CN105567622A - 一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用 - Google Patents

一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105567622A
CN105567622A CN201610116652.0A CN201610116652A CN105567622A CN 105567622 A CN105567622 A CN 105567622A CN 201610116652 A CN201610116652 A CN 201610116652A CN 105567622 A CN105567622 A CN 105567622A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
bacillus coli
recombination bacillus
tac
tukgsadh
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610116652.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105567622B (zh
Inventor
牛坤
郑裕国
熊涛
秦海彬
黄建峰
柳志强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority to CN201610116652.0A priority Critical patent/CN105567622B/zh
Publication of CN105567622A publication Critical patent/CN105567622A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105567622B publication Critical patent/CN105567622B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/0103—Glycerol dehydratase (4.2.1.30)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用，所述重组大肠杆菌是将甘油脱水酶基因dhaB123、甘油脱水酶再激活因子基因gdrA、α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体编码基因TUkgsadh和甘油三磷酸脱氢酶编码基因gpd1导入宿主菌中构建而成；通过利用基因敲除技术降低副产物1,3-丙二醇产量的同时再生醛脱氢酶的辅因子NAD+，从而提高3-羟基丙酸的产量，提高15倍。

Description

一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种3-羟基丙酸的制备方法，特别涉及一种生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及其制备方法和应用。
(二)背景技术
纵观世界经济发展，以石油为基础的化石能源起到了功不可没的作用，但随着化石能源日益枯竭、全球油价不断飙升、环境污染日趋严重等问题的出现，许多国家都更加重视对可再生能源、环保能源以及新型能源的开发与研究；同时随着人类科学技术的不断进步，通过不断开发新型化学、生物方法，将使以生物资源为基础的生物加工过程替代传统化学工业成为可能。因此，从化石经济向生物经济过渡，由生物基原料代替石油基原料生产化工原料，是社会经济发展的必然趋势。
近年来，生物柴油作为一种极具发展前景的生物资源得到了快速的发展，而在此过程中，每生产10吨生物柴油就会产生1吨甘油，这不可避免地造成了市场上廉价甘油的过剩，因此，加快甘油下游产品开发的基础研究迫在眉睫。为了解决这一问题，业界兴起了以甘油为原料生产其他化学品的热潮，当前利用甘油的有效途径包括：生产乙醇，制备1,3-丙二醇，合成环氧氯丙烷，生产乙二醇，生产乳酸，合成二羟基丙酮等。研发甘油的革新用途，建立其下游化学品开发利用的有效途径，降低生物柴油生产成本，提高资源利用率成为这一新兴能源产业面临的巨大挑战，也是科学家们不断探索的新问题。
3-羟基丙酸(3-HP)是一种三碳无手性有机酸，与乳酸是同分异构体，可与水、醇、醚等多种有机溶剂互溶。其性质较为活泼，工业上可以用来合成很多重要的化工产品，如脱水生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，与醇发生酯化作用生成酯，还可通过还原作用生成1,3-丙二醇等。另外，还可用于生产涂料、胶黏剂、水处理化学品和个人护理用品等。鉴于3-HP在商业上的重大开发价值，2004年，美国能源部也将3-HP列为当前世界上12中最具开发潜力的化工产品之一。因此，以甘油为原料生物合成3-羟基丙酸的研究有望成为甘油下游产品开发的另一个具有重要价值的新途径。
3-HP的合成方法大致可分为化学合成法和生物合成法两大类。目前，3-HP的制备主要依靠化学法，即将邻卤代醇与氰化钾作用生成的3-羟基丙腈进行水解或通过Reformatsky反应来制备3-HP。此外，将丙烯酸催化水解也可得到3-HP，这是市场上3-HP的主要来源。然而由于丙烯酸和丙烯腈易燃，且工艺需高温操作，故化学合成法的安全性较低、对设备的要求也较高。同时，由于丙烯酸的原料来源限制，该方法生产的3-HP已经远不能满足市场的需求，这在很大程度上限制了3-HP化学合成技术的发展，并且导致了3-HP的价格高居不下，目前3-HP的国内市场售价高达8.5万元/吨，这也进一步阻碍了其下游产品的开发利用。与之相反，以甘油为原料采用生物合成法生产3-HP不但可以有效利用生物柴油生产过程中产生的大量副产物，延伸生物柴油产业链，还能有效降低3-HP的生产成本，加快其工业化应用的进程。
生物合成法合成3-HP包括两种方法：(1)采用野生菌株；(2)构建基因工程菌株。早在1962年就有通过微生物直接发酵合成3-HP的报道，然而接下来却长期处于实验室研究当中，并没有大规模生产。随着基因工程技术的发展，构建基因工程菌株生产3-HP，提高3-HP的产量，已经成为现在研究的热点。目前，按照利用底物不同的所构建的基因工程菌有两种：
A.以葡萄糖为底物
美国Cargill公司与陶氏公司开展了“以谷物类碳水化合物生产3-HP的发酵新工艺”这一合作项目。该公司利用玉米制得葡萄糖，然后通过构建基因工程菌来发酵制得3-HP，其路径主要包括：从橙色绿曲挠菌中克隆乳酰辅酶A脱水酶活性的多肽编码基因，从人类细胞中克隆有羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的酶编码基因，前者将乳酰辅酶A脱水生成丙烯酰辅酶A，后者可催化丙烯酰辅酶A水合生成羟基丙酰辅酶A。羟基丙酰辅酶A在一定条件下脱去辅酶A生成羟基丙酸。
B.以甘油为底物
