CN104630250A - 一种基于基因组尺度代谢网络模型指导胞内还原力调节的异丁醇合成菌株构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于基因组尺度代谢网络模型指导胞内还原力调节的异丁醇合成菌株构建方法;基于基因组尺度代谢网络模型,采用流量平衡分析和代谢最小调节分析,模拟胞内还原力代谢不同改造方式对菌株生长和异丁醇合成的作用规律,根据表型系数得出甘油醛-3-磷酸脱氢酶是异丁醇合成菌株胞内还原力调节的关键靶点。采用合成生物学人工调控元件,构建和调节依赖于NADP+的甘油-3-磷酸脱氢酶代谢通路,匹配平衡胞内还原力代谢,获得高效异丁醇合成菌株LA09。菌株胞内NADPH/NADP比值达到了0.4~0.8,以20~50g/L的葡萄糖为底物进行分批发酵时,36h内异丁醇产量可达8g/L以上,提高了60%以上。
Description
技术领域
本发明属于合成生物学和生物能源技术领域,具体涉及初始异丁醇合成菌株构建,并通过基因组尺度代谢网络模型模拟预测还原代谢调节关键靶点,指导构建异源依赖于NADP的甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gapN),并通过不同强度的组成型启动子控制gapN的表达水平调节胞内还原力,构建异丁醇合成菌株的方法。
背景技术
随着生物能源的兴起,异丁醇的生物合成最近获得了重要的关注。异丁醇具有能量密度高,挥发性和腐蚀性小,辛烷值高等优点,是理想的汽油替代品,也是最基本的化学平台物质之一。目前采用合成生物学构建异源Erhlich途径,以α-酮异戊酸为前体,耦合分支氨基酸合成途径,在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌等菌种中实现了异丁醇的合成。
为了改造优化异丁醇合成菌株,代谢网络模型模拟指导是至关重要的。有文献报道对异丁醇合成菌株代谢网络模型进行了基元模式分析,在大肠杆菌中通过途径分析发现维持NADH代谢平衡是厌氧异丁醇合成的关键因素(Trinh CT(2012)Elucidating and reprogramming Escherichia coli metabolisms forobligate anaerobic n-butanol and isobutanol production.Appl.Microbiol.Biotechnol.95(4):1083-1094),在枯草芽孢杆菌中通过通量相关性分析则发现戊糖磷酸途径是提高NADPH促进异丁醇合成的重要靶点(LiSS,Wen JP,Jia XQ(2011)Engineering Bacillus subtilis for isobutanol production,by heterologous Ehrlichpathway construction and the biosynthetic 2-ketoisovalerate precursor pathway overexpression.ApplMicrobiol Biotechnol 91(3):577-589)。值得注意的是,这种基元模式分析只能采用精简的代谢网络模型(对大肠杆菌研究了79个代谢反应,对枯草芽孢杆菌则研究了131个反应),未能全面考虑所有的胞内氧化还原代谢反应(如,NADH和NADPH分别参与了300和100多个反应),这对还原力代谢分析和靶点预测具有一定的片面性。因此,从还原力角度出发,采用更加全面的基因组尺度代谢网络模型,全局性地深入分析各种还原力调节方式对异丁醇合成菌株整体代谢作用规律,预测获得最佳还原力调节靶点及其改造方式,是十分必要的。
系统预测还原力调节靶点,需要综合考虑还原力代谢反应的辅因子置换、敲除和过表达等调节方式对异丁醇合成菌株胞内代谢的作用规律。然而,目前还没有报道同时完成这三种还原力调节方式的模拟预测,通常单一地针对敲除或过表达或辅因子替换,进行模拟预测还原力调节靶点。而采用通量平衡分析(FBA)耦合代谢最小调节算法(MOMA),为尝试模拟这三种还原力调节策略,预测异丁醇合成还原力调节靶点提供了可能。进一步对预测靶点进行改造,采用敲除、过表达或替换等简单方法通常不能够达到最佳胞内还原力状态,还有可能造成过度调节引起菌株生长和产物合成能力下降。因此,为了充分调节还原力代谢平衡,需要筛选和构建适用于异丁醇合成菌株的还原力调节代谢通路,同时为了达到最佳还原力状态,防止过度调节,采用人工基因表达调节元件对还原力调节代谢通路进行基因表达水平调节是十分重要的,其中人工组成型启动子库是典型的基因表达水平调节元件,为构建还原力调节代谢通路提供了一种有力的工具。
