JP2015528312A - 低pH条件下での発酵による有機酸の生産 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年9月14日に出願された米国仮特許出願第61/701,293号に基づく優先権の利益を主張する。
本発明は、再生可能な炭素源を有用な化合物に変換する能力を増強するために遺伝子組み換えされた生体触媒を用いて、再生可能な化学原料を生産する技術分野に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子組み換え生体触媒を用いて、再生可能な炭素源からコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、および乳酸のような有機酸を生産する方法を提供する。
コハク酸(本明細書中、“コハク酸(succinate)”とも言う)は、動物飼料、可塑剤、凝固剤(congealer)、ポリマー、繊維、およびプラスチックを含む種々の製品、とりわけ、コハク酸ポリブチル(“コハク酸ポリブチレン”、“ポリ(コハク酸ブチレン)”および“PBS”とも言う)の製造において、既に大量に化学的に使用されているか、または使用される可能性がある。コハク酸から製造されるポリマーの多くは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、およびポリエチレンテレフタレート(PET)のような石油由来の他のポリマーより遙かに迅速に生分解され得る。そのようなものとして、コハク酸から製造されたプラスチックは、それらが埋立地または他の堆肥化環境においてより迅速に腐敗し得るため、非常に望ましい(Kunioka et al., 2009)。この特性は、単量体サブユニットが、生きている生物では通常豊富には見出されない石油化学的に誘導された化合物ではなく、生物学的に誘導された化合物またはその化学的均等物である、多くの他のポリマーおよびプラスチック類に当てはまる。例えば、フマル酸(fumarate)、リンゴ酸(malate)、アジピン酸(adipate)、L−乳酸、D−乳酸、および他の天然物である有機酸に由来するポリマーは全て、堆肥化環境において、多くの石油化学的に誘導されたポリマーより容易に分解される。そのようなものとして、人類の利益ために、現在の石油化学製品から製造されたポリマーおよびプラスチックを生化学的製品(生物により製造および/または代謝された化合物)から製造されたポリマーおよびプラスチックに置き換えることが望ましい。
本明細書に記載の本発明は、低pHでの発酵により、再生可能な炭素源から出発して、コハク酸(コハク酸)、リンゴ酸(リンゴ酸)、D−乳酸、L−乳酸(乳酸)およびフマル酸(フマル酸)のような有機酸を生産する遺伝子組み換え微生物を提供する。好ましい態様において、微生物は、低pHにおいて所望の有機酸に対して、S.セレビシエ株よりも耐性の野生型酵母の誘導株である。より好ましい態様において、野生株は、クリベロマイセス・マーキシアヌ種またはイサタケンキア・オリエンタリス種のものであり、誘導株は、遺伝子組み換えされている。
定義
本明細書で用いる用語“例えば”または“のような”は、主題のための2以上の方法、アプローチ、溶液、または組成物があることを示すことを意図し、記載される例は、その例に限定されることを意味しない。
グルコースからリンゴ酸またはフマル酸への酸化還元均衡のとれた微好気的経路を含む酵母株の構築
グルコースからリンゴ酸またはフマル酸への還元経路は、解糖が、3炭素単位当たり1分子のNADHを生じ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ工程が1分子のNADHを消費するため、酸化還元均衡がとれている。従って、他の考察の不存在下では、細胞は、嫌気的にグルコースからリンゴ酸またはフマル酸を生産することができるはずである。しかしながら、細胞塊生合成からの余分な還元当量が、完全な嫌気性条件下でこれを可能にするのを妨げる(以下参照)。しかしながら、よく制御された微好気性条件(1分当たり、液体量当たり、0.1未満の空気容量)下で、細胞塊から生成された余分なNADHは、増殖およびリンゴ酸およびフマル酸の生産を可能にするために酸化され得る。微好気的にリンゴ酸またはフマル酸を生産する遺伝子組換え株を作製するために、フマル酸レダクターゼおよびコハク酸デヒドロゲナーゼに必要な1つまたはそれ以上の遺伝子に欠失を導入して、細胞質またはミトコンドリアの何れかにて、フマル酸がコハク酸に代謝されることを阻止する。