重组菌株催化甘油合成3-HP需要甘油脱水酶和醛脱氢酶的共同作用。第一步是甘油脱水酶在辅酶维生素B12的作用下，将甘油脱水转化成3-羟基丙醛(3-HPA)；第二步是3-HPA在醛脱氢酶的氧化作用下生成3-HP，在此过程中生成还原当量NADH，产生的3-HP是细胞代谢的终产物，可在发酵液中高度聚集，其主要代谢反应路径如图1所示。其中编码甘油脱水酶的基因为dhaB基因，主要存在于克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)、弗氏柠檬菌(Citrobacterfreundii)、巴氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumpasteuianu)中，而醛脱氢酶则负责将3-HPA转化成3-HP，编码醛脱氢酶的基因有四种，分别为：aldh4、ald2、aldA和aldB，前两种来源于酵母菌，后两种则来源于大肠杆菌。
迄今为止，构建基因工程菌制备3-HP的研究取得了一定的进展，但是还存在诸多问题：(1)以大肠杆菌为宿主，3-HP产量相对较高，但由于其自身不具有甘油脱水酶活性，构建过程复杂，并且大肠杆菌自身不能生成甘油脱水酶的辅酶维生素B12，需要在发酵体系中额外加入，因其价格昂贵，从而使发酵成本大增；(2)代谢过程中会产生各种副产物，分离纯化困难；(3)重组菌中甘油脱水酶和醛脱氢酶的活性不平衡，且辅酶NAD+再生困难也是制约3-HP产量的重要原因。
(三)发明内容
本发明目的是针对现有问题，提供了一株敲除菌，用于降低副产物1,3-丙二醇(1,3-PDO)的产量，同时再生醛脱氢酶的辅因子NAD+的菌株。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将甘油脱水酶基因dhaB123、甘油脱水酶再激活因子基因gdrA(甘油脱水酶基因dhaB123和甘油脱水酶再激活因子基因gdrA的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示)、α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体编码基因TUkgsadh(核苷酸序列为SEQIDNO.3所示)和甘油三磷酸脱氢酶编码基因gpd1(核苷酸序列为SEQIDNO.4所示)导入宿主菌中构建而成；所述宿主菌为敲除乙醛还原酶/醇脱氢酶基因yqhD(GeneID:947493)的大肠杆菌，所述α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体是将α-酮戊二酸半醛脱氢酶KGSADH(核苷酸序列为SEQIDNO.2所示)的120位谷氨酸突变为天冬氨酸，219位脯氨酸突变为丙氨酸获得的。
进一步，所述甘油脱水酶基因dhaB123和甘油脱水酶再激活因子基因gdrA通过重组载体pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA导入宿主菌中。
进一步，所述α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体基因TUkgsadh通过重组载体pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh导入宿主菌中。
进一步，所述甘油三磷酸脱氢酶编码基因gpd1通过重组载体pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh导入宿主菌中。
进一步，所述大肠杆菌为E.coliW3110。
本发明还提供一种所述重组大肠杆菌在合成3-羟基丙酸中的应用，具体所述的应用：将重组大肠杆菌接种至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的发酵培养基中(以甘油为底物)，在37℃、150rpm条件下振荡培养至OD600达到0.4～0.8时，向发酵液中加入终浓度0.01～0.5mM的IPTG，同时加入终浓度5g/L的VB12(维生素B12)，在28℃、150rpm条件下诱导发酵，发酵结束获得含3-羟基丙酸的发酵液，将发酵液分离纯化，获得3-羟基丙酸；所述发酵培养基浓度组成为：甘油10-30g/L(优选30g/L)，NaCl1g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，Na2HPO4·12H2O22.7g/L，KH2PO43g/L，酵母膏4g/L，(NH4)2SO43.2g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0。
进一步，优选所述IPTG终浓度为0.01mM。
进一步，所述重组大肠杆菌在发酵培养前先进行斜面活化和种子培养，所述斜面活化为：将重组大肠杆菌接种至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的LB固体培养基培养基，在37℃培养16h，获得活化后的重组大肠杆菌；所述种子培养为：将活化后的重组大肠杆菌接种至含有50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的LB液体培养基，在37℃培养10h，获得种子液。所述种子液按体积浓度6％的接种量接种至发酵培养基。
本发明所述甘油脱水酶基因dhaB123及甘油脱水酶再激活因子基因gdrA来自克雷伯氏菌KlebsiellapneumoniaeDSM2026。本发明所使用的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)来自巴西固氮螺菌A.brasilense。本发明所使用的甘油三磷酸脱氢酶基因gpd1来自酿酒酵母S.cerevisiae。
本发明不仅克隆了来自K.penumoniaeDSM2026的甘油脱水酶基因dhaB123及甘油脱水酶激活因子基因gdrA构建重组质粒pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA，而且还克隆了A.brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶基因kgsadh筛选突变体编码基因TUkgsadh与来自酿酒酵母的甘油三磷酸脱氢酶编码基因gpd1构建了重组质粒pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh。
本发明所述宿主E.coliW3110，是敲除了生成1,3-丙二醇合成途径相关基因的乙醛还原酶基因yqhD，达到减少副产物1,3-丙二醇的合成并提高3-羟基丙酸产量的目的。本发明通过将重组质粒pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA和pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh导入到宿主重组大肠杆菌E.coliW3110_ΔyqhD中实现3-HP的生产。
本发明所述缺失基因的方法采取Red系统同源重组，在本领域技术人员的能力范围之内。所述重组载体导入重组宿主菌的方法采用化学转化法。
