CN105176898B - 一种利用甘油生产丙烯酸的重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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本发明公开了一种利用甘油生产丙烯酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的重组菌是过表达甘油脱水酶基因，甘油脱水酶再激活酶基因，3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶基因和丙醛脱氢酶基因。本发明的重组菌中构建了以甘油为原料，从头合成丙烯酸的代谢途径。同时，本发明还提供了该重组菌的构建方法以及应用方法。本发明以E.coli宿主菌，实现了以甘油为底物，在大肠杆菌这种模式菌株中首次合成得到丙烯酸，为丙烯酸的生产提供了新的技术方法。

Description

一种利用甘油生产丙烯酸的重组菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种利用甘油生产丙烯酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
由于化石能源危机日趋严重以及利用化石能源带来的环境问题，制造生物燃料成为迫切问题。随着生物柴油的大量生产，产生了大量副产物甘油。据估计，每生产10吨生物柴油大约生成1吨粗甘油。甘油可以作为低廉的可再生原料，用来生产化学品和燃料，可以带来巨大经济和环境效益。
丙烯酸(CH2＝CH-COOH)是一个重要的不饱和有机酸和化学工业原料。它可以广泛的应用在聚凝剂、分散剂、油漆和涂料方面，还能作为皮革、造纸、纺织中的粘合剂。同时，丙烯酸的聚合物，例如超吸水性分子材料的应用，进一步推动了丙烯酸的需求。
丙烯酸可以通过化学合成获得，但是化学合成途径具有原料有限、成本居高不下以及容易造成环境污染等问题；与化学合成法相比，生物合成操作简单、条件温和、绿色环保。越来越多的科研工作者将研究重点放在了生物合成途径上。
已知一些微生物可以在代谢中间过程产物微量丙烯酸作为中间体，包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium propionicum)、金属硫化叶菌(Sulfolobus metallicus)、埃氏巨球型菌(Megasphaera elsdenii)、橙色绿曲挠菌(Chloroflexus aurantiacus)，布氏酸菌(Acidianus brierleyi)和脱硫弧菌丙烯酸菌(Desulfovibrio acrylicus)等，但是，以上微生物大部分属于厌氧的无机自养型细菌，难以培养，代谢途径不清，不易进行生物改造。目前，微生物产丙烯酸的研究主要是利用丙酮丁醇梭菌(Clostridium propionicum)作为宿主菌实现，但是该菌的生物发酵产量低，且不能进行有效改造。同时，现有技术中尚没有一种以模式菌株大肠杆菌为宿主菌，以甘油为底物生产丙烯酸的重组菌。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种利用甘油生产丙烯酸的重组菌，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种利用甘油生产丙烯酸的重组菌。该重组菌过表达甘油脱水酶基因，甘油脱水酶再激活酶基因，3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因和丙醛脱氢酶基因。
优选地，所述甘油脱水酶基因，为来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的甘油脱水酶基因dhaBl23；所述甘油脱水酶再激活酶基因，为来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB；所述3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因，为来源于橙色绿曲挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因pcsII；所述丙醛脱氢酶基因，为来源于沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的丙醛脱氢酶基因pduP。
本发明的另一目的在于提供一种所述重组菌的构建方法，该方法的步骤如下：
1)克隆获得甘油脱水酶基因dhaBl23，甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB，3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因pcsII和丙醛脱氢酶基因pduP；
2)将步骤1)所得的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因pcsII和丙醛脱氢酶基因pduP连接到质粒载体上，获得重组质粒；
3)将步骤1)所得的甘油脱水酶基因dhaB l23和甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB插入到宿主菌的丙酸调节子基因prpR座位上，得到宿主重组菌；
4)将步骤2)所得的重组质粒导入到步骤3)所得的宿主重组菌中，获得重组菌。
优选地，步骤1)所述克隆甘油脱水酶基因dhaBl23所用引物如SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示；所述克隆甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB所用引物如SEQ ID NO.3-SEQ IDNO.4所示；所述克隆3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因pcsII所用引物如SEQ ID NO.5-SEQ IDNO.6所示；所述克隆丙醛脱氢酶基因pduP所用引物如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示。
优选地，步骤2)所述质粒载体，为质粒pETDuet-1。