サッカロミセス・セレビシエにおいて、これらの遺伝子は、コハク酸デヒドロゲナーゼをコード化する、4つのサブユニットについてのSDH1、SDH2、SDH3、およびSDH4(Robinson and Lemire, 1996)、ならびに細胞質およびミトコンドリアのフマル酸レダクターゼのそれぞれをコード化する遺伝子についてのFRD1およびOSM1として解説される。野生型バックグラウンドにおけるFRD1およびOSM1の両方の欠失は、FADH2をFADに再度酸化することができないため、嫌気性条件下での増殖欠如をもたらすことが十分に立証されている(Camarasa et al., 2007)。しかしながら、微好気性条件は、この増殖の問題を軽減し得る。
グルコースからコハク酸への酸化還元均衡のとれた嫌気的経路を含む酵母株の構築
グルコースからの嫌気的および微好気的コハク酸生合成は、コハク酸への還元経路が、解糖から得られ得る還元当量よりも多くの還元当量を消費するため、リンゴ酸またはフマル酸への経路よりも複雑である。グルコースからのコハク酸生合成の考えられる最良の収率は、通常、NADH、NADPH、およびFADH2の形態であるが、システイン、グルタチオン、コエンザイムA−SHなどのような他の化合物の形態でも有り得る酸化還元当量のような、酸化還元当量の新規生産または消費を結果として生じない比率で酸化および還元経路を実行することにより得られる。グルコースからコハク酸への経路のみを考慮すると、この均衡は、理論上、還元経路を介して約5モルのグルコースが代謝され、同時に酸化経路を介して約2モルのグルコースが代謝されることにより得られる。不可能でない場合、先行技術文献に記載される材料および方法を用いてこの正確な均衡をとることは困難である。さらに、グルコースからコハク酸への発酵を含む何れかの発酵法において、細胞塊の構築が必要とされ、嫌気性条件下での細胞塊の構築は還元当量の新規生産をもたらす。サッカロミセス属、クリベロマイセス属、カンジダ属、およびイサタケンキア属のような野生型の酵母においては、エタノールおよび二酸化炭素が主要な発酵産物であり、これらの余分な還元当量は、グリセロールを分泌することにより処分される。しかしながら、グリセロールの分泌は、コハク酸、リンゴ酸またはフマル酸に他の形で使用される炭素を失わせる。そのようなものとして、還元対酸化経路の比率が5:2よりわずかに高いとき(各経路を介して代謝されるグルコースモル量について)、コハク酸生産および細胞塊生産を含む細胞全体の酸化還元均衡が達成され得る。しかしながら、再度述べるが、先行技術文献に記載される材料および方法によって、この均衡が達成するのは困難または不可能である。
野生型酵母株の単離
野生型酵母株を、5%キシロースおよび抗生物質(クロラムフェニコール、30mg/l、およびアンピシリン、150mg/l)を含む、1/4強度のYP培地(2.5g/l 酵母抽出物+54g/l ペプトン)中、pH5にて、バブラー管(ガストラップ;Homebrew Emporium, Cambridge, MA, USAより市販されている)を装着した振とうフラスコ中で腐敗サトウキビバガスサンプルから、その増殖物を富化により分離し、30℃にて48時間穏やかに振とうしながらインキュベートした。こうして得られた分離株を、培地がバッファリングされておらず、pHが培養物の増殖中に自然に低下するため、キシロースを利用して嫌気的または少なくとも微好気的に、厳密に嫌気的にではなく、そして低pHで増殖できるように選択した。次いで、富化培養物を、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを添加したYP+2%キシロースプレートまたは2%キシロースおよびクロラムフェニコールおよびアンピシリンを添加した最小(Difcoの酵母窒素ベース、または“YNB”)培地のいずれかにプレーティングし、30℃にて好気的にインキュベートした。酵母クローンを同じプレート上で精製し、次いで、該種をrDNAの大サブユニットのD1/D2ドメイン領域の配列決定により同定した。野生株酵母は、発酵施設、発酵食品、汚染食品、土壌、植物、湖、川、海などのような他のニッチから分離され得る。
リボソームRNAをコードする遺伝子を配列決定することによる、野生の酵母株の同定
rDNAの大サブユニットのD1/D2ドメインを、同定されるべき酵母種のゲノムDNAから増幅させた。酵母種は、腐敗バガスから入手した。PCRおよび配列決定に用いるプライマーを、以下の表1に記載する。
クリベロマイセス・マーキシアヌ種およびイサタケンキア・オリエンタリス種からの酵母は、低pHにてコハク酸に対してS.セレビシエよりも耐性である