本发明以大肠杆菌E.coliW3110为宿主菌，在合成产物时需要添加适量的维生素B12；敲除了宿主菌合成副产物1,3-丙二醇的相关基因，减少了副产物1,3-丙二酸的合成。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：通过利用基因敲除技术降低副产物1,3-丙二醇产量的同时再生醛脱氢酶的辅因子NAD+，从而提高3-羟基丙酸的产量，提高15倍。
(四)附图说明
图1.利用甘油合成3-羟基丙酸的代谢途径示意图；
图2.pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA载体构建示意图；
图3.pCDFDuet-tac-TUkgsadh载体构建示意图；
图4.pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh载体构建示意图；
图5.甘油在大肠杆菌中的代谢途径(虚线表示已经敲除的路径)；
图6.IPTG诱导浓度对重组大肠杆菌目的蛋白表达量的影响示意图(Maker表示标准蛋白质，泳道1-4的菌株为E.coliW3110_ΔyqhD(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-TUkgsadh)，IPTG诱导浓度依次为0、0.01mM、0.25mM及0.5mM，泳道5-8的菌株为E.coliW3110_ΔyqhD(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh)，IPTG诱导浓度依次为0、0.01mM、0.25mM及0.5mM，箭头指示目的蛋白)；
图7.重组大肠杆菌发酵3-羟基丙酸(3-HP)的高效液相色谱检测；(A～D为标准品，E、F为未敲除菌E.coliW3110(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-TUkgsadh)发酵产物的示差检测图和紫外检测图，G、H为敲除菌E.coliW3110_ΔyqhD(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-TUkgsadh)发酵产物的示差检测图和紫外检测图，I、J为敲除菌E.coliW3110_ΔyqhD(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh)发酵产物的示差检测图和紫外检测图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下列实施中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
下列实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
所用酶试剂购自TaKaRa公司，提取质粒所用的试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；酵母粉、蛋白胨购置OXOID公司；所有的培养基如无特别说明均用去离子水配置。
“基因缺失”或“基因敲除”指将目的基因从基因组中删除，从而使目的基因失去表达，导致某些功能的缺失。
“电击转化”指分子生物学转染技术的一种，用于将外来目的基因整合到宿主中并稳定表达。主要利用高压电脉冲的电击作用将质粒或者基因片段导入到宿主。
“热击转化”指分子生物学转染技术的一种，用于将外来基因整合到宿主细胞中稳定表达，其利用热击作用将外来质粒导入宿主细胞中。
“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平。
本实验中所用菌株为大肠杆菌E.coliW3110。
“扩增”是指在个体染色体或者质粒中额外的引入基因以便能够过量表达。
培养基配方：
(1)LB培养液：5g/L酵母粉，10g/LNaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，pH自然，121℃灭菌20min。
(2)LB固体培养基：20g/L琼脂，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，pH自然。
(3)发酵培养基：甘油30g/L，NaCl1g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，Na2HPO4·12H2O22.7g/L，KH2PO43g/L，酵母膏4g/L，(NH4)2SO43.2g/L，其余为水，pH7.0，121℃灭菌20min。
实施例1：质粒中启动子的替换
菌株及质粒：E.ciliBL21(DE3)购自Transgen公司，表达载体pACYCDuet-1和pCDFDuet-1购自诺维信公司。
质粒pACYCDuet-1和pCDFDuet-1启动子的替换是通过同源重组将质粒上T7启动子的序列更换为tac启动子的序列。
以pACYCDuet-tac质粒的构建为例。培养含有质粒pACYCDuet-1的大肠杆菌菌株，然后以pACYCDuet-1质粒为模板，利用突变引物使质粒模板上的T7序列突变为tac，然后将用DpnI内切酶消化好的模板化学转化进BL21(DE3)感受态细胞中。然后涂布于含50mg/L氯霉素的LB固体培养基平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒进行测序验证。验证结果显示T7启动子序列(T7碱基序列：
TAATACGACTCACTATA)成功替换为tac启动子(tac启动子序列：
TGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGT)。其中所用的替换引物序列为：
Iup:5’-GGAAATTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGGGGAATTG-3’
Idown:5’-CAATTCCCCACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAATTTCC-3’
IIup:5’-AGCTTTTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGGGGAATTG-3’
IIdown:5’
-CAATTCCCCACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAAAAAGC-3’。
同理替换pCDFDuet-1的启动子为tac。
实施例2：
1、肺炎克雷伯氏菌中甘油脱水酶及甘油脱水酶激活因子的克隆与表达
(1)菌株及质粒：肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniaeDSM2026)购自德国DSM公司，大肠杆菌E.coliBL21(DE3)购自Transgen公司，表达载体pACYCDuet-tac为实施例1方法制备。
(2)甘油脱水酶基因(dhaB123)(dhaB1GeneID：7947197；dhaB2GeneID：7947198；dhaB3GeneID：7947200)和甘油脱水酶激活因子基因(gdrA)(gdrAGeneID：6936977)的克隆是以K.peneumoniaeDSM2026为模板，通过常规PCR方法扩增获得。(扩增甘油脱水酶基因及甘油脱水酶激活因子基因的引物序列为：
