微生物法，但目前此两种方法均未实现工业化生产，虽然生产工艺一直在改进，但化学法存在一定的缺点。微生物法合成3-羟基丙酸是以可再生资源为原料，其合成条件温和、副产物少、对环境影响较小等，具有化学法无法比拟的优点。由于自然界中能将葡萄糖或甘油直接转化为3-羟基丙酸的野生菌株较少且产量极低，目前微生物法合成3-羟基丙酸的研究主要集中在利用分子生物学手段构建以谷物类碳水化合物或甘油为底物生产3-羟基丙酸基因工程菌上。但是由于表达宿主Escherichia coli性能、能量平衡及关键酶甘油脱水酶结构的复杂性等问题使得3-羟基丙酸的产量不理想。
因此，利用微生物催化合成3-羟基丙酸是一种上佳的选择，该方法具有底物选择广泛、转化过程简单及转化率高等特点。目前已有研究报道一些菌株Candidarugosa,Byssochlamys sp.,Rhodococcus erythropolis能够将丙酸或丙烯酸转化合成3-羟基丙酸。但由于丙酸及丙烯酸对菌体生长具有一定的抑制性，寻找新型底物及其转化菌株尤为重要。我们从自然界中筛选获得一株Acetobacter sp.CGMCCNO.8142可将1,3-丙二醇转化为3-羟基丙酸，转化率90%以上，且底物1,3-丙二醇对菌株生长无明显抑制作用（专利申请号201310468917.X），该菌株是合成3-羟基丙酸的高效生物催化剂。本发明提出了一种提新型的、高效的、生产过程稳定的利用种间甘油发酵生产1,3-丙二醇耦合生物催化制备3-羟基丙酸的方法，采用两个不同菌种相结合，以甘油为底物一步法合成3-羟基丙酸，该系统通过反应器装置实现了NADH的可持续再生，使3-羟基丙酸合成反应高效率的进行，利用该方法生产3-羟基丙酸培养工艺简单、转化效率高、转化液成分简单，易于后期产品分离纯化、可节约大量的能源和生产成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的、高效的、生产过程稳定的利用种间甘油发酵生产1,3-丙二醇耦合生物催化制备3-羟基丙酸的方法。
本发明通过以下技术方案实现上述目的，本发明的技术方案为：
以甘油为底物，利用产1,3-丙二醇菌株(如克雷伯氏菌、重组大肠杆菌等)发酵生产1,3-丙二醇；以可选择性氧化多元醇的菌株（如醋杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌等）作为细胞催化剂将1,3-丙二醇催化合成3-羟基丙酸；建立反应体系并控制反应条件催化合成3-羟基丙酸，所述底物是甘油。
本发明优选产1,3-丙二醇菌株为克雷伯氏菌，可选择性氧化多元醇的菌株为醋杆菌。
所示耦合主要包括分别建立酶反应底物可持续生成系统和NADH再生系统；将两个系统耦合，实现NADH平衡和促进酶反应；所述酶反应底物可持续生成系统是利用Klebsiella pneumoniae以甘油为底物发酵产生1,3-丙二醇，作为下一步酶反应的底物，该过程消耗NADH；所述NADH再生系统是利用上一步发酵产生的1,3-丙二醇作为反应底物，以Acetobacter sp.静息细胞为细胞催化剂催化合成3-羟基丙酸，该反应过程产生NADH，实现NADH的再生。
所述耦合合成体系可利用温度调控1,3-丙二醇的发酵生产及3-羟基丙酸的合成速率，实现NADH的平衡及3-羟基丙酸产量的调节。
所述1,3-丙二醇是以甘油为底物培养发酵Klebsiella pneumoniae获得的，其发酵条件为：5L发酵罐，装液量2.5L，37℃，初始甘油浓度20g/L，转速200～250r/min，通气量0.5L/min。从8h起流加甘油使其保持在20g/L左右，直至22h，用10mol/L的KOH控制pH保持在7.5。所述发酵液组成为：甘油20g/L，葡萄糖5g/L，酵母膏5g/L，KH2PO47.5g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO42g/L，FeSO4·7H2O0.005g/L，VB120.015g/L，微量元素溶液10mL/L，pH8.5。微量元素溶液(g/L)：ZnCl20.07g/L，MnCl2·4H2O0.1g/L，H3BO30.06g/L，CoCl2·6H2O0.2g/L，CuCl20.02g/L，NiCl2·6H2O0.025g/L，Na2MoO4·2H2O0.035g/L。
所述细胞催化剂是以Acetobacter sp.培养生长获得的静息细胞，其生长条件为：葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO41g/L，pH6.0。