本发明首次从还原力代谢角度出发,采用基因组尺度代谢网络模型,模拟预测得出异丁醇合成菌株还原力代谢调节关键靶点—甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的代谢反应,并指导构建来自Clostridium的NADP+-甘油-3-磷酸脱氢酶(gapN编码)代谢通路(Martínez I,Zhu J,Lin H,Bennett GN,San KY(2008)Replacing Escherichia coli NAD-dependent glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)with aNADP-dependent enzyme from Clostridium acetobutylicum facilitates NADPH dependent pathways.MetabEng 10(6):352-359),并通过不同强度的人工组成型启动子调节gapN的表达水平,最终获得了一株异丁醇合成菌株。本发明所提供的基于模型模拟设计还原力调节方式还未见报道,其结合合成生物学中人工调控元件的精确调控胞内还原力的方法,对构建大肠杆菌异丁醇合成菌株,具有迫切的现实意义和应用价值。
发明内容
本发明针对异丁醇合成菌株的还原力平衡这一关键问题,提供了一种采用异丁醇合成菌株基因组尺度代谢网络模型,模拟预测出甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的代谢反应是胞内还原力调节关键靶点,理论指导构建依赖于NADP+-甘油-3-磷酸脱氢酶代谢通路,并通过不同强度的人工组成型启动子调节该代谢通路的表达水平,构建异丁醇合成菌株的方法。
为了实现本发明的目的,采用了如下技术方案:
一种基于基因组尺度代谢网络模型理性调节胞内还原力的异丁醇合成菌株构建方法,其步骤如下:
(1)在大肠杆菌MG1655基因组尺度代谢网络模型基础上,根据初始异丁醇合成菌株LA02基因型,添加异丁醇合成的代谢反应和异丁醇运输反应,获得的异丁醇合成菌株基因组尺度代谢网络模型;
(2)根据初始异丁醇合成菌株湿实验数据设定异丁醇合成菌株基因组尺度代谢网络模型的约束条件,联合采用代谢通量平衡分析算法和最小代谢调节算法模拟预测得出甘油醛-3-磷酸脱氢酶为最关键还原力调节靶点;
(3)针对步骤(2)模拟预测的关键靶点,构建和调节依赖于NADP的甘油醛-3-磷酸脱氢酶代谢通路,从而调节异丁醇合成菌株胞内还原力状态,构建得到一株异丁醇合成菌株。
具体方法为:
(1)将含有alsS、ilvC和ilvD基因的质粒pACYCLA09和含有kivd和yqhD基因的质粒pTRCLA10导入大肠杆菌LA01中,获得初始异丁醇合成菌株LA02。
(2)采用代谢通量平衡分析算法模拟计算胞内各个还原力的代谢反应的初始代谢通量,并依据各个还原力代谢反应的初始代谢通量,采用最小代谢调节算法模拟预测每个还原力代谢反应的辅因子置换、敲除和过表达对菌株生长和异丁醇合成等代谢通量变化,计算每个候选还原力代谢反应的的表型系数,选取表型系数最大的还原力代谢反应为最关键还原力调节靶点。
(3)针对模拟预测出的甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的代谢反应这一关键靶点,构建依赖于NADP的甘油醛-3-磷酸脱氢酶代谢通路,并采用人工启动子调节该通路表达水平调节异丁醇合成菌株胞内还原力,从而调节异丁醇合成菌株胞内还原力,最终获得一株高效合成的异丁醇合成菌株。
人工启动子调节的依赖于NADP的甘油醛-3-磷酸脱氢酶代谢通路分别存在于质粒pTRCLA13、pTRCLA14、pTRCLA15、pTRCLA16和pTRCLA17上;依赖于NADP的甘油醛-3-磷酸脱氢酶代谢通路是由来自于Clostridium acetobutylicum ATCC824的gapN基因编码,gapN基因大小为1449bp,其序列为SEQ ID NO:24;人工启动子分别为BBa_J23105、BBa_J23106、BBa_J23118、BBa_J23102和BBa_J23100,其序列分别为SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。
人工启动子调节的依赖于NADP的甘油醛-3-磷酸脱氢酶代谢通路具体步骤如下:
(1)以GeneBank已报道中Clostridium acetobutylicum ATCC824的gapN基因(NCBI-GeneID:1119839)和组成型启动子序列为依据分别设计设计引物BBa_J23105-F、BBa_J23106-F、BBa_J23118-F、BBa_J23102-F、BBa_J23100-F和gapN-R,引物序列分别为为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35,利用PCR获得五个包含不同启动子控制的gapN基因
(2)然后将步骤(1)中的获得的片段分别用KpnI和SalI,双酶切连接到相同双酶切的pTRCLA10质粒上,获得重组质粒pTRCLA13、pTRCLA14、pTRCLA15、pTRCLA16和pTRCLA17
(3)将重组质粒pACYCLA09分别与重组质粒pTRCLA13、pTRCLA14、pTRCLA15、pTRCLA16和pTRCLA17,共同转化进入E.coli LA01中(E.coli MG1655菌株pflB基因缺陷型),获得5株不同的胞内还原力调节的异丁醇合成菌株;
(4)对步骤(3)中构建菌株进行摇瓶发酵,获得高效异丁醇合成菌株,其产量最大可达到8g/L以上。
发酵方法为:30~37摄氏度条件下培养,转速200~250rpm,当细胞OD600增长到0.6~0.8时,加入0.1~1mM的IPTG进行异丁醇诱导。