dhaB1-4-F-EcoR1：CCGGAATTCATGAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTACT，
dhaB1-4-R-HindIII：GTTAAGCTTGATCTCCCACTGACCAAAGCTGG)
扩增的产物再经过Clean-up试剂盒回收目的基因片段。
(3)将质粒pACYCDuet-tac和回收后的目的基因片段用EcoRI和HindIII酶切，回收酶切产物，再进行连接，酶切后的pACYCDuet-tac质粒与目的基因片段按照摩尔比1:1的比例，16℃连接12小时以上，连接产物转化入BL21(DE3)感受态细胞中，然后涂布于含50mg/L氯霉素的LB固体培养基平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒进行测序验证。验证结果显示甘油脱水酶基因及甘油脱水酶激活因子基因与质粒pACYCDuet-tac连接正确，获得重组载体
pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA。
2、巴西固氮螺菌中的α-酮戊二酸半醛脱氢酶的克隆与表达
菌株及质粒：表达载体pCDFDuet-tac为本实施例1方法制备，大肠杆菌E.coliBL21(DE3)购自Transgen公司。
本发明所使用的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)来自巴西固氮螺菌A.brasilense(kgsadhGeneID：95102055)，将该酶编码的序列进行分析后。对该基因进行了化学合成，得到质粒pET-28(b)-kgsadh。以pET-28(b)-kgsadh质粒为模板通过多次定点突变获得120位谷氨酸突变为天冬氨酸及219位脯氨酸突变为丙氨酸的pET-28(b)-TUkgsadh质粒。扩增引物为：E120D-F：
AATGGTTCGCCGATGACGGCCGCCGTGTAT，E120D-R：
ATACACGGCGGCGTCATCGGCGAACCATT，P219A-F：
CTTCCTACCTGATCGCGCACCCTGTAATCCG，P219A-R：
CGGATTAVAGGGTGCGCGATCAGGTAGGAAG。
突变的α-酮戊二酸半醛脱氢酶的克隆是以pET-28(b)-TUkgsadh为模板通过PCR扩增获得目的基因，扩增引物为：K-NdeI-F：
GGAATTCCATATGGCTAACGTGACTTATAC，K-XhoI-R：
CCGCTCGAGTTACACTGCCATAACAG。再利用Clean-up试剂盒回收目的片段
TUkgsadh。
将质粒pCDFDuet-tac和回收后的TUkgsadh目的基因用NdeI和XhoI酶切，回收酶切产物，再进行连接，pCDFDuet-tac质粒与TUkgsadh目的基因片段按照摩尔比1:3的比例进行连接，16℃连接12小时以上，连接产物转化入BL21(DE3)感受态细胞中，然后涂布于含有50mg/L硫酸链霉素的LB固体培养基平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒进行测序验证。验证结果显示突变的α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体基因与pCDFDuet-tac质粒连接正确，获得重组载体pCDFDuet-tac-
TUkgsadh。
3、酿酒酵母S.cerevisiae中甘油三磷酸脱氢酶的克隆与表达
菌株及质粒：重组质粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh为步骤2方法构建，大肠杆菌E.coliBL21(DE3)购自Transgen公司购买。
本发明所使用的甘油三磷酸脱氢酶来自酿酒酵母(gpd1GeneID：851539)，将该酶编码的序列进行分析后。对该基因进行了化学合成，得到质粒pET-28(b)-gpd1。以pET-28(b)-gpd1质粒为模板通过PCR扩增获得目的基因gpd1，扩增引物为：
GPD1-F-NcoI:CATGCCATGGATGTCTGCTGCTGCTGACCGT，
GPD1-R-EcoRI:CCGGAATTCTTAGCAGCCGGATCTCAGTG。再利用Clean-up试剂盒回收目的基因片段。
将质粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh和回收后的目的基因片段用NcoI和EcoRI双酶切，回收酶切产物，再进行连接，质粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh与目的基因片段按照摩尔比1:3的比例进行连接，16℃连接12小时以上，连接产物转化入BL21(DE3)感受态细胞中中，然后涂布于含有50mg/L硫酸链霉素的LB固体培养基平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒进行测序验证。验证结果显示甘油三磷酸脱氢酶基因与pCDFDuet-tac-TUkgsadh连接正确，获得重组载体
pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh。
4、yqhD基因的敲除
菌株及质粒：单敲除菌E.coliK12-yqhD::kan菌株、E.coliW3110、质粒pKD46、pCP20购自耶鲁大学CGSC菌种库。
以单敲除菌E.coliK12-yqhD::kan菌株的乙醛还原酶/醇脱氢酶基因替代基因的上下游约150个碱基片段为模板设计引物，PCR扩增打靶片段，再利用胶回收试剂盒收回目的基因片段。
扩增引物序列为：
yD-K-F：CCAGCAAGCGGCAAATCTCTTCACG
yD-K-R：CTTCCTCATTACTTGCTTGCCAGAC
利用胶回收试剂盒回收的目的片段进一步用乙醇纯化，以质粒pKD46为媒介与E.coliW3110野生菌进行同源重组敲除yqhD基因，通过扩增引物验证敲除yqhD的E.coliW3110工程菌，即为E.coliW3110_ΔyqhD。
5、重组菌株的构建
在E.coliW3110_ΔyqhD菌株中过量表达外源性甘油脱水酶基因(dhaB123)、甘油脱水酶再激活因子基因(gdrA)和α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体基因(TUkgsadh)，获得重组菌E.coliW3110_ΔyqhD(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh)，实现以甘油为碳源生产3-HP。