所述种间甘油发酵生产1,3-丙二醇耦合催化合成3-羟基丙酸的过程概括为：（1）分别建立酶反应底物可持续生成系统和NADH再生系统；（2）将两个系统耦合，实现NADH平衡和促进酶反应。详述如下：
本发明建立的酶反应底物可持续生成系统是利用Klebsiella pneumoniae以甘油为底物发酵产生1,3-丙二醇，作为下一步酶反应的底物，该过程消耗NADH；
本发明建立的NADH再生系统是利用上一步发酵产生的1,3-丙二醇作为反应底物，以Acetobacter sp.静息细胞为细胞催化剂催化合成3-羟基丙酸，该反应过程产生NADH，实现了NADH的再生；
本发明转化生产3-羟基丙酸是将上述两个系统通过反应器装置在一定条件下耦合，就能使底物甘油转化生成3-羟基丙酸同时实现被消耗的NADH的再生，使3-羟基丙酸合成反应高效率的进行，获得高产量3-羟基丙酸。
具体耦合条件为：将活化后的Klebsiella pneumoniae种子液接种发酵罐发酵，控制发酵培养液中甘油浓度为20g/L左右，温度35-40℃培养20-22小时，控制pH7.0-8.0；将Klebsiella pneumoniae发酵液与5g/L干重的Acetobacter sp.菌悬液混合，控制反应条件为：28-35℃，pH5.5-6.0。
优选耦合条件如下：将Klebsiella pneumoniae种子液以4%（V/V）接种量接种发酵，培养条件为：5L发酵罐，装液量2.5L，37℃，初始甘油浓度20g/L，转速150r/min，通气量0.5L/min，从8h起流加甘油使其保持在20g/L左右，直至22h，用10mol/L的KOH控制pH保持在7.5；同时，将Klebsiellapneumoniae发酵液与收集备用的5g/L（干重）的Acetobacter sp.菌悬液混合，反应条件为：30℃，pH6.0，反应48h。
本发明提出了一种利用种间发酵生产1,3-丙二醇耦合催化合成3-羟基丙酸的新方法，即采用两个不同菌种相结合，以甘油为底物一步法合成3-羟基丙酸，该系统通过反应器装置实现了NADH的可持续再生，使3-羟基丙酸合成反应高效率的进行，利用该方法生产3-羟基丙酸培养工艺简单、转化效率高、转化液成分简单，易于后期产品分离纯化、可节约大量的能源和生产成本。
具体实施方式
实施例1
（1）将Klebsiella pneumoniae活化后，移至种子培养基（酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L）中培养，37℃，180r/min，培养6～7h后获得种子培养液备用。
（2）将Acetobacter sp.活化后，移至种子培养基（葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨2g/L，pH6.0）中培养，30℃，220rpm培养16h后，以10%的接种量接入发酵培养基（葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨2g/L，pH6.0）中，30℃，220rpm培养48h后，离心获得菌体，将菌体用pH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤两次后，用pH6.0的磷酸盐缓冲液将菌体悬浮，制成菌体浓度5g/L的菌悬液备用。
（3）利用反应器装置将酶反应底物可持续生成系统和NADH再生系统耦合，实现NADH平衡和促进酶反应，具体步骤如下：将Klebsiella pneumoniae种子液以4%（V/V）接种量接种发酵，培养条件为：5L发酵罐，装液量2.5L，37℃，初始甘油浓度20g/L，转速150r/min，通气量0.5L/min，从8h起流加甘油使其保持在20g/L左右，直至22h，用10mol/L的KOH控制pH保持在7.5；同时，将Klebsiella pneumoniae发酵液与收集备用的5g/L（干重）的Acetobacter sp.菌悬液混合，反应条件为：30℃，pH6.0，反应48h后，3-羟基丙酸的产量为48-54g/L。
实施例2