培养基为:20~40g/L葡萄糖,5~10g/L酵母浸粉,5~6g/L Na2HPO4·12H2O,3~4g/L KH2PO4,0.5~1.5g/L NaCl,1~2g/L NH4Cl,0.2~0.6g/L MgSO4,0.01~0.05g/L CaCl2和1000倍稀释的Trace mix A;其中:Trace mix A包含2~4g/L H3BO3,1~3g/L MnCl2·4H2O,0.2~0.8g/L ZnSO4·7H2O,0.3~0.5g/LNaMoO4·2H2O,0.07~0.10g/L CuSO4·5H2O,and 49~60mg/L Co(NO3)2·6H2O。
下面根据具体载体图和序列等对本发明详细说明:
(1)针对异丁醇合成途径,构建了包括alsS、ilvC、ilvD、kivd和yqhD的异丁醇合成途径,获得了初始大肠杆菌异丁醇合成菌株,其具体步骤如下:
以pTRC99a为模板,设计引物PLO-F和PLO-R,引物序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7,利用PCR获得片段PLO;以pTRC99a为模板,设计引物TB-F和TB-R,引物序列为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9,利用PCR获得片段TB;片段PLO和TB用KpnI和PstI双酶切后,连接获得质粒pTRCLA(图6)。
以pTRC99a为模板,设计引物PT-F和PT-R,引物序列为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11,利用PCR获得片段PT;以pACYC184为模板,设计引物OC-F和OC-R,引物序列为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13,利用PCR获得片段OC;片段PT和OC用BglII和MluI双酶切后,连接获得质粒pACYCLA(图7)。
以GeneBank已报道中Bacillus subtilis 168的alsS基因(NCBI-Gene ID:936852)为依据设计引物alsS-F和alsS-R,引物序列为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15,利用PCR获得alsS基因,然后BamHI和SalI双酶切连接到相同双酶切的pUC18质粒上,获得重组质粒pUCLA03(图3);
以GeneBank已报道中Escherichia coli MG1655的ilvC基因(NCBI-Gene ID:948286)为依据设计引物ilvC-F和ilvC-R,引物序列为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17,利用PCR获得ilvC基因,然后MluI和salI双酶切连接到相同双酶切的pUCLA03质粒上,获得重组质粒pUCLA04(图4);
以GeneBank已报道中E.coli MG1655的ilvD基因(NCBI-Gene ID:948277)为依据设计引物ilvD-F和ilvD-R,引物序列为SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19,利用PCR获得ilvD基因,然后BglII和salI双酶切连接到相同双酶切的pUCLA04质粒上,获得重组质粒pUCLA05(图5)。
重组质粒pUCLA05经过BamHI和SalI双酶切,将含有alsS、ilvC和ilvD的片段连接到pACYCLA上获得重组质粒pACYCLA09(图8)。
以GeneBank已报道中Lactococus lactis的kivd基因(NCBI-Gene ID:1114953)为依据设计引物kivd-F和kivd-R,引物序列为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21,利用PCR获得kivd基因,然后BamHI和XbaI双酶切连接到相同双酶切的pUC18质粒上,获得重组质粒pUCLA01(图1);
以GeneBank已报道中E.coli MG1655的yqhD基因(NCBI-Gene ID:947493)为依据设计引物yqhD-F和yqhD-R,引物序列为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23,利用PCR获得yqhD基因,然后PstI和XbaI双酶切连接到相同双酶切的pUCLA01质粒上,获得重组质粒pUCLA02(图2);
重组质粒pUCLA02经过BamHI和XbaI双酶切,将含有kivd和yqhD的片段连接到pTRCLA上获得重组质粒pTRCLA10(图9)。
将重组质粒pACYCLA09分别与重组质粒pTRCLA10共同转化进入E.coli LA01中(E.coli MG1655菌株pflB基因缺陷型),获得初始异丁醇合成菌株LA02。
(2)针对异丁醇合成过程中还原力失衡这一关键问题,采用异丁醇合成菌株基因组尺度代谢网络模型预测模拟还原力调节关键靶点,具体如下:
根据初始异丁醇合成菌株实验数据作为约束条件,采用代谢通量平衡分析算法模拟计算胞内各个还原力的代谢反应的初始代谢通量,并去除其中的通量为0的、生长必需的、未知基因信息的、和次要外围的代谢反应(包括,细胞膜合成,甘油磷脂代谢,无机离子运输和代谢,多糖合成和循环,膜脂代谢,胞壁质合成,内/外膜运输代谢反应),筛选获得候选还原力代谢反应;针对候选还原力代谢反应,采用最小代谢调节算法模拟预测候选反应的辅因子置换、敲除、过表达等改造方式对菌株生长和异丁醇合成等代谢通量的变化,计算表型系数,选取表型系数最大的甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的代谢反应(表型系数为1.8~2.0)为最关键还原力调节靶点;
(3)针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的代谢反应这一关键靶点,构建gapN基因编码的NADP+-甘油-3-磷酸脱氢酶代谢通路,并通过人工组成型启动子调节gapN的表达水平,精确调节胞内还原力水平,获得异丁醇合成菌株LA09,其具体步骤如下:
以GeneBank已报道中Clostridium acetobutylicum ATCC824的gapN基因(NCBI-Gene ID:1119839)和组成型启动子序列为依据分别设计设计引物BBa_J23105-F、BBa_J23106-F、BBa_J23118-F、BBa_J23102-F、BBa_J23100-F和gapN-R,引物序列分别为为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35,利用PCR获得五个包含不同启动子控制的gapN基因。然后将这五个获得的片段分别用KpnI和SalI,双酶切连接到相同双酶切的pTRCLA10质粒上,获得重组质粒pTRCLA13、pTRCLA14、pTRCLA15、pTRCLA16和pTRCLA17(图10-14)。最后,将重组质粒pACYCLA09分别与重组质粒pTRCLA10、pTRCLA13、pTRCLA14、pTRCLA15、pTRCLA16和pTRCLA17,共同转化进入E.coli LA01中(E.coli MG1655菌株pflB基因缺陷型),最终获得了异丁醇合成菌株E.coli LA02、E.coli LA05、E.coli LA06、E.coli LA07、E.coli LA08和E.coli LA09。
(4)异丁醇分批发酵:首先在含有3mLLB培养基的试管中培养异丁醇合成菌株,过夜,按照1~2%的接种量接种到含有不同体积M9Y培养基的密封的250mL三角瓶中,30~37摄氏度条件下培养,转速200~250rpm,当细胞OD600增长到0.6~0.8时,加入0.1~1mM的IPTG进行异丁醇诱导。M9Y培养基有20~40g/L葡萄糖,5~10g/L酵母浸粉,5~6g/L Na2HPO4·12H2O,3~4g/L KH2PO4,0.5~1.5g/L NaCl,1~2g/L NH4Cl,0.2~0.6g/L MgSO4,0.01~0.05g/L CaCl2和1000倍稀释的Trace mix A。其中。Trace mixA包含2~4g/L H3BO3,1~3g/L MnCl2·4H2O,0.2~0.8g/L ZnSO4·7H2O,0.3~0.5g/L NaMoO4·2H2O,0.07~0.10g/L CuSO4·5H2O,and 49~60mg/L Co(NO3)2·6H2O。
利用本发明的方法所获得的最佳异丁醇合成菌株,以36g/L的葡萄糖为底物,36h内异丁醇产量可达8g/L以上,提高了60%以上。
本发明提供了采用基因组尺度代谢网络模型,模拟预测得出异丁醇合成菌株还原力代谢调节关键靶点—甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的代谢反应,指导构建gapN基因编码的NADP+-甘油-3-磷酸脱氢酶代谢通路,并通过不同强度的组成型启动子对gapN基因进行表达调节,进而调节大肠杆菌异丁醇合成菌株胞内还原力状态,最终获得异丁醇合成菌株。以20~40g/L的葡萄糖为底物进行分批发酵时,gapN的表达调节实现异丁醇合成菌株胞内NADPH/NADP+值提高了100%~300%,36h内异丁醇产量可达8g/L以上,提高了60%以上。本发明对实现大肠杆菌中胞内还原力调节和异丁醇高效合成表现出了重大潜力和价值。
附图说明
图1:pUCLA01质粒物理图谱;
图2:pUCLA02质粒物理图谱;
图3:pUCLA03质粒物理图谱;
图4:pUCLA04质粒物理图谱;
图5:pUCLA05质粒物理图谱;
图6:pTRCLA质粒物理图谱;
图7:pACYCLA质粒物理图谱;
图8:pACYCLA09质粒物理图谱;
图9:pTRCLA10质粒物理图谱;
图10:pTRCLA13质粒物理图谱;
图11:pTRCLA14质粒物理图谱;
图12:pTRCLA15质粒物理图谱;
图13:pTRCLA16质粒物理图谱;