本领域技术人员应该理解，上述大肠杆菌(E.coliW3110)基因的缺失各个步骤按照标准的分子克隆技术进行；上述过表达的两种基因共同克隆表达到大肠杆菌(E.coliW3110)中，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行；其中的α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变均按照标准的分子克隆技术进行。
将E.coliW3110_ΔyqhD接种于50ml的LB液体培养基中，37℃培养至OD600约为0.4时转入50ml的离心管中，冰浴20min，使培养物冷却至0℃。4℃，4000g离心10min，弃上清，再用预冷的0.1mol/LCaCl2水溶液重悬沉淀，冰浴30min。4℃，4000g，10min离心，弃上清。再加入2mL预冷的0.1mol/LCaCl2(含有15％甘油)重悬沉淀，分装，-80℃保存，得到感受态细胞。
重组质粒pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA和重组质粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh，重组质粒pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA和重组质粒pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh双质粒分别通过化学热击法转化入E.coliW3110_ΔyqhD感受态细胞，涂布于加有50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的LB固体培养基，通过PCR筛选获得阳性克隆，获得重组E.coliW3110_ΔyqhD(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-TUkgsadh)和重组E.coliW3110_ΔyqhD(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh)。同样条件下制备对照重组大肠杆菌E.coliW3110(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-TUkgsadh)。
实施例3：重组菌株的摇瓶发酵实验及重组菌株实施SDS-PAGE目的蛋白的表达
将实施例2方法构建的重组大肠杆菌接种至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素LB固体培养基，在37℃培养16h，获得活化后的重组大肠杆菌。
将活化后的重组大肠杆菌接种至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素LB培养基，在37℃培养10h，获得种子液。
将种子液按照体积浓度6％的接种量接种到装有50mL的含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的发酵培养基中，37℃、150rpm振荡培养。当OD600达到0.6左右时，向发酵液中分别加入IPTG，终浓度分别为0、0.01mM、0.25mM及0.5mM，同时分别加入终浓度5g/L的VB12，在28℃、150rpm条件下诱导发酵42h。
取加入诱导剂发酵培养后12h的发酵产物2mL，12000g离心2分钟收集菌体，菌体细胞用生理盐水洗涤两次后用400μLpH8.0，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液重悬细胞，取20μL悬浮液加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴煮20分钟，10％SDS-PAGE电泳检测，即可检测目的蛋白的表达情况(其中DhaB蛋白质分子量中的亚基的大小分别为：α亚基：62KD，β亚基：21KD，γ亚基：12KD；甘油脱水酶激活因子GdrA：62KD；α-酮戊二酸半醛脱氢酶KGSADH：54KD)。
同时诱导发酵42h后取1mL发酵液，4℃离心1.5min，取上清用高效液相色谱检测发酵产物，样品分析前经0.22μm微滤膜过滤。发酵液中3-HP、甘油用HPLC测定，色谱柱为AminexHPX-87H柱，柱温60℃；流动性为5mMH2SO4，流速为0.6mL/min。检测器为紫外检测器与折光示差检测器，进样量为20μL，采用外标法定量。3-羟基丙酸标准品的紫外出峰时间为12.1min，乳酸标准品的紫外出峰时间为11.7min，甘油标准品示差出峰时间为12.5min，1,3-PDO标准品的出峰时间为16.2min。
表1.重组大肠杆菌发酵对比
注：ΔyqhD-K-D：E.coliW3110_ΔyqhD
(pACYCDuet-tac-dhaB/pCDFDuet-tac-TUkgsadh)；
ΔyqhD-K-G-D：E.coli
w3110_ΔyqhD(pACYCDuet-tac-dhaB/pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh)；
0、0.01、0.25及0.50代表不同IPTG诱导浓度(mM)。
实验结果表明(图7和表1所示)，在摇瓶发酵实验中，42h时敲除yqhD基因且表达gpd1基因的菌株E.coliW3110_ΔyqhD(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh)中，3-羟基丙酸产量达到4.46g/L，而未表达gpd1基因的菌株E.coliW3110_ΔyqhD(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-TUkgsadh)其3-羟基丙酸产量为4.25g/L，但是未敲除yqhD基因的对照组菌株E.coliW3110(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-TUkgsadh),其3-羟基丙酸产量仅为0.29g/L。实验结果明，敲除生成1,3-PDO代谢支路对于生成3-HP具有良好的作用，提高了3-HP的产量。
虽然本发明已经公开了示例性示范方案，但是本领域人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实验方案的任意组合。

Claims (10)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌是将甘油脱水酶基因dhaB123、甘油脱水酶再激活因子基因gdrA、α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体编码基因TUkgsadh和甘油三磷酸脱氢酶编码基因gpd1导入宿主菌中构建而成；所述宿主菌为敲除乙醛还原酶/醇脱氢酶基因yqhD的大肠杆菌，所述α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体是将α-酮戊二酸半醛脱氢酶的120位谷氨酸突变为天冬氨酸，219位脯氨酸突变为丙氨酸获得的。
