CN109478416A - 实验室适应性进化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞和/或生物体的实验室适应性进化。具体地，本发明涉及用于细胞或生物体的实验室适应性进化的方法，以便在不需要进行基因工程的情况下产生所需代谢特征。此外，本发明提供了计算机程序单元和计算机可读介质。此外，本发明涉及由本发明方法所获得的细胞或生物体。

Description

实验室适应性进化的方法
技术领域
本发明涉及细胞和/或生物体的实验室适应性进化。具体地，本发明涉及用于细胞或生物体的实验室适应性进化的方法，以便在不需要进行基因工程的情况下产生所需代谢特征。此外，本发明提供了计算机程序单元和计算机可读介质。此外，本发明涉及由本发明方法所获得的细胞或生物体。
背景技术
实验室适应性进化(实验室适应性驯化，adaptive laboratory evolution)是指在导致适应性变化的限定条件下培养细胞或生物体，这些适应性变化是细胞或(微生物)生物体群体在指定生长条件下的选择期间积累下来的。
最近人们对微生物菌株进行经设计的修饰越来越感兴趣，例如在食品工业中，通常不希望进行基因工程或根本不能应用基因工程。此外，即使可以应用基因工程，该方法也是受限的，特别是在发展复杂特征方面。
到目前为止，难以预测在实验室适应性进化期间所需特征如何发展。特别是，在不同参数或组分变化的各种条件下，预测所需特征具有挑战性。
具体地，难以建立不能将细胞适合性最大化的代谢特征。由于自然选择对适应性更高的细胞有利，因此适应性进化的条件选择是非直观的，尤其是当在目标条件下所需代谢特征不能使细胞适应性最大化时。术语“目标条件”或“目标小生境”是指旨在细胞或生物体的所需应用(例如，生产风味化合物或葡萄酒发酵)的化学环境。
因此，需要能够设计对代谢特征进行修饰和/或开发复杂代谢特征的方法。具体地，需要评估化学环境对于所需代谢特征进化的适用性的方法。
发明内容
本发明的目的是提供设计用于适应性进化的化学环境以产生所需代谢特征的方法。
可以通过根据独立权利要求之一的主题来解决该目的。参考附图，从属权利要求描述了本发明的实施方式。
所描述的实施方式类似地涉及用于评估化学环境的适用性的方法、计算机程序单元和计算机可读介质。虽然可能未对实施方式的不同组合进行详细描述，但是它们可以产生协同效应。应当注意，在本发明上下文中，术语“通量(flux)”和“通量函数(function offlux)”以及“通量(fluxes)”和“通量函数(functions of fluxes)”将可互换使用。
此外，应当注意，可以按照所描述的步骤顺序进行关于方法的本发明所有实施方式，然而这不是该方法步骤唯一且必不可少的顺序。由此描述了该方法步骤所有的不同顺序和组合。
根据本发明的第一方面，提供了用于评估化学环境对于进化细胞或生物体的所需代谢特征的适用性的方法。该方法包括对代谢模型中的一种或多种通量进行模拟，特别是对代谢模型中的一种或多种通量函数进行模拟。因此，代谢模型包括生化反应和胞外化合物输入和输出的化学计量表示。代谢特征包括目标的集合，后者是在细胞或生物体中存在的通量函数。
所需代谢特征在其中旨在细胞或生物体的所需应用的目标环境中不提供适合性益处。
具体地，所需代谢特征在其提供适合性益处的进化化学环境中得以进化，而在目标环境中所需特征不提供适合性益处。在目标环境中，利用所需特征。在目标环境中，所需特征允许增加或减少至少一种所需通量和/或避免至少一种通量增加或减少。在一个具体的实施方式中，在目标环境中所需特征允许至少一种所需产物的产生通量增加。
技术人员应理解的是，进化环境和目标环境不同，例如，进化环境和目标环境的组成不同。
因此，一个具体的实施方式涉及用于评估化学环境对于进化细胞或生物体的所需代谢特征的适用性的方法，其中旨在将细胞或生物体用于其中所需代谢特征不提供适合性益处的不同化学环境中。
换言之，一些实施方式涉及用于评估进化化学环境对于进化细胞或生物体的所需代谢特征的适用性的方法，其中将所需代谢特征用于目标环境中，而在目标环境中所需代谢特征不提供适合性益处。
采用根据本发明的方法，可以确定合适的化学环境，可以将其用于进化细胞或生物体的所需代谢特征。
根据本发明的一个实施方式，采用化学计量矩阵以表示代谢模型。可替换地，可以提供代谢模型的图表示法。
应当注意，在本发明上下文中，对模型中的一种或多种通量函数进行模拟可以是指对一种或多种通量函数进行优化。
根据本发明的代谢特征是由细胞或生物体的相应模型的多种目标之一或其组合所构建的细胞或生物体的代谢特性。因此，代谢特征由至少一种目标、优选至少两种目标(例如3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种目标)构建。目标表示在细胞或生物体中存在的通量函数。
通常，代谢特征在细胞或生物体的多个世代中得以进化。这表示进化代谢特征需要细胞或生物体的至少两代，例如至少10代、至少50代、至少100代、至少200代、至少300代或更多代，优选至少50代、更优选约100代。这表示将细胞或生物体在化学环境中培养一段时间，特别是在进化化学环境中培养数天、数周、数月或数年。
术语“代谢特征”是指细胞或生物体的代谢性状，例如在某些条件下产生某种产物的能力，在某些条件下存活和繁殖的能力，如某些pH、某些气体水平或某些营养素，优选某些气体水平或某些营养素。
如果化学环境适合于建立代谢特征，则认为该化学环境适合于进化代谢特征。这表示，当将细胞或生物体的群体保持(即培养)在该化学环境中时，细胞或生物体的部分群体已经建立了代谢特征，例如至少一个细胞或生物体已经建立了代谢特征。优选地，至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的群体已经建立了代谢特征。
术语“已经建立了代谢特征”表示后续世代(如2代、10代、100代、1000代、5000代或更多代)的代谢特征不会在进化化学环境和/或目标化学环境中丧失。具体地，这表示在具有代谢特征的至少50％、60％、70％、80％或90％的细胞中，该特征不会在后续世代中丧失。
在本发明的上下文中，可能需要使模型中的至少一种通量函数是上调目标，其中上调目标是期望由于暴露于化学环境而增加的通量函数。
本发明的具体优势在于可以定量估计/评估化学环境对于进化细胞或生物体的特定代谢特征的适用性。本发明的所需应用是指在具有本发明方法所确定的合适化学环境的进化小生境中的细胞或生物体的进化。在确定的合适化学环境中的进化强化或增强所需代谢特征。随后，将细胞或生物体转移到目标小生境(例如，生产化学环境)中，其中细胞或生物体的被强化或被增强的代谢特征将产生所需产物，如风味化合物，例如由酵母产生的风味化合物。
根据本发明的实施方式，对一种或多种与生长有关的目标进行模拟。因此，生长是通过产生生物质组分或生物质的一种或多种反应的通量函数。
“目标反应”或“目标”被认为与生长有关，以便在本方法的上下文中设定或引入数值范围(scale)。这允许比较彼此之间的不同环境。例如，可以认为在适应性进化中对反应(即对给定酶的活性)的选择压力越高，则每单位生长需要的目标更高。这是因为适应性进化中自然选择有利于快速/高产量生长。例如，在第一环境中，上调目标的与细胞生长有关的值较高。而在第二环境中，相同目标的与细胞生长有关的值较低，在这两种情况中均假定生长最佳。对于生长率或生长产量增加，第一环境情况下目标的值需要高于第二种情况下目标的值。通过分别对这两种情况每一种进行与生长有关的比较，可以将这两种化学环境在定量水平上进行相互比较。
在一个实施方式中，至少一种上调目标选自由L-苏氨酸醛缩酶、丙酮酸羧化酶、4-羟基苯丙酮酸脱羧酶、4-羟基苯乙酸脱氢酶、酪醇脱氢酶、酪醇分泌物和4-羟基苯乙酸分泌物所组成的组，和/或其中至少一种下调目标选自丙酮酸脱羧酶和4-羟基丙酮酸分泌物。
在一个具体的实施方式中，上调目标是L-苏氨酸醛缩酶、丙酮酸羧化酶、4-羟基苯丙酮酸脱羧酶、4-羟基苯乙酸脱氢酶、酪醇脱氢酶、酪醇分泌物和4-羟基苯乙酸分泌物，并且下调目标是丙酮酸脱羧酶和4-羟基丙酮酸分泌物。
根据本发明的实施方式，在将生长约束为固定值或在一定范围内时进行模拟。
这种对生长的约束进一步提高了比较不同化学环境的可能性。
根据本发明的实施方式，在对细胞或生物体的模型中的任意摄取设定约束时进行模拟。因此，摄取是一种或多种表示胞外化合物摄取的反应的一种或多种通量函数。
胞外化合物的摄取可以是主动的(例如，由转运蛋白或囊泡介导)，或是被动的(化合物扩散进入细胞中)。还包括的是化合物与影响代谢通量的细胞或生物体的受体或酶的相互作用。
根据本发明的实施方式，在将摄取总和约束为固定值或将其约束在固定范围内时进行模拟。
例如，可以将摄取总和约束为通过将摄取总和最小化在固定生长而获得的固定值。这种设定可指最佳或接近最佳转化而生长的情况。
根据本发明的一个实施方式，在将摄取绝对值之和(即L1范数)约束为最佳值时进行模拟。
根据本发明的实施方式，在将任意摄取约束为固定值或约束在固定范围内时进行模拟。
根据本发明的实施方式，在将任意摄取约束为最佳值时进行模拟。术语“最佳值”可以表示极值。它们可以例如是取决于在模型中限定的反应方向的最小值或最大值。
根据本发明的另一个实施方式，将上调目标和下调目标优化成相反的方向。
因此，上调目标是需要增加的目标，而下调目标是需要减少的目标。因此，上调目标可以增加细胞或生物体的所需代谢特征。另一方面，下调目标是那些对所需代谢特征起不期望的消极作用或不起作用的目标。
在对特定化学环境中的细胞或生物体进行模拟中，对于在增强特征的性能方面不同的上调目标和下调目标，可以出现几种可能的解。本发明的要点是为每种环境选择使特征增强的最差解和利用这些最差解来比较化学环境。为了基于化学环境使上调目标增强和/或使下调目标抑制的最差性能来比较化学环境，可以将上调目标的绝对值最小化，并且可以将下调目标的绝对值最大化。
根据本发明的实施方式，在模拟中会考虑绝对通量值，并采用绝对通量值来进行模拟。
在代谢模型中，通量的符号取决于在模型中限定通量的方向。负通量表示该通量的方向与相应具有正号的通量相反。
根据本发明的实施方式，对超过或低于至少一个阈值的目标数量进行优化。这种优化可以有助于改善化学环境。
根据本发明的实施方式，对超过或低于至少一个阈值的与生长有关的目标数量进行模拟。
超过预设阈值的与生长有关的目标数量可以提供关于化学环境对于目标覆盖度的信息。
测量“目标覆盖度”能够指示与参考条件相比以优越的方式优化了多少种通量。预设阈值可以是参考条件中的一种或多种通量函数。此外，可选地，应用阈值来确定与参考条件比较，目标的值应高出多少或低多少。
根据本发明的实施方式，针对参考化学环境中的通量函数，确定至少一个阈值。
原则上，可以任意选择参考化学环境。该方法的一个目的是确定允许细胞或生物体中的目标进化比在参考环境中细胞或生物体的目标进化更好的化学环境。例如，酵母的参考化学环境可以是用于生产葡萄酒酵母生长的必含葡萄汁的培养基。
根据本发明的另一个实施方式，在模拟中限定至少一种被抑制的通量。
根据本发明的一个实施方式，通过约束反应的通量来进行模拟，该反应的通量是作为组分被包含在化学环境中的抑制剂(如底物类似物)或调节触发剂(如2-脱氧葡萄糖)的目标。
术语“调节触发剂”是指例如通过转录调控来激活或抑制细胞或生物体中的途径(特别是代谢途径)的化合物。
术语“抑制剂”是指抑制细胞或生物体中的反应(特别是代谢反应)的化合物，例如，底物类似物。
因此，根据本发明的另一个实施方式，可以通过将那些通量约束为零来进行模拟，这些通量是作为组分被包含在化学环境中的抑制剂或调节触发剂的目标。
根据一个实施方式，方法包括以下确定化学环境的数值得分的附加步骤。因此，得分指示在化学环境中选择压力对目标的强度。得分还指示在化学环境中选择压力对目标的覆盖度。
稍后在后面提供限定并确定数值得分的明确实施例。
根据一个实施方式，方法还包括确定数值得分的步骤，其中该得分指示在化学环境中最差情况选择压力对目标的强度并且指示在化学环境中选择压力对目标的最差情况覆盖度。
根据另一个实施方式，基于前述实施方式中的一个实施方式限定数值得分，并且还将化学环境中的组分数量考虑在内。
可能的是，化学环境中的组分数量越少，环境的成本效率就越高。此外，通常不易获知如何从化学环境中摄取不同化合物/组分的先验。这尤其适用于一起提供多种组分的情况。在许多组分的情况下，化学环境中的细胞不太可能以至少接近最佳比例的方式摄取和使用多种组分。在这种情况下，最佳比例应被理解为对应于最佳生长的比例。
进一步参考数值得分，在本发明的一个实施方式中，得分包括化学环境中选择压力的强度和选择压力对目标的覆盖度以及组分数量的函数。
根据一个实施方式，方法包括以下步骤：在第一步骤中，通过施加多个约束来进行第一模拟，从而确定第一模拟结果。其中一个约束应被理解为设定将生长限定为固定值或固定范围的条件。另一个约束设定模型中通量的热力学界限。通过优化摄取总和来进行第一步骤中的模拟。优化通过以下进行：将化学环境中可用组分的摄取总和最小化以便设定细胞或生物体摄取的这些组分而生长的最佳转化。
在第二方法步骤中进行第二模拟，从而使用或依赖于第一模拟结果。从而，确定第二模拟结果。第二模拟包括将细胞或生物体生长的约束设定为固定值，可替换地，将生长约束在固定范围内。在第二模拟中设定的另一约束将第一模拟中考虑的摄取总和约束为第一模拟结果。第二模拟结果指示化学环境的适用性，并且促进被确定为优化上调目标总和的条件和被确定为优化下调目标总和的另一条件。
根据另一个实施方式，除了上述方法步骤之外，还包括涉及第三模拟的第三方法步骤，从而确定第三模拟结果。在该第三模拟中，对相对于参考化学环境中的参考上调目标被增强的上调目标的数量进行优化。类似地，在第三模拟内还对相对于参考化学环境中的下调目标被抑制的下调目标的数量进行优化。
在本发明的另一个实施方式中，将对化学环境的数值得分的确定正规化为由以下值给出的得分：
该公式取决于包括上述第一模拟步骤、第二模拟步骤和第三模拟步骤中的模拟。在以上公式中，n表示目标数量，并且覆盖度(coverage)是指在第三模拟步骤中获得的最佳目标数量。u表示上调目标的数量，并且强度(strength)是在第二模拟步骤中获得的优化的上调目标总和与优化的下调目标总和之和。c表示化学环境中的组分数量。最后，Wc、Ws和Wm表示数学权重。这些权重可以由用户设定或选择。例如，可以将Wc、Ws和Wm选择为以下值：1000、100、1。因此，在评估化学环境对于进化包括目标的特征时为目标覆盖度分配最高权重并为化学组分数量分配最低重要性。通过为各权重选择各个特定值，第一模拟步骤、第二模拟步骤和/或第三模拟步骤的结果-根据以上总和公式中的三项-可以被给予由数值表示的值(value)定量出的数值得分衡量的更大或更小影响。
上述公式提供了确定化学环境的实际数值得分的实例，并且允许将不同化学环境进行定量比较，其可以被用于进化细胞或生物体的所需代谢特征。参考实施方式的详细描述，给出了明确简化的示例计算。根据该示例计算，根据上述公式确定数值得分将变得明显。
本发明的方法提供评估化学环境适用性的得分。可以将该得分用于评估不同化学环境，并进行排序。
根据另一个实施方式，采用与化学环境中强度(strength)和/或覆盖度(coverage)和/或组分数量相关的函数来计算评估化学环境适用性的得分。在不脱离本发明范围下，技术人员将容易地调整这种情况。
本发明的方法可以例如用于优化或搜索算法，如遗传算法或模拟退火中的适合性评分。当使用遗传算法时，化学环境可以例如表示遗传算法中的个体，并且化学环境中各种化合物的存在或不存在可以表示基因集(有时也被称为遗传算法中的特征)。
还可以将本发明方法用于评估哪种天然环境适合于进化所需代谢特征。因此，化学环境可以是细胞或生物体的天然环境。这表示将已知的或通过本领域技术人员已知的方法所测定的至少一种天然环境的各种化合物用于评价化学环境的适用性。如果确定天然环境适合于进化所需代谢特征，则可以从天然环境中分离出该生物体。可以分析分离出的生物体中代谢特征的存在性。用于分析代谢特征的方法是技术人员已知的，并且包括例如酶促测试、代谢物分析、生理学表征、通量分析、通过技术人员已知的方法(例如，新一代测序)确定生物体的蛋白质组或基因组。
代谢特征可以是细胞或生物体的代谢性状，例如在某些条件下生产所需产物的能力、在某些条件下存活和繁殖的能力，如某种气体水平、营养素的存在与否，或对物质的抵抗力或敏感性。优选地，代谢特征允许细胞或生物体通过细胞或生物体产生至少一种所需产物。这表示，例如相对于在应用本发明方法之前细胞或生物体中所需产物的含量，获得代谢特征的细胞或生物体能够将产量提高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或更多的所需产物。还考虑了细胞或生物体在获得代谢特征后能够产生所需化合物，而它在获得代谢特征之前并不能产生该化合物。代谢特征也可以是例如产物产量减少。例如，在醇发酵过程中，醇(如乙醇)产生减少。
至少一种所需产物可以是可由细胞或生物体(特别是微生物)产生的任何产物，例如聚合物、酸、醇或酯。所述至少一种所需产物可以是食物化合物，优选芳香化合物。芳香化合物可以是例如醇、醛、酯、脂肪酸、酮、内酯、支链氨基酸衍生的芳香物或其前体、芳香族化合物或吡嗪。用作芳香化合物的醇可以是例如1,2-丁二醇、2-丁醇、2-3-丁二醇、乙醇、2-乙基丁醇、2-乙基己醇、2-庚醇、己醇、异丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、2-甲基丙醇、2-壬醇、(Z)-1,5-辛二烯-3-醇、2-辛醇、1-辛烯-3-醇、1-戊醇、苯乙醇、2-苯乙醇、1-壬醇。用作芳香化合物的醛的实例是乙醛、癸醛、庚醛、(Z)-4-庚烯醛、己醛、2-己烯醛、异己醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丙醛、壬醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(Z)-2-壬烯醛、(E)-2-壬烯醛、辛醛、丁醛、戊醛、丙醛、丙烯醛、噻吩-2-醛。酯的实例是乙酸甲酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、异丁酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸异丁酯、乙酸2-甲基-1-丁酯、乙酸3-甲基-1-丁酯、乙酸3-辛酯、乙酸戊酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、丁酸丙酯、丙酸2-羟乙酯、丙酸2-甲基-2-乙基-3-羟己酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯。用作芳香化合物的脂肪酸的实例是乙酸、丁酸、己酸、癸酸、异丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、辛酸、苯乙酸、丙酸、戊酸。用作芳香化合物的内酯的实例是δ-癸内酯、γ-癸内酯、γ-丁内酯、δ-十二内酯、δ-辛内酯、(Z)-6-十二烯-δ-内酯。用作芳香化合物的酮的实例是苯乙酮、丙酮、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、2-丁酮、3-羟基-2-丁酮、2-庚酮、2-己酮、3-甲基-2-丁酮、4-甲基-2-戊酮、2-壬酮、2-辛酮、1-辛烯-3-酮、2-戊酮、3-戊酮、2-十三酮、2-十一烷酮。用作芳香化合物的芳香族化合物是例如香草醛、苯甲醛、β-苯乙醇、乙酸苯乙酯或三甲基苯。用作芳香化合物的吡嗪是例如2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-甲氧基-3-异丙基吡嗪。支链氨基酸衍生的芳香物是例如甲硫醇、异戊酸、异丁基乙酸、异丁醇、异丁酸(isobutanoate)、异戊基乙酸、异戊醇、2-甲基丁醇。
在优选的实施方式中，芳香化合物可以是乙酸苯乙酯，或支链氨基酸衍生的芳香物或其前体，如甲硫醇、异戊酸、异丁基乙酸、异丁醇、异丁酸、异戊基乙酸、异戊醇、2-甲基丁醇。
因此，一个实施方式涉及进化所需代谢特征的进化化学环境，这种所需代谢特征导致在目标化学环境中的乙酸苯乙酯的产生增加和/或支链氨基酸衍生的芳香物或其前体的产生增加。因此，本发明涉及用于评估化学环境对于进化所需代谢特征的适用性的方法，这种所需代谢特征导致在目标化学环境中的乙酸苯乙酯的产生增加和/或支链氨基酸衍生的芳香物或其前体的产生增加。
在优选的实施方式中，细胞或生物体具有工业相关性。特别考虑的是微生物。微生物可以选自细菌、酵母或霉菌的组。工业相关细菌的实例是埃希氏菌属(Escherichia)，如大肠埃希菌(Escherichia coli)。酵母可以是例如酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。霉菌的一个实例是曲霉属(Aspergillus)，如黑曲霉(Aspergillus niger)。与工业相关的微生物的实例是戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)(如嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、德氏乳杆菌亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.)保加利亚乳杆菌(bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)、醋杆菌属(Acetobacter sp.)(如加纳醋杆菌(Acetobacter ghanensis)、可可豆醋杆菌(Acetobacter fabarum))、克鲁维酵母菌属(Luyveromyces sp.)(如马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Exigua酿酒酵母菌(Kazachstania exigua))、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、Ogataea polymorpha、嗜热毛壳菌(Chartomiumthermophilum)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、Scheffersomyces stipitis、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、有孢圆酵母属(Torulaspora sp.)(如戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii))、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酒香酵母属(Brettanomyces sp.)(如布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis))、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)、脉孢菌属(Neurospora sp.)(如好食脉孢菌(Neurospora sitophila))、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、甘薯长喙壳菌、香菇菌(Lentinus edodes)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、原毛平革菌属(Phanerochaete sp.)、栓菌属(Trametes sp.)、嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)、肋生弧菌(Vibrio costicola)、根霉属(Rhizopussp.)(如根样根霉菌(Rhizopus rhizopodiformis)、稻根霉菌(Rhizopus oryzae)、少孢根霉(Rhizopus oligosporus)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus))、局限青霉(Penicillium restrictum)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、皱落念珠菌(Candidarugose)、californica念珠菌(Candida californica)、曲霉属(Aspergillus sp.)(如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黄柄曲霉(Aspergillusflavipes))、青霉属(Penicillium sp.)(如简青霉(Penicillium simplicissimum)、桔青霉(Penicillium citrinum)、candidum青霉(Penicillium candidum)、短密青霉(Penicillium brevicompactum))、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或环状芽孢杆菌(Bacillus circulans))。
在一些实施方式中，本文公开的方法涉及酵母所需特征的进化，优选酿酒酵母、更优选允许发酵(如葡萄酒发酵或用乳酸菌发酵)中所需分子产生的酿酒酵母。
通常，化学环境是细胞或生物体的培养基，也被称为生长培养基。培养基可以是复合培养基，即含有组分未限定和/或组分含量未限定的混合物的培养基，如必含麦芽汁或葡萄汁。可替换地，培养基可以是限定的培养基，即其所有化合物及其含量已知的培养基。优选地，培养基可以是限定的培养基。通常，化学环境包括一种或多种碳源(例如，葡萄糖、乙醇、甘油、果糖、木糖、乳糖、甲醇、甲烷、CO2、阿拉伯糖、半乳糖、葡糖酸、葡糖醛酸、核糖、纤维素、半纤维素、果胶、木质素、半乳糖醛酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、丙酮酸、脂肪酸)、一种或多种氮源(例如，肽、尿素、氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸))、胺类(NH4)2SO4)、微量元素(例如，FeSO4、MnCl2、CoCl2、CuSO4、NaMoO4、H3BO3、KI)和维生素(例如，泛酸盐、硫胺素、肌醇、烟酸、吡哆醇、生物素、对氨基酸苯甲酸)。可以以不同离子态或不同水合化形式或以不同的盐形式引入化学环境中的组分。可以以不同比例引入化学环境中的组分。碳源可以提供用于生物合成的碳和用于能量产生的碳，或者可以存在用于生物合成和能量产生的各自底物。化学环境也可以由多种碳源和氮源组成或由既是碳源又是氮源的一种或多种底物组成。化学环境可以包含可用于进化代谢特征的不同化合物。除了几种微量元素和维生素之外，示例性的化学环境还可以包括甘油(一种作为主要碳源的醇)和L-缬氨酸(一种作为氮源的氨基酸)。示例性的化学环境可以包含葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4、Mg2SO4、L-甲硫氨酸、FeSO4.7H2O、ZnSO4.7H2O、CaCl2.6H2O、MnCl2.2H2O、CoCl2.6H2O、CuSO4.5H2O、NaMoO4.2H2O、H3BO3、KI和Na2EDTA.2H2O、d-生物素、对氨基苯甲酸、烟酸、泛酸钙、吡哆醇HCL、硫胺素HCl和肌醇。化学环境还可以包含抑制剂，如1,5-葡糖酸内酯、2-脱氧葡萄糖、2-磷酸乙醇酸、二酰胺、D-苏糖2,4-二磷酸、碘乙酸钠、2-磷酸甘油酯异羟肟酸(2-phosphoglycolohydroxamate)、4-氯汞苯甲酸、4-甲基吡唑盐酸盐、5-磷酸阿拉伯糖(5-phosphoarabinonate)、6-氮杂尿嘧啶、6-氮杂尿苷、乙酰唑胺、乙酰丙酮、乙酰丙酮酸、乙酰乙酰基-CoA、别嘌呤醇、氨基乙基丙酮酸、抗霉素A、ascosteroside、棘白菌素Bder.、麦角柯宁碱A(ergokonin A)、天冬氨酸半醛、金担子素A(aureobasidin A)、巴佛洛霉素A1(bafilomycin A1)、刀豆素A(concanamycin A)、hygrolidin、lencanicidin、β-氯-L-丙氨酸盐酸盐、卡莫司汀、二硫化四乙基秋兰姆、秋兰姆、卡泊芬净、棘球白素C der.、浅蓝菌素C75、克霉唑、丁苯吗啉、环丙唑醇、氟康唑、妥布氯唑、伏立康唑、二乙烯三胺五乙酸、依洛尼塞(eflornithine)、依替膦酸二钠水合物、帕米膦酸二钠盐水合物、氟尿嘧啶、氟伐他汀、来适可(lescol)、葡萄糖胺、羟基脲、碘乙酰胺、来氟米特、甲硫氨酸磺肟磷酸盐(methionine sulfoxime phosphate)、甲氨喋呤、甲胺、甲基汞、霉酚酸酯、霉酚酸、多球壳菌素der.、粘噻唑A、嗜球果伞素B、氯硝柳胺、尼替西农、硝酸盐、N-膦酰基乙酰基-L-天冬氨酸盐、草酸盐、P1,P5-二(腺苷-5')五磷酸盐(Ap5A)、吡啶氧基丙氨酸、槲皮素、雷帕霉素、西奈芬净、soraphen A、TOFA、角鲨抑素、角鲨抑素der.、萨拉哥酸(zaragozic acid)、盐酸特比萘芬、特比萘芬、萘替芳、三氮菌素C、三氯生、曲托喹啉、丙戊酸和氨己烯酸。
目标化学环境是用于培养细胞或生物体以利用所需代谢特征的环境。这表示在目标化学环境中培养细胞或生物体例如以生产所需产物。
在一些实施方式中，化学环境是用于进化细胞或生物体的代谢特征的进化化学环境。化学环境不同于用于培养细胞或生物体以利用代谢特征(例如以生产至少一种所需产物)的目标化学环境。这允许在目标环境中不改善细胞或生物体适合性的特征得以进化。例如，如果由于所需代谢特征(例如，所需产物的产生)，在目标化学环境中细胞或生物体的生长减少，那么在目标化学环境中(在目标化学环境中代谢特征不是适合性优势)代谢特征的进化几乎不可行或根本不可能。因此，首先将细胞或生物体培养在进化化学环境中，在该进化化学环境中代谢特征的至少一种目标提供适合性优势。在这种情况下，本发明的方法旨在评估进化化学环境对于进化代谢特征的适用性。
如在本文中所使用的术语“适合性优势”、“适合性益处”是指具有特定特征的细胞或生物体比不具有特定特征的其它细胞或生物体具有适合性益处，例如，与不具有特定特征的其它细胞或生物体相比，具有特定特征的细胞或生物体的生长得到增强。如本文其它地方已经公开的，在其中特定特征表达适合性益处的进化环境中建立了特定特征。在旨在使用细胞或生物体的目标环境中，特定特征不提供适合性益处，即对生长不是有益的。在目标环境中，利用该特定特征。在一些实施方式中，在目标环境中，特定特征允许所需分子产生(产生增强)和/或允许避免或减少不需要分子产生。
在另一个实施方式中，细胞可以是肿瘤细胞或一组肿瘤细胞或病原体。
本发明方法也可用于将细胞或生物体去稳定化。具体地，考虑了肿瘤细胞或病原体的去稳定化。优选地，考虑了肿瘤细胞的去稳定化。这表示在本发明上下文中，化学环境可导致将细胞或生物体(例如，肿瘤细胞或病原体)去稳定化的代谢特征得以进化。细胞或生物体的去稳定化可以是例如细胞或生物体的生长减少和/或死亡。
这表示通过本发明方法评估的化学环境可能会导致去稳定化的细胞或生物体得以进化。这表示在细胞或生物体的至少一个世代之后，通常在细胞或生物体的几代(如至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少10代、至少20代、至少50代或更多代)之后，实现去稳定化的细胞或生物体。优选地，在至多10000代、至多1000代、至多500代、至多300代、至多200代、至多100代、至多50代、至多30代、至多20代、至多10代、至多5代、至多3代之后实现使细胞去稳定化的代谢特征。
在旨在使细胞去稳定化的实施方式中，当将组合物施用于患有癌症的患者时，可以评估不同化合物成分(即化学环境)对于进化使肿瘤细胞去稳定化的代谢特征的适用性。因此，本发明还涉及用于作为药物使用的组合物。具体地，本发明涉及用于在治疗癌症中使用的组合物。
本发明的另一方面涉及用于确定进化细胞或生物体的代谢特征的化学环境的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用本文所述的方法评估至少两种化学环境的适用性，
(b)选择至少一种具有进化代谢特征适用性的环境，其超过适用性阈值。
如上所述，通常旨在将细胞或生物体用于与进化代谢特征的环境(进化环境)不同的不同环境(目标环境)，其中在目标环境中代谢特征不提供适合性益处。
本发明还涉及用于确定进化细胞或生物体的代谢特征的化学环境的方法，包括以下步骤：
(a)使用本文所述的方法评估至少两种化学环境的适用性，
(b)选择至少一种具有进化代谢特征适用性的化学环境，其属于具有进化代谢特征最大潜能的化学环境。
在步骤(b)中，可以选择属于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、3％、2％的具有进化所有测试化学环境的代谢特征最大潜能的化学环境的化学环境。技术人员应理解，也可以选择多种化学环境，并将其平行地用于进化代谢特征。
在一个具体的实施方式中，提供进化细胞或生物体的代谢特征的化学环境的方法，包括以下步骤：
(a)使用本文所述的方法评估至少两种化学环境的适用性，
(b)选择至少一种具有进化代谢特征适用性的化学环境，其超过适用性阈值，
(c)制备步骤(b)的化学环境。
另一方面涉及通过上述方法能获得的或通过上述方法获得的化学环境。
适用性阈值可以是预设阈值。可以设定适用性阈值，使得超过阈值的化学环境是所有测试化学环境中具有进化代谢特征最大潜能的化学环境中的60％、50％、40％、30％、20％、10％。技术人员理解，取决于计算环境适用性的方式，进化代谢特征的潜在环境也可以是低于阈值。在一个具体的实施方式中，选择具有进化代谢特征的最高潜能的环境。在另一个具体的实施方式中，选择具有进化代谢特征的最大潜能的两个环境之一、三个环境之一、四个环境之一、五个环境之一、六个环境之一、十个环境之一、二十个环境之一、五十个环境之一、一百个环境之一、五百个环境之一、一千或更多个环境之一。
此外，本申请涉及用于进化细胞或生物体的代谢特征的方法，包括以下步骤：
本发明还涉及用于确定进化细胞或生物体的代谢特征的化学环境的方法，包括以下步骤：
(a)使用本文所述的方法评估至少两种化学环境的适用性，
(b)选择至少一种具有进化代谢特征适用性的化学环境，其属于具有进化代谢特征最大潜能的化学环境；
(c)在步骤(b)中选定的化学环境中培养细胞或生物体。
在一个具体的实施方式中，用于进化细胞或生物体的代谢特征的方法包括以下步骤：
(a)使用本文所述的方法评估至少两种进化化学环境的适用性，
(b)选择至少一种具有进化代谢特征适用性的化学环境，其属于具有进化代谢特征最大潜能的化学环境；
(c)在选定的进化化学环境中培养细胞或生物体以进化所需特征，
(d)在目标化学环境中培养细胞或生物体以由细胞或生物体产生至少一种所需产物。
此外，本申请涉及用于进化细胞或生物体的代谢特征的方法，包括以下步骤：
(a)使用本文所述的方法评估至少两种化学环境的适用性，
(b)选择至少一种具有进化代谢特征适用性的环境，其超过适用性阈值，
(c)在步骤(b)中选定的化学环境中培养细胞或生物体。
此外，本申请涉及通过本文所述的方法获得的细胞或生物体。具体地，本申请考虑通过包括以下步骤的方法获得的细胞或生物体：
(a)使用本文所述的方法评估至少两种化学环境的适用性，
(b)选择至少一种具有进化代谢特征适用性的环境，其超过适用性阈值，
(c)在步骤(b)中选定的化学环境中培养细胞或生物体。
在一个具体的实施方式中，用于进化细胞或生物体的代谢特征的方法包括以下步骤：
(a)使用本文所述的方法评估至少两种进化化学环境的适用性，
(b)选择至少一种具有进化代谢特征适用性的进化化学环境，其超过适用性阈值，
(c)在选定的进化化学环境中培养细胞或生物体以进化所需特征，
(d)在目标化学环境中培养细胞或生物体以由细胞或生物体产生至少一种所需产物。
根据本发明的另一方面，提供了计算机程序单元，其中当由处理器执行计算机程序单元时，该计算机程序单元适于进行上述方法步骤的任何步骤或任何组合。
根据本发明的另一方面，提供了计算机可读介质，其包括以上计算机程序单元。
可以看到，本发明的一个要点是量化化学环境对于进化细胞或生物体的所需代谢特征的适用性。利用所描述的方法步骤，可以对不同化学环境的进行定量比较，以确定这种允许细胞或生物体的所需进化的化学环境。
需要注意，参考不同的主题描述了本发明的一些实施方式。具体地，参考方法型权利要求描述了一些实施方式，而参考装置型权利要求描述了其它实施方式。然而，本领域技术人员将从以上及以下描述中获知，除非另有说明，否则除了属于一种主题类型的特征的任何组合之外，与不同主题相关的特征之间的任何组合也被认为在本申请中公开。
以上限定的方面和实施方式以及本发明的其它方面、实施方式、性状和优势也可以从下文描述的实施方式的实例中获得，并且参考实施方式的实例进行解释。下面将参考实施方式的实例更详细地描述本发明，但本发明并不限于此。
本发明的另一方面涉及确定用于筛选具有所需代谢特征的细胞或生物体的选择化学环境的方法，包括以下步骤：
(a)使用本文公开的方法评估至少两种化学环境对于进化代谢特征的适用性，
(b)选择至少一种具有进化代谢特征适用性的化学环境，其属于具有进化代谢特征最大潜能的化学环境；
其中化学环境对于进化代谢特征的适用性与化学环境对于筛选具有所需代谢特征的细胞或生物体的适用性相关。
化学环境对于筛选具有所需代谢特征的细胞或生物体的适用性与化学环境对于进化代谢特征的适用性相关，是指适合于进化代谢特征的化学环境也适合用于筛选具有所需代谢特征的细胞或生物体。
另一个实施方式涉及使用选择化学环境来筛选具有所需代谢特征的细胞或生物体的方法，
(a)确定以上定义的选择化学环境，
(b)在选择化学环境中培养至少两种细胞或生物体，
(c)选择至少一种细胞或生物体，其显示出比在选择环境中的一种或多种其它细胞或生物体生长更快；
其中在选择环境中生长更快表明细胞或生物体含有所需代谢特征。
由于所需代谢特征在选择环境中提供适合性益处，因此与不含所需代谢特征的其它细胞或生物体相比，含有代谢特征的细胞或生物体将显示出生长更快。因此，在选择环境中细胞或生物体生长更快可表明细胞或生物体含有所需特征。
在本发明上下文中的“生长更快”表示与在选择环境中生长的其它细胞或生物体相比，生物体或细胞的生长多出5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、100％、200％或更多。技术人员知道确定细胞或生物体生长的方法。生长可以被确定，例如通过测量含有细胞或生物体的溶液的OD加以确定。
所述至少两种细胞或生物体可以是例如细胞收集物(cell collection)或生物体菌株收集物(organism strain collection)，如酵母菌株收集物(yeast straincollection)。
因此，在一些实施方式中，术语“细胞”还指“细胞系”，并且术语“生物体”是指“生物体菌株”。
因此，在一些实施方式中，将生物体菌株的生长与生物体菌株收集物中的其它生物体菌株的生长进行比较。在其它实施方式中，将细胞系的生长与细胞系收集物中的其它细胞系的生长进行比较。在一个实施方式中，一种或多种其它细胞或生物体是对照细胞或对照生物体，其中已知其不含有所需的代谢特征。
附图说明
图1示出简化的代谢网络及其在进化小生境(即进化化学环境)和目标小生境(即目标化学环境)中的进化。
图2示出具有胞外化合物交换反应的toy模型的图示。
图3是依赖于本发明方法的遗传算法的图示。
图4A EvolveX计算的相对于观察到的最小得分的进化小生境中选择压力、目标覆盖度和组分数量的综合得分的直方图，用于特定进化小生境对于进化支链氨基酸衍生的芳香物产生增加的适用性。
图4B EvolveX计算的相对于观察到的最小得分的进化小生境中选择压力、目标覆盖度和组分数量的综合得分的直方图，用于特定进化小生境对于进化乙酸苯乙酯产生增加的适用性。
图5a)由中心碳代谢中的不同前体合成L-苯丙氨酸和支链氨基酸。b)与亲本菌株相比，从在EvolveX设计的培养基上进化用于增加支链氨基酸衍生的芳香物产生(即将乙醇、甘氨酸L-精氨酸作为唯一的碳源和氮源)的谱系分离出的E-菌株中的支链氨基酸衍生的芳香族化合物比从在EvolveX设计的培养基上进化用于增加乙酸苯乙酯(即甘油、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸)产生的谱系分离出的G-菌株中的支链氨基酸衍生的芳香族化合物更为显著。计算了与一式三份葡萄酒必不可少的亲本菌株发酵相比的一式三份葡萄酒必不可少的进化菌株发酵的Log2倍变化。发现用星号标记的log2倍变化是显著的(即Dunnett检验，>对照，p<0.05)。c)发现与从亲本菌株相比，在EvolveX设计的培养基上进化用于增加乙酸苯乙酯(即甘油、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸)产生的谱系分离出的菌株中的乙酸苯乙酯产生增加。d)Ehrlich途径是分解代谢途径，通过该途径产生支链的芳香族氨基酸衍生的芳香物。Ehrlich途径产生杂醇酸，并且更丰富地产生可以进一步与酸反应(即酯化)的杂醇，产生作为发酵产物中的重要芳香化合物的酯。
图6A EvolveX计算的相对于观察到的最小得分的进化小生境中选择压力、目标覆盖度和组分数量的综合得分的直方图，用于特定进化小生境对于进化酿酒酵母以增强乳酸菌(LAB)生长支持的适用性。
图6B进化的菌株示出乳酸菌生长增强得以改善。接种于来自亲本酿酒酵母菌株(T8)和进化酿酒酵母菌株(A11、A12、B11)的经调节的培养基(调节至初始OD600 0.01)的乳酸乳球菌(IL1403)和植物乳杆菌(WCSF1)的4天生长，其中在收集经调节的培养基时通过相应酵母菌株的OD600将亲本酿酒酵母菌株(T8)和进化酿酒酵母菌株(A11、A12、B11)归一化。
具体实施方式
多张图中的类似或相关的组分具有相同的标号。附图中的视图是示意性的，未非完全按比例的。
在下文中，显示了基于本发明方法的算法的简单toy模型实例。toy模型旨在提供简单易懂的实例。本发明和上述实施方式之一均不限于针对toy模型描述的简单情景。
利用简化的代谢网络，图1中的图示描述了进化小生境和目标小生境的分离，其中小生境表示化学环境，因此进化的代谢特征在目标小生境中不提供适合性益处。
接下来将在图1图示中使用的简化代谢网络发展成代谢模型，该代谢模型是本文考虑用于呈现基于本发明的方法步骤计算实例的toy模型。在图2中，增强了代谢网络中胞外化合物的交换反应，其是指胞外化合物的输入和输出。此外，用图2中的标识符表示通量和代谢物。
从图2中所示的反应，可以推导出模型的以下化学计量矩阵S，并且引入以下多种矢量：质量平衡矢量(b-矢量)、下限矢量和上限矢量(lb-矢量和ub-矢量)和生物学目标矢量(c-矢量)
toy模型的以下lb-矢量和ub-矢量限定了通量下限和上限，对应于对相应通量矢量分量的热力学约束或容量约束。在此示例计算中，值-1000和值1000表示无限制的通量界限：
toy模型的以下c-矢量编码模型的生物学目标：
显然，在以上c-矢量的唯一非零分量是指与交换反应Gext相关的通量矢量分量v17(参见图2)时，本文所考虑的toy模型的生物学目标是产生胞外化合物Gext的生长。
toy模型的以下b-矢量限定代谢物质量平衡，即toy模型中所考虑的14种代谢物的平衡。在此假定为稳态，因此将b-矢量的各分量设定为零：
应当注意，以上引入的toy模型的lb-矢量限定了toy模型的可能通量矢量的每个分量的下限。类似地，以上限定的toy模型的ub-矢量为toy模型的可能通量矢量的每个分量引入上限。在比本文所考虑的toy模型更复杂的情景中，多种可能的通量矢量的各个分量的下限和上限的值可以通过实验来确定，或者可以根据热力学约束来确定。
关于与生物学目标有关的以上c-矢量，该目标可以在不同模型中变化。例如，在较大的模型中，该生物学目标不一定是生长，而是例如ATP生成最大化。
最后，结合如以上toy模型这一情形所示将所有分量设定为零的b-矢量，对稳态进行模拟是模拟化学环境中细胞或生物体进化的一种便捷方式，从而假定该系统处于上述质量平衡表征的稳态。
基于对参考情况的了解和随后与参考情况的比较对根据本发明实施方式的化学环境的适用性进行定量确定。在本发明的上下文中，与参考情景进行比较旨在定量评价化学环境的适用性或潜能。具体地，对于根据本发明的最差情况覆盖度的考虑，可以考虑参考状态通量范围，并将其与相应模型中的通量进行比较。因此，在toy模型计算中，在考虑根据本发明的最差情况覆盖度的背景下，需要参考状态通量。
稍后考虑了最差情况覆盖度和与之相关的计算。在此，将用于toy模型计算的参考状态定义为在底物A和B中生长的状态，比较图2。
通过如下每个通量的最小值和最大值描述参考状态：
min max
v1 0 0
v2 10 10
v3 0 0
v4 0 0
v5 10 10
v6 10 10
v7 -10 -10
v8 -10 -10
v9 0 0
v10 0 0
v11 10 10
v12 0 0
v13 -10 -10
v14 -10 -10
v15 0 0
v16 0 0
v17 10 10
v18 0 0
。
在做此准备之后，目前参考toy模型解释了根据本发明实施方式的方法步骤。为此，应评估含有底物C和D的化学环境对于反应v3的上调通量(即，v3是上调目标)的适用性或潜能。
应当注意，为了简化情况，在toy模型内不考虑抑制。
在第一步骤中，如下使用线性优化来设定生长最优性条件：
min∑v摄摄， (1)
经受以下约束
S·v＝0， (2)
vμ＝10， (3)
v抑制＝0， (4)
vlb≤v≤vub。 (5)
在此，v摄取表示特定化学环境中可用组分的摄取反应的通量，S表示物种的基因组规模代谢toy模型的化学计量矩阵，v表示通量矢量，vμ是生长速率(即通量)，v抑制是由特定化学环境中所存在的抑制剂所抑制的反应的通量，vlb和vub分别表示通量下限和通量上限。
应当注意，在大多数模型中，将摄取通量定义为负，使得在这些情况下，上述最小化将以-v摄取进行。在不脱离本发明范围下，技术人员将容易地调整这种情况。
以下面的公式来实现等式(1)至(5)中给出的上述规定：
maxf′x (I)
经受以下约束：
Aeq·x＝beq， (II)
lbi≤xi≤ubi， (III)
其中如下示出以上引入的量Aeq、lb、ub、f和beq：
由添加了两列的toy模型的S-矩阵示出矩阵Aeq，这两列是指化学环境中各组分的可能分泌物。这指的是以上等式2中的约束。因此，以下给出Aeq：
-1 -1 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 -1 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 1 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 1 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 1 -1 0 0 1 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 -1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 -1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0
以下示出等式(I)至(III)中引入的矢量lb、ub和f：
lb、ub和f的最后三行表示化学环境中各组分的可能分泌物的约束，其指的是等式3中的约束。
以上矢量f中的值1表示目标化学环境中各组分的摄取，对应于等式1中的约束。
lb和up的倒数第5行和倒数第6行表示所允许的化学环境中各成分的自由摄取。
以下矢量beq表示toy模型的b-矢量，对应于等式2中的约束：
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
。
用例如CPLEX LP求解器或GLPK求解器对上述等式组进行求解。求解器返回与目标函数的最佳值对应的变量的值。值得注意的是，x在实际情况下可能不是唯一的。然而，目标函数(即f’x)的最佳值是唯一的。在本文所考虑的toy模型中，获得了以下x各分量在此情况下的唯一值：
0
0
10
10
0
10
0
0
-10
-10
10
0
0
0
-10
-10
10
0
0
0
在toy模型计算的下一个方法步骤中，可以根据以下等式考虑对在生长最优性约束下对目标反应的最差情况选择压力进行模拟：
min∑|v上调|+∑-|v下调|， (6)
经受以下：
S·v＝0， (7)
vμ＝10， (8)
v抑制＝0， (9)
vlb≤v≤vub， (10)
∑v摄取≤min∑v摄取。 (11)
在此，v上调(vup)和v下调(vdown)分别表示上调目标反应的通量和下调目标反应的通量。
在本文所考虑的toy模型的具体实例中，目标通量是不可逆的。因此，不需要添加变量和约束来对在本文作为混合整数线性规划问题的通量绝对值进行优化。但是，在更复杂的情况下，这可能是必要的。
将以上约束带入以下公式：
maxf′x (IV)
经受至以下：
Aeq·x＝beq，(V)
A·x≤b， (VI)
lbi≤xi≤ubi。 (VII)
等式(IV)中的矩阵Aeq是由模型的S-矩阵示出的，其中添加两列通量变量以描述化学环境中各组分的可能分泌物。这对应于以上等式7中的约束。因此，矩阵Aeq为：
-1 -1 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 -1 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 1 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 1 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 1 -1 0 0 1 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 -1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 -1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0
。
可以将由等式8和等式11引入的关于等式(VI)中量A的约束表示为：
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 0
。
其中第一行是指等式8中的约束，而第二行是等式11中的约束。
此外，在toy模型范围内的该方法步骤中出现以下矢量lb、up和f：
根据等式7中的约束，得到以下b-矢量beq：
0
O
0
0
O
0
O
0
0
O
0
0
0
0
。
最后，换算成等式(VI)形式的等式8和11的约束产生等式(VI)中以下b值：
-10
20
。
同样，通过利用例如CPLEX LP或CPLEX MILP求解器来求解该问题，这取决于是否存在目标中涉及的可逆通量(即，通量具有小于0的下限，lb<0)。在toy模型的情况下，求解器返回作为对应于目标函数的最佳值的x(即变量的值)的下面矢量x：
0
0
10
10
0
10
0
0
-10
-10
10
0
0
0
-10
-10
10
0
0
0
。
应同样注意，x在实际情况下可能不是唯一的，只确目标函数(即f’x)的最佳值是唯一的。
根据以上结果，在本文所考虑的toy模型情形中，将与特定化学环境所产生的选择压力的强度的得分相关的目标函数(即f’x)的最佳值确定为10。
接下来，在toy模型的范围内，可以如下对在生长最优性约束和最差情况选择压力约束下的最差情况目标反应覆盖度进行模拟：
min∑b目标 (12)
经受至以下：
S·v＝0， (13)
vμ＝10， (14)
v抑制＝0， (15)
vlb≤v≤vub， (16)
∑v摄取≤min∑v摄取。 (17)
∑|v上调|+∑-|v下调|≤min(∑|v上调|+∑-|v下调|)， (18)
|v上调|-((1+δ)·wub-|v上调|ub)·(1-b目标)≤|v上调|ub， (19)
|v下调|-((1-δ)·wlb-|v下调|lb)·(1-b目标)≥|v下调|lb， (20)
b目标∈{0，1}。 (21)
在此，b目标(btargets)是限定目标反应的绝对通量是否超出在参考条件(即wlb，wub)下由绝对通量范围限定的相应阈值的二元变量。以上已经考虑了用于toy模型计算的具有参考条件的参考情景情景，并且目前将会把针对该情景获得的各值用于toy模型计算。
以上等式(19)和(20)中的参数6是阈值参数，表明在特定化学环境中与生长有关的通量应该低多少或是高出多少，以便考虑暴露于(即被覆盖的)选择压力的相应目标反应。因此，通过等式(19)和(20)，引入了用于定量确定toy情景中的目标反应的覆盖度的实例。结合来自等式(18)的约束，因此通过等式(12)至(21)的集合来考虑最差情况覆盖度情景。
为了清楚地计算，将以上约束带入以下公式，其中x可以包括连续变量和整数变量两者：
maxf′x (VIII)
经受：
Aeq·x＝beq， (IX)
A·x≤b， (X)
lbi≤xi≤ubi， (XI)
x＝[xb，xc]， (XII)
xb∈{0，1}。 (XIII)
由以下表达式给出上述等式(VIII)至(XIII)中的量。
Aeq同样表示模型的S-矩阵，其中添加了两列来描述化学环境中各组分的可能分泌物，并且添加了针对目标反应的覆盖度变量的附加列，其反映等式13中的约束。因此，等式(IX)中的Aeq为：
-1 -1 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 -1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 1 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 1 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 1 -1 0 0 1 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 -1 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 -1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0
。
以上等式(X)中的量A对等式14、17和19中的约束进行编码，并且因此示出以下：
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 O 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 0 0
0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1000
0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
。
由以下表达式给出矢量lb、ub和f：
此外，将该计算步骤中通量矢量的各分量的以下变量类型(C＝连续的；B＝二进 制)定义为：
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
B
。
由以下矢量beq表示等式13的约束：
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
。
最后，表示等式14、17和19中约束的等式(X)中的量b表示为以下：
-10
20
0
10
。
然后用例如CPLEX MILP求解器求解等式(VIII)至(XIII)所给出的问题。
在toy模型的情况下，求解器返回作为对应于目标函数的最佳值的x(即变量的值)的以下矢量：
0
0
10
10
0
10
2.27E-13
0
-10
-10
10
2.27E-13
0
0
-10
-10
10
2.27E-13
0
0
1
。
因此，对应于由特定化学环境产生的选择压力对目标的覆盖度的得分的目标函数(即f’x)的最佳值为1(以上矢量的最后一个分量的值)。该值表示在该情形下的唯一目标即使是在最差情况下也会被覆盖。
因此，在toy模型情形下，预期含有C和D的化学环境比参考化学环境对于目标通量增加产生更强的选择压力。
可以由特定化学环境中的最差情况选择压力、最差情况覆盖度和组分数量得到综合数值得分：
值(value)是综合得分(即，值越低，用于进化特征的特定化学环境越佳)，n是目标反应的数量，覆盖度是最差情况覆盖度(即，min∑b目标)，u是上调目标反应的数量，强度是最差情况选择压力强度(即，min∑|v上调|+∑-|v下调|)，c是特定化学环境中组分数量，并且Wc、Ws、Wm分别是为覆盖度、强度和化学环境复杂性分配的权重。
在toy模型情形下，将权重设定为Wc＝1000、Ws＝1和Wm＝1，得到的含有化合物C和D的化学环境的综合得分为992。
如果评估了多种化学环境，则将该得分与其它化学环境的得分进行比较，以从所考虑的化学环境的集合中选择合适的化学环境。通常，得分越低，特定化学环境越适合进化特定所需代谢特征。在不脱离本发明的范围下，技术人员将容易地调整评分公式，例如以使得得分越高适用性越佳。
也可以通过从可能组分的集合优化组分组合来进行化学环境的设计，例如，采用根据本发明的方法作为遗传算法中的适合性函数。
针对图3，给出了在遗传算法背景下应用根据本发明方法的实例。该算法适合用于设计用于适应性进化代谢特征的最佳化学环境。遗传算法中群体中的个体是特定化学环境，将其定义为表示化合物组合的二元矢量。适合性得分评估用于适应性进化代谢特征的个体化学环境的良好性。在繁殖阶段产生了通过交叉、突变和精英化的个体的下一代。
EvolveX情形研究1.改善葡萄酒芳香物的产生
该情形研究旨在进化酿酒酵母以在葡萄酒必不可少的目标小生境中获得两种所需代谢特征：1)乙酸苯乙酯的产生增加(即苯乙基醇和乙酸酯的酯，具有玫瑰和蜂蜜香味及覆盆子样味道)和2)支链氨基酸衍生的芳香物或其前体的产生增加。根据针对初始表型的上调和下调目标通量来进一步限定这些特征。使用酿酒酵母的基因组规模代谢模型将它们确定为改变超过阈值以获得所需特征所必需的最小化通量(即包括在通量的最小数量内)。作为初始代谢表型，当在含有作为氮源的胺(而不是葡萄酒必不可少的氮源复杂混合物)的过量葡萄糖上生长时，将酿酒酵母通量分布用于确定增强氨基酸衍生的芳香物从头生成的目标。为了实现这些所需特征的适应性进化(即目标通量的特定上调和下调)和自然选择，需要设计进化小生境，使得当细胞在进化小生境中生长时，所需特征是随生长增强的(即适合性有益的)。因此，当长时间暴露于进化小生境时，细胞群体将会富集实现或增强目标小生境所需特征的突变。
然后使用EvolveX算法来评估作为进化小生境的特定化学环境对于目标小生境所需特征的适应性进化的适用性。将酿酒酵母的基因组规模代谢模型用于预测在由其化学组成限定的给定进化小生境下选择压力对目标反应的通量的相对强度。EvolveX可以考虑由多种不同分子组成的小生境，这些不同分子包括可被生物体利用的碳源和氮源(即模型中描述的摄取和利用)和抑制剂(例如底物类似物)或调节触发因子(例如2-脱氧葡萄糖)，可以模拟其对特定代谢反应的影响。如果限定参考小生境(例如，共同生长条件)的话，则EvolveX还计算由比在参考条件下更强的选择压力引起的目标反应的覆盖度。此外，EvolveX从目标通量的选择压力、由比在参考条件下更强的选择压力产生的目标通量覆盖度和小生境中化学成分数量得到特定进化小生境的综合得分。在此，运行EvolveX对化学环境评分，其由在酿酒酵母的基因组规模代谢模型中限定的三种常见碳源和氮源的所有组合形成并另外包含葡糖酸盐。作为参考条件，使用实验室葡萄糖基本培养基。手动检查得分良好的环境(即，综合得分越低越好)，以选择用于实验适应性进化的进化小生境。为了使乙酸苯乙酯产生增加得以进化，选择以下培养基：甘油、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸，并且为了使支链氨基酸衍生的芳香物产生增加得以进化，选择以下培养基：乙醇、甘氨酸L-精氨酸。将这些化合物的组合用作在适应性进化实验中的唯一碳源和氮源。如直方图中所示(图4A)，选定的乙醇、甘氨酸、L-精氨酸的组合对于进化支链芳香酸衍生酯的产生增加的适用性得分良好(相对于观察到的最小得分为1.04)，并且选择该组合而不是得分更低者，因为乙醇作为碳源可以支持快速生长从而促进实验。甘油、L-苯丙氨酸和L-苏氨酸对于进化乙酸苯乙酯的产生增加的适用性得分相对较好(相对于观察到的最小得分为1.06)(图4B)。选择这种组合而不是得分更高者，因为初始实验表明，D-核糖和葡糖酸盐作为碳源将无法维持生长，并且预计作为碳源和氮源唯一贡献的氨基酸也无法维持生长。
以小规模液体培养进行实验适应性进化。在选定的进化小生境中以三个重复谱系连续转移约80代后，从每个谱系的最终群体中分离出9个单一菌株。根据它们相对于最终群体在进化小生境-培养基中表现的表现，以一式三份在目标小生境(即对葡萄酒必不可少的葡萄酒发酵模拟培养)中表征了选定的菌株(一种菌株来自为乙酸苯乙酯产生增加而进化的谱系中的每种，而一种菌株来自为支链氨基酸衍生的芳香物产生增加而进化的谱系中的两种)。取出样品用于采用GC-MS进行挥发性芳香物分析。发现在来自相应的EvolveX设计的培养基中进化的群体的菌株中目标化合物产生增加。图3示出了相对于亲本菌株的分离出进化菌株中产生目标化合物，b)支链氨基酸衍生的芳香物，c)乙酸苯乙酯。图5进一步示出了a)在酿酒酵母代谢中目标芳香化合物的起源和前体，和d)产生可进一步反应产生酯的芳香杂醇和杂醇酸的Ehrlich途径。
EvolveX情形研究2：EvolveX设计的酿酒酵母的适应性进化以增强对乳酸菌(LAB) 生长的支持。
第二种情形研究旨在为了改变的胞外代谢物组(即分泌的代谢物)而适应性地进化酿酒酵母以影响LAB的生长支持。我们以前观察到酿酒酵母能够使LAB在缺乏必需氨基酸的培养基上生长。发现在富含氮但N源的性质不平衡的培养基中，酿酒酵母分泌含氮化合物，特别是氨基酸。在此，我们旨在使用EvolveX来设计其中在此条件下酿酒酵母将适应性地进化以分泌改变的胞外代谢物组以增强LAB生长的条件。利用反映氨基酸生物合成调节的其它约束来使用酿酒酵母的基因组规模代谢模型。具体而言，1)将L-酪氨酸合成约束为主动的，即使在培养基中提供L-酪氨酸但并非所有的芳香族氨基酸是可用的，2)将高丝氨酸(L-苏氨酸前体)合成约束为积极的，即使在培养基中存在L-异亮氨酸或L-苏氨酸。此外，在模型中允许自由摄取L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-酪氨酸。将EvolveX的目标通量设定如下：上调：L-苏氨酸醛缩酶、丙酮酸羧化酶、4-羟基苯丙酮酸脱羧酶、4-羟基苯乙酸脱氢酶、酪醇脱氢酶、酪醇分泌物和4-羟基苯乙酸分泌物；和下调：丙酮酸脱羧酶和4-羟基丙酮酸分泌物。然后使用EvolveX算法对化学环境评分，其由在酿酒酵母的基因组规模代谢模型中限定的三种常见碳源和氮源的所有组合形成并另外包含葡糖酸盐。作为参考化学环境，使用含有作为N源的硫酸铵的葡萄糖基本培养基。手动检查得分良好的环境(即，综合得分越低越好)，以选择用于实验适应性进化的进化小生境。由此，我们选择1)丙酮酸和2)L-苏氨酸的组合(得分相对于观察到的最小得分为1.01，进化小生境的得分直方图，参见图6A)。
在将1)丙酮酸、2)L-苏氨酸、3)L-异亮氨酸、4)L-亮氨酸、5)L-缬氨酸和6)L-酪氨酸作为唯一C源和N源的YNB(不含N源，NaOH+琥珀酸，pH 5.8)缓冲性溶液的生长板中进行实验室适应性进化，进行约100代，在此期间每隔三天通过钉扎方式(pinning)转移到新平板中。从显示出在进化小生境中的生长显著改善的群体中，分离出单个快速生长的菌株。测试分离出的菌株相对于亲本菌株对LAB(乳酸乳球菌，植物乳杆菌)的生长支持。通过将酵母菌株培养在CDM35葡萄糖培养基(含有铵和氨基酸：L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸；Ponomarova等人，正在准备手稿)中来制备用于测试LAB生长支持的调节培养基(conditioned medium)，由此使LAB不能生长。在30℃(无摇动)孵育16小时或20小时(即，从初始OD600为0.01)后，将酵母细胞沉淀并丢弃。将上清液进一步通过0.22μm无菌PVDF过滤器。然后，以96孔板中的初始OD600 0.01，将LAB接种到酵母调节的培养基和酵母未调节的培养基中。在30℃下孵育LAB，不摇动，并在4天后评估它们的生长。三种进化的菌株示出相对于乳酸乳球菌(IL1403)和植物乳杆菌(WCSF1)，生长支持改善(图6B)。
该申请还包括以下实施方式：
实施方式1：一种用于评估化学环境对于进化细胞或生物体的所需代谢特征的适用性的方法，该方法包括对代谢模型中的一种或多种通量函数进行模拟，
其中代谢模型包括生化反应和胞外化合物的输入和输出的化学计量表示，
其中代谢特征包括目标的集合，
其中目标是通量函数。
实施方式2：根据实施方式1的方法，其中对一种或多种与生长有关的目标进行模拟，
其中生长是产生生物质组分或生物质的一种或多种反应的通量函数。
实施方式3：根据实施方式2的方法，其中在将生长约束为固定值或一定范围内时进行模拟。
实施方式4：根据实施方式3的方法，
其中在将生长约束为其最佳值时进行模拟。
实施方式5：根据实施方式3或4的方法，其中在对任意摄取设定约束时进行模拟，
其中摄取是表示胞外化合物输入的反应的通量函数。
实施方式6：根据实施方式5的方法，其中在将摄取总和约束为固定值或一定范围内时进行模拟。
实施方式7：根据实施方式6的方法，其中在将摄取总和约束为最佳值时进行模拟。
实施方式8：根据实施方式7的方法，其中在将任意摄取约束为固定值或一定范围内时进行模拟。
实施方式9：根据实施方式8的方法，其中在将任意摄取约束为最佳值时进行模拟。
实施方式10：根据前述实施方式中任一项的方法，其中将上调目标和下调目标优化为相反方向，
其中上调目标是需要增加的那些目标，和
其中下调目标是需要降低的那些目标。
实施方式11：根据前述实施方式中任一项的方法，其中对绝对通量值进行模拟。
实施方式12：根据前述实施方式中任一项的方法，其中将上调目标的绝对值最小化并将下调目标的绝对值最大化。
实施方式13：根据前述实施方式中任一项的方法，其中对超过或低于至少一个阈值的目标数量进行优化。
实施方式14：根据前述实施方式中任一项的方法，其中对超过或低于至少一个阈值的与生长有关的目标数量进行模拟。
实施方式15：根据实施方式13或14的方法，其中针对参考化学环境中的通量函数确定至少一个阈值。
实施方式16：根据前述实施方式中任一项的方法，其中在模拟中限定至少一种被抑制的通量。
实施方式17：根据前述实施方式中任一项的方法，其中通过约束反应的通量来进行模拟，所述反应的通量是化学环境中所包含的抑制剂或调节触发剂的目标。
实施方式18：根据前述实施方式中任一项的方法，其中通过将反应的通量约束为零来进行模拟，所述反应的通量是化学环境所包含的抑制剂或调节触发剂的目标。
实施方式19：根据前述实施方式中任一项的方法，其中采用代谢模型的化学计量矩阵。
实施方式20：根据前述实施方式中任一项的方法，还包括：确定化学环境的数值得分，
其中得分指示化学环境中选择压力对目标的强度，和/或
其中得分指示化学环境中选择压力对目标的覆盖度。
实施方式21：根据前述实施方式中任一项的方法，还包括：确定化学环境的数值得分，
其中得分指示化学环境中最差情况选择压力对目标的强度，
其中得分指示化学环境中选择压力对目标的最差情况覆盖度。
实施方式22：根据实施方式20或21的方法，其中在确定化学环境得分时，该得分考虑化学环境中的组分数量。
实施方式23：根据实施方式22的方法，其中得分包括化学环境中选择压力的强度和选择压力对目标的覆盖度以及组分数量的函数。
实施方式24：根据前述实施方式中任一项的方法，其中对一种或多种与生长有关的目标反应的通量函数进行模拟，该方法包括以下步骤：
(a)对施加多个约束的模型进行第一优化，从而确定第一优化结果，
其中该约束设定将生长限定为固定值或在一定范围内的条件；
其中该约束设定模型中通量的热力学界限；
其中模型的第一优化使摄取总和优化，
(b)采用第一优化结果进行第二优化，从而确定第二优化结果，
其中该约束将生长设定为固定值或在一定范围内；
其中该约束将摄取总和设定为第一优化结果，
其中第二优化结果指示化学环境的适用性，
其中模型的第二优化促进被确定为优化上调目标总和的条件，和
其中模型的第二优化促进被确定为优化下调目标总和的条件。
实施方式25：根据前述实施方式的方法，还包括以下步骤：
(c)对模型进行第三优化，从而确定第三优化结果，
其中对相对于参考化学环境中上调目标被增强的上调目标的数量进行优化，和
其中对相对于参考化学环境中下调目标被抑制的下调目标的数量进行优化。
实施方式26：根据实施方式24和25的方法，
其中得分由以下值示出：
其中
-n表示目标数量，
-覆盖度表示在步骤(c)中获得的目标的最小值，
-u表示上调目标的数量，
-强度表示在步骤(b)中获得的上调目标的最小化总和与下调目标的最大化总和之和，以及
-c表示化学环境中的组分数量，
-Wc、Ws和Wm表示数学权重。
实施方式27：根据前述实施方式中任一项的方法，
其中将该方法用于遗传算法中的适合性评分。
实施方式28：根据实施方式27的方法，
其中化学环境表示遗传算法中的个体，其中化学环境的化合物表示遗传算法中个体的性质或基因。
实施方式29：根据前述实施方式中任一项的方法，其中化学环境是细胞或生物体的天然环境。
实施方式30：一种用于选择分离根据实施方式29的菌株的位点的方法，
其中该方法使具有代谢特征的细胞或生物体分离出来。
实施方式31：根据前述实施方式中任一项的方法，
其中代谢特征使细胞或生物体产生至少一种所需产物。
实施方式32：根据实施方式31的方法，
其中至少一种所需产物是食物化合物，优选芳香化合物。
实施方式33：根据实施方式32的方法，其中至少一种所需产物是聚合物、酸、醇或酯。
实施方式34：根据前述实施方式中任一项的方法，其中细胞或生物体具有工业相关性。
实施方式35：根据前述实施方式中任一项的方法，其中细胞或生物体是选自细菌、酵母或霉菌的组的微生物。
实施方式36：根据实施方式35的方法，其中酵母是酿酒酵母。
实施方式37：根据前述实施方式中任一项的方法，
其中化学环境是用于细胞或生物体的培养基。
实施方式38：根据实施方式1至37的方法，
其中化学环境是用于进化细胞或生物体的代谢特征的进化化学环境，并且不同于用于培养细胞或生物体产生至少一种所需产物的目标化学环境。
实施方式39：根据实施方式1至37的方法，
其中细胞是肿瘤细胞。
实施方式40：根据实施方式1至37的方法，
其中生物体是病原体。
实施方式41：根据实施方式39或40的方法，
其中代谢特征导致细胞或生物体去稳定化。
实施方式42：根据实施方式41的方法，
其中细胞或生物体去稳定化导致细胞或生物体的生长减少和/或死亡。
实施方式43：一种用于确定进化细胞或生物体的代谢特征的化学环境的方法，包括以下步骤：
(a)使用前述实施方式中任一项的方法评估进化至少两种化学环境的代谢特征的适用性，
(b)选择至少一种具有进化代谢特征适用性的化学环境，其属于具有进化代谢特征最大潜能的化学环境。
实施方式44：根据实施方式43的方法，其中在步骤(b)中，选择属于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、3％、2％的具有进化代谢特征最大潜能的化学环境的化学环境。
实施方式45：一种用于确定进化细胞或生物体的代谢特征的化学环境的方法，包括以下步骤：
(a)使用前述实施方式中任一项的方法评估至少两种化学环境的适用性，
(b)选择至少一种具有进化代谢特征适用性的化学环境，其超过预设的适用性阈值。
实施方式46：一种用于进化细胞或生物体的代谢特征的方法，包括实施方式43至45的步骤，并且还包括以下步骤：
(c)在步骤(b)中选定的化学环境中培养细胞或生物体。
实施方式47：通过实施方式46的方法获得的细胞或生物体。
实施方式48：一种用于进化实施方式44的细胞或生物体的代谢特征的方法，包括以下步骤：
(a)根据实施方式43的步骤(a)和(b)来确定进化细胞或生物体的代谢特征的进化化学环境，
(c)在进化化学环境中培养细胞或生物体以进化所需特征，
(d)在目标化学环境中培养细胞或生物体，以由细胞或生物体产生至少一种所需产物。
实施方式49：根据实施方式1至46和48的方法，其中代谢特征是至少一种芳香化合物产生增加。
实施方式50：根据实施方式49的方法，其中至少一种芳香化合物是芳香族芳香化合物或支链氨基酸衍生的芳香物或其前体。
实施方式51：根据实施方式50的方法，其中芳香族芳香化合物是乙酸苯乙酯。
实施方式52：根据实施方式1至46和48的方法，其中代谢特征是增强乳酸菌生长的氨基酸产生增加。
实施方式53：一种计算机程序单元，当该计算机程序单元被处理器执行时，适于进行根据实施方式1至44中任一项的方法步骤。
实施方式54：一种计算机可读介质，包括根据实施方式53的计算机程序单元。
实施方式55：一种用于确定用于筛选具有所需代谢特征的细胞或生物体的选择化学环境的方法，包括实施方式43或44的步骤；
其中化学环境对于进化代谢特征的适用性与化学环境对于筛选具有所需代谢特征的细胞或生物体的适用性相关。
实施方式56：一种采用选择化学环境来筛选具有所需代谢特征的细胞或生物体的方法，
(a)根据实施方式55确定选择化学环境，
(b)在选择化学环境中培养至少两种细胞或生物体，
(c)选择至少一种细胞或生物体，其显示出比在选择环境中的一种或多种其它细胞或生物体生长更快；
其中在选择环境中生长更快表明细胞或生物体含有所需代谢特征。
实施方式57：根据实施方式55或56的方法，其中所需代谢特征在目标化学环境中不提供适合性益处。
实施方式58：根据实施方式55至57的方法，其中所需代谢特征在选择化学环境中提供适合性益处。

Claims (27)

1.一种用于评估进化化学环境对于进化细胞或生物体的所需代谢特征的适用性的方法，所述方法包括对代谢模型中的一种或多种通量函数进行模拟，
其中所述代谢模型包括生化反应和胞外化合物的输入和输出的化学计量表示，
其中所述代谢特征包括目标的集合，
其中所述目标是通量函数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述所需代谢特征在旨在使用所述细胞或生物体的目标化学环境中不提供适合性益处。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述所需代谢特征在所述进化化学环境中提供适合性益处。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对一种或多种与生长有关的目标进行模拟，
其中所述生长是产生生物质组分或生物质的一种或多种反应的通量函数，并且其中在将所述生长约束为固定值或在一定范围内时进行模拟。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在对任意摄取设定约束时进行模拟，
其中所述摄取是表示胞外化合物输入的反应的通量函数。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在将摄取总和约束为固定值或在一定范围内时进行模拟，其中可选地在将摄取总和约束为最佳值时进行模拟，和/或其中在将任意摄取约束为固定值或在一定范围内时进行模拟。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将上调目标和下调目标优化为相反方向，
其中所述上调目标是需要增加的那些目标，和
其中所述下调目标是需要降低的那些目标，
其中任选地，将上调目标的绝对值最小化并且将下调目标的绝对值最大化，和/或其中对超过或低于至少一个阈值的目标数量进行优化。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其中对超过或低于至少一个阈值的与生长有关的目标数量进行模拟，并且其中可选地针对参考化学环境中的通量函数确定所述至少一个阈值。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其中在所述模拟中限定至少一种被抑制的通量，并且其中可选地通过将反应的通量约束为零来进行模拟，所述反应的通量是所述进化化学环境所包含的抑制剂或调节触发剂的目标。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：确定所述进化化学环境的数值得分，
其中所述得分指示所述化学环境中最差情况选择压力对所述目标的强度，
其中所述得分指示所述进化化学环境中所述选择压力对所述目标的最差情况覆盖度，和/或
其中在确定所述进化化学环境的所述得分时，所述得分考虑所述进化化学环境中的组分数量。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对一种或多种与生长有关的目标反应的通量函数进行模拟，
所述方法包括以下步骤：
(a)对施加多个约束的所述模型进行第一优化，从而确定第一优化结果，
其中约束设定将生长限定为固定值或在一定范围内的条件；
其中约束设定所述模型中通量的热力学界限；
其中所述模型的所述第一优化使摄取总和优化，
(b)采用所述第一优化结果进行第二优化，从而确定第二优化结果，
其中约束将生长设定为固定值或在一定范围内；
其中约束将摄取总和设定为所述第一优化结果，
其中所述第二优化结果指示所述进化化学环境的适用性，
其中所述模型的所述第二优化促进被确定为优化上调目标总和的条件，和
其中所述模型的所述第二优化促进被确定为优化下调目标总和的条件。
12.根据前述权利要求所述的方法，还包括以下步骤：
(c)对所述模型进行第三优化，从而确定第三优化结果，
其中对相对于参考化学环境中的上调目标被增强的上调目标的数量进行优化，和
其中对相对于参考化学环境中的下调目标被抑制的下调目标的数量进行优化。
13.根据权利要求9和10所述的方法，
其中由下值确定所述得分：
其中
-n表示目标数量，
-覆盖度表示在步骤(c)中获得的目标的最小值，
-u表示上调目标的数量，
-强度表示在步骤(b)中获得的上调目标的最小化总和与下调目标的最大化总和之和，和
-c表示在所述进化化学环境中的组分数量，
-Wc、Ws和Wm表示数学权重。
14.一种用于确定进化细胞或生物体的代谢特征的进化化学环境的方法，包括以下步骤：
(a)采用前述权利要求中任一项的方法评估至少两种化学环境对于进化代谢特征的适用性，
(b)选择至少一种具有进化代谢特征适用性的化学环境，其属于具有进化代谢特征最大潜能的化学环境。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在步骤(b)中，选择属于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、3％、2％的具有进化代谢特征最大潜能的化学环境的化学环境。
16.一种用于进化细胞或生物体的代谢特征的方法，包括以下步骤：
(a)根据权利要求12所述的步骤(a)和(b)确定进化所述细胞或生物体的所述代谢特征的进化化学环境，
(c)在所述进化化学环境中培养所述细胞或生物体以进化所述所需特征，
(d)在目标化学环境中培养所述细胞或生物体，以由所述细胞或生物体产生至少一种所需产物。
17.根据权利要求1至13所述的用于评估进化化学环境的适用性的方法，根据权利要求14或15所述的用于确定进化化学环境的方法，根据权利要求16所述的用于进化代谢特征的方法，其中所述微生物是酵母，优选酵母属，更优选酿酒酵母。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述代谢特征是至少一种芳香化合物的产生增加。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种芳香化合物是芳香族芳香化合物或支链氨基酸衍生的芳香物或其前体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述芳香族芳香化合物是乙酸苯乙酯。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述代谢特征是增强乳酸菌生长的氨基酸的产生增加。
22.由权利要求16的方法获得的细胞或生物体。
23.一种计算机可读介质，包括计算机程序单元，当所述计算机程序单元被处理器执行时，其适于进行根据权利要求1至11中任一项所述的方法步骤。
24.一种用于确定用于筛选具有所需代谢特征的细胞或生物体的选择化学环境的方法，包括权利要求14或15所述的步骤；
其中所述化学环境对于进化代谢特征的适用性与所述化学环境对于筛选具有所需代谢特征的细胞或生物体的适用性相关。
25.一种采用选择化学环境来筛选具有所需代谢特征的细胞或生物体的方法，
(a)根据权利要求24确定选择化学环境，
(b)在所述选择化学环境中培养至少两种细胞或生物体，
(c)选择至少一种细胞或生物体，其显示出比在所述选择环境中的一种或多种其它细胞或生物体生长更快；
其中在所述选择环境中生长更快表明所述细胞或生物体含有所述所需代谢特征。
26.根据权利要求24至25所述的方法，其中所述所需代谢特征在所述目标化学环境中不提供适合性益处。
27.根据权利要求24至26所述的方法，其中所述所需代谢特征在所述选择化学环境中提供适合性益处。
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