图14:pTRCLA17质粒物理图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行说明,下述实施例是说明性的,不是限定性的,本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化,所述的这些改进和变化都应当视为在本发明的范围内,本发明的范围和实质有权利要求来限定。其中菌株Lactococus lactis、Clostridium acetobutylicum ATCC824,Bacillus subtilis 168和E.coli MG1655,质粒pTRC99a和pACYC184均有市售。以下实施例中未注明的具体的实验方法,通常按照常规条件,如《分子克隆:实验手册》中所述的方法或厂商提供的方案进行"
实施例1载体质粒pTRCLA和pACYCLA构建
(1)以pTRC99a为模板,设计引物PLO-F和PLO-R,引物序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7,利用PCR获得片段PLO;以pTRC99a为模板,设计引物TB-F和TB-R,引物序列为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9,利用PCR获得片段TB;片段PLO和TB用KpnI和PstI双酶切后,连接获得质粒pTRCLA(图6)。
双酶切体系:片段PLO或片段TB 20μL,KpnI 1μL,PstI 1μL,10×buffer 1μL,ddH2O 23μL,37℃反应1h。
连接体系:TB片段7μL,PLO片段1μL,T4连接酶0.5μL,ddH2O 1.5μL,22℃反应1h。
(2)以pTRC99a为模板,设计引物PT-F和PT-R,引物序列为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11,利用PCR获得片段PT;以pACYC184为模板,设计引物OC-F和OC-R,引物序列为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13,利用PCR获得片段OC;片段PT和OC用BglII和MluI双酶切后,连接获得质粒pACYCLA(图7)。
双酶切体系:片段PT或片段OC 20μL,BglII 1μL,MluI 1μL,10×buffer 1μL,ddH2O 23μL,37℃反应1h。
连接体系:PT片段7μL,OC片段1μL,T4连接酶0.5μL,ddH2O 1.5μL,22℃反应1h。
通用PCR扩增方法
PCR体系:ddH2O 27μL,模板1μL,Fastpfu buffer 10μL,Fastpfu 1μL,引物13μL,引物23μL,dNTP 5μL。
PCR条件:Step 194℃4min,Step 294℃30s,Step 360℃30s,Step 472℃1.5min,Step 572℃10min,Step 64℃保温。
实施例2异丁醇合成途径的重组质粒pACYCLA09和pTRCLA10构建
(1)首先提取DNA模版
Bacillus subtilis 168在LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、pH 7.0)中进,37℃200rpm培养,至对数期后,利用基因组提取试剂盒(天根)提取总DNA。
Lactococus lactis在MRS培养基(10g/L蛋白胨、10g/L牛肉浸粉、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、1.0mL吐温80、2g/L柠檬酸氢二铵、5g/L乙酸钠、2g/L K2HPO4·3H2O、0.58g/L MgSO4·7H2O、0.25g/LMnSO4·H2O、pH 7.0)中静止培养至对数期后,利用基因组提取试剂盒(天根)提取总DNA。
E.coli MG1655在LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、pH 7.0)中进,37℃200rpm培养,至对数期后,利用基因组提取试剂盒(天根)提取总DNA。
(2)扩增alsS、ilvC、ilvD、kivd和yqhD基因
alsS基因引物序列为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15,以Bacillus subtilis 168基因组为模板;ilvC基因引物序列为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17,以E.coli MG1655基因组为模板;ilvD基因(NCBI-GeneID:948277)引物序列为SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19,以E.coli MG1655基因组为模板;kivd基因引物序列为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21,以Lactococus lactis基因组为模板;yqhD基因引物序列为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23,以E.coli MG1655基因组为模板;。