2.如权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于所述甘油脱水酶基因dhaB123和甘油脱水酶再激活因子基因gdrA通过重组载体pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA导入宿主菌中。
3.如权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于所述α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体编码基因TUkgsadh通过重组载体pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh导入宿主菌中。
4.如权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于所述甘油三磷酸脱氢酶编码基因gpd1通过重组载体pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh导入宿主菌中。
5.如权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于所述大肠杆菌为E.coliW3110。
6.一种权利要求1所述重组大肠杆菌在合成3-羟基丙酸中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用：将重组大肠杆菌接种至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的发酵培养基中，在37℃、150rpm条件下振荡培养至OD600达到0.4～0.8时，向发酵液中加入终浓度0.01～0.5mM的IPTG，同时加入终浓度5g/L的VB12，在28℃、150rpm条件下诱导发酵，发酵结束，获得含3-羟基丙酸的发酵液，将发酵液分离纯化，获得3-羟基丙酸；所述发酵培养基终浓度组成为：甘油10-30g/L，NaCl1g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，Na2HPO4·12H2O22.7g/L，KH2PO43g/L，酵母膏4g/L，(NH4)2SO43.2g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述IPTG终浓度为0.01mM。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述重组大肠杆菌在发酵培养前先进行斜面活化和种子培养，所述斜面活化为：将重组大肠杆菌接种至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的LB固体培养基中，在37℃培养16h，获得活化后的重组大肠杆菌；所述种子培养为：将活化后的重组大肠杆菌接种至LB液体培养基，在37℃培养10h，获得种子液。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述种子液按体积浓度6％的接种量接种至发酵培养基。
CN201610116652.0A 2016-03-02 2016-03-02 一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用 Active CN105567622B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610116652.0A CN105567622B (zh) 2016-03-02 2016-03-02 一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610116652.0A CN105567622B (zh) 2016-03-02 2016-03-02 一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105567622A true CN105567622A (zh) 2016-05-11
CN105567622B CN105567622B (zh) 2019-10-29

Family

ID=55878256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610116652.0A Active CN105567622B (zh) 2016-03-02 2016-03-02 一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105567622B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108070546A (zh) * 2016-11-10 2018-05-25 北京科技大学 产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及其应用
CN108866117A (zh) * 2018-07-05 2018-11-23 青岛农业大学 一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用
CN108913724A (zh) * 2018-07-05 2018-11-30 青岛农业大学 一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用
CN109182232A (zh) * 2018-07-30 2019-01-11 浙江工业大学 重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用
KR101966883B1 (ko) * 2018-01-04 2019-08-13 주식회사 노루홀딩스 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법
KR101966884B1 (ko) * 2019-02-13 2019-08-13 주식회사 노루홀딩스 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법
CN114032230A (zh) * 2021-12-29 2022-02-11 安徽省农业科学院农业工程研究所 一种细菌甘油脱水酶突变体Gt9及其表达菌株的构建和应用
CN114806984A (zh) * 2022-02-28 2022-07-29 江苏大学 一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌ec01 s7、构建方法和应用
WO2023159745A1 (zh) * 2022-02-28 2023-08-31 江苏大学 一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110144377A1 (en) * 2009-06-16 2011-06-16 E. I. Du Pont Nemours And Company Process for the biological production of 3-hydroxypropionic acid with high yield