优选地，步骤3)所述宿主菌为大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌。
所述方法的具体步骤如下：
1)以肺炎克雷伯氏菌的DNA为模板，分别以如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示和SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的引物克隆甘油脱水酶基因dhaBl23和甘油脱水酶基因dhaBl23；以橙色绿曲挠菌DNA为模板，以如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示的引物克隆3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因pcsII；以沙门氏菌的DNA为模板，以如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示的引物克隆丙醛脱氢酶基因pduP；
2)将步骤1)所得的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因pcsII和丙醛脱氢酶基因pduP连接到质粒pETDuet-1上，获得重组质粒pETDuet-1-pcsII-pduP；
3)将步骤1)所得的甘油脱水酶基因dhaB l23和甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB插入到大肠杆菌的丙酸调节子基因prpR座位上，得到宿主重组菌；
4)将步骤2)所得的重组质粒pETDuet-1-pcsII-pduP导入到步骤3)所得的宿主重组菌中，获得重组菌。
所述重组菌可以在发酵生产丙烯酸中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述重组菌发酵生产丙烯酸的方法，该方法的步骤如下：
1)活化权利要求1或2所述的重组菌，获得活化重组菌；
2)将步骤1)所得的活化重组菌接种到含有氨苄青霉素的M9液体培养基中进行发酵培养。
优选地，上述方法中步骤2)所述发酵培养，是按1％的接种量接种，在37℃，180rpm的条件下培养至OD600达到1.0时，加入异丙基硫代半乳糖苷诱导和维生素B12，每隔12h添加一次异丙基硫代半乳糖苷和抗生素IPTG，异丙基硫代半乳糖苷诱导后48h终止发酵。
所述重组载体导入宿主菌的方法采用热激转化法。
本发明获得的有益效果如下：
本发明以E.coli宿主菌，实现了以甘油为底物，在大肠杆菌这种模式菌株中首次合成得到丙烯酸，为丙烯酸的生产提供了新的技术方法。
本发明通过在大肠杆菌prpR基因座位处插入外源的甘油脱水酶基因(dhaB123)和甘油脱水酶再激活基因(gdrAB)到宿主E.coli上过表达，同时过表达外源的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因(pcsII)和丙醛脱氢酶基因(pduP)实现以甘油为碳底物生产发酵产丙烯酸。
定义和缩写
在本发明中使用下列的缩写或简称：
甘油脱水酶基因：dhaB123
甘油脱水酶再激活酶基因：gdrAB
3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因：pcsII
丙醛脱氢酶基因：pduP
丙酸调节子：prpR
大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)：E.coli
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)：K.penumoniae
沙门氏菌(Salmonella typhimurium)：S.typhimurium
pETDuet-1-pcsII-pduP载体：pETDuet-1-pp质粒
“基因插入”指将目标基因从基因组特定座位处插入到基因组中，从而使宿主菌携带某种特定基因表达其对应功能的蛋白质。
“热激转化”或“热转化”指分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到宿主基因中并稳定表达，其利用受到热激后，细胞膜出现裂隙，将外来基因导入宿主基因或将外来质粒导入宿主原生质体，又热激转化或热转化等。
“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
附图说明
图1为利用甘油合成丙烯酸的代谢途径示意图。
图2为pETDuet-1-pcsII-pduP载体构建示意图。
图3为重组大肠杆菌发酵产物丙烯酸的高效液相色谱检测；
(A为标准品，B为菌发酵产物)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
1)种子液摇瓶培养基
LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。
2)发酵生产摇瓶培养基
M9改良培养基：40g/L glycerol,1.5g/L KH2PO4,3g/L(NH4)2SO4,1g/L一水合柠檬酸,1g/L二水合柠檬酸三钠,1.9g/L KCl,3g/L MgSO4,0.138g/L FeSO4·7H2O，4.5mg/Lvitamin B1和100μL微量元素。
微量元素(每升)：3.7g(NH4)6Mo7O24·4H2O,2.47g H3BO4,1.58g MnCl2·4H2O,0.29g ZnSO4·7H2O,0.25g CuSO4·5H2O。
在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100mg/L的氨苄青霉素,每隔12h添加维生素B12用于甘油脱水酶(DhaB123)发挥作用。
实施例1外源基因的克隆
丙醛脱氢酶基因(pduP)(Gene ID:1253572)的克隆是以S.typhimurium为模板，通过PCR扩增获得，引物序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所说，(引物：5'-GGAATTCCATATGAATACTTCTGAACTCGAAAC-3'和5'-CGGGGTACCTTAGCGAATAGAAAAGCCGTTG-3')，再利用回收试剂盒回收目的片段。
