CN112074606A - 用于乳酸生产的微生物和工艺 - Google Patents

Abstract

公开了用于生产D‑乳酸和L‑乳酸的改进的酵母菌株和发酵工艺。改进导致更高的滴度、更高的产率、更短的时间、更低的pH和更高的平均比生产率。

Description

用于乳酸生产的微生物和工艺

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年2月16日提交的美国临时申请系列号62/631,541的优先权。

技术领域

本发明涉及用于化学生产的微生物的基因工程的领域。更具体地，本发明涉及使用基因修饰的酵母，由可再生碳资源生产乳酸。

背景技术

当前使用的许多塑料和纤维在自然环境中难以堆肥；例如，衍生自聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酯和尼龙的塑料和纤维在自然环境中保留很长的时间。为了长期环境管理工作的目的，期望用衍生自在自然环境中易于堆肥的生物可再生资源的聚合物替代传统的塑料和纤维。此外，随着世界上开采的石油的供应变得更加稀少并且获得起来更昂贵，期望用生物可再生单体替代石油化学单体。乳酸的聚合物一般在自然环境中可堆肥。乳酸(2-羟基丙酸)作为两种立体异构体之一存在：L-乳酸，也称为L(+)-乳酸或S-乳酸(L-LAC)，或D-乳酸，也称为D(-)-乳酸或R-乳酸(D-LAC)。两种异构体可通过发酵由生物可再生资源(比如糖)制备。目前通过发酵生产的大部分乳酸为L-LAC。聚-L-乳酸(PLLA)为生物可降解的并且制备用于一些应用的塑料；然而，其相对低的约180℃的熔化温度限制了其有用性(Tsuji，2005)。然而，通过将等重量的PLLA和聚-D-乳酸(PDLA)熔化在一起，可将PLLA的熔化温度升高约45℃达到约225℃，产生本文中所谓的“立构复合PLA”(Tsuji，2005)。

将熔化温度升高至高于水的沸点对于许多应用是重要的，比如用于热饮的杯子、塑料餐具和可在热的温度下洗涤和熨烫或压制的织物。最重要地，立构复合PLA的较高的熔化温度对于生产高质量“压裂珠”是必要的，该“压裂珠”被泵入深层气藏和油藏中的裂隙岩层，目的是使裂缝保持足够打开以提取、移除或泵出期望的天然气或油。

乳酸可从游离酸或丙交酯开始聚合。丙交酯为乳酸的环二酯，并且可由两个L-LAC分子组成(L,L-丙交酯)、两个D-LAC分子组成(D,D-丙交酯)或L-LAC和D-LAC各一个分子组成(D,L-丙交酯或内消旋丙交酯)。将L-乳酸和D-乳酸单体的混合物，或丙交酯(L,L-丙交酯、D,D-丙交酯和D,L-丙交酯)的混合物聚合不导致具有期望的较高熔化温度的聚合物(Tsuji，2005)。而是，为了获得具有较高熔化温度的期望的聚合物，必须分别制备高度纯的L-LAC的高分子量聚合物和高度纯的D-乳酸的高分子量聚合物，并且仅在聚合之后混合。因此，为了制备期望的和有用的立构复合PLA，起始材料必须为纯手性的L-LAC和纯手性的D-LAC。有时将纯的异构体称为“光学纯的”。如本文使用的“光学纯的”或“纯手性的”意为乳酸为按重量百分数计或摩尔百分数计大于99％的一种异构体。可通过任何一种众所周知的方法确定光学纯度，例如使用填有介质的柱的分析高压液相色谱(HPLC)，该介质本身在其表面上携带光学纯的手性组分，例如，填有D-青霉胺包被的珠的Phenomenex(Torrance，美国加利福尼亚州)Chirex 3126柱(250X 4.60mm)。流动相为具有1ml/分钟的流速的1mM硫酸铜水溶液并且在254nm处UV检测。可替换的方法使用Shodex^TM ORpak CRX-853(8.0mm I.D.x50mm)柱(Showa Denko，日本东京)，用0.5mM CuSO₄水溶液洗脱，流速1.0mL/分钟，用230nm的UV检测，并且柱温度为50℃(根据制造商推荐)。如果在特定的上下文中未指定乳酸的异构体，则术语“乳酸”或“乳酸盐”指任一种或两种异构体，或两者的混合物。通过非生物化学合成生产的乳酸为等份的L-LAC和D-LAC的外消旋混合物，所以其不能用于制备立构复合PLA。

历史上，如果通过用微生物发酵来生物生产，则大部分大规模制造的乳酸为L-LAC，或如果化学(即，非生物)生产，则为L-LAC和D-LAC的外消旋混合物。开发了通过大肠杆菌(Escherichia coli)的基因工程改造的菌株生产高度纯的手性D-LAC的工艺(Zhou等，2003)。然而，因为大肠杆菌只能在中性pH下良好生长，所以D-LAC必须作为盐(例如与铵、钠、钾、钙或镁阳离子一起)生产，并且然后必须将质子化的游离酸与阳离子分离，以实现聚合，这增加了工艺的显著的成本。截至2017年11月28日，可从Corbion(荷兰，阿姆斯特丹)的Purac部门购买通过未公开的工艺生产的D-LAC。然而，D-LAC的购买价格显著高于L-LAC的购买价格。由于纯的D-LAC的高价格，立构复合PLA尚未被大规模商业生产商广泛采用。

美国专利申请公开号US 2015/0152449公开了用于由L-LAC或L-LAC和D-LAC的外消旋混合物生产D-LAC的化学工艺。该工艺涉及首先通过加热L-LAC制备外消旋混合物。然后将外消旋丙交酯混合物溶于正丁醇和丙酮中，并且经过固定化的Novozyme 435(MilliporeSigma，美国密苏里州圣路易斯)的柱，该Novozyme 435为对于酯形成具有立体特异性的脂肪酶。产物为D-乳酸的1-丁醇酯和L,L-乳酸基乳酸的1-丁醇酯(二聚体)的50-50混合物。然后可将这两种化学品通过蒸馏分离并且大概水解以得到游离酸、丙交酯和/或聚合物，但是该美国专利申请公开未公开如何完成该最后一个步骤。来自酶工艺和蒸馏工艺的产率和纯度不是完美的。在一个示例中，在固定化酶上运行8次每次7小时之后，乳酸D-丁酯的产率从92％下降至79％。在通过蒸馏分离两种酯的一个示例中，“分析的蒸馏产物为93.9％的乳酸(R)-丁酯；0.4％的乳酸(S)-丁酯、5.0％的丁醇；0.5％的(S,S)-丁基乳酸基乳酸酯；0.1％的(R,R)-丁基乳酸基乳酸酯和0.1％的(R,R)-丙交酯。”如此，乳酸酯部分含有约99％的D-LAC和约1％的L-LAC。该美国专利申请公开中未显示该水平的纯度是否足够制备高质量的立构复合PLA。无论如何，该美国专利申请公开中公开的工艺是相当复杂的，需要若干单元操作(除了发酵和下游纯化之外)、可能具有有限寿命的昂贵酶以及防爆器材，并且因此可能比用于生产纯的形式的异构化形式的乳酸的简单发酵工艺更昂贵。

因此，仍需要生产光学纯的D-LAC的工艺，以便鼓励更宽泛地采用立构复合PLA作为经济上有吸引力的可堆肥的塑料。

降低生产D-LAC的成本的一种途径是使用酵母作为生产生物体。与大部分细菌相比，在相对低的pH下，许多酵母菌株可良好生长，所以能够在其pKa或低于其pKa(其pKa公开为pH 3.86)的pH下通过发酵生产D-LAC或L-LAC。在pH 3.86下，与pH 7发酵相比，只需要约一半多的阳离子，使得分离阳离子的下游工艺将相应地较便宜。如果生产发酵罐中的最终pH可甚至低于3.86，则生产成本可甚至进一步降低。

在通过酵母生产L-乳酸的领域，存在很多现有技术，但是在D-乳酸生产的领域，存在很少的现有技术(见Sauer等，2010年综述)。

Zhou等公开了通过天然产生D-LAC的基因工程改造的大肠杆菌增加D-LAC的生产，其中删除了竞争厌氧途径，并且应用代谢进化(Zhou等，2003；美国专利号7,629,162和8,426,191)。Dequin和Barre(1994)介绍了通过引入L-乳酸脱氢酶而工程改造天然不产生L-LAC或D-LAC的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以生产L-LAC的概念，但是所得酵母仍产生乙醇。Porro等(1995)通过引入L-LAC脱氢酶并且通过删除一种或多种编码丙酮酸脱羧酶的基因而阻断乙醇途径，扩展了由酵母生产不含乙醇的L-LAC的概念。Porro等还介绍了使用来自除了酵母属(Saccharomyces)之外的属，比如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)的酵母的概念(美国专利号6,429,006B1、7,049,108B2和7,326,550)。Rajgarhia等介绍了阻断甘油生物合成途径并且使用来自除了酵母属之外的属(包括克鲁维酵母属、毕赤酵母属(Pichia)和汉逊酵母属(Hansenula))的Crabtree阴性酵母，用于L-LAC生产的概念(美国专利号6,485,947和7,141,410)。

Crabtree阳性酵母菌株(例如，许多酿酒酵母菌株)为这样的菌株：当糖浓度高于约5g/L时，即使存在空气氧，也通过“厌氧”或“发酵”途径，由可发酵的碳源(比如葡萄糖或其他适当的糖)，产生乙醇和二氧化碳。Crabtree阴性酵母菌株(例如，许多马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)菌株和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)菌株)为这样的菌株：当糖的浓度高于约5g/L时，即使存在空气氧，也不通过“厌氧”或“发酵”途径，由可发酵的碳源(比如葡萄糖或其他适当的糖)，产生乙醇和二氧化碳。

可通过van Dijken的方法，确定菌株是Crabtree阳性还是Crabtree阴性，该方法使用浸没在含有2％葡萄糖的丰富培养基中的倒置Durham管，并且在有氧温育之后，确定倒置Durham管中的气体(二氧化碳)的累积(van Dijken等，1986)。Crabtree阳性菌株产生气体，该气体可见地收集在倒置Durham管中，而Crabtree阴性菌株不产生气体。