CN103497922A (zh) * 2013-09-10 2014-01-08 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种联产3-hp和p3hp的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用
CN103789388A (zh) * 2014-02-19 2014-05-14 江南大学 一种以甘油为原料发酵-生物催化耦合合成体系生产3-羟基丙酸的方法
KR20140094364A (ko) * 2013-01-22 2014-07-30 서울대학교산학협력단 재조합 대장균을 이용하여 3-히드록시프로피온산을 고수율로 생산하는 방법
CN104611383A (zh) * 2013-11-04 2015-05-13 新昌县冠阳技术开发有限公司 重组生物体3 - 羟基丙酸的制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110144377A1 (en) * 2009-06-16 2011-06-16 E. I. Du Pont Nemours And Company Process for the biological production of 3-hydroxypropionic acid with high yield
KR20140094364A (ko) * 2013-01-22 2014-07-30 서울대학교산학협력단 재조합 대장균을 이용하여 3-히드록시프로피온산을 고수율로 생산하는 방법
CN103497922A (zh) * 2013-09-10 2014-01-08 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种联产3-hp和p3hp的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用
CN104611383A (zh) * 2013-11-04 2015-05-13 新昌县冠阳技术开发有限公司 重组生物体3 - 羟基丙酸的制备方法
CN103789388A (zh) * 2014-02-19 2014-05-14 江南大学 一种以甘油为原料发酵-生物催化耦合合成体系生产3-羟基丙酸的方法

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHELLADURAI RATHNASINGH ET AL: "Development and Evaluation of Efficient Recombinant Escherichia coli Strains for the Production of 3-Hydroxypropionic Acid From Glycerol", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *
HUN SU CHU ET AL: "Metabolic Engineering of 3-Hydroxypropionic acid biosynthesis in Escherichia coli", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *
KUN NIU ET AL: "Investigation of the key factors on 3-hydroxypropionic acid production with different recombinant strains", 《3 BIOTECH》 *
KWANGWOOK KIM ET AL: "Enhanced production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol by modulation of glycerol metabolism in recombinant Escherichia coli", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 *
MUGESH SANKARANARAYANAN ET AL: "Production of 3‑hydroxypropionic acid from glycerol by acid tolerant Escherichia coli", 《JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY 》 *
张晓梅 等: "产3-羟基丙酸重组菌的构建及其转化甘油的研究", 《生物技术通报》 *
张鸿达 等: "微生物发酵法生产3–羟基丙酸的研究进展", 《化工进展》 *
曹宁 等: "肺炎克雷伯氏菌3-羟基丙酸合成关键基因过表达与NAD+再生的耦合", 《北京化工大学学报（自然科学版）》 *
权国燕 等: "甘油脱水酶再激活因子提高重组大肠杆菌3-羟基丙酸合成能力", 《中国生物工程杂志》 *
熊涛: "3-羟基丙酸合成途径的构建及优化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *
牛坤 等: "甘油发酵生产3-羟基丙酸的代谢改造工程研究进展", 《食品与发酵工业》 *
胡南 等: "重组大肠杆菌生物转化甘油生产3-羟基丙酸", 《生物技术》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108070546A (zh) * 2016-11-10 2018-05-25 北京科技大学 产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及其应用
CN108070546B (zh) * 2016-11-10 2021-10-19 北京科技大学 产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及其应用
KR101966883B1 (ko) * 2018-01-04 2019-08-13 주식회사 노루홀딩스 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법
CN108866117B (zh) * 2018-07-05 2021-02-02 青岛农业大学 一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用
CN108866117A (zh) * 2018-07-05 2018-11-23 青岛农业大学 一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用
CN108913724A (zh) * 2018-07-05 2018-11-30 青岛农业大学 一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用