新たに分離された酵母株クリベロマイセス・マーキシアヌ(SD98)およびイサタケンキア・オリエンタリス(SD108)を、標準的実験室株であるサッカロミセス・セレビシエ(BY4742)および産業的に使用されている蒸留酒酵母であるサッカロミセス・セレビシエ(エタノールレッド)と、30℃およびpH3.3での好気的増殖について比較した。
K.マーキシアヌの遺伝子組み換え株におけるコハク酸の生産
大腸菌またはサッカロミセス・セレビシエからの以下の遺伝子は、クリベロマイセス・マーキシアヌの染色体上のピルビン酸デカルボキシラーゼ(PDC1)遺伝子(SD98)の正確なオープンリーディングフレームを置き換えるカセットとして共に統合されている:大腸菌からのpck(ピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする);大腸菌からのmdh(リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする);大腸菌からのfumBまたはfumC(フマラーゼをコードする);FRD1(サッカロミセス・セレビシエからのフマル酸レダクターゼをコードする)。G418耐性についてのkanMXマーカーをコードする遺伝子(Wach et al., 1994)もまた、統合カセットの一部である。
フマル酸レダクターゼ反応のためのFADH2供給
大腸菌および酵母の両方におけるコハク酸への還元経路での最後の工程は、還元当量を供給する補因子としてのFADH2を用いてフマル酸レダクターゼにより触媒される。上記の通り、コハク酸を嫌気的または微好気的に生産する細胞のために、該細胞は、還元経路および酸化経路の両方を組み合わせる必要がある。還元経路は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ工程でのNADHおよびフマル酸レダクターゼ工程でのFADH2などの還元当量を消費し、一方、酸化経路は、NADHおよびNADPHなどの還元当量を生産する。酸化還元均衡を天然のフマル酸レダクターゼを用いて達成するために、細胞は、NADHおよびNADPHからFADへの還元当量の移動を可能にするはずである。KJ122、コハク酸生産のために開発された大腸菌株(Jantama et al., 2008a ; Jantama et al., 2008b)は、この機能を果たし得る酵素をコード化する少なくとも3つの遺伝子を含む。hpaC遺伝子は、大腸菌C、大腸菌W、および大腸菌Bに存在し(Galan et al., 2008; Roper et al., 1993)、fre遺伝子(ubiBとしても公知)は、殆どまたは全ての大腸菌株に存在する(Louie et al., 2002; Louie et al., 2003; Niviere et al., 1999)。これらの両方の遺伝子は、NAD(P)H−フラビンオキシドレダクターゼ(FAD:NADHレダクターゼ、FAD:NADPHレダクターゼ、または単純にFADレダクターゼとしても公知)をコードしており、NADHまたはNADPHから供与される還元当量を用いてFADをFADH2に戻す機能を果たす。この機能を行うことが知られているさらに別の酵素は、cysJによってコード化される大腸菌亜硫酸レダクターゼのアルファサブユニットであり、FADの還元のための基質としてNADPHを使用することが知られている(Coves et al., 1993; Eschenbrenner et al., 1995)。しかしながら、酵母は、そのような酵素を含むことが知られていない(Camarasa et al., 2007)。このように、FADレダクターゼの重要な機能は、コハク酸を生産するように作製された酵母株に、hpaC遺伝子、またはfre遺伝子、または同様の機能を有する相同もしくは類似の遺伝子(他の異種遺伝子については本明細書の他の箇所に記載される通りである)を挿入し、発現させることにより、供給される必要がある。等価な遺伝子としては、シュードモナス・フルオレッセンスからのprnF遺伝子(Tiwari et al., 2012)、大腸菌WからのhpaC遺伝子(Galan et al., 2008; Roper et al., 1993)、大腸菌からのfre遺伝子(Louie et al., 2002; Louie et al., 2003; Niviere et al., 1999)、または大腸菌のcysJ遺伝子(Coves et al., 1993; Eschenbrenner et al., 1995)が含まれるが、これらに限定されない。