Klebsiella pneumoniae种子液及Acetobacter sp.菌悬液的获得同实施例1，耦合条件不同。将Klebsiella pneumoniae种子液以5%（V/V）接种量接种发酵，培养条件为：5L发酵罐，装液量2.5L，35℃，初始甘油浓度18g/L，转速150r/min，通气量0.5L/min，从8h起流加甘油使其保持在18g/L左右，直至22h，用10mol/L的KOH控制pH保持在7.8；同时，将Klebsiella pneumoniae发酵液与收集备用的5g/L（干重）的Acetobacter sp.菌悬液混合，反应条件为：32℃，pH6.0，反应48h后，3-羟基丙酸的产量为45-50g/L。
实施例3
Klebsiella pneumoniae种子液及Acetobacter sp.菌悬液的获得同实施例1，耦合条件不同。将Klebsiella pneumoniae种子液以5%（V/V）接种量接种发酵，培养条件为：5L发酵罐，装液量2.5L，35℃，初始甘油浓度21g/L，转速150r/min，通气量0.5L/min，从8h起流加甘油使其保持在21g/L左右，直至20h，用10mol/L的KOH控制pH保持在8.0；同时，将Klebsiella pneumoniae发酵液与收集备用的5g/L（干重）的Acetobacter sp.菌悬液混合，反应条件为：35℃，pH5.5，反应48h后，3-羟基丙酸的产量为43-48g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种以甘油为原料发酵-生物催化耦合合成体系生产3-羟基丙酸的方法，其特征在于以甘油为底物，利用产1,3-丙二醇菌株以甘油为原料发酵生产1,3-丙二醇；以可选择性氧化多元醇的菌株作为细胞催化剂将1,3-丙二醇催化合成3-羟基丙酸；利用偶联反应装置将克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）发酵和醋杆菌（Acetobacter sp.）静息细胞催化反应耦合。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述产1,3-丙二醇菌株为克雷伯氏菌、重组大肠杆菌及其它可以甘油为原料发酵生产1,3-丙二醇的菌株；可选择性氧化多元醇的菌株为醋杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌或其它可选择性氧化多元醇的菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述产1,3-丙二醇菌株为克雷伯氏菌，可选择性氧化多元醇的菌株为醋杆菌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于耦合步骤为：分别建立酶反应底物可持续生成系统和NADH再生系统；将两个系统耦合，实现NADH平衡和促进酶反应；所述酶反应底物可持续生成系统是利用Klebsiella pneumoniae以甘油为底物发酵产生1,3-丙二醇，作为下一步酶反应的底物，该过程消耗NADH；所述NADH再生系统是利用上一步发酵产生的1,3-丙二醇作为反应底物，以Acetobacter sp.静息细胞为细胞催化剂催化合成3-羟基丙酸，该反应过程产生NADH，实现NADH的再生。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于具体步骤如下：将活化后的Klebsiella pneumoniae种子液接种发酵罐发酵，控制发酵培养液中甘油浓度为20g/L左右，温度35-40℃培养20-22小时，控制pH7.0-8.0；将Klebsiella pneumoniae发酵液与5g/L干重的Acetobactersp.菌悬液混合，控制反应条件为：28-35℃，pH5.5-6.0。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于具体条件如下：将Klebsiella pneumoniae种子液以4%（V/V）接种量接种发酵，培养条件为：5L发酵罐，装液量2.5L，37℃，初始甘油浓度20g/L，转速150r/min，通气量0.5L/min，从8h起流加甘油使其保持在20g/L左右，直至22h，用10mol/L的KOH控制pH保持在7.5；同时，将Klebsiella pneumoniae发酵液与收集备用的5g/L（干重）的Acetobacter sp.菌悬液混合，反应条件为：30℃，pH6.0，反应48h。
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