CN108913724B (zh) * 2018-07-05 2021-02-02 青岛农业大学 一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用
CN109182232A (zh) * 2018-07-30 2019-01-11 浙江工业大学 重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用
CN109182232B (zh) * 2018-07-30 2022-04-19 浙江工业大学 重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用
KR101966884B1 (ko) * 2019-02-13 2019-08-13 주식회사 노루홀딩스 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법
CN114032230A (zh) * 2021-12-29 2022-02-11 安徽省农业科学院农业工程研究所 一种细菌甘油脱水酶突变体Gt9及其表达菌株的构建和应用
CN114806984A (zh) * 2022-02-28 2022-07-29 江苏大学 一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌ec01 s7、构建方法和应用
WO2023159745A1 (zh) * 2022-02-28 2023-08-31 江苏大学 一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用
CN114806984B (zh) * 2022-02-28 2024-04-09 江苏大学 一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌ec01 s7、构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105567622B (zh) 2019-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105567622A (zh) 一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用
Erian et al. Engineered E. coli W enables efficient 2, 3-butanediol production from glucose and sugar beet molasses using defined minimal medium as economic basis
Huang et al. Simultaneous production of 3-hydroxypropionic acid and 1, 3-propanediol from glycerol by a recombinant strain of Klebsiella pneumoniae
Shin et al. High-yield production of meso-2, 3-butanediol from cellodextrin by engineered E. coli biocatalysts
CN112877272B (zh) 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法
CN105018403A (zh) 一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
CN109321590B (zh) 利用乙酸生产l-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN112280722B (zh) 用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组菌及其应用
CN105647844B (zh) 一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌及其构建方法与应用
CN105647845B (zh) 一种生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及应用
CN103497922B (zh) 一种联产3-hp和p3hp的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用
JP2020516316A (ja) ３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する遺伝子組換え菌、その製造方法、及びその応用
CN107201374B (zh) 光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建方法及应用
CN107384847B (zh) 一种高效转化木糖生产乙二醇的重组菌及其应用
Lu et al. Overexpressions of xylA and xylB in Klebsiella pneumoniae lead to enhanced 1, 3-propanediol production by cofermentation of glycerol and xylose
CN108060203B (zh) 一种全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法
CN107119003B (zh) 一种利用葡聚糖合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用
CN102768713A (zh) 异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型及分子改造方法
CN108085288A (zh) 一种利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法
CN106148255A (zh) 产有机酸途径缺失的工程菌及其在联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇中的应用
CN111394396B (zh) 一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法
JP2019520849A (ja) ２，３−ブタンジオール及び他の代謝物を産生する細菌株
CN101265474A (zh) 产气荚膜梭菌甘油脱水酶激活因子基因及其1,3-丙二醇的生产方法
CN107287146B (zh) 强化表达tqsA基因的克雷伯氏菌及其生产1,3-丙二醇的应用
CN105176898B (zh) 一种利用甘油生产丙烯酸的重组菌及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant