CN104812889B

CN104812889B - 通过在低ph下发酵产生有机酸

Info

Publication number: CN104812889B
Application number: CN201380058737.2A
Authority: CN
Inventors: R·R·约卡姆; S·多勒; J·G·佩罗
Original assignee: Myriant Corp
Current assignee: PTT Global Chemical PCL
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2013-09-13
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2033-09-13
Also published as: JP2020127417A; EP2895593B1; EP2895593A1; KR102253532B1; EP2895593A4; CA2884266C; JP2018134108A; US20150240270A1; WO2014043591A1; KR20150055006A; JP6879976B2; JP2015528312A; BR112015005416A2; MY182946A; US11072807B2; CN104812889A; CA2884266A1

Abstract

本发明涉及遗传改造的微生物中有机酸的生物合成。更尤其是，本发明提供遗传改造的微生物，其在低pH下对有机酸特别耐受并且能够在低pH下通过发酵产生有机酸。

Description

通过在低PH下发酵产生有机酸

相关申请的交叉参考

该申请要求保护2012年9月14日提交的美国临时申请系列号61/701,293的优先权。

发明领域

本发明是使用生物催化剂产生可再生化学原料的领域，已经遗传改造了所述生物催化剂以增加其将可再生碳源转化成有用的化合物的能力。更尤其是，本发明提供使用遗传修饰的生物催化剂从可再生碳源产生有机酸，如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和乳酸的方法。

发明背景

琥珀酸(为了简洁，本文中也称为“琥珀酸”)是在多种产品，包括动物饲料、增塑剂、冷冻剂、聚合物、纤维和塑料，最特别的是聚琥珀酸丁酯(也称为“聚琥珀酸亚丁酯”、“聚(琥珀酸亚丁酯)”和“PBS”)的制造中早已使用或可能使用的潜在大体积化学物。由琥珀酸制备的许多聚合物以比来源于石油的其他聚合物，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚对苯二甲酸乙二酯(PET)快得多的速率被生物降解。像这样，由琥珀酸制备的塑料是高度想要的，因为它们在垃圾或其他堆肥环境中会更迅速地腐烂(Kunioka等,2009)。这种性质扩展至许多其他聚合物和塑料，其中单体亚基是生物来源的化合物或其化学等同物，而不是正常在活生物体中没有大量发现的石油化学来源的化合物。例如，来源于延胡索酸(延胡索酸)、苹果酸(苹果酸)、己二酸(己二酸)、L-乳酸(L-乳酸)、D-乳酸(D-乳酸)，和其他天然发生的有机酸的聚合物均比堆肥环境中的许多石油化学来源的聚合物降解地更迅速。像这样，为了人类的利益，期望利用由生物化学物(由活生物体制备和/或代谢的化学物)制备的聚合物和塑料替换目前由石油化学物制备的聚合物和塑料。

当然，可以从石油制造许多生物化学物，如琥珀酸、延胡索酸，和己二酸，并且实际上，目前使用的制备PBS和尼龙的方法(2012)使用石油来源的单体。然而，因为世界石油供应是有限的，还期望开发通过从可再生碳源，如糖、糖聚合物、甘油、脂肪酸、二氧化碳、木质素或生物量的任何其他形式或来源于生物量的废物发酵产生生物化学单体的材料和方法。因此，期望开发从可再生生物资源制备生物可降解塑料的方法。

已经开发了若干方法用于通过发酵产生有机酸，例如通过乳杆菌(Lactobacillus)、埃希氏菌(Escherichia)和芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌产生L-乳酸(Grabar等,2006；Patel等,2006)，通过丝状真菌米根霉(Rhizopus oryzea)产生延胡索酸(Roa Engel等,2008)，通过遗传改造的大肠杆菌(Escherichia coli)或凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)产生D-乳酸(Wang等,2011；Jarboe等,2010；Grabar等,2006)，通过遗传改造的大肠杆菌(E.coli)产生己二烯二酸(Niu等,2002)，通过酵母(Saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、假丝酵母(Candida)和伊萨酵母(Issatchenkia)属的多种遗传改造的酵母种产生L-乳酸(Zhang等,2011；US 7,049,108,US 7,229,805)，通过遗传改造的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)产生苹果酸(US 2008/0090273)，和通过遗传改造的大肠杆菌、酿酒酵母、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)产生琥珀酸(Zhang等,2009a；Zhang等2009b；Jantama等,2008a；Jantama等,2008b；WO 2010/003728；WO 2008/128522；WO 2010/043197；WO 2012/103261；US2012/0015415)。

许多上述方法，包括基于细菌的所有那些使用不能在低pH下生长的生物体。如本发明中所用，术语“低pH”定义为5.6或更低的pH。当低pH不耐受的生物催化剂，如细菌生物催化剂用于产生有机酸，如琥珀酸时，培养基的pH变成酸性的并且通过加入碱，一般是钠、钾、铵、镁或钙的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或其混合物将pH维持在约5.6至约7.5。因此，培养液中的有机酸以盐存在，并且大多数有机酸分子是带电荷的。荷电状态具有优点和缺点。优点是荷电盐不轻易地穿过细胞膜弥散回到细胞内。缺点是有机酸的聚合化学或其他进一步的化学用途一般需要有机酸的质子化形式(也称为“游离酸”)，所以发酵产生的盐需要可能昂贵的下游处理来提供游离的酸形式。像这样，在低pH(接近或更优选低于有机酸的最低pKa的pH)下产生有机酸将是有利的，从而大多数分子处于游离酸状态。将其他考虑因素放在一边，低pH发酵液处理较廉价以给出游离酸的纯制剂，因为必须分离的平衡离子(如钠、钾、铵、镁、钙)少得多。然而，该方法遇到的问题至少在理论上是质子化的酸比其各自的盐更疏水，所以所述质子化的酸更易于通过细胞膜的疏水脂双层弥散回到细胞内(vanMaris等,2004)。如果需要能量将有机酸泵出细胞，那么接着发生无效循环，其会消耗细胞的资源远离想要的生物合成(van Maris等,2004)。

但是，存在通过在低pH发酵产生有机酸的方法。最有名且最古老的是通过黑曲霉(Aspergillus niger)和相关种产生柠檬酸的方法(Papagianni,2007)，尽管柠檬酸可能是特例，因为质子化形式可能比一羧酸和二羧酸的质子化形式更极化。近期，已经开发了方法用于通过多种酵母在pH下产生L-乳酸，并且这些酵母之一已经商业化，尽管还未揭示是哪一种酵母(Aker等,Session Abstract 170,Society for Industrial MicrobiologyAnnual Meeting,July 24-28,2011,New Orleans,LA,USA)。已经改造了酿酒酵母菌株以产生苹果酸，但是pH维持在5(Zelle等,2008)。甚至更近期，已经遗传改造了酿酒酵母、东方伊萨酵母(Issatchemkia orientalis)和解脂耶氏酵母菌株以在相对低的pH下产生琥珀酸(WO 2008/128522；WO 2010/043197；US 2012/0040422；WO 2010/003728；WO 2011/023700；WO 2009/101180；WO 2012/038390；WO 2012/103261；和US 2012/0015415)。然而，当提及时，在这些现有技术专利申请中已经发表的滴度和产量相比于通过在中性pH下操作的细菌产生系统获得的那些相对低，所以来自发表的酵母方法的滴度和产量足够的高以与中性pH细菌方法竞争并不明显(Jantama等2008a；Jantama等,2008b)。此外，如本发明所公开，在从腐烂的甘蔗渣和其他环境中存在若干酵母菌株，其在低pH下比酿酒酵母菌株更耐受琥珀酸和L-乳酸。

WO 2012/103261公开了已经被改造以产生琥珀酸或苹果酸的东方伊萨酵母菌株。这些菌株来源于在许多不同酵母种类的集合中被选择为在低pH对高浓度的琥珀酸最有抗性的野生型亲本。具体而言，当与马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)菌株相比时，所选的东方伊萨酵母(I.orientalis)菌株对琥珀酸更有抗性。WO 2012/103261没有公开被改造以过量产生琥珀酸的克鲁维酵母属的酵母。然而，如本发明将公开，本发明人已经发现了马克思克鲁维酵母的新野生型菌株，其在富含稀释剂的培养基中生长时比东方伊萨酵母菌株在低pH下对琥珀酸更耐受(参见图1)。因此，种类内不同菌株之间在低pH下对有机酸的耐受性方面明显地存在一些变异，并且完成筛选的精确条件可能影响该筛选的结果。例如，在将东方伊萨酵母鉴定为对琥珀酸最耐受的WO 2012/103261中筛选对琥珀酸的耐受性推测在YPD培养基(含有2％葡萄糖作为碳源)，pH 2.5下完成，而在将野生马克思克鲁维酵母(K.marxianus)菌株(其与马克思克鲁维酵母的任何已知菌株不同)鉴定为对琥珀酸最耐受菌株的下文中公开的筛选在含有5％葡萄糖的1/4强度YP培养基(2.5g/l酵母提取物加5g/l蛋白胨)中和3.3的起始pH下完成。WO 2012/103261公开了缺失编码PEP羧激酶的PCK基因对琥珀酸产生有益，因为一般认为PEP羧激酶是葡萄糖异生酶，并在想要方向的反方向起作用。然而，在适当改造的菌株中，本发明人提出了完全相反的方面，即，使用PEP羧激酶用于回补(二氧化碳掺入)反应比使用如WO 2012/103261中要求的丙酮酸羧化酶或PEP羧化酶更有利。WO 2012/103261的发明人提出通过增加戊糖磷酸途径流量而提供用于产生琥珀酸的还原途径的还原当量。相反，本发明人建议用于琥珀酸合成的还原当量最好通过TCA循环的氧化和还原分支平衡流来提供。

已经公开了东方伊萨酵母的菌株，其已经被改造以产生苹果酸或延胡索酸(WO2012/103263)。然而，WO 2012/103263没有公开克鲁维酵母作为产生苹果酸或延胡索酸的宿主的用途，并且如上用于WO 2012/103261，其教导反对使用PEP羧激酶用于从PEP至草酰乙酸(OAA)的羧化反应。

在任何情况下，WO 2102/103261中公开的琥珀酸产生参数和WO 2012/103263中公开的苹果酸产生参数分别对琥珀酸或苹果酸的商业生产不足以有吸引力，所以仍有改善的空间，并且仍然需要开发改善的方法用于在低pH下通过发酵产生琥珀酸和其他有机酸，如延胡索酸、L-苹果酸、D-乳酸、L-乳酸。

酿酒酵母当在作为碳源的葡萄糖上需氧或厌氧生长时天然产生大量的琥珀酸(Oura,1977；Heerde和Radler,1978；de Klerck,2010)。在酵母中产生琥珀酸的氧化和还原生物化学途径是众所周知的(de Klerck,2010)并且与大肠杆菌和许多其他生物体的那些类似，除了在酵母中，许多氧化步骤主要在线粒体或原线粒体(也称为protomitochindria)内被催化。琥珀酸是克雷伯氏循环，也称为三羧酸循环或TCA循环中的中间物。在存在氧气的条件下，大多数需氧生物体氧化运行TCA循环，其以草酰乙酸(OAA)和乙酰-CoA开始，运行经过柠檬酸、乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酰-CoA、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸并回到OAA。在该方法中，产生NADH、NADPH和FADH₂形式的还原当量，和2摩尔的CO₂/摩尔乙酰-CoA。因此，乙酰-CoA的乙酰基部分在循环中实际上被氧化成CO₂和水，并且OAA作为获得再生的引物或催化剂而起作用。琥珀酸是中间物。在需氧条件下，还原当量最终通过氧化磷酸化被氧气氧化，以产生水和ATP，因此，再生NAD、NADP和FAD用于下一个循环。然而，在缺少氧气或其他氧化剂的情况下，TCA循环不能在上述氧化循环中专一运行，因为细胞不能再生TCA循环所需量的NAD、NADP和FAD。虽然在基本培养基中厌氧条件下，需要至少三个TCA循环中间物α-酮戊二酸、琥珀酰-CoA和OAA作为其他生物合成途径的生物化学中间物，但是大多数TCA循环的酶反应物必须仍然是有活性的。在这些条件下，将TCA“循环”分成两个线性的非环形的叉或分支，一个氧化分支如上所述开始，但以琥珀酰CoA终止，和一个还原分支也以OAA开始，但以与上述方向相反的方向，通过苹果酸和延胡索酸运行，以琥珀酸终止。该第一个分支在本文中应该称为氧化分支，而第二个分支在本文中应该称为TCA循环的还原分支，因为作为从OAA到琥珀酸的途径之一，其消耗作为NADH和FADH₂的还原当量，以再生NAD和FAD。

如在本发明中所定义，术语TCA循环的“产生琥珀酸的氧化途径”或“氧化分支”指克雷伯氏循环的一部分，其以磷酸烯醇丙酮酸开始并以琥珀酸终止，并且包括中间物如草酰乙酸、乙酰CoA、柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸和琥珀酰CoA，并涉及还原当量如NADH的产生。另一方面，如本发明中所定义，术语TCA循环的“产生琥珀酸的还原途径”或“还原分支”指克雷伯氏循环的一部分，其以草酰乙酸开始并以琥珀酸终止，包括作为中间物的苹果酸和延胡索酸并消耗还原当量如NADH和FADH₂。在野生型酵母细胞中，克雷伯氏循环完全在线粒体中运转。本发明涉及遗传改造的酵母细胞，其中产生琥珀酸的氧化途径和产生琥珀酸的还原途径完全在细胞质中转运。

草酰乙酸在酵母细胞的细胞质中通过丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸的羧化反应产生。丙酮酸羧化成草酰乙酸由丙酮酸羧化酶介导，而磷酸烯醇丙酮酸的羧化由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶介导。草酰乙酸从细胞质进入线粒体并起始克雷伯氏循环。

来自异柠檬酸(克雷伯氏循环的氧化部分中的中间物)的碳也进入乙醛酸循环，导致在细胞质中形成乙醛酸和琥珀酸。乙醛酸循环在本领域中也称为乙醛酸旁路。乙醛酸途径在线粒体中从柠檬酸循环中分支出来并导致在细胞质中作为终产物的琥珀酸的产生。已经作出努力以在琥珀酸产生中开发乙醛酸途径。为了在细胞质中通过运转乙醛酸循环来积累琥珀酸，必须实现以下三个遗传操作：(i)在适当位置上阻断柠檬酸循环的运转，以便来自柠檬酸循环的碳再次导入乙醛酸循环；(ii)增强参与乙醛酸循环的酶的运转；和(iii)通过遗传操作在线粒体包被中去除二羧酸转运蛋白来阻止琥珀酸从胞质溶胶再次进入线粒体。

本发明的目标是在线粒体外没有乙醛酸循环参与的情况下产生琥珀酸。这通过在酵母细胞的细胞质内表达一般在线粒体内表达的并且参与克雷伯氏循环的氧化或还原部分的那些酶来实现。

已经遗传改造了大肠杆菌(E.coli)菌株以在厌氧或微需氧条件下产生琥珀酸(Jantama等,2008a；Jantama等,2008b)。理论上，为了从葡萄糖实现琥珀酸的最大可能产量，必须通过TCA循环的氧化和还原分支合成琥珀酸(WO2011/063157)。还原途径比氧化途径固有地从葡萄糖更高地产出，因为所述还原途径并不丢失任何碳原子，并且其在PEP羧激酶反应中从二氧化碳掺入碳原子。然而，因为还原途径需要一个NADH和一个FADH₂/琥珀酸，并且因为从葡萄糖到PEP的糖酵解途径仅产生一个NADH/3个碳单位，因此从葡萄糖到琥珀酸的还原途径不是氧化还原平衡的，并因而不能通过自身厌氧运转。氧化途径每消耗3个碳单位(如丙酮酸)产生两个NADH和一个NADPH。因而，如果还原和氧化途径以正确的比例运转，那么即使在缺少氧气的情况下也能平衡氧化还原当量(如NADH、NADPH和FADH₂)的产生和消耗。

在大肠杆菌中，并且可能在运转TCA循环的大部分或全部其他生物中，TCA的调节已经很可能进化到保存碳和能量，并且不使琥珀酸从葡萄糖的产量最大化。像这样，使被改造用于同型发酵琥珀酸产生的大肠杆菌菌株进行“再进化”(也称为代谢进化)，其可能导致平衡TCA循环的两个分支，以在厌氧或微需氧的条件下提供氧化还原平衡(Jantama等,2008a；Jantama等,2008b)。

尽管在酵母低pH发酵中产生二羧酸，如琥珀酸具有理论上的优势，但是由于酵母中膜结合细胞器形式的亚细胞区室化，在酵母中改造琥珀酸产生几乎不像在大肠杆菌中那样直接。首先，在酵母中，可能在大多数(如果不是所有)其他酵母中，在需氧条件下，TCA循环在线粒体或原线粒体内运转(WO 2008/128522,WO 2010/043197)。在缺少特定的琥珀酸转运蛋白的情况下，线粒体内膜对琥珀酸是不通透的(Lee等,2011)，但是在延胡索酸或磷酸的交换中将琥珀酸输入到线粒体的转运蛋白是已知的(Lee等,2011；Palmieri等,1999；Palmieri等,2000)。然而，对于琥珀酸从线粒体分泌到细胞质没有任何已知的机制，所以从TCA循环，即使是以分支模式产生的琥珀酸也不能轻易地分泌到线粒体外并因此分泌到细胞外。像这样，现有技术中公认的是，将期望通过在产生苹果酸和琥珀酸的还原途径中安排关键的酶，如丙酮酸脱酸酶、苹果酸脱氢酶和延胡索酸酶来改造细胞质中的二羧酸，如苹果酸和琥珀酸，以在线粒体外的细胞质中存在并足够的有活性(US 2008/0090273、US 2012/0040422、WO 2010/003728、WO 2011/023700.WO 2009/101180和WO 2012/038390、WO 2008/128522、WO 2010/043197、WO 2009/011974)。然而，现有技术还未认识到或解决在酵母中怎样从线粒体输出琥珀酸或怎样在厌氧或微需氧条件下达到氧化还原平衡，同时使琥珀酸从葡萄糖(或其他碳源)的产量最大化的问题。

两个线粒体膜蛋白被报道在酵母中将琥珀酸泵入线粒体中交换磷酸或延胡索酸(Lee等,2011；Palmieri等,1999；Palmieri等,2000)。像这样，在本发明的优选实施方案中，编码那些转运蛋白的任一或两个基因，即DIC1(WO 2008/128522)和SFC1将从酵母中缺失，这与被改造以产生琥珀酸的本发明的酵母的新特征组合。

使用酵母或细菌用于琥珀酸生产的现有技术参考依赖于使用乙醛酸旁路来产生还原当量(如NADH)，以供应还原琥珀酸途径(WO 2009/101180、WO 2008/128522、Vemuri等,2002；Cox等,2006；Zhu等,2013)。此外，因为乙醛酸旁路酶异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶在酵母中是在细胞质中的，所以依赖于使用这些酶在酵母细胞质中合成琥珀酸(WO 2009/101180，WO 2008/128522)。然而，当与使用TCA循环的氧化分支比较时，在细菌或酵母中使用用于琥珀酸合成的乙醛酸旁路内在更没有效力，因为TCA循环的氧化分支在琥珀酰-CoA到琥珀酸步骤产生ATP或GTP，而乙醛酸旁路在任何步骤均不产生ATP或GTP。因此，使用乙醛酸旁路是不经济的，所以有利地避免其用于生物合成琥珀酸和其他二羧酸、TCA循环中间体及其衍生物。本发明人已经认识到使TCA循环的还原和氧化分支为琥珀酸产生运转的重要性，并且在酵母中，期望使两个分支在细胞质中运转，并且避免使用乙醛酸旁路酶。为此，可以通过本领域所熟知的方法从宿主酵母菌株中缺失编码异柠檬酸裂解酶(例如ScICL1、ScICL2、KmICL1、IoILC1及其他)和苹果酸合酶(例如ScMLS1、ScMLS2、KmMLS1、IoMLS1,及其他)的基因。

具体而言，尽管在现有技术中讨论了平衡还原和氧化途径用于琥珀酸产生的概念(Jantama等,2008b；Abbott等,2009)，但是没有现有技术参考文献提示在酵母中将TCA循环的氧化分支的酶从线粒体重定向到细胞质中，或在细胞质中直接安装氧化琥珀酸途径的酶，例如没有线粒体指向信号序列的细菌酶。事实上，现有技术通过推荐缺失RTG3(其为编码以氧化方向运转的TCA酶的正调节物)教导在酵母中不使用TCA循环的氧化分支用于二羧酸产生(WO 2009/011974)，并且讨论平衡还原和氧化途径的现有技术推荐使用乙醛酸旁路而不是TCA酶用于氧化途径(Raab和Lang,2011)。此外，线粒体内和外的所有相关酶的产生和活性调节是极其复杂的，并且怎样改造合适水平并不明显。最后，线粒体膜对NAD和NADH不渗透，并且怎样在线粒体基质和细胞质之间达到有效的氧化还原平衡并不明显。存在可能用于在线粒体膜之间穿梭还原当量的至少三个系统，即天冬氨酸-苹果酸穿梭、甘油-3-磷酸脱氢酶穿梭和醇脱氢酶穿梭(Easlon等,2008)。然而，怎样改造一种或多种这些穿梭以产生期望的条件用于生物合成琥珀酸或其他二羧酸也并不明显。本文公开的发明认识到了这些问题并为这些问题提供了解决方案。

现有技术研究人员已经公开了用于在多种酵母，包括来自酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、球拟酵母菌(Torulopsis)、接合酵母(Zygosaccharomyces)和伊萨酵母属的酵母中产生L-乳酸和D-乳酸的材料和方法(Zhang等,2011；US 6,429,006、US 7,049,108、US 7,326,550、US 7,229,805和美国专利申请公开2009/0226989、2007/0031950)。然而，从葡萄糖到乳酸的生物合成途径比到琥珀酸的途径内在简单地多。从葡萄糖到乳酸的途径是氧化还原平衡的，并且其不涉及线粒体，所以关于酵母中乳酸生物合成的现有技术不足以教导怎样在酵母中最好地产生琥珀酸或其他二羧酸。若干现有技术公开内容教导了在酿酒酵母中产生琥珀酸的方法和材料。然而，酿酒酵母(S.cerevisiae)不像其他属，如克鲁维酵母、毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母和伊萨酵母属的一些酵母一样在低pH下对有机酸耐受，所以能够在非酵母属酵母中产生琥珀酸将是一个改进。除了对有机酸的耐受性，在酵母属酵母和其他酵母，如克鲁维酵母和伊萨酵母之间存在许多其他根本的区别。因而，现有技术的教导没有使怎样改造非酵母属酵母种在没有过度实验的情况下用于经济可行地产生琥珀酸变得显而易见。例如，尽管野生型酿酒酵母含有ScPDC1、ScPDC5和ScPDC6编码的丙酮酸脱酸酶的至少三种活性同工酶，但是野生型乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和野生型马克思克鲁维酵母各自含有一个活性丙酮酸脱酸酶，其分别由KlPDC1和KmPDC1编码。第二，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)中基因表达的调节可以与酿酒酵母中的完全不同(Booth等,2010；Rusche和Rine,2010)。第三，酿酒酵母的默认情况是二倍性的。二倍性仅当饥饿时才是稳定并且形成孢子的。然而，乳酸克鲁维酵母的默认情况是单倍性的。乳酸克鲁维酵母单倍性仅当它们饥饿时才交配，并且交配一发生，所得二倍体就形成孢子变成单倍体(Booth等,2010；Kegel等,2006)。第四，乳酸克鲁维酵母和马克思克鲁维酵母比酿酒酵母显示高得多的非同源末端结合水平(Kegel等,2006；Abdel-Banat等,2010)。这种差异的结果是在克鲁维酵母中进行染色体改造比在酿酒酵母中困难得多。在酿酒酵母的进化中，存在全基因组的复制(Dujon等,2004)，其对该属具有深远影响，然而该复制在克鲁维酵母属的进化过程中却并没有发生。最后，一方面在酿酒酵母之间，另一方面在乳酸克鲁维酵母和马克思克鲁维酵母之间存在根本的生理学差异。从酿酒酵母中缺失ScSDH1基因(编码琥珀酸脱氢酶的必需亚基)阻断其在作为唯一碳源的乳酸上生长，然而，在乳酸克鲁维酵母中，缺失同源基因不影响在乳酸上的生长(Saliola等,2004)。因此，在酿酒酵母和马克思克鲁维酵母之间存在如此多的主要差异，以至于用于酿酒酵母的现有技术的知识和教导将不足以使怎样在没有过度实验的情况下最佳改造非酵母属酵母用于产生琥珀酸和其他二羧酸显而易见。

遗传改造和代谢进化的组合已经用于构建大肠杆菌的菌株，其产生高水平的琥珀酸(Zhang等,2009a；Zhang等,2009b；Jantama等,2008a；Jantama等,2008b)。用于代谢进化为先前句子中引用的科学参考文献中所述的有机酸产生所选的微生物生物体的方法并入本文作为参考。

已经公开了已经被改造以产生L-乳酸和/或D-乳酸的酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、东方伊萨酵母、假丝酵母种、球拟酵母菌种和接合酵母菌株(Zhang等,2011；US 6,429,006、US 7,049,108、US 7,326,550、US 7,229,805和美国专利申请公开2009/0226989和2007/0031950)。

已经公开了已经被改造以产生L-苹果酸的酿酒酵母的菌株(美国专利申请公开2008/0090273和国际专利申请公开WO 2009/011974)。也公开了用于在细胞质中产生丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和延胡索酸酶的想法作为用于共同产生苹果酸和琥珀酸的方法。已经公开了东方伊萨酵母的菌株，其已经被改造以产生苹果酸或延胡索酸(WO 2012/103263)。然而，该专利申请没有公开克鲁维酵母作为产生苹果酸或延胡索酸的宿主的用途，也没有公开PEP羧激酶用于从PEP至草酰乙酸(OAA)的羧化反应的用途。

已经公开了已经被改造以过量产生琥珀酸的酿酒酵母、东方伊萨酵母和解脂耶氏酵母的菌株(WO 2008/128522、WO 2010/043197、US 2012/0040422、WO 2010/003728、WO2011/023700、WO 2009/101180、WO 2012/103261、US 2012/0015415和WO 2012/038390)。尽管若干上文列出的申请要求覆盖在任何酵母、真菌或真核生物中的琥珀酸产生，但是任何这些公开的的教导均没有接近促成该宽泛权利要求。此外，任何上文列出的申请中的公开发酵参数在经济上对商业化生产不足以有吸引力。像这样，仍然需要并且有充足的空间来改善通过在低pH下发酵用于琥珀酸产生的当前技术。

发明概述

本文公开的发明提供了遗传改造的微生物，其通过在低pH下发酵从可更新碳源开始产生有机酸，如琥珀酸(琥珀酸)、苹果酸(苹果酸)、D-乳酸、L-乳酸(乳酸)和延胡索酸(延胡索酸)。在优选的实施方案中，微生物是野生酵母菌株的衍生物，其比酿酒酵母菌株在低pH下对期望的有机酸更耐受。在更优选的实施方案中，野生菌株是马克思克鲁维酵母或东方伊萨酵母种,并且所述衍生物是经过遗传改造的。

在本发明的优选实施方案中，本发明的遗传改造生物含有来源于已知来自大肠杆菌和酿酒酵母的至少部分琥珀酸生物合成途径的酶，包括PEP羧激酶。在本发明的另一优选实施方案中，本发明遗传改造生物的琥珀酸生物合成途径中的酶的至少一个子集定位在细胞质(也称为胞质溶胶)中，而不是或除了定位在线粒体内。氧化途径和还原途径在一个亚细胞区室内的组合允许两条途径以氧化还原平衡的方式运行。在本发明的仍然另一实施方案中，仅来自还原性TCA途径的酶定位在细胞质中，在所述情况下还原当量通过众所周知的穿梭系统，如甘油-3-磷酸穿梭交换到线粒体中和线粒体外。

在本发明的优选方面，本发明的遗传改造的酵母细胞在细胞质中含有从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)到琥珀酸的氧化和还原途径必需的所有酶，其以充足的水平来以平衡方式运转氧化和还原途径，从而在厌氧或微需氧条件下产生琥珀酸作为主要的发酵产物。在本发明的一个方面，编码所述酶的一种或多种基因来自酵母种。在本发明的另一个方面，编码琥珀酸途径酶的一种或多种基因来自细菌和/或酵母，如酿酒酵母或马克思克鲁维酵母。在本发明的仍然另一方面，编码从PEP到琥珀酸的氧化和还原途径所需要的所有酶(包括PEP羧激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱氢酶和用于TCA循环的氧化和/或还原分支的所有酶)的基因来自细菌。在另一实施方案中，所述基因的来源是细菌大肠杆菌和/或酵母，如酿酒酵母或马克思克鲁维酵母。

在本发明的另一实施方案中，产生琥珀酸的遗传改造的酵母对FAD还原酶具有增加的活性。在本发明的一个方面，通过引入编码FAD还原酶的一个或多个异源基因实现FAD还原酶的活性增加。

在本方面的另一实施方案中，提供用于产生乳酸的遗传改造的酵母细胞。在本发明的一个方面，用于产生乳酸的遗传改造的酵母细胞包含编码乳酸脱氢酶基因的外源基因。在本发明的仍然另一方面，用于产生乳酸的遗传改造的酵母细胞包含外源甘油脱氢酶基因的修饰形式，所述基因编码催化从丙酮酸形成D-乳酸的蛋白质。

在本发明的另一实施方案中，使用于产生乳酸、苹果酸、延胡索酸和琥珀酸的遗传改造的酵母细胞进行代谢进化过程，以进一步增加各酸的产生。

附图简述

图1.在丰富生长培养基中存在有机酸的情况下在低pH下酵母菌株生长的比较。从腐烂甘蔗渣中分离酵母菌株东方伊萨酵母(SD108)和马克思克鲁维酵母(SD98)菌株。酿酒酵母BY4742是标准的实验室菌株并且酿酒酵母Ethanol Red是酿酒厂酵母。

图2.在含有酵母氮源的最小生长培养基中存在有机酸的情况下在低pH下酵母菌株生长的比较。从腐烂甘蔗渣中分离酵母菌株东方伊萨酵母(SD108)和马克思克鲁维酵母(SD98)菌株。酿酒酵母BY4742是标准的实验室菌株并且酿酒酵母Ethanol Red是酿酒厂酵母。

图3.在微需氧条件下马克思克鲁维酵母菌株SD541发酵产生乳酸。利用携带大肠杆菌乳酸脱氢酶基因ldh的质粒转化马克思克鲁维酵母SD98菌株以获得菌株SD517，其进行代谢进化以获得菌株SD541。

图4.基因表达盒的结构，所述基因盒具有编码参与从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的还原途径的酶的基因。该基因盒编码酶PEP羧激酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶和延胡索酸还原酶。在表2中列出了所使用的基因、启动子和终止子。将kanMX盒构建到pck和mdh基因之间的盒的中间。

图5.在马克思克鲁维酵母菌株SD565和马克思克鲁维酵母菌株SD631中发酵产生琥珀酸。SD565具有插入到丙酮酸脱酸酶基因座上的G418抗性标志物盒。SD631具有插入到丙酮酸脱酸酶基因座上的G418抗性标志物盒与编码参与从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的还原途径的酶的四个其他基因。

优选实施方案的详细描述

定义。如本专利申请中所用，短语“例如”或“如”旨在表示对目前主题而言多于一种方法、手段、解决方法或事件的组成，并且给出的实例不旨在限制该实例。

可以通过使用游离酸名称，如“琥珀酸”或盐、酯、硫酯或酰胺提及任何羧酸或二羧酸，在所述情况下名称可以称为“琥珀酸”。例如，铵盐可以命名为琥珀酸铵，并且乙酯可以是琥珀酸乙酯。在细胞内的生理条件下，和在细胞外的发酵液中，游离酸和盐在一定程度上均存在，并且所述盐将具有抗衡离子的混合物，所以为了本发明目的，两种类型的名称应该均涉及两种形式。在其他短语中，“琥珀酸”和“琥珀酸”应该互换使用并且两者应该涉及化合物的所有形式。名称应该对所有其他有机酸是真实的。

对于命名法，来自细菌如大肠杆菌的基因或编码区一般以斜体的三个小写字母命名，有时候后跟大写字母，例如“mdh”或“fumB”分别用于编码苹果酸脱氢酶或延胡索酸B的基因，然而基因编码的酶或蛋白质可以以相同字母命名，但是第一个字母大写而且不斜体，例如“Mdh”或“FumB”分别用于苹果酸脱氢酶和延胡索酸B酶。来自酵母，如酿酒酵母或马克思克鲁维酵母的基因或编码区一般以三个大写字母命名，有时候后跟整数，均斜体，例如“PDC1”用于编码丙酮酸脱羧酶的基因，然而基因编码的酶或蛋白质可以以相同字母命名，但是第一个字母大写而且不斜体，对于蛋白质后跟小写“p”，例如“Pdc1p”用于丙酮酸脱酸酶1。还可以通过更具描述性的名称，例如用于上文给出的实例的苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶B和丙酮酸脱羧酶1指定酶或蛋白质。当指来自特定酵母种类的基因或酶时，可以将缩写属和种的第一个字母的一对字母放到基因或酶的前面，以指定基因或酶的特定版本。例如，ScMDH1指定来自酿酒酵母的苹果酸脱氢酶同工酶1，然而KmMDH1指定来自马克思克鲁维酵母的苹果酸脱氢酶1同工酶。如果不存在小写字母来指示来自特定种类的基因或酶，例如“DIC1”，那么基因名称指来自任何和全部酵母种类的基因或酶。注意这些命名不必是唯一的，因为任何特定的命名可能不限于特定的DNA或蛋白质序列，因为任何给定的种类均可以具有许多不同的菌株，并且不同的菌株可能具有执行相同功能的不同基因或酶。此外，编码具有特定催化活性的酶的一个实例的基因或编码区可以具有若干不同的名称，因为历史上不同的起源，或因为基因来自不同的物种。

“质粒”表示环形或线形DNA分子，其基本上小于染色体，与微生物的染色体或染色体分开，并且其独立于染色体或染色体进行复制。“质粒”可以以每个细胞约1个拷贝或每个细胞多于1个拷贝存在。

“表达盒”表示这样的DNA序列，其可以是染色体或质粒的一部分，其含有至少启动子和编码酶或其他蛋白质的基因或区域，从而所述编码区通过启动子表达，并且酶或蛋白质通过含有所述DNA序列的宿主细胞产生。“表达盒”可以是至少部分合成的或通过遗传改造方法构建的，从而所述编码区从启动子表达，所述启动子与所述编码区不天然结合。任选地，“表达盒”可以含有转录终止子，其可以是或不是与编码区天然结合的终止子。“表达盒”可以含有多于一种蛋白质的编码区。在一些情况下，所述盒将仅具有一个启动子，其在DNA序列的5'末端功能偶联基因，在所述情况下其可以被称为操纵子或合成操纵子。在其他情况下，含有多于一个编码区的表达盒将具有在所述盒中功能偶联各编码区的不同启动子，从而各编码区以适当的水平在宿主菌株，如酵母菌株中表达。

基因或编码区的“过量表达”表示引起该基因或编码区编码的酶或蛋白质在宿主微生物中在相同或类似生长条件下以高于宿主微生物的野生型版本中发现的水平产生。例如这可以通过一种或多种以下方法实现：1)安装较强的启动子，2)安装较强的核糖体结合位点，3)安装终止子或较强的终止子，4)在编码区的一个或多个位点上改进密码子的选择，5)提高mRNA稳定性，和6)通过在染色体中引入多个拷贝或在多拷贝质粒上安放盒来增加基因的拷贝数。从过量表达的基因产生的酶或蛋白质称为“过量产生的”。“过量表达的”基因或“过量产生的”蛋白质可以是这样的，其对宿主微生物而言是天然的，或其可以是这样的，其已经通过遗传改造方法从供体生物移植到宿主微生物中，在所述情况下酶或蛋白质和编码所述酶或蛋白质的基因或编码区称为“外来的”或“异源的”。外来的或异源基因和蛋白质根据定义是过量表达的和过量产生的，因为它们不存在于未改造的宿主生物中。

第一个基因、DNA序列或蛋白质的“同源物”是执行与所述第一个基因、DNA序列或蛋白质类似生物功能并且如通过用于序列比较(Saliola等,2004；Altschul等,1997；Altschul等,1990)并允许缺失和插入的BLAST计算机程序测定与所述第一个基因或蛋白质具有至少25％序列同一性(当比较蛋白质序列或使用适当的遗传密码比较来自基因序列的蛋白质序列时)的第二个基因、DNA序列或蛋白质。酿酒酵母基因ScURA3的同源物的实例是来自马克思克鲁维酵母的KmURA3基因。

第一个基因、DNA序列或蛋白质的“类似物”是执行与所述第一个基因、DNA序列或蛋白质类似生物功能但是其中如通过用于序列比较(Altschul等,1990；Altschul等,1997)并允许缺失和插入的BLAST计算机程序测定与所述第一个基因、DNA序列或蛋白质具有低于25％序列同一性(当比较蛋白质序列或比较来自基因序列的蛋白质序列时)的第二个基因、DNA序列或蛋白质。例如，来自乳酸克鲁维酵母的延胡索酸酶1KlFum1p是来自大肠杆菌的FumB的类似物，因为它们两者充当延胡索酸酶，但是两种酶或其各自的基因之间没有显著的序列同源性。本领域中有知识的科学家将知道具有特定生物功能的许多酶和蛋白质，例如延胡索酸酶或苹果酸脱氢酶可以作为同源物或类似物见于许多不同生物中，并且因为该酶或蛋白质家族的成员共有相同的功能，尽管它们在结构上轻微或实质性上不同，但是使用目前遗传改造方法，同一家族的不同成员在许多情况下可以用于执行相同的生物功能。因此例如，来自马克思克鲁维酵母的KmFum1p延胡索酸酶和来自大肠杆菌的FumB延胡索酸酶催化相同的反应，所以任一种酶都可以导致延胡索酸的产生并最终导致适当程度的琥珀酸产生，并且选择使用哪一种最终可以通过选择在类似发酵条件下导致较高滴度的延胡索酸或琥珀酸的一种酶来进行。

“强组成型启动子”是这样的DNA序列，其通常位于通过RNA聚合酶转录的DNA序列或基因的上游(当以常规5’-3’方向描述时，是基因的5’一侧)并引起所述DNA序列或基因以通过任何适当测定方法直接或间接容易检测的水平通过RNA聚合酶转录而表达。适当测定方法的实例包括1)定量反转录酶加PCR，2)编码酶的酶测定，3)考马斯亮蓝染色的蛋白质凝胶，或4)因所述转录间接产生的代谢物的可测量产生，并且无论存在或缺少特异地调节转录水平的蛋白质、代谢物或诱导化学物，该可测量转录均发生。非“强组成型启动子”的启动子实例是大肠杆菌的P_lac启动子或KlLAC4基因前面的启动子，因为两个基因在缺少诱导物如乳糖的情况下均是受负调控的。通过使用本领域熟知的方法，“强组成型启动子”可以用于替换天然启动子(另外天然存在于DNA序列或基因上游的启动子)，产生表达盒，其可以置于质粒或染色体中，并且其以高于来自天然启动子的水平的水平提供想要的DNA序列或基因的表达水平。强组成型启动子对种或属可以是特异的，但是来自细菌或酵母的强组成型启动子经常可以分别在远源细菌或酵母中很好地发挥功能。例如，来自酿酒酵母的启动子可以在乳酸克鲁维酵母或马克思克鲁维酵母中很好地发挥功能(Lee等,2012)。强组成型启动子的实例是驱动编码糖酵解途径中的酶的基因、编码核糖体蛋白质的基因和编码翻译延伸因子的基因表达的启动子(Sun等,2012)。

“主要的发酵产物”表示除水或二氧化碳以外的以高于任何其他发酵产物的浓度产生的发酵产物。

可以通过本领域熟知的许多方法中的任何方法，包括在质粒文库中克隆DNA、限制性酶消化和连接、PCR扩增、在酵母中重组和使用市售试剂盒的所谓Gibson方法(例如NewEngland Biolabs,Ipswitch,MA,USA)构建或获得本文公开的质粒和基因盒。还可以通过擅长该服务的商业公司，如GeneArt(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)和DNA 2.0(Menlo Park,CA,USA)定制合成想要的DNA序列。

以下实施例旨在说明，不在限制，并且本领域技术人员将认识到许多变型在本发明范围内是可能的。

实施例1

构建含有从葡萄糖到苹果酸或延胡索酸的氧化还原平衡的微需氧途径的酵母菌株

从葡萄糖到苹果酸或延胡索酸的还原途径是氧化还原平衡的，因为糖酵解产生一摩尔的NADH/三个碳单位，并且苹果酸脱氢酶步骤消耗一摩尔的NADH。因此，在缺少其他考虑因素的情况下，细胞应该能够从葡萄糖厌氧产生苹果酸或延胡索酸。然而，来自细胞量生物合成的过量还原当量不允许其在严格厌氧条件下发生(见下文)。但是，在控制得当的微需氧条件(少于0.1体积的空气/液体体积/分钟)下，可以氧化从细胞量产生的过量NADH，以允许苹果酸和延胡索酸的生长和产生。为了产生改造的菌株(其微需氧产生苹果酸或延胡索酸)，在延胡索酸还原酶和琥珀酸脱氢酶必需的一种或多种基因中引入缺失，以防止延胡索酸在细胞质或线粒体中代谢成琥珀酸。在酿酒酵母中，这些基因被分别注释为编码琥珀酸脱氢酶的四个亚基SDH1、SDH2、SDH3和SDH4(Robinson和Lemire,1996)，和编码细胞质和线粒体延胡索酸还原酶的基因FRD1和OSM1。充分记载了在野生型背景中缺失FRD1和OSM1均导致在厌氧条件下由于不能将FADH₂再氧化成FAD而缺乏生长(Camarasa等,2007)。然而，微需氧条件将缓和该生长问题。

将编码可以催化丙酮酸(PDC)脱羧基化和延胡索酸转化成琥珀酸的酶的基因缺失后，引入基因表达盒，其赋予产生细胞质PEP羧激酶、苹果酸脱氢酶和任选地延胡索酸酶(如果延胡索酸是想要的产物)。例如，可以使用全部来自大肠杆菌的pck、mdh和fumB和/或fumC。在本发明的另一方面，可以使用来自其他细菌的基因。在优选的实施方案中，使用来自大肠杆菌的fumC，因为FumC酶不需要任何铁硫簇，而铁硫簇在酵母中在线粒体中生成(Avalos等,2013)，因此细胞质酶优选不依赖于铁硫簇。或者，可以使用酵母基因，如来自酿酒酵母的MDH2或修饰的MDH3(Zelle等,2008)和修饰的FUM1(Stein等,1994)，或其来自马克思克鲁维酵母、东方伊萨酵母或多形汉逊酵母(H.polymorpha)的同源物。本领域技术人员将知道产生苹果酸和延胡索酸之间的差异将是细胞中不表达延胡索酸酶(在该情况下将产生苹果酸)与在细胞中表达延胡索酸酶(在该情况下将产生延胡索酸以及至少一些苹果酸)之间的差异。

可以通过非同源或优选同源整合到染色体中，或通过安装含有想要的盒的复制质粒完成表达盒的安装。多于一个基因各自与其自身启动子和终止子装配成包装为本领域所熟知，所述包装可以作为一个邻接DNA序列操作用于整合到染色体或复制质粒中的(Shao等,2012)。

在单个菌株中完成缺失如上所述的基因和安装用于产生苹果酸或延胡索酸的还原途径的表达盒后，使所得的经改造菌株进行代谢进化以选择更快速的生长。代谢进化可以在化学成分确定的培养基，如补充有100g/l葡萄糖和菌株所需任何其他营养物的酵母氮源(YNB,可从Sigma Chemical Company,USA得到)中进行。pH控制设置在约pH 2到pH 5之间的微需氧发酵罐用于培养待进化的菌株，通过向约5或更多体积的新鲜培养基中加入1体积的接种物，以适当间隔(一般在约20℃-50℃的温度下生长约1天-约5天)重复制备从完全生长的发酵罐至新鲜发酵罐的连续接种。必要时重复该过程，直至获得经济上有吸引力的生长。因为产生酸，例如通过加入碳酸盐或铵、钠、钾、镁或钙的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐的混合物来完成对pH的控制。

实施例2

构建含有从葡萄糖到琥珀酸的氧化还原平衡的厌氧途径的酵母菌株

从葡萄糖的厌氧和微需氧琥珀酸生物合成比苹果酸或延胡索酸的生物合成更复杂，因为产生琥珀酸的还原途径消耗比从糖酵解获得的更多的还原当量。通过以不产生氧化还原当量的净产生或消耗的比例运行氧化和还原途径获得从葡萄糖的琥珀酸生物合成的最可能产量，该氧化还原当量一般是NADH、NADPH和FADH₂的形式，但也可能是其他化合物，如半胱氨酸、谷胱甘肽、辅酶A-SH等的形式。仅考虑从葡萄糖到琥珀酸的途径，理论上通过使约5摩尔葡萄糖通过还原途径代谢同时使约2摩尔葡萄糖通过氧化途径代谢来获得该平衡。如果并非不可能，通过使用现有技术公开的材料和方法难以安排这种精确的平衡。此外，在任何发酵方法中，包括葡萄糖到琥珀酸，必须产生细胞量，并且在厌氧条件下产生细胞量导致还原当量的净产生。在野生型酵母中，如酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属和伊萨酵母属中，其中乙醇和二氧化碳是主要的发酵产物，这些过量还原当量通过分泌甘油被处理掉。然而，分泌甘油消耗碳，其否则可用于琥珀酸、苹果酸或延胡索酸。像这样，如果还原途径与氧化途径的比例稍微高于5:2(在通过每一条途径代谢的葡萄糖摩尔方面)，那么可以实现整个细胞的氧化还原平衡，包括延胡索酸产生和细胞量产生。然而，该平衡仍然难以或不可能通过现有技术中公开的材料和方法来实现。

本发明人已经认识到上文公开的细微差别，并且已经在本文中提供了材料和方法来解决所述问题。

改造酵母从葡萄糖产生琥珀酸的第一步是产生这样的宿主菌株，其中不想要的发酵途径的通量已经减少或缺失。在酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属和伊萨酵母的酵母中，主要的发酵途径是产生乙醇(加二氧化碳)和甘油。可以通过缺失编码丙酮酸脱酸酶(EC 4.1.1.1)的所有基因降低或阻断产生乙醇的通量。酿酒酵母具有三个此类基因，ScPDC1、ScPDC5和ScPDC6。乳酸克鲁维酵母和马克思克鲁维酵母各自分别仅具有一个丙酮酸脱酸酶基因KlPDC1和KmPDC1。可以通过缺失编码甘油-3-磷酸脱氢酶(EC1.1.1.8；EC 1.1.99.5；EC1.1.1.177；EC 1.1.1.94)的所有基因降低或阻断产生甘油的通量。酿酒酵母含有三个此类基因，GUT2、GPD1和GPD2。乳酸克鲁维酵母含有两个此类基因，KlGUT2(Saliola等,2008)和KlGPD1(Neves等,2004)。马克思克鲁维酵母含有与乳酸克鲁维酵母基因同源的基因，并且其执行相同的功能。如果以这种方式阻断甘油生物合成途径，那么可以通过补给相对少量的甘油来满足细胞对甘油的需要。或者，可以通过缺失编码甘油-3-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.21)的所有基因降低或阻断产生甘油的通量。酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母和马克思克鲁维酵母各自含有名为GPP1的基因或其同源物，并且其可以缺失用于减少或消除产生甘油的通量的目的。

在优选的实施方案中，克隆并安装编码还原途径和氧化途径从葡萄糖到琥珀酸必需的所有酶的基因，以便它们全部从强的组成型启动子表达。在另一优选实施方案中，还原和氧化途径所有必需的酶指向细胞质。还原途径必需的酶包括PEP羧激酶(EC 4.1.1.49)、苹果酸脱氢酶(EC 1.1.1.37)、延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)和延胡索酸还原酶(EC 1.3.1.6)。氧化途径必需的酶包括丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)、丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.4.1)、柠檬酸合酶(EC 4.3.1.7或4.3.1.28)、顺乌头酸酶(EC 4.2.1.3)、异柠檬酸脱氢酶(EC 2.7.1.40)、-酮戊二酸脱氢酶(EC 1.2.4.2)和琥珀酰CoA合成酶，也称为琥珀酸CoA连接酶(EC 6.2.1.4或EC 6.2.1.5)。这些酶中的一些需要多于一个亚基来发挥功能，在所述情况下编码所有亚基的基因需要被克隆和表达。

可以通过本领域所熟知的许多方法的任何方法，例如在适当质粒、粘粒、噬菌粒、细菌人工染色体或酵母人工染色体中进行基因文库构建，随后使用DNA探针筛选或在适当的突变体宿主细胞中，例如细菌或酵母菌株中通过功能互补进行选择来完成对必需基因的克隆。例如来自大肠杆菌、酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的许多此类基因的DNA序列已经被发表并可以在National Center for Biotechnology Information网址,http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/上获得。对于这些情况，可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增和克隆想要的基因，然后克隆到适当的载体中。为了从生物体中获得想要基因的DNA序列或其DNA序列还未被发表的DNA序列，例如来自东方伊萨酵母或马克思克鲁维酵母的DNA序列，可以通过良好建立的方法获得完整基因组的DNA序列并通过与来自另一生物体的已知基因的同源性定位想要的基因(Altschul等,1997；Altschul等,1990)。然后可以通过PCR扩增想要的基因并克隆到适当的表达载体或表达盒中。

将每个想要的基因克隆到后，缺失或突变将天然(野生型)蛋白质指向亚细胞细胞器而非细胞质的任何序列，从而基本上防止蛋白质运输到所述细胞器中。用于完成该操作的方法为文献中所熟知。例如，已知可以缺失将蛋白质靶向线粒体基质(线粒体内室)中的N末端蛋白质序列以将蛋白质重定向到细胞质。“N末端靶向序列”也称为基质靶向序列(MTSs)，因为它们也携带N末端横跨内膜进入基质中。在缺少其他分选信息的情况下，它们将蛋白质导向基质。它们已经被相当详细地研究过，并且它们的主要特征已经知道了超过10年。它们由约10-80个氨基酸残基组成，所述氨基酸残基具有形成具有一个疏水表面和一个带正电表面的兼性螺旋的潜力。一级结构上没有共有序列，其甚至在密切相关的直向同源物之间经常很不同。然而，这些兼性螺旋的一般性质“在真菌和动物之间广泛保守”(Neuport和Hermann,2007)。一个具体的实例是由ScFUM1基因编码的野生型延胡索酸酶指向线粒体和细胞质，但是如果编码N末端17个氨基酸的DNA序列缺失，那么在线粒体中就不会发现所述酶(Stein等,1994)。通过从MDH3基因缺失编码C末端三肽序列SKL的9个碱基完成对将过氧化物酶体苹果酸脱氢酶重定向到细胞质的实例(Zelle等,2008)。

将任何细胞器靶向序列缺失或突变后，将每一个想要的酶的基因在功能上偶联组成型启动子。在优选的实施方案中，每一个想要基因偶联不同的启动子，以便基因表达盒可以一起装配在一个阵列中，而在所述阵列中不具有任何基本上重复的DNA序列，其继而使得更便于将装配的阵列整合到预期宿主菌株的染色体中或质粒中作为媒介物用于引入装配阵列。将阵列装配完后，将其安装在上文所述的宿主菌株中。在实施例11中给出了将通常是线粒体酶的酶重定向到细胞质的具体实例。

可以通过非同源或优选同源整合完成表达盒安装到染色体中，或通过安装含有想要的表达盒的复制质粒完成安装。任选地，安装表达盒可以与缺失一个或多个不想要的基因，例如KmPDC1组合，以便所述盒取代不想要的基因，实现一次完成两个想要的步骤。可以安排不想要基因的启动子以用于驱动想要基因之一的表达。例如，可以设计盒在KmPDC1基因座上的整合以给出大肠杆菌pck基因的表达，以便pck可读框精确地代替KmPDC1可读框。如果超过一个基因待从盒中表达，那么其可以被安排，以便阵列的最后一个基因在功能上偶联KmPDC1终止子。

在单个菌株中完成缺失如上所述的基因并安装用于产生琥珀酸的还原途径，优选氧化途径的表达盒后，使所得的改造菌株进行代谢进化以选择更快速的生长。代谢进化可以在化学成分确定的培养基，如补充有100g/l葡萄糖和菌株所需任何其他营养物的酵母氮源(YNB)中进行。pH控制设置在约pH 2到pH 5.6之间的微需氧发酵罐用于培养待进化的菌株，并通过向约5或更高体积的新鲜培养基中加入1体积的接种物进行从完全生长的发酵罐至新鲜发酵罐的接种。群体中发生自发突变，并且比其亲本生长得更快速的任何突变体将接替群体。必要时重复该过程，直至通过该进化过程获得经济上有吸引力的生长。因为产生酸，例如通过加入碳酸盐或铵、钠、钾、镁或钙的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐的混合物来完成对pH的控制。

实施例3

分离野生酵母菌株

通过从配备有起泡器(气阱；可从Homebrew Emporium,Cambridge,MA,USA获得)的培养摇瓶中含有5％木糖和抗生素(氯霉素，30mg/l，和氨苄青霉素，150mg/l)的1/4强度YP培养基(2.5g/l酵母提取物加54g/l蛋白胨)，pH 5中的腐烂甘蔗渣富集其生长来分离野生酵母菌株并将其在30℃下轻柔振荡温育48小时。因此，选择所得分离物以厌氧或至少微需氧(如果不是严格的厌氧)利用木糖，并且能够在低pH下生长，因为培养基是未缓冲的并且pH在培养物生长过程中自然降低。然后将富集的培养物涂布在具有氯霉素和氨苄青霉素的YP加2％木糖平板上或具有2％木糖和氯霉素以及氨苄青霉素的最小(Difco YeastNitrogen Base或“YNB”)培养基上并在30℃下需氧温育。在相同平板上纯化酵母菌落，然后通过测序rDNA大亚基的D1/D2结构域区域鉴定种类。可以从其他小生境，如发酵设备、发酵食品、污染食品、土壤、植物、湖泊、河流、海洋等分离野生酵母。

用于分离野生酵母的备选方法可以与上文段落中描述的类似，但是以约5-60g/l向培养基中加入有机酸，如琥珀酸并调整pH至约2.5-5.6。可以直接选择或从样品中富集在低pH下对低有机酸特别耐受的酵母。此外，富集培养基中的碳源可以是除木糖之外的，例如其可以是葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、淀粉、甲醇或甘油。

实施例4

通过测序编码核糖体RNA的基因鉴定野生酵母菌株

从待鉴定的酵母种类的基因组DNA中扩增rDNA大亚基的D1/D2结构域。从腐烂的甘蔗渣中获得酵母种类。在下文表1中列出了用于PCR和测序的引物。

利用引物SD123、124、125、126、129和130(表1)测序利用引物SD123和124获得的来自SD98模板DNA的PCR产物。利用引物SD127和128测序利用引物SD127和128获得的PCR产物。组合所有8条序列以获得1725bp长的邻接DNA序列，发现其与马克思克鲁维酵母菌株CHY161218S核糖体RNA基因，部分序列(Genbank ID:HQ396523.1)具有100％同一性。

酵母菌株SD108基因组DNA用作模板以利用引物SD123和SD124产生PCR产物。当利用引物SD124和SD125测序时，该PCR产物给出599bp邻接序列，其显示与东方伊萨酵母(也称为库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii))菌株NRRL Y-5396rDNA(Genbank IDEF550222.1)具有100％同一性。

实施例5

来自马克思克鲁维酵母和东方伊萨酵母种的酵母比酿酒酵母在低pH下对琥珀酸更耐受

新分离的酵母菌株马克思克鲁维酵母(SD98)和东方伊萨酵母(SD108)与标准的酿酒酵母实验室菌株(BY4742)和工业上使用的酿酒酵母酿酒菌株(Ethanol Red)比较在30℃和pH 3.3下的需氧生长。

所有四种酵母菌株从YP加2％葡萄糖平板接种到具有2％葡萄糖，pH 5的液体YP培养基中，并在30℃需氧温育过夜。读取过夜OD₆₀₀并将这些培养物用于接种3ml具有多种有机酸的各0.25x YP。最终的pH是3.3，并且起始OD₆₀₀是0.1。培养物在30℃下需氧温育46小时。在46小时时读取OD₆₀₀。也读取培养物的最终pH并且发现所有四种培养物的pH大概是3(图1)。在化学成分明确的矿物质培养基中获得了相似的结果(图2)。

实施例6

在遗传改造的马克思克鲁维酵母菌株中产生琥珀酸

来自大肠杆菌或酿酒酵母的下列基因一起整合为盒，替换马克思克鲁维酵母(SD98)染色体上的丙酮酸脱羧酶(PDC1)基因的正确可读框：来自大肠杆菌的pck(编码丙酮酸羧激酶)；来自大肠杆菌的mdh(编码苹果酸脱氢酶)；来自大肠杆菌的fumB或fumC(编码延胡索酸酶)；FRD1(编码来自酿酒酵母的延胡索酸还原酶)。编码G418抗性的kanMX标志物(Wach等,1994)也是整合盒的一部分。

上文提及的基因各自侧翼是来自马克思克鲁维酵母(Km)或酿酒酵母(Sc)的启动子和终止子序列并在下文表2中指出了合适启动子和终止子序列的代表性实例。

上述盒提供了PEP通过TCA循环的还原臂转化成琥珀酸所需要的所有酶。所有这些酶均在酵母细胞的细胞质(胞质溶胶)中表达。设计所述盒以整合到KmPDC1基因座上，以便该盒中的第一个基因pck从KmPDC1启动子转录。

为了进一步提高转化成琥珀酸的效率，根据马克思克鲁维酵母的密码子偏好改变DNA序列来进一步优化以上基因各自的表达。

上文提供的实例还可以应用于其他酸耐受性酵母菌株，如东方伊萨酵母的SD108菌株。

实施例7

为延胡索酸还原酶反应提供FADH₂

大肠杆菌和酵母中产生琥珀酸的还原途径中最后一步由延胡索酸还原酶催化，其中FADH₂作为供应还原当量的辅助因子。如上提及，细胞为了厌氧或微需氧产生琥珀酸，细胞必须组合还原和氧化途径。所述还原途径在苹果酸脱氢酶步骤消耗作为NADH的还原当量并在延胡索酸还原酶步骤消耗作为FADH₂的还原当量，然而氧化途径产生作为NADH和NADPH的还原当量。为了使用天然的延胡索酸还原酶实现氧化还原平衡，细胞必须能够从NADH和NADPH转移还原当量到FAD。开发用于琥珀酸产生的大肠杆菌菌株KJ122(Jantama等,2008a；Jantama等,2008b)含有至少三个基因，其编码可以执行该功能的酶。hpaC基因存在于大肠杆菌C、大肠杆菌W和大肠杆菌B中(Galan等,2008；Roper等,1993)，fre基因(也称为ubiB)存在于大肠杆菌的大多数或所有菌株中(Louie等,2002；Louie等,2003；Niviere等,1999)。这些基因均编码NAD(P)H-黄素氧化还原酶(也称为FAD:NADH还原酶、FAD:NADPH还原酶或简单地FAD还原酶)，其利用NADH或NADPH贡献的还原当量将FAD再负荷成FADH₂。已知执行该功能的另一酶是cysJ编码的大肠杆菌亚硫酸盐还原酶的α亚基，已知其使用NADPH作为底物用于还原FAD(Coves等,1993；Eschenbrenner等,1995)。然而，不知道酵母含有该酶(Camarasa等,2007)。像这样，FAD还原酶的重要功能需要通过在被改造以产生琥珀酸的酵母菌株中安装和表达(如本文其他地方为其他异源基因所描述)hpaC基因或fre基因或具有相似功能的同源或类似基因来提供。等同基因包括但不限于，来自荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)的prnF基因(Tiwari等,2012)、来自大肠杆菌W的hpaC基因(Galan等,2008；Roper等,1993)、来自大肠杆菌的fre基因(Louie等,2002；Louie等,2003；Niviere等,1999)或来自大肠杆菌的cysJ基因(Coves等,1993；Eschenbrenner等,1995)。提供FAD还原酶以在厌氧琥珀酸产生过程中允许氧化还原平衡的这种原则不仅广泛应用于酵母，还应用于被改造用于高水平琥珀酸产生的任何其他微生物。此类基因的来源也可以广泛变化，唯一的要求是所述基因在被改造用于琥珀酸产生的微生物中提供充足的FAD还原酶活性。如果其中FAD:NADH还原酶不能充分地使用NADPH作为还原当量的供体，那么也安装和表达一个或多个编码大肠杆菌的pntA加pntB基因编码的转氢酶(如膜结合的酶(EC 1.6.1.2))的基因，或编码可溶性转氢酶(EC 1.6.1.1)的sth基因(也称为udhA)是必要的(Cao等,2011；Nissen等,2001；Anderlund等,1999)。

实施例8

酸耐受酵母产生D-乳酸

近期已经显示来自凝结芽孢杆菌的甘油脱氢酶具有进化成具有从丙酮酸产生D-乳酸的新活性的能力(Wang等,2011)。在凝结芽孢杆菌中编码甘油脱氢酶(EC 1.1.1.6)的基因命名为gldA，而进化形式命名为gldA101。可以通过缺失在乙醇产生中发挥功能的一种或多种基因(例如ScPDC1、SCPDC5和ScPDC6，或KmPDC1，或IoPDC1)并安装表达gldA101基因或其同源物或类似物的表达盒将酵母从乙醇生产者转变成D-乳酸生产者。所得酵母菌株然后可以如上进行代谢进化以增加生长和D-乳酸的生产力。可以使用BLAST搜索利用默认参数在公共数据库中发现与凝结芽孢杆菌的gldA同源的许多基因(Altschul等,1990；Altshcul等,1997)并且其如所述进行进化(Wang等,2011)。对低pH特别耐受的酵母菌株(如本文所述的那些)是使用该方法产生D-乳酸的优选宿主菌株。

实施例9

酸耐受酵母产生D-乳酸

作为实施例9的备选，可以通过缺失在乙醇产生中发挥功能的一种或多种基因(例如ScPDC1、SCPDC5和ScPDC6，或KmPDC1，或IoPDC1)并安装表达大肠杆菌ldhA基因或其同源物或类似物(编码D-乳酸脱氢酶，其为催化丙酮酸加NADH转化成D-乳酸加NAD的酶；EC1.1.1.28)的表达盒将酵母从乙醇生产者转变成D-乳酸生产者。所得酵母菌株然后可以如上所述进行代谢进化以增加生长、生产速率和对高浓度D-乳酸的耐受性。可以使用BLAST搜索利用默认参数在公共数据库中发现与大肠杆菌的ldhA同源的许多基因(Altschul等,1990；Altshcul等,1997)并且其如所述进行进化(Jantama等,2008)。对低pH特别耐受的酵母菌株(如本文所述的那些)是使用该方法产生D-乳酸的优选宿主菌株。

在一个实例中，通过来自大肠杆菌C的ldhA基因的可读框将马克思克鲁维酵母菌株SD98的PDC1基因的可读框精确置于染色体中，并且将PDC1终止子保持在原位置。在终止子下游安装kanMX盒(Wach等,1994)，随后是天然存在于紧靠PCD1终止子下游的DNA序列，以提供同源性用于同源重组到马克思克鲁维酵母染色体中。构建含有该盒的质粒命名为pSD57(SEQ ID No.1)。通过PCR使用引物SD336和SD343从该质粒上产生线性DNA片段，并且使用200mg/L抗生素G418(也称为遗传霉素)的选择用来转化SD98，以产生新的菌株分离物。通过诊断PCR使用相同的引物在分离物亚组中证实正确的想要的基因替换。在含有抗生素G418的平板上重新划线若干分离物后，获得产生D-乳酸而非乙醇的分离物。通过诊断PCR证实的该纯合二倍体分离物命名为SD517。

使用含有100g/L葡萄糖并补充有10微克/L生物素、1mg/L烟酸和1mg/L盐酸硫胺素的成分明确的培养基(Difco Yeast Nitrogen Base)并在270RPM下搅拌在37℃小规模(200ml)微需氧发酵罐中培养SD517。将pH设置为5.0并在需要时通过加入2M KOH来进行控制。在192小时内产生15g/l D-乳酸。

在192小时时从发酵罐中分离单菌落并命名为SD517-1-2。该新菌株在192小时内类似发酵中产生30g/l D-乳酸，表明所述菌株已经进化了更快的生长、更多的D-乳酸产生和或对D-乳酸更高的耐受性。从该发酵结束时分离的单菌落命名为SD517-D1。

利用命名为SD517-D1的新菌落分离菌株将上文段落中描述的方法重复一次，除了向培养基中加入麦角固醇(20mg/L终浓度)和Tween 80(终浓度0.05％)的额外改变外。SD517-D1在168小时内产生38g/l D-乳酸。利用2M KOH控制pH，最终设置点为pH 3.5。实际最终pH是3.9。同样，较高的滴度表明可能已经发生了额外的进化，并且同样从发酵结束时挽救了单菌落并命名为SD541。

除了以15ml/分钟(0.05体积/体积/分钟或VVM)供应空气外，重复上文段落中描述的发酵方法。在48小时时，已经产生49g/l D-乳酸(参见图3)，并且pH已经降至3.8。在48小时时从发酵罐中分离单菌落并命名为SD542。同样，较高的滴度表明已经发生额外的进化。

实施例10

酸耐受酵母产生琥珀酸

构建基因表达盒以编码产生足以提供从PEP(磷酸烯醇丙酮酸)到琥珀酸的还原TCA途径的四种酶，即PEP羧激酶(EC 4.1.1.49)、苹果酸脱氢酶(EC 1.1.1.37)、延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)和延胡索酸还原酶(EC 1.3.1.6)。在表2中列出了所用的基因、启动子和终止子。将kanMX盒构建到两个基因之间的盒中间。在图4中显示了盒的结构。将盒构建到命名为pSD59fumC(SEQ ID No.2)的质粒中。通过PCR，使用引物SD390和SD392从作为模板的该质粒产生线性DNA片段。将线性DNA片段转化到菌株SD98中，在200mg/L选择抗生素G418抗性。将转化的分离物重新划线到含有G418的平板上后，通过诊断PCR鉴定纯合二倍体分离物并命名为SD631，其含有正确整合到两条同源染色体中PDC1基因座上的琥珀酸生物合成盒。还构建仅在PDC1基因座含有编码对抗生素G418抗性的kanMX盒的纯合二倍体对照菌株并命名为SD565。SD565不含有被改造的琥珀酸基因盒。

使用含有100g/L葡萄糖并补充有10微克/L生物素、1mg/L烟酸和1mg/L盐酸硫胺素的成分明确的培养基(Difco Yeast Nitrogen Base)在37℃下200ml发酵罐中微需氧培养SD565和SD631。允许pH降至pH 5.0，然后利用2M碳酸氢铵维持在pH 5.0。以15ml/分钟供应空气并以6ml/分钟供应二氧化碳。搅拌维持在270RPM。在144小时内，SD631产生4.7g/L琥珀酸，而SD565仅产生0.5g/L，表明SD631中的基因盒根据设计来发挥功能(参见图5)。

可以进一步改造菌株SD631以在细胞质中含有如下文实施例11中所述的TCA循环的氧化和还原分支所必需的所有酶。菌株SD631及其衍生物可以通过如为大肠杆菌琥珀酸生产者所述在连续的小型发酵罐中转移接种物来进化以产生较高的琥珀酸滴度、生产速率和对琥珀酸的耐受性(Jantama等,2008)。在进化过程中pH设置点可以降低，以选择能够在低pH产生并积累琥珀酸的菌株。

实施例11

线粒体酶重定向到细胞质

在酵母中，天然发现于线粒体中的酶通过胞质翻译多肽的N末端上的信号序列指向到线粒体中(Vogtle等,2009)。通过缺失编码信号序列的DNA缺失该信号序列导致酶的胞质定位(Hurt等,1987)。通过推广，本领域熟知的是可以通过缺失信号序列改造从细胞质天然指向线粒体的任何给定酶以保留在细胞质中。本文中将给出一个具体实例。编码线粒体异柠檬酸脱氢酶(TCA循环氧化分支的一个酶)的IDH1基因的初始翻译产物的氨基末端序列是MLNRTIAKRTLATAAQAER。线粒体中相应的成熟异柠檬酸脱氢酶的氨基末端序列是LATAAQAER。因此，缺失DNA序列CTTAACAGAACAATTGCTAAGAGAACT将产生具有以MLATAAQER…的氨基酸末端开始的初始翻译产物的截短多肽，因为其缺少线粒体信号序列而保留在细胞质中。通过将该方法推广，TCA循环还原或氧化分支的任何酶均可以重定向到细胞质。氧化途径必需的线粒体酶包括丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.4.1)、柠檬酸合酶(EC 4.3.1.7or4.3.1.28)、顺乌头酸酶(EC 4.2.1.3)、异柠檬酸脱氢酶(EC 2.7.1.40)、-酮戊二酸脱氢酶(EC 1.2.4.2)和琥珀酰CoA合成酶，也称为琥珀酸CoA连接酶(EC 6.2.1.4或EC 6.2.1.5)。这些酶中的一些酶需要多于一个亚基来发挥功能，在所述情况下，需要克隆并表达编码所有亚基的基因。编码这些酶和亚基的基因包括，但不限于ScPDA1、ScPDB1、ScPDX1、ScLPD1、ScCIT1、ScCIT2、ScACO1、ScIDH1、ScKGD1、ScKGD2、ScLSC1、ScLSC2，以及来自其他酵母，如马克思克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、东方伊萨酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的相关同源物和类似物。

备选方法是利用来自细菌，如大肠杆菌、反刍动物细菌(放线杆菌(Actinobacillus)、Mannheimia、Basfia等等)，或其他细菌的基因和酶。因为细菌不具有线粒体，异源酶及其亚基将被表达并且保留在酵母的细胞质中。如果所需要的酶在酵母线粒体基因组中天然编码，优选方法是使用用于这种情况的细菌基因和酶，因为线粒体信号序列将不存在于天然蛋白质中，所以将其重定向到细胞质中将会更困难。

可以在任何合适的酵母菌株中实践本文公开的发明，所述酵母菌株具有比酿酒酵母在低pH下更耐受有机酸的性质。例如，Candida magnolia将是合适的宿主菌株(Zhang等,2011)。

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Claims

1.克鲁维酵母属的遗传改造的酵母细胞，其在低pH下耐受有机酸，其中从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的还原途径必需的酶以足以在厌氧或微需氧条件下产生琥珀酸作为发酵产物的水平存在于细胞质中，其中细胞质中运行的所述还原途径包含磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶和延胡索酸还原酶并且编码所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶和延胡索酸还原酶的至少一种基因插入丙酮酸脱羧酶基因座。

2.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其进一步包含选自丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的额外羧化酶。

3.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其进一步包含编码从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的氧化途径必需的胞质酶的一种或多种基因，其中在细胞质中运行的所述氧化途径包含选自丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，柠檬酸合酶，顺乌头酸酶，异柠檬酸脱氢酶，α-酮戊二酸脱氢酶和琥珀酰-CoA合成酶的一种或多种异源酶并且编码所述异源酶的至少一种基因插入丙酮酸脱羧酶基因座。

4.权利要求3的遗传改造的酵母细胞，其中编码从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的氧化和还原途径必需的所述胞质酶的一种或多种基因来自酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属或伊萨酵母属的酵母。

5.权利要求3的遗传改造的酵母细胞，其中编码从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的氧化和还原途径必需的所述胞质酶的一种或多种基因来自细菌基因。

6.权利要求3的遗传改造的酵母细胞，其中编码从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的氧化和还原途径必需的所述胞质酶的一种或多种基因来自埃希氏菌属、放线杆菌属、Mannheimia或Basfia属的细菌。

7.权利要求3的遗传改造的酵母细胞，其中编码从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的氧化和还原途径必需的所述胞质酶的一种或多种基因来自大肠杆菌基因。

8.权利要求3的遗传改造的酵母细胞，其中所述氧化途径和还原途径在不使用乙醛酸旁路的酶的情况下运转。

9.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其中所述延胡索酸酶不含有铁硫簇。

10.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其中所述延胡索酸酶由大肠杆菌fumC基因编码。

11.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其中所述遗传改造的酵母细胞是代谢上进化的。

12.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其进一步包含在负责将琥珀酸从细胞质转运到线粒体中的二羧酸转运蛋白中的突变。

13.权利要求12的遗传改造的酵母细胞，其中所述二羧酸转运蛋白由DIC1基因或SFC1基因编码。

14.生产琥珀酸的方法，其包括培养权利要求13的遗传改造的酵母细胞并收获所述琥珀酸的步骤。

15.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其中所述遗传改造的酵母细胞进一步包含编码有利于还原当量在所述遗传改造的酵母细胞的线粒体和细胞质之间交换的蛋白质的至少一种基因。

16.权利要求15的遗传改造的酵母细胞，其中编码有利于还原当量在线粒体和细胞质之间交换的蛋白质的所述基因来自编码天冬氨酸-苹果酸穿梭的基因、编码甘油-3-磷酸脱氢酶穿梭的基因和编码醇脱氢酶穿梭的基因。

17.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其产生对FAD还原酶具有增加的活性的琥珀酸。

18.权利要求17的遗传改造的酵母细胞，其包含编码FAD还原酶的一种或多种异源基因。