PCR体系:ddH2O 27μL,模板1μL,Fastpfu buffer 10μL,Fastpfu 1μL,引物13μL,引物23μL,dNTP 5μL。
PCR条件:Step 194℃4min,Step 294℃30s,Step 360℃30s,Step 472℃1.5min,Step 572℃10min,Step 64℃保温。
经PCR扩增获得alsS、ilvC、ilvD、kivd和yqhD基因片段
(3)重组质粒pACYCLA09构建
在含有氯霉素(20μg/mL)的LB培养基中(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L),接种带有质粒pUC18的大肠杆菌DH5α,37℃,200rpm/min过夜培养。质粒提取盒(天根)提取质粒。
载体pUC18和alsS基因片段用BamHI和SalI双酶切,T4连接酶连接,获得重组质粒pUCLA03。然后pUCLA03和ilvC基因片段用MluI和salI双酶切,T4连接酶连接,获得重组质粒pUCLA04。然后pUCLA04和ilvD基因片段用BglII和salI双酶切,T4连接酶连接,获得重组质粒pUCLA05。重组质粒pUCLA05经过BamHI和SalI双酶切,将含有alsS、ilvC和ilvD的片段连接到pACYCLA上获得重组质粒pACYCLA09(图8)。
双酶切体系:质粒或者片段20μL,BamHI 1μL,XbaI 1μL,10×buffer 1μL,ddH2O 23μL,37℃反应1h。
连接体系:基因双酶切片段7μL,质粒双酶切片段1μL,T4连接酶0.5μL,ddH2O 1.5μL,22℃反应1h。
(4)重组质粒pTRCLA10的构建
在含有氯霉素(20μg/mL)的LB培养基中(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L),接种带有质粒pUC18的大肠杆菌DH5α,37℃,200rpm/min过夜培养。质粒提取盒提取质粒。
对载体pUC18和片段kivd基因用BamHI和XbaI双酶切,T4连接酶连接,获得重组质粒pUCLA01。然后pUCLA01质粒和yqhD基因片段以PstI和XbaI双酶切,T4连接酶连接,获得重组质粒pUCLA02;重组质粒pUCLA02经过BamHI和XbaI双酶切,将含有kivd和yqhD的片段连接到pTRCLA上获得重组质粒pTRCLA10(图9)。
双酶切体系:质粒或者片段20μL,BamHI 1μL,XbaI 1μL,10×buffer 1μL,ddH2O 23μL,37℃反应1h。
连接体系:基因双酶切片段7μL,质粒双酶切片段1μL,T4连接酶0.5μL,ddH2O 1.5μL,22℃反应1h。
实施例3初始异丁醇合成菌株构建
(1)大肠杆菌E.coli LA01电转化感受态制备
1)-80冰箱中划线转接出菌株接种,37℃培养。
2)挑取单克隆,转接到5mL LB试管中,200rpm,37℃培养过夜。
3)1%接种量接种至50ml LB培养基,37℃,200rmp,OD600达到0.5~0.6时停止培养。
4)无菌条件下,将细菌转移至冰预冷的50mL离心管中,冰上放置20min,4200rpm,4℃离心10min。
5)弃培养基,管倒置1min,用50mL预冷10%的甘油重悬沉淀,离心洗涤3次。
6)加500uL 10%的甘油重悬,分装在已灭菌预冷的离心管中,每个离心管中约100uL。
7)液氮迅速冷却,-80℃保藏。
(2)双质粒电转化
1)将预先需要转化的质粒样品用PCR试剂盒纯化,洗脱体系中含有的离子。
2)向新鲜制备的100uL感受态中加入双质粒样品pACYCLA09和pTRCLA10(体积不少过10uL,DNA量不超过100ng),轻弹混匀后在冰上放置30min,同时将电击杯放置冰上30min。
3)无菌条件下,将菌液移至预冷的电击杯中,冰上放置30min。
4)擦干电击杯,1800伏电击5s。
5)向电击杯中快速加入l mL预热至37℃的SOC培养基,然后将混合菌液吸至预灭菌的1.5mL离心管中,37℃,100-120rpm,培养45min。
6)10000rpm,1min。弃去大部分清夜,留有培养液大约50~100uL,轻轻吹打悬浮,涂在含有氯霉素和氨苄青霉素抗生素的LB琼脂平板表面。
7)倒置培养皿,37℃培养过夜。
(3)异丁醇合成菌株鉴定
将平板上的单克隆挑取至带有双抗性的LB培养基中进行过夜培养,采用试剂盒提取质粒,进行双酶切和PCR验证。验证正确后的菌株为所需的初始异丁醇合成菌株LA02。
实施例4初始异丁醇合成菌株基因组尺度网络模型和靶点模拟预测
初始异丁醇合成菌株E.coli LA02由大肠杆菌MG1655构建而成,采用最新的大肠杆菌基因组尺度代谢网络模型IJO1366进行升级补充,添加异丁醇合成途径代谢反应和异丁醇非消耗能量型的运输反应,调整pntAB基因编码转氢酶所催化的转氢反应(THD2pp)需要1个胞外氢离子运输到胞内,最后获得异丁醇合成菌株E.coli LA02代谢的基因组尺度代谢网络模型。
以Constraint-Based Reconstruction and Analysis 2.0(COBRA)工具包和Groubi线性/非线性规划优化算法为工具。根据实验测定的数据设定葡萄糖吸收速率下限为-7.0~-10.0mM/g/h,异丁醇生成速率下限为为0.1~1.0mM/g/h,副产物乳酸、乙醇、乙酸和琥珀酸的生成速率下限分别设定为8~10、0.5~1.5、0.5~1.5和0.1~0.8mM/g/h,并根据参考文献设定氧气吸收速率下限为-1.0~-5.0mM/g/h,才用通量平衡分析模拟计算胞内NADH和NADPH参与的各个代谢反应的初始代谢通量。
针对其中候选还原力代谢反应,约束改造后的模型中代谢通量是初始代谢通量的0倍(可模拟反应敲除)或1~5倍(可模拟反应代谢过表达),或添加改变辅因子的还原力代谢反应(设定原来反应的代谢通量为0,添加的反应代谢通量约束为初始代谢通量的0~5倍变化),然后再采用MOMA算法模拟预测候选反应的改造引起的胞内代谢通量变化。并计算表型系数(fPH),计算方式如下
fPH=(fbiomass)×(fisobutanol 2)
fbiomass=(vbiomass,modification/vbiomass,initial)
fisobutanol=(visobutanol,modification/visobutanol,initial)
通过比较分析筛选,fPH值最高的代谢反应GAPD是最关键的靶点(fPH=1.8~2.0)
实施例5gapN编码的依赖于NADP+的甘油醛-3-磷酸脱氢酶代谢通路表达质粒构建
(1)以GeneBank已报道中Clostridium acetobutylicum ATCC824的gapN基因(NCBI-Gene ID:1119839)和组成型启动子序列为依据分别设计设计引物BBa_J23105-F、BBa_J23106-F、BBa_J23118-F、BBa_J23102-F、BBa_J23100-F和gapN-R,引物序列分别为为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35,利用PCR获得五个包含不同启动子控制的gapN基因
PCR体系:ddH2O 27μL,模板1μL,Fastpfu buffer 10μL,Fastpfu 1μL,引物13μL,引物23μL,dNTP 5μL。
PCR条件:Step 194℃4min,Step 294℃30s,Step 361℃30s,Step 472℃1.5min,Step 572℃10min,Step 64℃保温。
(2)然后将步骤(1)中的获得的片段分别用KpnI和SalI,双酶切连接到相同双酶切的pTRCLA10质粒上,获得重组质粒pTRCLA13、pTRCLA14、pTRCLA15、pTRCLA16和pTRCLA17(图10-14)。
双酶切体系:质粒或者片段20μL,KpnI 1μL,SalI,1μL,10×buffer 1μL,ddH2O 23μL,37℃反应1h。
连接体系:gapN双酶切片段7μL,pTRCLA10双酶切片段1μL,T4连接酶0.5μL,ddH2O 1.5μL,22℃反应1h。
实施例6gapN编码的依赖于NADP+的甘油醛-3-磷酸脱氢酶代谢通路调节胞内还原力的异丁醇合成菌株构建
具体方法见实施例3,将重组质粒pACYCLA09分别与重组质粒pTRCLA13、pTRCLA14、pTRCLA15、pTRCLA16和pTRCLA17,共同转化进入E.coli LA01中(E.coli MG1655菌株pflB基因缺陷型),进行双酶切和PCR验证。验证正确后,获得5株不同的胞内还原力调节的异丁醇合成菌株LA05、LA06、LA07、LA08和LA09。
实施例7异丁醇合成菌株分批发酵实验
(1)培养基与方法
M9Y培养基:20~40g/L葡萄糖,5~10g/L酵母浸粉,5~6g/L Na2HPO4·12H2O,3~4g/L KH2PO4,0.5~1.5g/L NaCl,1~2g/L NH4Cl,0.2~0.6g/L MgSO4,0.01~0.05g/L CaCl2和1000倍稀释的Trace mix A。其中。Trace mix A包含2~4g/L H3BO3,1~3g/L MnCl2·4H2O,0.2~0.8g/L ZnSO4·7H2O,0.3~0.5g/LNaMoO4·2H2O,0.07~0.10g/L CuSO4·5H2O,and 49~60mg/L Co(NO3)2·6H2O
异丁醇气相色谱(GC)定量分析:色谱柱为PEG-20M毛细色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm,上海科创)。程序升温,60℃保持1min,以10℃/min升温至110℃,再以30℃/min升温至230℃,保持2min。进样口及检测器温度均为230℃。
(2)发酵实验:首先在含有3mL LB培养基的试管中培养异丁醇合成菌株,过夜,按照1%~5%的接种量接种到含有不同体积M9Y培养基的密封的250mL三角瓶中,30摄氏度条件下培养,转速200~250rpm,当细胞OD600增长到0.4~0.8时,加入0.1~1mM的IPTG进行异丁醇诱导。发酵培养24~36h后取培养液,10000rpm离心,并0.22μm膜过滤,取上清测定异丁醇含量。
(3)异丁醇含量测定:将发酵液在4℃,10000rpm条件下离心10min,取500μL上清液与300μL甲苯(色谱纯)涡旋混合2min,50℃水浴10min,然后离心5min,取有机相用于样品分析。测定结果表明异丁醇产量为8g/L以上。
Claims (8)
1.一种基于基因组尺度代谢网络模型理性调节胞内还原力获得高效异丁醇合成菌株的方法,其特征步骤如下:
(1)在大肠杆菌MG1655基因组尺度代谢网络模型基础上,根据初始异丁醇合成菌株LA02基因型,添加异丁醇合成的代谢反应和异丁醇运输反应,获得的异丁醇合成菌株基因组尺度代谢网络模型;
(2)根据初始异丁醇合成菌株湿实验数据设定异丁醇合成菌株基因组尺度代谢网络模型的约束条件,联合采用代谢通量平衡分析算法和最小代谢调节算法模拟预测得出甘油醛-3-磷酸脱氢酶为最关键还原力调节靶点;
(3)针对步骤(2)模拟预测的关键靶点,构建和调节依赖于NADP的甘油醛-3-磷酸脱氢酶代谢通路,从而调节异丁醇合成菌株胞内还原力状态,最终获得一株高效合成的异丁醇合成菌株。
2.权利要求1所述的方法,其特征在于:采用代谢通量平衡分析算法模拟计算胞内各个还原力的代谢反应的初始代谢通量,并依据各个还原力代谢反应的初始代谢通量,采用最小代谢调节算法模拟预测每个还原力代谢反应的辅因子置换、敲除和过表达对菌株生长和异丁醇合成等代谢通量变化,计算每个候选还原力代谢反应的的表型系数,选取表型系数最大的还原力代谢反应为最关键还原力调节靶点。
3.权利要求1所述的方法,其特征在于:将含有alsS、ilvC和ilvD基因的质粒pACYCLA09和含有kivd和yqhD基因的质粒pTRCLA10导入大肠杆菌LA01中,获得初始异丁醇合成菌株LA02。
4.权利要求1所述的方法,其特征在于:针对模拟预测出的甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的代谢反应这一关键靶点,构建依赖于NADP的甘油醛-3-磷酸脱氢酶代谢通路,并采用人工启动子调节该通路表达水平调节异丁醇合成菌株胞内还原力,从而调节异丁醇合成菌株胞内还原力,最终获得一株高效合成的异丁醇合成菌株。
5.权利要求1或4所述的方法,其特征在于:人工启动子调节的依赖于NADP的甘油醛-3-磷酸脱氢酶代谢通路分别存在于质粒pTRCLA13、pTRCLA14、pTRCLA15、pTRCLA16和pTRCLA17上;依赖于NADP的甘油醛-3-磷酸脱氢酶代谢通路是由来自于Clostridiumacetobutylicum ATCC824的gapN基因编码,gapN基因大小为1449bp,其序列为SEQ ID NO:24;人工启动子分别为BBa_J23105、BBa_J23106、BBa_J23118、BBa_J23102和BBa_J23100,其序列分别为SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28和SEQID NO:29。
6.权利要求1或4所述的方法,其具体步骤如下:
(1)以GeneBank已报道中Clostridium acetobutylicum ATCC824的gapN基因(NCBI-GeneID:1119839)和组成型启动子序列为依据分别设计设计引物BBa_J23105-F、BBa_J23106-F、BBa_J23118-F、BBa_J23102-F、BBa_J23100-F和gapN-R,引物序列分别为为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35,利用PCR获得五个包含不同启动子控制的gapN基因
(2)然后将步骤(1)中的获得的片段分别用KpnI和SalI,双酶切连接到相同双酶切的pTRCLA10质粒上,获得重组质粒pTRCLA13、pTRCLA14、pTRCLA15、pTRCLA16和pTRCLA17
(3)将重组质粒pACYCLA09分别与重组质粒pTRCLA13、pTRCLA14、pTRCLA15、pTRCLA16和pTRCLA17,共同转化进入E.coli LA01中(E.coli MG1655菌株pflB基因缺陷型),获得5株不同的胞内还原力调节的异丁醇合成菌株;
(4)对步骤(3)中构建菌株进行摇瓶发酵,获得高效异丁醇合成菌株,其产量最大可达到8g/L以上。
7.权利要求6所述的方法,其特征在于发酵方法为:30~37摄氏度条件下培养,转速200~250rpm,当细胞OD600增长到0.6~0.8时,加入0.1~1mM的IPTG进行异丁醇诱导。
8.权利要求6所述的方法,其特征在于培养基为:20~40g/L葡萄糖,5~10g/L酵母浸粉,5~6g/L Na2HPO4·12H2O,3~4g/L KH2PO4,0.5~1.5g/L NaCl,1~2g/L NH4Cl,0.2~0.6g/L MgSO4,0.01~0.05g/L CaCl2和1000倍稀释的Trace mix A;其中:Trace mix A包含2~4g/L H3BO3,1~3g/L MnCl2·4H2O,0.2~0.8g/L ZnSO4·7H2O,0.3~0.5g/L NaMoO4·2H2O,0.07~0.10g/LCuSO4·5H2O,and 49~60mg/L Co(NO3)2·6H2O。
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