3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因(pcsII)的克隆是以Chloroflexus aurantiacus为模板，克隆丙酰辅酶A合成酶基因(pcs)(AF445079)的阅读框区域2566bp-3552bp，该区域为pcs水合酶编码功能域，通过PCR扩增获得，引物序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示，(引物：5'-CATGGATCCTATGGAACGCTATCGCTACTTC-3'和5'-CAGAGCTCCTACAACGGCGCACTCTGGCG-3')，再利用回收试剂盒回收目的片段。
甘油脱水酶基因(dhaB123)(dhaB1 Gene ID:7947197；dhaB2 Gene ID:7947198；dhaB3Gene ID:7947200)和甘油脱水酶再激活酶基因(gdrAB)(gdrA Gene ID：6936977；gdrB Gene ID：6938011)的克隆是以K.peneumoniae为模板，通过PCR扩增获得，引物序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示。(引物：5'-CAGCTCTAGAGGATTTCACCTTTTGAGCCGATG-3'和5'-TTAACGGCATGCTGACCTCCGCTTAG-3'；5'-GCGGAGGTCAGCATGCCGTTAATAG-3'和5'-CAGAAGCTTCAGTTTCTCTCACTTAACG-3')，再利用回收试剂盒回收目的片段。
以甘油脱水酶基因(dhaB123)片段和甘油脱水酶再激活酶基因(gdrAB)片段为底物，通过搭桥PCR获得dhaB123-gdrAB。
实施例2外源基因的插入及重组质粒的构建
1.外源基因插入宿主菌的过程
在E.coli prpR座位处插入基因dhaB123，gdrAB,形成突变菌株E.coli，△prpR::dhaB123-gdrAB；菌株构建的具体过程如下：
1)以大肠杆菌prpR基因上下游500个碱基片段为模板设计引物，PCR扩增prpR基因上下游片段，利用回收试剂盒回收目的基因片段。
2)甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因的克隆是以肺炎克雷伯氏菌为模板，通过PCR扩增获得，再利用回收试剂盒回收目的片段，以甘油脱水酶基因段和甘油脱水酶再激活酶基因片段为底物，通过搭桥PCR获得dhaB123-gdrAB，利用回收试剂盒回收搭桥获得的基因片段。
3)以上述1)和2)获得的基因片段为模板进行搭桥PCR，再利用回收试剂盒回收目的片段ΔprpR(UP)-dhaB123-gdrAB-prpR(Dn)，以自杀质粒PRE112为媒介与大肠杆菌进行同源重组插入dhaB123-gdrAB基因得到Escherichia coliΔprpR::dhaB123-gdrAB；
2.重组质粒pETDuet-1-pcsII-pduP的构建过程
1)3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因的克隆是以橙色绿曲挠菌为模板，通过PCR扩增红的，再利用回收试剂盒回收目的片段，具体克隆过程与实施例1相同；
2)丙醛脱氢酶基因的克隆是以沙门氏菌为模板，通过PCR扩增获得，再利用回收试剂盒回收目的片段，具体克隆过程与实施例1相同；
3)将质粒pETDuet-1和割胶回收后的pcsII基因片段进行酶切，回收酶切产物，再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pETDuet-1-pcsII；
4)将质粒pETDuet-1-pcsII和割胶回收后的pduP基因片段进行酶切，回收酶切产物，再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pETDuet-1-pcsII-pduP(简写为pETDuet-1-pp)。
又或者，重组质粒pETDuet-1-pp(pETDuet-1-pcsII-pduP)的构建以质粒pETDuet-1-pduP和割胶回收后的pcsII基因片段为基础获得，进行双酶切所用的酶为BamHI和HindIII。
其中，将质粒pETDuet-1和割胶回收后的pduP基因片段用NdeI和KpnI酶切，回收酶切产物，再进行连接，载体与pduP基因片段按照摩尔比1:4的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pETDuet-1-pduP后，再通过限制性酶和测序鉴定。
实施例3重组菌株构建
接E.coli，△prpR::dhaB123-gdrAB于20mL的LB液体培养基中，加入50μg·mL-1的氨苄青霉素，培养至一定菌体浓度。用灭菌离心管在4℃下4000rpm离心5分钟，去除上清，用冰浴的无菌水悬浮并洗涤菌体，离心弃上清，再用4℃保存的Trans5αChemicallyCompetent Cell试剂solution A悬浮并离心，再用4℃冷藏的solution B重悬浮，分装，-80℃保存，得到感受态细胞。
重组质粒pETDuet-1-pp通过电击转化E.coli，△prpR::dhaB123-gdrAB感受态细胞，涂布于加有氨苄青霉素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆。得到工程菌株E.coli，△prpR::dhaB123-gdrAB(pETDuet-1-pp)。
实施例4重组菌株的摇瓶发酵试验
将活化后的重组菌株按1:100的比例接种到含有50mL的M9改良液体培养基的250mL 挡板摇瓶中(内含100μg·mL-1的氨苄青霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD600达到1.0左右时，加入50μmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和5μmol/L VB12，此后，每隔12h添加一次VB12和抗生素IPTG诱导后48h终止发酵。
取1mL发酵液，4℃，15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测发酵产物。液相色谱(图3)证实得到了产物丙烯酸；在摇瓶发酵中工程菌产量为58.6mg/L。