嫌気的コハク酸生産の際に酸化還元均衡を可能にするためにFADレダクターゼを提供するこの原理は、酵母のみでなく、高レベルのコハク酸生産のために作製された何れか他の微生物にも広く適用することができる。かかる遺伝子の供給源はまた多岐に亘り、唯一の必要条件は、遺伝子が、コハク酸生産のために作製された微生物において適当なFADレダクターゼ活性を提供することである。FAD:NADHレダクターゼが、還元当量の供与体としてNADPHを十分に使用することができない場合、トランスヒドロゲナーゼ(大腸菌のpntA+pntB遺伝子によりコード化される膜結合酵素(EC1.6.1.2)のような)をコード化する1つまたはそれ以上の遺伝子、または可溶性トランスヒドロゲナーゼ(EC1.6.1.1)をコード化するsth遺伝子(udhAとしても公知)を挿入し、発現させる必要がある(Cao et al., 2011; Nissen et al., 2001; Anderlund et al., 1999)。
酸耐性酵母によるD−乳酸の生産
バシラス・コアギュランス由来のグリセロールデヒドロゲナーゼは、ピルビン酸からD−乳酸を生産する新規の活性を有するように進化される可能性を有することが、最近、示された(Wang et al., 2011)。B.コアギュランスにおけるグリセロールデヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.6)をコード化する遺伝子は、gldAと呼ばれ、その進化形がgldA101と呼ばれる。酵母は、エタノール生産にて機能する1つまたはそれ以上の遺伝子(例えば、ScPDC1、SCPDC5、およびScPDC6、またはKmPDC1、またはIoPDC1)を欠失させ、gldA101遺伝子またはその相同体もしくは類縁体を発現する発現カセットを挿入することにより、エタノール生産体からD−乳酸生産体への転換が可能になる。次いで、得られた酵母株を、上記の通り、増殖およびD−乳酸の生産を高めるために代謝的進化させる。B.コアギュランスのgldAに相同な多くの遺伝子が、デフォルトパラメータを含むBLASTサーチを用いて公開されたデータベースに見出され得て(Altschul et al., 1990; Altshcul et al., 1997)、記載の通りに進化されている(Wang et al., 2011)。本明細書に記載のような低pHに特に耐性の酵母株は、この方法を用いてD−乳酸を生産するための好ましい宿主株である。
酸耐性酵母によるD−乳酸の生産
実施例9の別法として、酵母は、エタノール生産において機能する1つまたはそれ以上の遺伝子(例えば、ScPDC1、SCPDC5、およびScPDC6、またはKmPDC1、またはIoPDC1)を欠失させ、D−乳酸デヒドロゲナーゼ(ピルビン酸+NADHのD−乳酸+NADへの変換を触媒する酵素;EC1.1.1.28)をコード化する大腸菌のldhA遺伝子、またはその相同体もしくは類縁体を発現する発現カセットを挿入することにより、エタノール生産体からD−乳酸生産体へ変換され得る。次いで、得られた酵母株を、上記の通り、増殖、D−乳酸の生産率および高濃度のD−乳酸に対する耐性を高めるために代謝的進化させ得る。大腸菌のldhAに相同な多くの遺伝子が、デフォルトパラメータを含むBLASTサーチを用いて公開されたデータベースに見出され得て(Altschul et al., 1990; Altshcul et al., 1997)、記載の通りに進化されている(Jantama et al., 2008)。本明細書に記載のような低pHに特に耐性の酵母株は、この方法を用いてD−乳酸を生産するための好ましい宿主株である。
酸耐性酵母によるコハク酸の生産
遺伝子カセットは、PEP(ホスホエノールピルビン酸)からコハク酸への還元的TCA経路を提供するのに十分な4種の酵素、すなわちPEPカルボキシキナーゼ(EC4.1.1.49)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.37)、フマラーゼ(EC4.2.1.2)、およびフマル酸レダクターゼ(EC1.3.1.6)の生産をコードするように構築された。用いた遺伝子、プロモーター、およびターミネーターを、表2に列記した。kanMXカセットは、2つの遺伝子間のカセットの中間に設けられた。カセットの構造は図4に示す。カセットは、pSD59fumC(配列番号2)と呼ばれるプラスミド中に設けられた。直鎖状DNAフラグメントを、プライマーSD390およびSD392を用いてPCRによりテンプレートとしてこのプラスミドから作製した。直鎖状DNAフラグメントを、株SD98中に形質転換し、200mg/L濃度の抗生物質G418に対する耐性で選択した。形質転換した分離株をG418含有プレート上に再度画線した後、両相同染色体中のPDC1遺伝子座に正確に組み込まれたコハク酸生合成カセットを含むホモ接合二倍体の分離株は、診断的PCRにより同定され、SD631と呼ばれた。PDC1遺伝子座における、抗生物質G418に対する耐性をコードする、唯一のkanMXカセットを含むホモ接合二倍体の対照株もまた構築され、SD565と呼ばれた。SD565は、作製されたコハク酸遺伝子カセットを含んでいなかった。