本领域技术人员应该理解，上述大肠杆菌(E.coli)基因的插入实验，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行；上述过量表达的两种基因共同克隆到大肠杆菌(E.coli)中，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种重组菌的构建方法，所述重组菌过表达甘油脱水酶基因，甘油脱水酶再激活酶基因，3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因和丙醛脱氢酶基因，所述甘油脱水酶基因，为来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶基因dhaBl23；所述甘油脱水酶再激活酶基因，为来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB；所述3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因，为来源于橙色绿曲挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因pcsII；所述丙醛脱氢酶基因，为来源于沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的丙醛脱氢酶基因pduP，其特征在于，步骤如下：
1)克隆获得甘油脱水酶基因dhaBl23，甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB，3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因pcsII和丙醛脱氢酶基因pduP；
2)将步骤1)所得的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因pcsII和丙醛脱氢酶基因pduP连接到质粒载体上，获得重组质粒；所述pcsII基因是以Chloroflexus aurantiacus为模板，克隆丙酰辅酶A合成酶基因pcs的阅读框区域2566bp-3552bp获得的；
3)将步骤1)所得的甘油脱水酶基因dhaB l23和甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB插入到宿主菌的丙酸调节子基因prpR座位上，得到宿主重组菌；所述宿主菌为大肠杆菌；
4)将步骤2)所得的重组质粒导入到步骤3)所得的宿主重组菌中，获得重组菌。
2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)所述克隆甘油脱水酶基因dhaBl23所用引物如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；所述克隆甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB所用引物如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示；所述克隆3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因pcsII所用引物如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；所述克隆丙醛脱氢酶基因pduP所用引物如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示。
3.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)所述质粒载体，为质粒pETDuet-1。
4.权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)以肺炎克雷伯氏菌的DNA为模板，分别以如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示和SEQ IDNO.3-SEQ ID NO.4所示的引物克隆甘油脱水酶基因dhaBl23和甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB；以橙色绿曲挠菌DNA为模板，以如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示的引物克隆3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因pcsII；以沙门氏菌的DNA为模板，以如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示的引物克隆丙醛脱氢酶基因pduP；
2)将步骤1)所得的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因pcsII和丙醛脱氢酶基因pduP连接到质粒pETDuet-1上，获得重组质粒pETDuet-1-pcsII-pduP；
3)将步骤1)所得的甘油脱水酶基因dhaB l23和甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB插入到大肠杆菌的丙酸调节子基因prpR座位上，得到宿主重组菌；
4)将步骤2)所得的重组质粒pETDuet-1-pcsII-pduP导入到步骤3)所得的宿主重组菌中，获得重组菌。
5.权利要求1所述构建方法获得的重组菌在发酵生产丙烯酸中的应用。
6.一种利用权利要求1所述构建方法获得的重组菌发酵生产丙烯酸的方法，其特征在于，步骤如下：
1)活化权利要求1所述构建方法获得的重组菌，获得活化重组菌；
2)将步骤1)所得的活化重组菌接种到含有氨苄青霉素的M9液体培养基中进行发酵培养。
7.权利要求6所述方法，其特征在于，步骤2)所述发酵培养，是按1％的接种量接种，在37℃，180rpm的条件下培养至OD600达到1.0时，加入异丙基硫代半乳糖苷诱导和维生素B12，每隔12h添加一次异丙基硫代半乳糖苷和维生素B12，异丙基硫代半乳糖苷诱导后48h终止发酵。
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