ミトコンドリアの酵素の細胞質への再局在化
酵母では、ミトコンドリア中に天然に見出される酵素は、細胞質中で翻訳されるポリペプチドのN末端上のシグナル配列によりミトコンドリアに移行される(Vogtle et al., 2009)。このシグナル配列をコード化するDNAを欠失することによる、該シグナル配列の欠失は、該酵素の細胞質局在をもたらす(Hurt et al., 1987)。一般的に、細胞質からミトコンドリアに天然で移行される任意の酵素は、シグナル配列を欠失することにより細胞質内に残るように操作され得ることが、当技術分野で周知である。1つの具体例を本明細書に記載する。ミトコンドリアのイソクエン酸デヒドロゲナーゼ(TCA回路の酸化的分岐の酵素の1つ)をコード化するIDH1遺伝子の最初の翻訳産物のアミノ末端配列は、MLNRTIAKRTLATAAQAERである。ミトコンドリアにおける対応する成熟イソクエン酸デヒドロゲナーゼのアミノ末端配列は、LATAAQAERである。従って、DNA配列 CTTAACAGAACAATTGCTAAGAGAACTの欠失は、MLATAAQER…のアミノ末端で始まる最初の翻訳産物の短縮ポリペプチドをもたらし、それは、ミトコンドリアのシグナル配列を欠くため、細胞質中に残り得る。この方法を一般化することにより、TCA回路の還元または酸化的分岐の酵素のいずれかは、細胞質に再局在化され得る。酸化経路に必要なミトコンドリアの酵素としては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.2.4.1)、クエン酸シンターゼ(EC4.3.1.7または4.3.1.28)、アコニターゼ(EC4.2.1.3)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC2.7.1.40)、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、(EC1.2.4.2)およびコハク酸−CoAリガーゼとしても公知のスクシニル-CoAシンセターゼ(EC6.2.1.4またはEC6.2.1.5)が含まれる。これらの酵素のいくつかは、その機能に2以上のサブユニットを必要とし、その場合、全てのサブユニットをコード化する遺伝子がクローニングされ、発現される必要がある。これらの酵素およびサブユニットをコード化する遺伝子としては、ScPDA1、ScPDB1、ScPDX1、ScLPD1、ScCIT1、ScCIT2、ScACO1、ScIDH1、ScKGD1、ScKGD2、ScLSC1、ScLSC2、ならびにK.マーキシアヌ、K.ラクティス、イサタケンキア・オリエンタリス、ピチア・パストリス、およびハンゼヌラ・ポリモルファのような他の酵母由来の関連相同体および類縁体が含まれるが、これらに限定されない。
Claims (40)
- ホスホエノールピルビン酸からコハク酸(succinate)への酸化および還元経路の両方で必要とされる酵素が、コハク酸が嫌気性条件または微好気性条件下で発酵生産されるような均衡のとれた方法で該酸化経路および還元経路を実行するのに十分なレベルで細胞質中に存在する、遺伝子組み換え酵母細胞。
- ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを含む群から選択されるカルボキシル化酵素をさらに含む、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 該酵母細胞が、サッカロミセス属、ピチア属、ハンゼヌラ属、イサタケンキア属、カンジダ属またはクリベロマイセス属のものである、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる該細胞質内の酵素をコード化する1つまたはそれ以上の遺伝子が、酵母遺伝子由来である、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる該細胞質内の酵素をコード化する1つまたはそれ以上の遺伝子が、サッカロミセス属、クリベロマイセス属、カンジダ属、ピチア属、ハンゼヌラ属またはイサタケンキア属の酵母由来である、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる該細胞質内の酵素をコード化する1つまたはそれ以上の遺伝子が、細菌遺伝子由来である、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる該細胞質内の酵素をコード化する1つまたはそれ以上の遺伝子が、エシェリキア属、アクチノバチルス属、マンヘミア属、またはバスフィア属の細菌由来である、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる該細胞質内の酵素の1つまたはそれ以上の遺伝子が、大腸菌遺伝子由来である、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 該酸化経路および還元経路が、グリオキシル酸短絡回路の酵素を使用することなく実行される、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる該細胞質内の酵素が、PEPカルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、フマル酸レダクターゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼおよびスクシニルCoAシンセターゼを含む群から選択される、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 該酵素フマラーゼが、鉄−硫黄クラスターを含まない、請求項10に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 該フマラーゼが、大腸菌fumC遺伝子によりコードされている、請求項10に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 該遺伝子組み換え酵母細胞が、代謝的に進化している、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 細胞質からミトコンドリアへのコハク酸の輸送に関与するジカルボキシレートトランスポーターに変異をさらに含む、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 該ジカルボキシレートトランスポーターが、DIC1遺伝子またはSFC1遺伝子によりコードされている、請求項14に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞を増殖させ、生産されたコハク酸を回収する工程を含む、コハク酸の生産方法。
- クリベロマイセス属、カンジダ属、ピチア属、ハンゼヌラ属の遺伝子組み換え酵母細胞であって、ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への還元的生合成経路に必要な全ての酵素が発現され、該酵母細胞の細胞質において活性である、遺伝子組み換え酵母細胞。
- 該遺伝子組み換え酵母細胞が、該遺伝子組み換え酵母細胞のミトコンドリアと細胞質との還元当量の交換を促進するタンパク質をコード化する少なくとも1個の遺伝子をさらに含む、請求項17に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- ミトコンドリアと細胞質との還元当量の交換を促進するタンパク質をコード化する該遺伝子が、アスパラギン酸−リンゴ酸シャトルをコードする遺伝子、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーセシャトルをコード化する遺伝子およびアルコールデヒドロゲナーゼシャトルをコード化する遺伝子からなる群に由来する、請求項18に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への還元的生合成経路に必要な該酵素が、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、およびフマル酸レダクターゼを含む、請求項17に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 還元的生合成経路に必要な該酵素をコード化する1個またはそれ以上の遺伝子が、酵母株に由来する、請求項17に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 還元的生合成経路に必要な該酵素をコード化する1個またはそれ以上の遺伝子が、細菌株に由来する、請求項17に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 還元的生合成経路に必要な該酵素をコード化する1個またはそれ以上の遺伝子が、サッカロミセス属、クリベロマイセス属、ピチア属、ハンゼヌラ属またはイサタケンキア属の酵母株に由来する、請求項17に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 還元的生合成経路に必要な該酵素をコード化する1個またはそれ以上の遺伝子が、エシェリキア属、アクチノバチルス属、マンヘミア属、またはバスフィア属の細菌に由来する、請求項17に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 還元的生合成経路に必要な該酵素をコード化する1個またはそれ以上の遺伝子が、大腸菌株に由来する、請求項17に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- クリベロマイセス属、イサタケンキア属、カンジダ属またはピチア属、ハンゼヌラ属から選択される遺伝子組み換え酵母細胞であって、ホスホエノールピルビン酸(PEP)からリンゴ酸への還元経路に必要な全ての酵素が、その細胞質において発現され、リンゴ酸からコハク酸への代謝に必要な酵素が発現されない、遺伝子組み換え酵母細胞。
- クリベロマイセス属、イサタケンキア属、カンジダ属、ピチア属またはハンゼヌラ属から選択される遺伝子組み換え酵母細胞であって、ホスホエノールピルビン酸(PEP)からフマル酸への還元経路に必要な全ての酵素が、その細胞質において発現され、フマル酸からコハク酸への代謝に必要な酵素が発現されない、遺伝子組み換え酵母細胞。
- 請求項26に記載の遺伝子組み換え酵母細胞を増殖させ、生産されたリンゴ酸を回収することを含む、リンゴ酸の生産方法。
- 請求項27に記載の遺伝子組み換え酵母細胞を増殖させ、生産されたフマル酸を回収することを含む、フマル酸の生産方法。
- FADレダクターゼの増加した活性を有する、コハク酸を生産する微生物細胞。
- FADレダクターゼをコード化する1個またはそれ以上の異種遺伝子を含む、請求項30に記載の微生物細胞。
- 該微生物細胞が酵母細胞である、請求項29に記載の微生物細胞。
- ピルビン酸からのD−乳酸の形成を触媒するために代謝的に進化した、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む遺伝子組み換え酵母細胞。
- 該遺伝子組み換え酵母細胞が、クリベロマイセス属、ピチア属、ハンゼヌラ属、カンジダ属またはイサタケンキア属のものである、請求項33に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 請求項33に記載の酵母細胞を増殖させ、生産されたD−乳酸を回収することを含む、D−乳酸の生産方法。
- 炭素源としてのキシロースと有機酸を含む培地に環境試料を接種し、嫌気性条件または微好気性条件下で増殖させ、ペトリ皿に単一コロニーを分離し、その後、有機酸の存在下、低pHにて良好に増殖する株をスクリーニングすることを含む、低pHにて有機酸に耐性である酵母株の分離方法。
- 炭素源としてキシロースを含む培地に環境試料を接種し、嫌気性条件または微好気性条件下で増殖させ、ペトリ皿に単一コロニーを分離し、その後、有機酸の存在下、低pHにて良好に増殖する株をスクリーニングすることを含む、低pHにて有機酸に耐性である酵母株の分離方法。
- 該遺伝子組み換え酵母細胞が、乳酸生産能を増強するために代謝的に進化した、天然に生じない乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、遺伝子組み換え酵母細胞。
- 該乳酸デヒドロゲナーゼがD−乳酸デヒドロゲナーゼである、請求項38に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 該乳酸デヒドロゲナーゼが、大腸菌由来のldhA遺伝子、またはその相同体によりコード化されている、請求項38に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
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