关于通过工程改造的酵母在低pH下生产D-LAC的话题，很少有公开。“低pH”定义为低于为D-乳酸或L-乳酸公开的pKa(其为3.86)的pH。Winkler介绍了通过工程改造的酿酒酵母菌株，使用酵母生产D-乳酸的概念，并且显示了37g/L D-LAC的D-LAC生产，平均比生产率为0.54g/L-小时(美国专利申请公开号2007/0031950)。Miller等由工程改造的马克斯克鲁维酵母菌株，由90g/L葡萄糖开始并且在pH 3.0终止的培养基，以0.58g/L-小时的比生产率和0.69g/g的产率，生产D-LAC，但是未给出滴度和时间，所以只能假设所有葡萄糖都被利用，并且根据添加的KOH溶液的体积，推测出最大滴度为62g/L并且发酵时间为至少107小时(美国专利号8,137,953)。Yocum等公开了在48小时内以49g/L生产D-LAC的工程改造的马克斯克鲁维酵母的菌株，平均比生产率为1.02g/L-小时(美国专利申请号2015/0240270)。然而，现有技术都没有公开将是经济上有吸引力的用于在最终发酵液中低pH下生产D-LAC的菌株和工艺。

Baek等(2016)公开了工程改造和进化的酿酒酵母的菌株，其在52小时内产生112g/L D-LAC，其中产率为0.80g/g葡萄糖，并且比生产率为2.2g/L-hr。然而为了实现这些参数，作者使用了丰富培养基YPD(酵母提取物、蛋白胨、右旋糖)，和碳酸钙用于中和，两种特征都是非期望的。丰富培养基前期成本高并且增加了下游纯化成本。在中性pH下发酵消除了使用酵母作为生产生物体的优势。相同的小组(Baek等，2017)公开进一步工程改造和进化的酿酒酵母的菌株，其在55小时内，在pH 3.5下产生82.6g/L D-LAC，其中产率为0.83g/g葡萄糖，比生产率为1.50g/L-hr。然而，仍产生痕量的乙醇并且使用了丰富培养基(含有酵母提取物、蛋白胨、右旋糖的YPD培养基)，如上述，出于经济原因这是非期望的。另一韩国小组(PCT/KR2015/006225；Bae等，2018)公开了使用葡萄糖或洋姜粉末作为碳源，由工程改造的马克斯克鲁维酵母菌株生产L-LAC或D-LAC。在66小时内，以130g/L生产L-LAC，其中产率为0.98。在66小时内，以122g/L生产D-LAC，其中产率为0.95。然而，在两种情况下，用NaOH将pH保持在6.0下，并且使细胞在丰富培养基(含有酵母提取物、蛋白胨、右旋糖的YPD培养基)中预生长至高密度并且在接种生产发酵罐之前通过离心浓缩。该实践是不现实的并且太昂贵而不能在商业上使用。此外，如上所述，在基本上高于乳酸的pKa的pH下发酵消除了使用酵母的优势。Kim等(美国专利号9,353,388)公开了在酿酒酵母中由JEN1和ADY2编码的乳酸转运蛋白的过表达，然而报道的最高L-LAC滴度为13.3g/L，并且没有给出有关发酵条件的细节。本专利申请的表1通过列出用于通过使用酵母菌株发酵生产L-LAC和D-LAC的最佳公开工艺(其中最终pH等于或低于公开的乳酸的pKa)，总结了最相关的现有技术参考文献。

以与由石油生产的化学品有竞争力的成本通过发酵生产商品化学品是困难的。石油化学工业已经活跃了100多年，并且现在存在用于大规模生产有用的化学品(包括燃料和聚合物的单体，比如乙烯、丙烯、丁二烯、异戊二烯、乙二醇、对苯二甲酸、己二酸、六亚甲基二胺、己内酰胺等)的先进的技术。历史上，通过发酵生产的商品化学品非常少，并且仅有的大量示例是乙醇、L-LAC、柠檬酸、琥珀酸、衣康酸和一些L-氨基酸。通过发酵生产化学品存在三个非常显著的问题。第一，原始产物大部分在水中，并且必须将水与期望的化学品分离，这是能量密集型的并且昂贵的。第二，如果化学品用于聚合，其必须是极其纯的，以便防止链终止、不希望的着色和催化剂中毒。除了期望的产物之外，微生物通常产生各种各样的化学品，所以必须纯化掉这些不希望的污染物。许多微生物在含有许多养分，例如糖浆、蛋白胨、洋姜粉末或酵母提取物的丰富培养基(相对于基本培养基或化学限定培养基)中生长得更好，但是丰富培养基是相对昂贵的并且含有残留在发酵液中的许多杂质，并且因此也需要纯化掉。第三，在有吸引力的经济性所需的滴度下，期望的化学品通常对于细胞是有毒的，其限制了滴度和生产率。因此，通过发酵有利地生产商品化学品是非常困难的。

随着基因工程的出现，似乎有可能有利地生产更多的商品化学品，因为与过去使用传统菌株开发方法相比，可更容易且更彻底地控制生产微生物。然而，实际上，自基因工程的出现开始，只有很少的新商品化学品已经在商业规模上成功地生产，例如1,3-丙二醇。已经尝试了若干其他化学品，但是大部分只能取得有限的成功，这主要是由于石油化学品的价格竞争，例如琥珀酸、异戊二烯、1,4-丁二醇和异丁醇。

因此，仍需要用于生产商品化学品(比如D-LAC和L-LAC)的改进的微生物和发酵工艺，其中解决了许多上面提到的问题，使得经济上有吸引力的工艺可被商业化。本发明的重点是提供这种微生物和发酵工艺。

发明内容

本发明一般涉及以得到经济上有吸引力的工艺的滴度、产率、pH和时间，通过发酵生产D-乳酸和/或L-乳酸。

本发明的发明人认为，立构复合PLA的广泛采用将期望以不超过L-LAC的目前价格两倍的价格出售D-LAC。尽管不可能为L-LAC选择特定的出售价格，因为其价格根据时间、地点、体积和纯度而广泛变化，但是有可能使D-LAC将必须在小于48小时内，以大于90g/L，大于0.75g/g的产率，并且小于3.86的pH生产，其中平均比生产率大于1.875g/L-hr。本文公开了满足这些参数的菌株和发酵工艺，其中在现有技术中未公开过这种菌株或工艺。

现有技术公开了，理论上不可能通过以高产率和低pH，在厌氧或微需氧条件下发酵而生产有机酸，比如D-LAC，因为细胞将不得不消耗所有可用的能量(例如，ATP的形式)，以输出酸并且保持酸在细胞的外侧(van Maris等，2004)。因此，令人惊讶的是，发明人能够构建在微需氧条件下能够以高滴度和低pH生产D-LAC的酵母菌株。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但是下面描述了适当的方法和材料。所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其整体在此并入。在发生冲突的情况下，以包括本专利申请中提供的定义的说明书为准。

本发明的其他特征、结构、组分或特点以及优势将从本发明的描述中显而易见。

附图说明

图1、含有用于从马克斯克鲁维酵母菌株SD98删除KmURA3基因的盒的质粒pMS52的结构。

图2、含有用于在马克斯克鲁维酵母菌株SD98中的PDC1基因座处安装ldhA基因盒的盒的质粒pSD100 ldhA的结构。

图3、含有用于在马克斯克鲁维酵母菌株SD98中的GPP1基因座处安装ldhA基因盒的盒的质粒pSD95 ldhA的结构。

图4、含有用于在马克斯克鲁维酵母菌株SD98中的PCK1基因座处安装ldhA基因盒的盒的质粒pSD104-PCK1的结构。

图5、含有用于在马克斯克鲁维酵母菌株SD98中的NDE1基因座处安装ldhA基因盒的盒的质粒pSD104-NDE1的结构。

图6、含有用于在马克斯克鲁维酵母菌株中的δ-KmURA3基因座处重新安装KmURA3基因的、马克斯克鲁维酵母菌株SD98的野生型KmURA3基因以及URA3基因的1033bp上游侧翼序列和1046bp下游侧翼序列的质粒PCR产物的结构。

图7、在BioLector发酵中通过马克斯克鲁维酵母的SD1555和SD1566菌株的D-乳酸盐和丙酮酸盐的生产。

图8、在计算机控制的7升发酵罐中，作为时间的函数的通过马克斯克鲁维酵母的SD1555和SD1566菌株的D-乳酸盐和丙酮酸盐的生产。

具体实施方式

现将在本文中描述并在附图中阐释本公开的各种非限制性实施方式。本领域普通技术人员将理解结合一个非限制性实施方式描述或阐释的特征、结构、组分或特点可与一个或多个其他非限制性实施方式的特征、结构、组分或特点组合。这种组合旨在包括在本公开的范围内。本领域普通技术人员也将理解在不背离本发明的范围和精神的情况下，可修饰或改变结合一个或多个非限制性实施方式描述或阐释的特征、结构、组分或特点。

为了利于理解本发明，下面提供了术语的描述。

就术语而言，细菌基因或编码区通常用斜体小写字母命名，例如来自大肠杆菌的“ldhA”，而由基因编码的酶或蛋白质可用相同的字母命名，但是首字母为大写的并且没有斜体，例如“LdhA”。酵母基因或编码区通常用斜体大写字母命名，例如“PDC1”，而由基因编码的酶或蛋白质可用相同的字母命名，但是首字母为大写的并且没有斜体，例如“Pdc1”或“Pdc1p”，其中后者为在酵母中用于指定酶或蛋白质的惯例的示例。“p”为由指定的基因编码的蛋白质的缩写。酶或蛋白质也可用更具描述性的名称指代，例如，D-乳酸脱氢酶(ldhA/LdhA)或丙酮酸脱羧酶(PDC1/Pdc1)，分别指两个上面示例。因为历史上不同的起源，功能上冗余的基因，不同调控的基因，或因为基因来自不同的物种，编码具有特定的催化活性的酶的一个示例的基因或编码区可具有若干不同的名称。例如，编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因可命名为GPD1、GDP2或DAR1，以及其他名称。为了指定衍生特定的基因的生物体，可在基因名称前加上指示属和物种的两个字母。例如，KmURA3基因衍生自马克斯克鲁维酵母并且ScURA3基因衍生自酿酒酵母。

注意，乳酸和任何乳酸类似物的所有的异构体可以以固体、液体或溶液形式作为质子化的酸(也称为游离酸)或作为离子盐存在。在水溶液中，质子化的和离子形式平衡共存。因为提及这种化合物的所有形式将是繁琐的，所以任何提及酸形式或盐形式(例如，D-乳酸(D-LAC)或β-氯乳酸盐)包括所有形式或所有形式的混合物。

为了利于本发明的理解，下面限定了许多术语，并且其他术语出现在说明书的其他地方。

“酵母”意为能够在一些条件下以单个细胞状态生长的任何真菌生物体。在一些条件下，比如在饥饿下，一些酵母菌株也可以以菌丝状态或假菌丝(即，短菌丝)状态生长。特别地，酵母包括但不限于酵母属、克鲁维酵母属、伊萨酵母属(Issatchenkia)、毕赤酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属(Candida)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、接合酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和Lachancea中的生物体。

“盒”或“表达盒”意为当安装在宿主生物体中时，能够编码和产生或可替换地消除或减少一个或多个期望的蛋白质或酶的脱氧核糖核酸(DNA)序列。用于产生蛋白质或酶的盒通常包括至少一个启动子、至少一个编码序列，和任选地至少一个终止子。如果待表达的基因为异源的或外源的，则启动子和终止子通常衍生自两个不同的基因或衍生自异源基因，以便防止与衍生启动子或终止子的天然基因的双重重组。盒可任选地和优选地在一端或两端含有与宿主生物体中的DNA序列同源的一个或两个侧翼序列，使得盒可与宿主生物体(与染色体或质粒)进行同源重组，导致盒整合至所述染色体或质粒中。如果只有一端含有侧翼同源性，则圆形形式的盒可通过在侧翼序列处的单个重组而整合。如果盒的两端均含有侧翼同源性，则线性或圆形形式的盒可通过与周围侧翼的双重重组而整合。可通过基因工程改造构建盒，其中例如从非天然启动子表达编码序列，或它可使用天然相关的启动子。盒可构造到可为圆形的质粒中，或其可为通过聚合酶链式反应(PCR)、引物延伸PCR或通过体内或体外同源重组创建的线性DNA。盒可设计为包括选择标记基因或DNA序列，其在整合时被约30个或更多个碱基对的正向重复序列(相同的序列，以相同的定向存在于整合的选择基因的两端)围绕，使得可在盒被整合至染色体或质粒中之后，通过正向重复序列之间的同源重组而删除选择标记。有用的选择标记基因包括但不限于抗生素G418抗性(kan或kanR)、潮霉素抗性(hyg或hygR)、博来霉素抗性(zeo或zeoR)、naturicin抗性(nat或natR)、URA3、TRP1、TRP5、LEU2和HIS3。为了将生物合成的基因用作选择标记，宿主菌株当然必须在相应的基因中含有突变，优选地无效突变。对于抗生素抗性基因，抗性基因通常需要在宿主酵母菌株中良好发挥功能以实现选择的启动子。尽管期望待表达的基因可以以盒的形式安装在宿主菌株中，但是，基因(例如从起始密码子至终止密码子的编码序列)可在没有启动子或终止子的情况下整合至宿主染色体或质粒中，使得进入的编码序列精确地或近似地替代宿主菌株天然的基因的编码序列，使得在整合之后，进入的编码区由被进入的编码序列替代的宿主编码序列的剩余的启动子表达。

“D-乳酸脱氢酶”意为催化由丙酮酸盐形成D-乳酸盐的任何酶。“L-乳酸脱氢酶”意为催化由丙酮酸盐形成L-乳酸盐的任何酶。这些反应之一的必要的还原当量可由NADH、NADPH或任何其他还原当量供体供应。

“吉布森(Gibson)方法”意为用于将在其末端具有短的(约15-40个碱基对)重叠同源性的两个或更多个线性DNA片段连接在一起的方法。该方法可用于由合成的线性DNA片段、PCR片段或通过限制酶产生的片段构建质粒。可购买试剂盒以进行吉布森方法，例如

试剂盒(New England BioLabs，Ipswitch，美国马萨诸塞州)，并且按照制造商的指导来使用。

“转化体”意为由于将线性或圆形的和自主复制或不是自主复制的期望的DNA序列安装至宿主或亲本菌株中而得到的细胞或菌株。

“滴度”意为发酵液中化合物的浓度，通常表示为克每升(g/L)或％重量每体积(％)。滴度通过任何适当的分析方法确定，比如定量的分析色谱，例如高压液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC)，其中由外标(和任选地与内标一起)制备标准曲线。

“产率”意为发酵期间使用的每克碳源的产物的克数。这通常基于滴度、最终液体体积和供应的碳源的量来计算，其中针对取样的、进料的和/或蒸发的体积校正最终体积。其通常表示为克每克(g/g)或％重量每重量(％)。

“时间”意为从发酵中的接种至取样或收获所经过的时间，通常以小时测量。

“比生产率”意为以在给定时间段内在给定体积的发酵液中生产的产物的克数计的产物形成的速率，通常表示为克每升-小时(g/L-hr)。“平均比生产率”意为其中时间段为从接种至取样或收获的整个发酵的比生产率。平均比生产率低于来自发酵中期的比生产率，因为早期生长时间段期间和后期阶段期间的比生产率低于平均值。可通过将最终滴度除以收获时的小时数来计算平均比生产率。注意，尽管未明确地给出测量的时间段，但是一些公开的比生产率明显不是平均比生产率(见表1的一些示例)。

“pKa”意为溶液中的酸一半为共轭碱状态(通常为离子形式或盐形式)时的pH。L-LAC和D-LAC的pKa公开为3.78至3.86，但是精确的pKa可随着温度、浓度，和其他溶质的浓度而稍微改变。对于乳酸，共轭碱状态为乳酸根离子，所以pKa为其中乳酸根离子的浓度等于质子化或“游离酸”状态的浓度时的pH。可通过进行酸碱滴定并取滴定曲线的中点的众所周知方法测量pKa。本领域技术人员将了解，在水溶液中，D-乳酸在一定程度上，以两种形式存在，质子化酸形式和离子盐(即，共轭碱)形式。如此，取决于上下文，术语“D-乳酸盐”、“D-乳酸”和“D-LAC”可意为任一形式或两种形式的混合物。特别地，当讨论滴度和产率时，意图包括两种形式的总和，但是以游离酸表示，换句话说，滴度和产率表示为如同存在的任何盐形式转化成了游离酸形式。

“异源”意为不是天然或自然出现在生物体中，而是可通过基因工程，比如通过转化、交配或转导引入生物体中的基因或蛋白质。异源基因可整合(即，插入或安装)至染色体中，或包含在质粒上。术语“外源”意为通过基因工程，比如通过转化、交配、转导或诱变，已经引入生物体中，或在生物体中已经改变，以用于增加、减少或消除活性的目的的基因或蛋白质。外源基因或蛋白质可为异源的，或其可为宿主生物体的天然的，但是通过一种或多种方法(例如，突变、缺失、启动子的改变、终止子的改变、复制或在染色体中或质粒中插入一个或多个另外的拷贝)而改变的基因或蛋白质。因此，例如，如果DNA序列的第二拷贝插入在染色体中与天然位点不同的位点处，则第二拷贝将为外源的。

“质粒”意为基本上小于染色体、与微生物的染色体或多个染色体分离，并且与染色体或多个染色体分开复制的圆形或线性DNA分子。质粒可以以每个细胞约一个拷贝或以每个细胞大于一个拷贝存在。微生物细胞中质粒的保持通常需要在例如使用抗生素抗性基因或染色体营养缺陷型的互补来选择质粒的存在的培养基中生长。然而，一些质粒不需要选择压力用于保持稳定，例如许多酵母属菌株中的2微米圆形质粒。

“染色体”或“染色体DNA”意为基本上大于质粒并且通常不需要任何抗生素或营养选择的线性或圆形DNA分子。在本发明中，酵母人工染色体(YAC)可用作用于安装异源和/或外源基因的载体，但是其将需要选择压力以得到保持。

“过表达”意为造成由基因或编码区编码的酶或蛋白质在相同或类似的生长条件下在宿主微生物中以高于在野生型版本的宿主微生物中出现的水平的水平产生。这可通过，例如，一种或多种下述方法实现：安装更强的启动子、安装更强的核糖体结合位点、安装终止子或更强的终止子、改进在编码区中一个或多个位点处密码子的选择、改进mRNA稳定性或通过在染色体中引入多个拷贝或将盒置于多拷贝质粒上而增加基因的拷贝数。从过表达的基因产生的酶或蛋白质称为“过生产的”。过表达的基因或过生产的蛋白质可为宿主微生物天然的，或其可为通过基因工程方法从不同生物体移植至宿主微生物中的，在该情况下，酶或蛋白质以及编码酶或蛋白质的基因或编码区称为“外源的”或“异源的”。外源或异源基因和蛋白质按照定义为过表达的和过生产的，是因为它们不存在于天然野生型亲本或前体宿主生物体中。

“同源物”意为这样的基因、DNA序列或蛋白质：其与另一基因、DNA序列或蛋白质进行类似的生物功能，并且如通过用于序列比较的Basic Local比对检索工具(BLAST)计算机程序(Altschul等，1990；Altschul等，1997)确定的，与所述另一基因、DNA序列或蛋白质具有至少25％的序列同一性(当比较蛋白质序列或比较衍生自基因序列的蛋白质序列)，并且允许删除和插入。马克斯克鲁维酵母PDC1基因的同源物的示例将为来自酿酒酵母的PDC1基因。

“类似物”意为这样的基因、DNA序列或蛋白质：其与另一基因、DNA序列或蛋白质进行类似的生物功能，但是如通过用于序列比较的BLAST计算机程序(Altschul等，1990；Altschul等，1997)确定的，其中与所述另一基因、DNA序列或蛋白质具有小于25％的序列同一性(当比较蛋白质序列或比较衍生自基因序列的蛋白质序列)，并且允许删除和插入。马克斯克鲁维酵母Gpd1蛋白质的类似物的示例将为马克斯克鲁维酵母Gut2蛋白质，因为两种蛋白质都为催化相同反应的酶，但是在两种酶或它们各自的基因之间，没有显著的序列同源性。本领域普通技术人员将了解，许多具有特定的生物功能的酶和蛋白质(就在上面的示例中，甘油-3-磷酸脱氢酶)，可作为同源物或类似物出现在许多不同的生物体中，因为这种酶或蛋白质家族的成员共享相同的功能，但是它们的结构可略有不同或基本上不同。使用目前基因工程的方法，可在许多情况下使用相同家族的不同成员进行相同的生物功能。因此，例如，编码D-乳酸脱氢酶的基因可获自许多不同的生物体中的任一种。

“突变”意为来自天然或亲本DNA序列的任何改变，例如，一个或多个碱基对的倒位、复制、插入；一个或多个碱基对的缺失；导致过早产生终止密码子的碱基改变的点突变；或改变在该位置处编码的氨基酸的错义突变。“无效突变”意为有效消除基因的功能的突变。编码区的全部缺失将是无效突变，但是单个碱基改变也可导致无效突变。“突变体”、“突变菌株”、“突变酵母菌株”或“已经突变的”菌株意为当与天然野生型亲本或前体菌株比较时，包括一个或多个突变的菌株。

短语“消除或减少……的功能的突变”意为当测量可评估的参数或输出并且与未突变的亲本菌株的可评估的参数或输出比较时，降低菌株的基因、蛋白质或酶的任何所述可评估的参数或输出(比如mRNA水平、蛋白质浓度或比酶活性)的任何突变。这种突变优选地为缺失突变，但是其可为实现期望的功能消除或减少的任何类型的突变。

“强组成型启动子”意为下述DNA序列：其通常位于通过RNA聚合酶转录的DNA序列或基因的上游(当以常规的5’至3’方向描绘时位于基因的5’侧)，并且造成所述DNA序列或基因通过RNA聚合酶的转录以直接或间接通过任何适当的测定程序容易检测到的水平表达。适当的测定程序的示例包括定量的逆转录酶plus PCR、编码的酶的酶测定、考马斯蓝染色蛋白质凝胶，或可测量的由于所述转录间接产生的代谢产物的产生，并且无论是否存在特异性调节转录水平的蛋白质、代谢产物或诱导化学品，都发生这种可测量的转录。通过使用众所周知的方法，可使用强组成型启动子替代天然启动子(原本天然存在于DNA序列或基因上游的启动子)，导致可置于质粒或染色体中的表达盒，该表达盒提供期望的DNA序列或基因的表达水平，该水平高于天然启动子的水平。强组成型启动子可为针对物种或属具有特异性的，但是来自酵母的强组成型启动子通常可在远缘相关的酵母中良好发挥功能。例如，来自棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)的TEF1(翻译延伸因子1)启动子在许多其他酵母属(包括马克斯克鲁维酵母)中良好发挥功能。

“微需氧”或“微需氧发酵条件”意为发酵罐的空气供应小于每分钟每体积的液体发酵液0.1体积的空气(vvm)。

“化学限定培养基”、“基本培养基”或“矿物质培养基”意为由纯化的化学品构成的任何发酵培养基，该纯化的化学品比如：提供必要的元素(比如氮、硫、镁、磷，和有时钙和氯化物)的矿物盐(例如钠、钾、铵、镁、钙、磷酸盐、硫酸盐、氯化物等)、维生素(当微生物生长所必须或刺激微生物生长时)、一种或多种纯的碳源(比如纯糖、甘油、乙醇等)、微生物生长所必须或刺激微生物生长的微量金属(比如铁、锰、铜、锌、钼、镍、硼和钴)，以及任选地渗透保护剂(比如甘氨酸甜菜碱，也称为甜菜碱)。除了任选的渗透保护剂和维生素之外，这种培养基不含有对于正在发酵的微生物的生长不是必需的大量的任何养分或大于一种养分的混合物。这种培养基不含有任何大量的丰富或复合养分混合物，比如酵母提取物、蛋白胨、蛋白水解物、糖浆、肉汤、植物提取物、动物提取物、微生物提取物、乳清、洋姜粉末等。对于通过发酵生产商品化学品(其中通过简单的蒸馏纯化期望的化学品不是经济上有吸引力的选择)，相比丰富培养基，基本培养基是优选的，因为基本培养基通常是较便宜的，并且在发酵结束时，发酵液通常含有需要从期望的化学品中纯化掉的低浓度的不希望的污染化学品。

“发酵生产培养基”意为在其中使微生物生长以生产期望的产物(例如D-LAC或L-LAC)的工艺中，在包括一个或多个罐、容器或发酵罐的系列中的最后一个罐、容器或发酵罐中使用的培养基。对于其中大量的纯化是必要的或期望的通过发酵生产商品化学品，比如D-LAC或L-LAC，作为基本培养基的发酵生产培养基相对于丰富培养基是优选的，因为基本培养基通常较便宜，并且在发酵结束时发酵液通常含有需要从期望的化学品中纯化掉的低浓度的不希望的污染化学品。尽管一般优选在这种发酵中最小化丰富养分的浓度，但是在一些情况下，使接种体培养物在不同于发酵生产培养基的培养基中生长，例如，使相对小体积(通常发酵生产培养基体积的10％或更少)的接种体培养物在含有一种或多种丰富成分的培养基中生长，对于总体工艺是有利的。如果接种体培养物相对于生产培养物是相对小的，则接种体培养物的丰富组分可被稀释至发酵生产培养基中以至于它们基本上不干扰期望的产物的纯化。发酵生产培养基必须含有碳源，其通常为糖、甘油、脂肪、脂肪酸、二氧化碳、甲烷、醇或有机酸。在一些地理位置，例如，在美国中西部，D-葡萄糖(右旋糖)是相对便宜的并且因此可用作碳源。有关通过酵母生产乳酸的大部分现有技术出版物使用右旋糖作为碳源。然而，在一些地理位置，比如巴西和东南亚大部分，蔗糖相比右旋糖较便宜，所以在那些区域蔗糖是优选的碳源。

“最终pH”意为在当发酵视为完成、发酵停止和收获发酵液时，发酵结束时的发酵液的pH。尽管优选地，乳酸发酵的最终pH低于乳酸的pKa，但是也优选的是通过添加“碱”(碱物质)，控制发酵期间的pH，以防止pH过快下降或最终太低。“碱”可为溶液、悬液、浆液或固体形式。“碱”可为钠、铵、钾、镁或钙的氢氧化物、氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐。对于乳酸的生产，优选的碱为氢氧化钙或粉末状氢氧化钙的浆液，其导致在发酵液中形成一些与质子化酸形式混合的乳酸钙。在发酵结束时的所得发酵液可用硫酸处理，这造成硫酸钙(石膏)的沉淀，有助于移除钙，以增加以质子化形式存在的乳酸的比例。按照pH测量的要求，可手动完成或通过自动控制的泵或螺旋钻完成碱的进料以控制pH，该pH测量可手动获得或通过经浸没在发酵容器中的pH探针连续的监测获得。

为了利于理解本发明，下面表2中列举了各种基因。本发明中使用的质粒和外源基因的序列信息列举在下面表3中。

(上述)现有技术公开了生产D-LAC的若干基因工程改造的酵母，但是如上所述，公开的参数都没有接近对于经济上有吸引力的工艺来说必要的参数。此外，D-LAC一般比L-LAC对于生物体更有毒性，所以不能假定用于开发用于生产L-LAC的菌株和工艺的技术和方法直接适用于生产D-LAC的技术和方法。

马克斯克鲁维酵母菌株在37℃下生长并且储存在-80℃的20％至40％甘油中。通过Abdel-Banat等(2010)的“用于基因靶向的转化方案”方法完成马克斯克鲁维酵母的转化，其中修改之处为改变用于制备转化-感受态细胞的生长培养基，以防止培养物变得太酸。用于制备感受态细胞的生长培养基每升含有10g酵母提取物、20蛋白胨、3g葡萄糖和20g甘油。

使用本领域技术人员众所周知的标准DNA操作方法，在大肠杆菌DH5-α菌株(NewEngland BioLabs，Ipswitch，美国马萨诸塞州)的质粒中构建DNA盒，该方法包括合成的“g-block”DNA序列(Integrated DNA Technologies，Woodland，美国得克萨斯州)、高保真PCR、限制酶、DNA连接酶和使用NEBuilder试剂盒(New England BioLabs，Ipswitch，美国马萨诸塞州)的吉布森方法，。

用于整合的盒的一般设计具有以下述顺序的下述特征：(1)与靶基因座的上游的同源性，(2)强组成型启动子，(3)待表达的编码区，(4)终止子，(5)与靶基因座的下游的同源性，(6)选择(和任选地反向选择)标记基因，以及(7)与靶基因座的中间序列的同源性。对于标记基因的选择造成靶基因座的上游同源性和中间同源性之间的整合。通过诊断PCR(其显示具有正确的预期尺寸的上游和下游连接片段两者)鉴定含有正确的整合的转化体。反向选择(例如，针对URA3基因的反向选择)通过盒中的下游同源性组分与整合的盒的正下游出现的相同染色体序列的重组，导致选择标记和反向选择标记URA3基因和中间同源性序列环出。如果旨在删除靶基因座而不伴随插入，则省略上述一般设计的“(2)强组成型启动子，(3)待表达的编码区，(4)终止子”部分。

实施例

提供下述实施例，以进一步解释本发明，但是不旨在限制本发明的范围。

实施例1

菌株SD1555的构建

起始菌株是马克斯克鲁维酵母SD98，一种从腐败甘蔗渣中分离的野生Crabtree阳性菌株，在美国专利申请公开号2015/0240270中对其进行了解释。为了使用URA3基因作为用于整合转化的选择标记，从SD98中删除了天然KmURA3基因，以得到菌株KMS95。通过整合在质粒pMS52(SEQ ID No.1)上构建的盒来删除KmURA3基因。从质粒以线性片段获得该盒，并且整合至SD98中，选择潮霉素抗性(在没有潮霉素的YPD中3小时的生长时间段之后，YPD培养基中300mg/L潮霉素B，然后铺在潮霉素平皿上)。通过棉阿舒囊霉TEF1启动子驱动潮霉素抗性基因。在该盒在KmURA3基因座处正确整合之后，一部分中断的KmURA3基因和潮霉素抗性基因在正向重复序列侧翼，以利用对5-氟-乳清酸(5-FOA)抗性的第二选择(该5-氟-乳清酸(5-FOA)反向选择URA3基因；换句话说，其选择URA3基因的丢失)，允许正向重复序列之间的序列通过同源重组环出。通过将约1亿个细胞铺在补充有1g/L 5-FOA和24mg/L尿嘧啶的CM葡萄糖减尿嘧啶培养基(Teknova，Hollister，美国加利福尼亚州)上来完成对5-FOA抗性的选择。

在质粒上构建设计为表达大肠杆菌ldhA基因的四个不同盒。在所有四种情况下，ldhA基因均由马克斯克鲁维酵母PDC1启动子表达。四个不同盒设计为插入KMS95中的四个不同基因座中：PDC1(丙酮酸脱羧酶)基因座(SEQ ID No.2)、GPP1(甘油-3-磷酸磷酸酶)基因座(SEQ ID No.3)、PCK1(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)基因座(SEQ ID No.4)，和NDE1(NADH脱氢酶1)基因座(SEQ ID No.5)。盒设计为通过同源重组整合在靶基因座处，在CM葡萄糖减尿嘧啶培养基(Teknova，Hollister，美国加利福尼亚州)上选择酿酒酵母URA3基因，并且然后在通过下游侧翼的正向重复序列之间的同源重组而使URA3基因环出的第二步骤中，如上所述，选择对5-FOA抗性，以便再利用URA3基因，用于随后的转化。在每个转化步骤和每个环出步骤中，根据需要，将单个菌落一次或多次再划线，以使正确的菌株摆脱背景细胞，并且消除杂合二倍体。通过PCR，使用适当的引物鉴定正确的插入和正确的环出，所述适当的引物括出了在整合的盒的正上游或正下游的靶基因座处的盒和染色体序列的末端之间的边界。PCR诊断不能区分单倍体中正确整合的盒与正确整合的纯合二倍体；所以在构建的任何步骤中未进行该区分。从菌株KMS95开始，以上面列举的顺序一次一个，安装了四个ldhA盒。在每个盒的初始整合之后，通过5-FOA反向选择，将URA3基因环出。在因此安装第四个盒之后，通过由PCR从作为模板的SD98染色体DNA获得的线性DNA片段的转化，重新安装天然KmURA3基因(SEQ ID No.6)，以通过在CM葡萄糖减尿嘧啶平皿上选择而得到尿嘧啶原养型。所得菌株，其现含有四个拷贝的整合ldhA基因，命名为SD1555。盒插入至PDC1基因中阻断了不希望的乙醇的合成。盒插入至GPP1基因中阻断了不希望的甘油的合成。盒插入至PCK1基因中阻断了在作为碳源的D-LAC或L-LAC上的不希望的酵母的生长，因为已经降低或消除Pck1活性的菌株不能进行葡萄糖生成，并且糖异生对于在非可发酵的碳源(比如D-LAC或L-LAC)上生长是必要的。不能在D-LAC或L-LAC上生长是期望的性状，因为其防止当糖的浓度低或为零时，在发酵结束时滴度的损失。尽管pck1突变是优选的，因为PCK1编码糖异生途径中的第一关键步骤，但是降低或消除糖异生(例如，降低或消除果糖1,6-二磷酸磷酸酶活性)的任何其他突变也可导致类似的期望结果，即降低或消除了糖异生。盒插入至NDE1基因中造成细胞质NADH(用于D-LAC的生物合成的底物之一)的保存。

实施例2

菌株SD1566的构建

如下选择对β-氯乳酸盐(MilliporeSigma，美国密苏里州圣路易斯)具有抗性的SD1555的衍生物。将SD1555的约10⁸个细胞的菌苔均匀分散在含有包含20g/L葡萄糖的SDM2培养基的平皿上。将小规格的β-氯乳酸盐放置在平皿的中心处。β-氯乳酸盐未指定异构体，所以假定其为D-异构体和L-异构体的外消旋混合物。在三天之后，在中心杀伤区周围长出菌苔。在杀伤区的边缘，出现了若干个体菌落。将若干这种菌落再划线至含有具有20g/L葡萄糖和0.75g/Lβ-氯乳酸盐的SDM2的平皿。在37℃下三天之后，可看到对β-氯乳酸盐具有抗性的菌落。在三天时，在相同的平皿上，亲本菌株SD1555未给出可见的单个菌落。

除了β-氯乳酸盐，还有许多其他乳酸类似物可用于选择具有期望特性的抗性突变体。乳酸类似物的示例包括但不限于：3-氯乳酸盐(β-氯乳酸盐)、3-二氯乳酸、3-三氯乳酸、3-氟乳酸、3-二氟乳酸、3-三氟乳酸、3-溴乳酸、3-二溴乳酸、3-三溴乳酸、乳酸的所有可能的2-卤素取代的衍生物、上面类似物中任一种的所有手性形式，或上面中的任一种的任何盐。“乳酸类似物”意为结构上与乳酸相关并且在适当的条件下抑制亲本酵母菌株生长的任何化合物，并且包括上面公开的化合物的组。注意，术语“类似物”在“乳酸类似物”的上下文中具有与当在基因或蛋白质序列的上下文中使用时的不同的含义。如上所述，在基因或蛋白质的上下文中，术语“类似物”指发挥正向功能的可替换物，而在“乳酸类似物”的上下文中，词语意为干扰的有毒化合物。

被基因工程改造以生产乳酸的酵母菌株，“当与未突变的同基因菌株比较时，已经突变为赋予对更高浓度的乳酸类似物具有抗性”意为，菌株含有相对于亲本菌株的一个或多个突变，针对其在含有液体或琼脂的培养基中可出现一定浓度的乳酸类似物，其中当两种菌株在适于突变的菌株的可见生长的温度下温育约一天至五天之后，在类似的平行液体培养物中生长或在相同的陪替氏平皿上彼此相邻划线时，所述突变的菌株相比亲本菌株给出明显更好的生长或更大的菌落。在上面给出的实施例中，确定0.75g/L的β-氯乳酸盐浓度和在37℃下温育三天，以在琼脂平皿上显示良好的菌落尺寸的对照，但是对于其他酵母菌株和物种，其他条件可能显示亲本和突变体之间的更好的对照。通过区分所述抗性菌株与亲本菌株来确立对乳酸类似物的抗性的适当的条件，可通过经由将亲本菌株和突变菌株铺在或使其生长在含有0g/L至约10g/L浓度范围内的所述乳酸类似物的培养基中的常规实验确定。

例如，通过系统地改变含有支持亲本菌株的生长的基本培养基的陪替氏平皿中乳酸类似物的浓度，在已知亲本菌株良好生长的温度下温育，并且每天检查平皿，当突变体和亲本之间的菌落尺寸的对照可见时，对平皿记分，可鉴定当与亲本菌株比较时对乳酸类似物具有抗性的菌株。可替换地，可通过获得在含有0g/L至10g/L的浓度范围的乳酸类似物的液体培养基中突变菌株和亲本菌株的生长曲线，确定对乳酸类似物的相对抗性。

“亲本菌株”意为这样的起始菌株：其可经受导致包括基因改变的新的衍生菌株或后代菌株的一种或多种条件，该基因改变最终导致新的衍生菌株的至少一种可测量特性的改变，该特性显著不同于亲本菌株的特性，例如乳酸滴度、乳酸产率、乳酸的比生产率，或任何可测量的副产物(比如丙酮酸)的滴度。所述“一种或多种条件”可为对亲本菌株进行的许多操作中的任何一种或多种，例如涉及安装改变菌株的基因组成的DNA的基因工程；选择如上所述对于β-氯乳酸盐的抗性的自发突变体；以及对亲本菌株施加许多众所周知的诱变程序中的任一种，然后使诱变的细胞群体经受选择或筛选以得到期望的特性，例如对于乳酸类似物的抗性。众所周知的诱变程序包括将细胞暴露于化学诱变剂，例如亚硝基胍(也称为NTG、MNNG和N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)、甲磺酸乙酯(也称为EMS)，或诱变辐射，例如X-射线或紫外光。对于亲本菌株的诱变剂的适当的剂量可通过下述确定：将活的亲本细胞的群体暴露于一定范围的诱变剂剂量，并且选择剂量和条件以使得留下活的亚群，该亚群足够大，含有期望类型的期望的突变体，例如β-氯乳酸盐抗性的突变体。在本领域中，选择杀死约10％至95％的亲本群体的典型的诱变剂剂量。对β-氯乳酸盐或其他乳酸类似物具有抗性的菌株可选自已经被基因工程改造以生产乳酸的亲本菌株，但是对乳酸类似物具有抗性的菌株也可选自未被工程改造用于乳酸生产的亲本菌株。在该后一种情况下，可以对抗性突变体进行工程改造以用于生产乳酸，然后对其筛选以得到与从未选择对乳酸类似物的抗性的亲本菌株进行类似工程改造的菌株相比改进的乳酸生产。

通过在BioLector微型发酵罐(m2p-Labs，Hauppauge，美国纽约州)中在花板上发酵，将如上所述分离的β-氯乳酸盐抗性菌株与用于生产D-LAC的亲本菌株SD1555进行比较。用于BioLector的接种物在YPD中生长，其中右旋糖浓度降低至3g/L，而不是通常的20g/L。用于BioLector的发酵培养基是SDM2，其含有100g/L或200g/L葡萄糖，每孔1ml，起始OD600nm为0.1-0.2。将花板在37℃下以1200rpm摇动48小时。一种β-氯乳酸盐抗性分离株(名为SD1566)的性能优于亲本SD1555。D-LAC和丙酮酸盐的滴度显示在图7中。与亲本菌株SD1555相比，SD1566产生更高滴度的D-LAC，和明显更低滴度的不希望的副产物丙酮酸盐。“与未突变的亲本菌株相比，明显更低滴度的丙酮酸盐”意为可再现地与在相似条件下生长的亲本菌株的滴度相比，至少降低25％。SD1566的特征还在于计算机控制的7升发酵罐(NewBrunswick Scientific，Indianapolis，美国印第安纳州)。

实施例3

在7升发酵罐中通过菌株SD1566生产D-LAC

将酵母菌株SD1566的接种物在37℃下，在500ml带挡板的摇瓶中150ml的YPS-MES培养基中生长至OD 600nm为约2至6。将150ml接种至New Brunswick BioFlo 110或Eppendorf BioFlo 115发酵罐的4升AM1S培养基中。叶轮速度为750rpm，并且通风速度为260ml/min，等于起始体积的0.065vvm。起始pH为约6.6。温度设定在37℃。通过自动控制蠕动泵送3摩尔氢氧化钙浆液来控制pH，在剧烈搅拌的容器中使该氢氧化钙保持悬浮。起始设定点为pH 6。从零时间(接种时间)到30小时，pH设定点自动以线性方式缓降(即降低)至pH3.5。实际pH在33小时达到3.5。在36小时时，D-LAC滴度为110g/L，计算的产率为0.81g/g蔗糖(重复发酵的平均值)。最终丙酮酸滴度为0.55g/L。D-LAC的平均比生产率为3.05g/L-hr。为了比较，在相似条件下，亲本菌株SD1555在39小时内产生了78g/L的D-LAC和9.8g/L的丙酮酸盐，产率为0.67g/g。来自SD1555的D-LAC的平均比生产率为2.0g/L-hr。因此，抗β-氯乳酸盐的菌株SD1566的滴度、产率和平均比生产率得到改进，并且其丙酮酸盐副产物的滴度低于亲本SD1555。图8显示了作为发酵时间的函数的D-LAC滴度。

使用制造商推荐的Chirex 3126柱(Phenomenex，Torrance，美国加利福尼亚州)都未检测到由SD1555或SD1566的L-LAC生产。通过该HPLC方法，L-LAC的最小可检测滴度为0.01g/L，所以由SD1566生产的D-LAC的光学纯度大于99.9％。

本领域普通技术人员将认识到，本文所述的方法可用于通过基因工程改造天然不生产显著滴度的乳酸的其他酵母菌株、物种和属来增加生产乳酸的能力，或用于通过对已经具有一定生产乳酸能力的其他酵母菌株、物种和属进行基因工程改造来改进生产乳酸的能力。在四个靶基因中插入ldhA盒可有效消除或降低这四个靶基因的功能，但可以使用可替换的方法来实现功能的消除或降低。使基因的蛋白质产物与同基因野生型菌株相比，缺乏、失活或比活性低的任何突变或多于一个突变的组合，都可用于消除或降低四个目标基因(即PDC1、GPP1、PCK1和NDE1)中的任何一个，或这些基因的同源物或类似物的功能。另外，可以使用除大肠杆菌版本以外的编码D-乳酸脱氢酶的基因代替大肠杆菌版本，其以一个或多个拷贝以与本文公开的方式相似的方式安装。另外，可以使用编码L-乳酸脱氢酶的基因代替D-乳酸脱氢酶版本，其以一个或多个拷贝以与本文公开的方式相似的方式安装。

对于发酵工艺，可改变起始pH，可改变最终pH值(当发酵完成并且取样和/或收获发酵液以用于乳酸产物的下游加工和纯化时)，并且可改变发酵期间用于降低pH的的函数、算法或程序。可利用线性函数、阶跃函数或非线性函数、非阶跃函数(例如曲线函数，比如指数函数或抛物线函数)使pH缓降。不管用于降低pH的函数、算法或程序的类型如何，优选地，最终pH低于乳酸的pKa，以便降低整个工艺的成本。起始pH优选在4.5和7.0之间，因为酵母菌株通常在该范围内生长得更快。

用于控制发酵罐中的pH的材料可为任何适当的碱材料，比如钾、钠、铵、镁或钙的氢氧化物、氧化物、碳酸氢盐或碳酸盐。可使用螺旋钻，将材料作为溶液、悬浮液或浆液，或作为固体进料。

为了解释的目的已经呈现前述描述和实施例。除了提供的描述和实施例以外，鉴于上述教导，非限制性实施方式的特征、结构、组分或特点的许多组合、修改和变型是可能的。

表1提供了最佳的公开的乳酸发酵的总结，该乳酸发酵在酿酒酵母(S.c.)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)(K.m.)和东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)(I.o)中，在低于3.86的pKa的pH下进行。在本调查中使用的各种基因列在表2中。表3列举了与本专利申请一起提交的DNA序列信息。使用的生长培养基的组成在表4中给出。

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序列表

<110> PTT全球化学股份有限公司

<120> 用于乳酸生产的微生物和工艺

<130> GC2019-01PCT

<140> PCT/US 19/999999

<141> 2019-02-15

<150> 62/631541

<151> 2018-02-16

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10203

<212> DNA

<213> 马克斯克鲁维酵母

<400> 1

gtggcggttt tcatggcttg ttatgactgt ttttttgggg tacagtctat gcctcgggca 60

tccaagcagc aagcgcgtta cgccgtgggt cgatgtttga tgttatggag cagcaacgat 120

gttacgcagc agggcagtcg ccctaaaaca aagttaaaca tcatgaggga agcggtgatc 180

gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg 240

acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt 300

gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg 360

atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta 420

gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa 480

ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga gccagccacg 540

atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta 600

ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta 660

aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta 720

gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat 780

gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa 840

gctagacagg cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg 900

gaagaatttg tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataatgtcta 960

acaattcgtt caagccgacg ccgcttcgcg gcgcggctta actcaagcgt tagatgcact 1020

aagcacataa ttgctcacag ccaaactatc agaattctga accagtccta aaacgagtaa 1080

ataggaccgg caattcttca agcaataaac aggaatacca attattaaaa gataacttag 1140

tcagatcgta caataaagct ttgaagaaaa atgcgcctta ttcaatcttt gctataaaaa 1200

atggcccaaa atctcacatt ggaagacatt tgatgacctc atttctttca atgaagggcc 1260

taacggagtt gactaatgtt gtgggaaatt ggagcgataa gcgtgcttct gccgtggcca 1320

ggacaacgta tactcatcag ataacagcaa tacctgatca ctacttcgca ctagtttctc 1380

ggtactatgc atatgatcca atatcaaagg aaatgatagc attgaaggat gagactaatc 1440

caattgagga gtggcagcat atagaacagc taaagggtag tgctgaagga agcatacgat 1500

accccgcatg gaatgggata atatcacagg aggtactaga ctacctttca tcctacataa 1560

atagacgcat ataagtacgc atttaagcat aaacacgcac tatgccgttc ttctcatgta 1620

tatatatata caggcaacac gcagatatag gtgcgacgtg aacagtgagc tgtatgtgcg 1680

cagctcgcgt tgcattttcg gaagcgctcg ttttcggaaa cgctttgaag ttcctattcc 1740

gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttcagagcg cttttgaaaa ccaaaagcgc 1800

tctgaagacg cactttcaaa aaaccaaaaa cgcaccggac tgtaacgagc tactaaaata 1860

ttgcgaatac cgcttccaca aacattgctc aaaagtatct ctttgctata tatctctgtg 1920

ctatatccct atataaccta cccatccacc tttcgctcct tgaacttgca tctaaactcg 1980

acctctacat tttttatgtt tatctctagt attactcttt agacaaaaaa attgtagtaa 2040

gaactattca tagagtgaat cgaaaacaat acgaaaatgt aaacatttcc tatacgtagt 2100

atatagagac aaaatagaag aaaccgttca taattttctg accaatgaag aatcatcaac 2160

gctatcactt tctgttcaca aagtatgcgc aatccacatc ggtatagaat ataatcgggg 2220

atgcctttat cttgaaaaaa tgcacccgca gcttcgctag taatcagtaa acgcgggaag 2280

tggagtcagg ctttttttat ggaagagaaa atagacacca aagtagcctt cttctaacct 2340

taacggacct acagtgcaaa aagttatcaa gagactgcat tatagagcgc acaaaggaga 2400

aaaaaagtaa tctaagatgc tttgttagaa aaatagcgct ctcgggatgc atttttgtag 2460

aacaaaaaag aagtatagat tctttgttgg taaaatagcg ctctcgcgtt gcatttctgt 2520

tctgtaaaaa tgcagctcag attctttgtt tgaaaaatta gcgctctcgc gttgcatttt 2580

tgttttacaa aaatgaagca cagattcttc gttggtaaaa tagcgctttc gcgttgcatt 2640

tctgttctgt aaaaatgcag ctcagattct ttgtttgaaa aattagcgct ctcgcgttgc 2700

atttttgttc tacaaaatga agcacagatg cttcgttaac aaagatatgc tattgaagtg 2760

caagatggaa acgcagaaaa tgaaccgggg atgcgacgtg caagattacc tatgcaatag 2820

atgcaatagt ttctccagga accgaaatac atacattgtc ttccgtaaag cgctagacta 2880

tatattatta tacaggttca aatatactat ctgtttcagg gaaaactccc aggttcggat 2940

gttcaaaatt caatgatggg taacaagtac gatcgtaaat ctgtaaaaca gtttgtcgga 3000

tattaggctg tatctcctca aagcgtattc gaatatcatt gagaagctgc agcgtcacat 3060

cggataataa tgatggcagc cattgtagaa gtgccttttg catttctagt ctctttctcg 3120

gtctagctag ttttactaca tcgcgaagat agaatcttag atcacactgc ctttgctgag 3180

ctggatcaat agagtaacaa aagagtggta aggcctcgtt aaaggacaag gacctgagcg 3240

gaagtgtatc gtacagtaga cggagtatac tagtatagtc tatagtccgt ggaattctca 3300

tgtttgacag cttatcatcg attatttcta tccactttaa caccactcct cctagcacag 3360

ctagtaaaac ctcttatagc accatagatg aggctcattt taacgaattt tctctcgaag 3420

cttgaatagc ttagcatagt ggctcttctc atctcatcgc ggaattgaaa aatttcaacc 3480

actataaaat ctattataaa tacagtgaaa agtgccaaga cttctggtga attctaacta 3540

ataaccatac catcatgatt cctgagcaag gtgagcacaa ggcttttgtg cagagaaata 3600

ccaacgaaac caaaatccag atcgccattt ccttaaatgg tggtcacatt gaaattccag 3660

agtccatcat aggtaagaag agagttgaaa gtgatggcgt agctacgcaa gctactagtt 3720

ctcaaacgat cgacattcat accggtgtcg gattcctcga ccatatgatt catgctctgg 3780

cgaaacactc tggttggtca ctaatcgttg aatgtattgg tgatttgcac atcgatgatc 3840

accataccac tgaagactgc ggtattgccc taggtgatgc tttcaaacag gccttgggac 3900

aggtacgtgg tgtgaaaaga tttggattcg gttttgcgcc attagatgag gctttatcaa 3960

gagctgttgt cgatctatcc aatagaccat attctgttat tgaattagga ttgaaaagag 4020

aaaaaatcgg tgatttgtcc tgtgaaatga ttccacattt tctagaaagt tttactgaag 4080

cagctagatt gactgttcat gtggactgtt tgagaggttt caacgaccat cacagaagtg 4140

aaagtgcatt taaggcacta gcggtagccc ttagagaagc aacttcacct aatggtacca 4200

acgatgtccc atctacgaag ggtgttctca tgtgaattaa atggcagaaa gtttaaacct 4260

gtatatttat ttacacgata ttatgaaata gtttatttat cgaaattagt caaaatgctt 4320

aacaattctt ctgcatgttt ggtagaatct tcagcacgta ctgcagggtg tctaccacca 4380

gttcttaaag gtctttgttg gtaatttcta ccagacattt gtaatctagc tctggggctt 4440

ataccactaa ccactttagc tcttagcatg actctaccgt tatcctatca gttattaccc 4500

gggaatctcg gtcgtaatga taggtgcctg tcacggctct ttttttactg tacctgtgac 4560

ttcctttctt atttccaagg atgctcatca caatacgctt ctagatctat tatgcattat 4620

aattaatagt tgtagctaca aaaggtaaaa gaaagtccgg ggcaggcaac aatagaaatc 4680

ggcaaaaaaa actacagaaa tactaagagc ttcttcccca ttcagtcatc gcatttcgaa 4740

acaagagggg aatggctctg gctagggaac taaccaccat cgcctgactc tatgcactaa 4800

ccacgtgact acatatatgt gatcgttttt aacatttttc aaaggctgtg tgtctggctg 4860

tttccattaa ttttcactga ttaagcagtc atattgaatc tgagctcatc accaacaaga 4920

aatactaccg taaaagtgta aaagttcgtt taaatcattt gtaaactgga acagcaagag 4980

gaagtatcat cagctagccc cataaactaa tcaaaggagg gagttctccg agaacaagca 5040

gaggttcgag tgtactcgga tcagaagtta caagttgatc gtttatatat aaactataca 5100

gagatgttag agtgtaatgg cattgcgcac attgtatacg ctacaagttt agtcacgtgc 5160

tagaagctgt tttttgcacc gaaaattttt tttttttttt ttttttgttt tttggtgaag 5220

gccgggtcac ccggccagcg acatggaggc ccagaatacc ctccttgaca gtcttgacgt 5280

gcgcagctca ggggcatgat gtgactgtcg cccgtacatt tagcccatac atccccatgt 5340

ataatcattt gcatccatac attttgatgg ccgcacggcg cgaagcaaaa attacggctc 5400

ctcgctgcag acctgcgagc agggaaacgc tcccctcaca gacgcgttga attgtcccca 5460

cgccgcgccc ctgtagagaa atataaaagg ttaggatttg ccactgaggt tcttctttca 5520

tatacttcct tttaaaatct tgctaggata cagttctcac atcacatccg aacataaaca 5580

accatggata gatccggaaa gcctgaactc accgcgacgt ctgtcgagaa gtttctgatc 5640

gaaaagttcg acagcgtctc cgacctgatg cagctctcgg agggcgaaga atctcgtgct 5700

ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcctgcggg taaatagctg cgccgatggt 5760

ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg ccgcgctccc gattccggaa 5820

gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc ctgacctatt gcatctcccg ccgtgcacag 5880

ggtgtcacgt tgcaagacct gcctgaaacc gaactgcccg ctgttctgca gccggtcgcg 5940

gaggccatgg atgcgatcgc tgcggccgat cttagccaga cgagcgggtt cggcccattc 6000

ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca tggcgtgatt tcatatgcgc gattgctgat 6060

ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg gacgacaccg tcagtgcgtc cgtcgcgcag 6120

gctctcgatg agctgatgct ttgggccgag gactgccccg aagtccggca cctcgtgcac 6180

gcggatttcg gctccaacaa tgtcctgacg gacaatggcc gcataacagc ggtcattgac 6240

tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg ccaacatctt cttctggagg 6300

ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg agcggaggca tccggagctt 6360

gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg ctccgcattg gtcttgacca actctatcag 6420

agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc agggtcgatg cgacgcaatc 6480

gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg cccgcagaag cgcggccgtc 6540

tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa accgacgccc cagcactcgt 6600

ccgagggcaa aggaatagtc agtactgaca ataaaaagat tcttgttttc aagaacttgt 6660

catttgtata gtttttttat attgtagttg ttctatttta atcaaatgtt agcgtgattt 6720

atattttttt tcgcctcgac atcatctgcc cagatgcgaa gttaagtgcg cagaaagtaa 6780

tatcatgcgt caatcgtatg tgaatgctgg tcgctatact gctgtcgatt cgatactaac 6840

gctcaattca tcattttttt tttattcttt tttttgattt cggtttcttt gaaatttttt 6900

tgattcggta atctccgaac agaaggaaga acgaaggaag gagcacagac ttagattggt 6960

atatatacgc atatgtagtg ttgaagaaac atgaaattgc ccagtattct taacccaact 7020

gcacagaaca aaaacctgca ggaaacgaag ataaatcatg tcgaaagcta catataagga 7080

acgtgctgct actcatccta gtcctgttgc tgccaagcta tttaatatca tgcacgaaaa 7140

gcaaacaaac ttgtgtgctt cattggatgt tcgtaccacc aaggaattac tggagttagt 7200

tgaagcatta ggtcccaaaa tttgtttact aaaaacacat gtggatatct tgactgattt 7260

ttccatggag ggcacagtta agccgctaaa ggcattatcc gccaagtaca attttttact 7320

cttcgaagac agaaaatttg ctgacattgg taatacagtc aaattgcagt actctgcggg 7380

tgtatacaga atagcagaat gggcagacat tacgaatgca cacggtgtgg tgggcccagg 7440

tattgttagc ggtttgaagc aggcggcaga agaagtaaca aaggaaccta gaggcctttt 7500

gatgttagca gaattgtcat gcaagggctc cctatctact ggagaatata ctaagggtac 7560

tgttgacatt gcgaagagcg acaaagattt tgttatcggc tttattgctc aaagagacat 7620

gggtggaaga gatgaaggtt acgattggtt gattatgaca cccggtgtgg gtttagatga 7680

caagggagac gcattgggtc aacagtatag aaccgtggat gatgtggtct ctacaggatc 7740

tgacattatt attgttggaa gaggactatt tgcaaaggga agggatgcta aggtagaggg 7800

tgaacgttac agaaaagcag gctgggaagc atatttgaga agatgcggcc agcaaaacta 7860

aaaaactgta ttataagtaa atgcatgtat actaaactca caaattagag cttcaattta 7920

attatatcag ttattacccg ggaatctcgg tcgtaatgat ttttataatg acgaaaaaaa 7980

aaaaattgga aagaaaaagc tttttcagct ttgagaatac cattgtgccg ttgaagcaat 8040

tagcagagaa acacaagttt ttgatatttg aagacaggaa gtttgccgac attgggaaca 8100

ctgttaaatt acaatacacg tctggtgtat accgtatcgc cgaatggtct gatatcacca 8160

atgcacacgg tgtgactggt gcgggcattg ttgctggttt gaagcaaggt gccgaggaag 8220

ttacgaaaga acctagaggg ttgttaatgc ttgccgagtt atcgtccaag gggtctctag 8280

cgcacggtga atacactcgt gggaccgtgg aaattgctaa gagtgataag gactttgtta 8340

ttggatttat tgctcaaaac gatatgggtg gaagagaaga gggctacgat tggttgatca 8400

tgacgccagg tgttggtctt gatgacaaag gtgatgcttt gggacaacaa tacagaactg 8460

tggatgaagt tgttgccggt ggatcagaca tcattattgt tgacatgaat ggtcttcggt 8520

ttccgtgttt cgtaaagtct ggaaacgcgg aagtcagcgc cctgcaccat tatgttccgg 8580

atctgcatcg caggatgctg ctggctaccc tgtggaacac ctacatctgt attaacgaag 8640

cgctggcatt gaccctgagt gatttttctc tggtcccgcc gcatccatac cgccagttgt 8700

ttaccctcac aacgttccag taaccgggca tgttcatcat cagtaacccg tatcgtgagc 8760

atcctctctc gtttcatcgg tatcattacc cccatgaaca gaaattcccc cttacacgga 8820

ggcatcaagt gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat ggcccgcttt atcagaagcc 8880

agacattaac gcttctggag aaactcaacg agctggacgc ggatgaacag gcagacatct 8940

gtgaatcgct tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag ctgcctcgcg cgtttcggtg 9000

atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag 9060

cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg 9120

gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc 9180

atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 9240

aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 9300

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 9360

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 9420

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 9480

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 9540

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 9600

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 9660

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 9720

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 9780

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 9840

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 9900

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 9960

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 10020

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 10080

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 10140

ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 10200

tga 10203

<210> 2

<211> 7266

<212> DNA

<213> 马克斯克鲁维酵母

<400> 2

ggcgcgggag attgataaga cttttctagt tgcatatctt ttatatttaa atcttatcta 60

ttagttaatt ttttgtaatt tatccttata tatagtctgg ttattctaaa atatcatttc 120

agtatctaaa aattcccctc ttttttcagt tatatcttaa caggcgacag tccaaatgtt 180

gatttatccc agtccgattc atcagggttg tgaagcattt tgtcaatggt cgaaatcaca 240

tcagtaatag tgcctcttac ttgcctcata gaatttcttt ctcttaacgt caccgtttgg 300

tcttttatag tttcgaaatc tatggtgata ccaaatggtg ttcccaattc atcgttacgg 360

gcgtattttt taccaattga agtattggaa tcgtcaattt taaagtatat ctctctttta 420

cgtaaagcct gcgagatcct cttaagtata gcggggaagc catcgttatt cgatattgtc 480

gtaacaaata ctttgatcgg cgctatctgt aatggaaaca tgaaaactgt attataagta 540

aatgcatgta tactaaactc acaaattaga gcttcaattt aattatatca gttattaccc 600

gggaatctcg gtcgtaatga tttttataat gacgaaaaaa aaaaaattgg aaagaaaaag 660

cttggatcca caggacgggt gtggtcgcca tgatcgcgta gtcgatagtg gctccgtccg 720

gcgtagagga tcctcaattc atcatttttt ttttattctt ttttttgatt tcggtttctt 780

tgaaattttt ttgattcggt aatctccgaa cagaaggaag aacgaaggaa ggagcacaga 840

cttagattgg tatatatacg catatgtagt gttgaagaaa catgaaattg cccagtattc 900

ttaacccaac tgcacagaac aaaaacctgc aggaaacgaa gataaatcat gtcgaaagct 960

acatataagg aacgtgctgc tactcatcct agtcctgttg ctgccaagct atttaatatc 1020

atgcacgaaa agcaaacaaa cttgtgtgct tcattggatg ttcgtaccac caaggaatta 1080

ctggagttag ttgaagcatt aggtcccaaa atttgtttac taaaaacaca tgtggatatc 1140

ttgactgatt tttccatgga gggcacagtt aagccgctaa aggcattatc cgccaagtac 1200

aattttttac tcttcgaaga cagaaaattt gctgacattg gtaatacagt caaattgcag 1260

tactctgcgg gtgtatacag aatagcagaa tgggcagaca ttacgaatgc acacggtgtg 1320

gtgggcccag gtattgttag cggtttgaag caggcggcag aagaagtaac aaaggaacct 1380

agaggccttt tgatgttagc agaattgtca tgcaagggct ccctatctac tggagaatat 1440

actaagggta ctgttgacat tgcgaagagc gacaaagatt ttgttatcgg ctttattgct 1500

caaagagaca tgggtggaag agatgaaggt tacgattggt tgattatgac acccggtgtg 1560

ggtttagatg acaagggaga cgcattgggt caacagtata gaaccgtgga tgatgtggtc 1620

tctacaggat ctgacattat tattgttgga agaggactat ttgcaaaggg aagggatgct 1680

aaggtagagg gtgaacgtta cagaaaagca ggctgggaag catatttgag aagatgcggc 1740

cagcaaaact aaaaaactgt attataagta aatgcatgta tactaaactc acaaattaga 1800

gcttcaattt aattatatca gttattaccc gggaatctcg gtcgtaatga tttttataat 1860

gacgaaaaaa aaaaaattgg aaagaaaaag cttggatcca caggacgggt gtggtcgcca 1920

tgatcgcgta gtcgatagtg gctcaactta gactaaggag gtttggtctg aaattactct 1980

aggtcgttac ttgttcgaaa gattaaagca agtcgaagtc caaaccatct tcggtttgcc 2040

aggtgacttc aacttgtccc tattggacaa gatctacgaa gtcccaggta tgagatgggc 2100

tggtaacgct aacgaattga acgctgctta cgctgctgat ggttacgcca gattaaaggg 2160

tatggcctgt gtcatcacca ccttcggtgt tggtgaattg tctgccttga acggtattgc 2220

cggttcttac gctgaacacg ttggtgtttt gcacgttgtt ggtaagtaag tgaggcgcgc 2280

ctgttccatc catctcttcc caagctaagc aattgttgtt gcaccacacc ttgggtaacg 2340

gtgacttcac tgttttccac agaatgtctt ccaacatttc tgaaaccact gctatgatca 2400

ctgacatcaa cagtgctcca tctgaaatcg acagatgtat cagaaccacc tacatctctc 2460

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<211> 7660

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<213> 马克斯克鲁维酵母

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tgcttgcgct gctcctgcta gaaatccaga ccttaagtag tcaaacaaat tgtgttgaaa 60

agctggctcc actgatctga ctgggaaatt attcagggta gtcaagtatg tggtataaag 120

aactacccca gcaagggaat ttgccaccaa aggaggcaat attctatcag gaataacttt 180

ccacccatac ttatttagtg ccttagtaac tattccaatg gaggaatttt cgaagtagta 240

tgtatatttg ggactccaaa acttatattt tgaacgtcgt accttagaat ccttatttgt 300

atcatcactc ccagtcaaca gtactcgaat ataatgcgta tagtcaaatc tggccggtcg 360

aaacagtttt aatggagttc tcatatagaa tgaagtcatc tgataaacca tagatcttcc 420

accagcagtt aaagcaccaa caagtgacga attctgattg gaaagaccat tctgctttac 480

ttttagagca tcttggtctt ctgagctcat tatacctcaa tcaaaactga aattaggtgc 540

ctgtcacggc tcttttttta ctgtacctgt gacttccttt cttatttcca aggatgctca 600

tcacaatacg cttctagatc tattatgcat tataattaat agttgtagct acaaaaggta 660

aaagaaagtc cggggcaggc aacaatagaa atcggcaaaa aaaactacag aaatactaag 720

agcttcttcc ccattcagtc atcgcatttc gaaacaagag gggaatggct ctggctaggg 780

aactaaccac catcgcctga ctctatgcac taaccacgtg actacatata tgtgatcgtt 840

tttaacattt ttcaaaggct gtgtgtctgg ctgtttccat taattttcac tgattaagca 900

gtcatattga atctgagctc atcaccaaca agaaatacta ccgtaaaagt gtaaaagttc 960

gtttaaatca tttgtaaact ggaacagcaa gaggaagtat catcagctag ccccataaac 1020

taatcaaagg aggatgtcga ctaagagtta ctcggaaaga gcagctgctc atagaagtcc 1080

agttgctgcc aagcttttaa acttgatgga agagaagaag tcaaacttat gtgcttctct 1140

tgatgttcgt aaaacagcag agttgttaaa attagtcgag gttttgggtc catatatctg 1200

tctattgaag acacatgtag atatcttgga ggatttcagc tttgagaata ccattgtgcc 1260

gttgaagcaa ttagcagaga aacacaagtt tttgatattt gaagacagga agtttgccga 1320

cattgggaac actgttaaat tacaatacac gtctggtgta taccgtatcg ccgaatggtc 1380

tgatatcacc aatgcacacg gtgtgactgg tgcgggcatt gttgctggtt tgaagcaagg 1440

tgccgaggaa gttacgaaag aacctagagg gttgttaatg cttgccgagt tatcgtccaa 1500

ggggtctcta gcgcacggtg aatacactcg tgggaccgtg gaaattgcta agagtgataa 1560

ggactttgtt attggattta ttgctcaaaa cgatatgggt ggaagagaag agggctacga 1620

ttggttgatc atgacgccag gtgttggtct tgatgacaaa ggtgatgctt tgggacaaca 1680

atacagaact gtggatgaag ttgttgccgg tggatcagac atcattattg ttggtagagg 1740

tcttttcgca aagggaagag atcctgtagt ggaaggtgag agatacagaa aggcgggatg 1800

ggacgcttac ttgaagagag taggcagatc cgcttaagag ttctccgaga acaagcagag 1860

gttcgagtgt actcggatca gaagttacaa gttgatcgtt tatatataaa ctatacagag 1920

atgttagagt gtaatggcat tgcgcacatt gtatacgcta caagtttagt cacgtgctag 1980

aagctgtttt ttgcaccgaa aatttttttt tttttttttt tttgtttttt ggtgaagtac 2040

attatgtgaa atttcacaac caaagaaaaa gagtttaata caagtgcgaa gaaccaaacc 2100

ttgcttctta gtccattgac cgttataaaa gatacacatt tctgctagac tttctgcttt 2160

actactagtg tgaagaaaga tacaagagtc aatttttatt gagtcttgga ccgtcgattg 2220

ctagaacaaa aaaatcaaat acacagttaa aaatggatca actaaatggt aaggaacaac 2280

aagagttcca aagaattgtg gaacaaaagc aaatgaagga cttcatgcgt ctatactcca 2340

acttggtcga aagatgtttc agtgactgtg tcaacgactt tacctctgct aagctaactt 2400

ccaaggagca aagctgcata atgaaatgct cagaaaagtt cttgaaacat agtgaacgtg 2460

ttggacaacg tttccaagag caaaacgctg ctttgaacca aagcatgggt cgttaagtta 2520

tacaaacagt tatgatataa atagttatag ctttctctct gtatatagcc aatatagcta 2580

ctaatagttc acataaacaa gtgctgcacg atgtgtaaag gaacttatct ataatagatt 2640

tcaaatatca accactacta ctcactatac tcagtgatgg ccgatgtcat aagaatcgct 2700

aatataaatt aataggcgaa tgcacaagaa gcataccaag aaaataaaag ttgaaggaaa 2760

aagagagaat ttagatctcc tcagacacca agtaatcggt attgtgttac ctgcaaaccg 2820

ataaatcggt gttgcagact ctctgcattg cactcaacta ggccttgcct ctatgaagag 2880

gtc 2883

Claims (19)

1.一种被基因工程改造以生产乳酸的酵母菌株，所述酵母菌株包括编码外源乳酸脱氢酶的染色体整合的基因，其中所述酵母菌株在发酵生产培养基中以至少1.875g/L-hr的平均比生产率生产乳酸，并且其中所述发酵生产培养基具有低于3.86的最终pH。

2.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株在发酵生产培养基中以至少3.00g/L-hr的平均比生产率生产乳酸。

3.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株在发酵生产培养基中以至少3.00g/L-hr的平均比生产率和小于1g/L的最终丙酮酸滴度生产乳酸。

4.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株选自由下述属组成的组：酵母属、克鲁维酵母属、伊萨酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、接合酵母属、裂殖酵母属、耶罗威亚酵母属和Lachancea。

5.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株选自由下述属组成的组：酵母属和克鲁维酵母属。

6.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中编码外源乳酸脱氢酶的所述基因在选自由下述组成的组中的至少一个染色体基因座处整合：丙酮酸脱羧酶基因或其同源物或类似物、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因或其同源物或类似物、甘油-3-磷酸磷酸酶基因或其同源物或类似物，以及NADH脱氢酶1基因或其同源物或类似物。

7.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中编码外源乳酸脱氢酶的所述基因在丙酮酸脱羧酶基因或其同源物或类似物、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因或其同源物或类似物、甘油-3-磷酸磷酸酶基因或其同源物或类似物以及NADH脱氢酶1基因或其同源物或类似物的基因座处整合。

8.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株对乳酸类似物具有抗性。

9.根据权利要求8所述的酵母菌株，其中所述乳酸类似物选自由下述组成的组：3-氯乳酸盐(β-氯乳酸盐)、3,3-二氯乳酸、3,3,3-三氯乳酸、3-氟乳酸、3,3-二氟乳酸、3,3,3-三氟乳酸、3-溴乳酸、3,3-二溴乳酸、3,3,3-三溴乳酸、乳酸的所有可能的2-卤素取代的衍生物、上面所述乳酸类似物中任一种的所有手性形式，以及所述乳酸类似物中任一种的任何盐。

10.根据权利要求1所述的酵母菌株，进一步包括突变，所述突变消除或降低选自由PCK1、NDE1、PDC1和GPP1组成的组中的一个或多个基因的功能，或消除或降低所述一个或多个基因的一个或多个同源物或类似物的功能。

11.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述乳酸为光学纯的D-乳酸。

12.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述乳酸为光学纯的L-乳酸。

13.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述乳酸为D-乳酸和L-乳酸的混合物。

14.一种用于生产乳酸的工艺，所述工艺包括下述步骤：

(a)提供根据权利要求1所述的酵母菌株和所述发酵生产培养基；和

(b)在所述发酵生产培养基中培养所述酵母菌株；以及

(c)从所述发酵生产培养基中回收乳酸。

15.一种用于选择对乳酸类似物具有改进的抗性的酵母菌株的工艺，所述工艺包括下述步骤：

(a)使亲本酵母菌株在第一培养基上生长，以产生酵母细胞的群体；

(b)任选地将所述酵母细胞的群体暴露于诱变剂；

(c)使所述酵母细胞的群体经受第二培养基，其中所述第二培养基包括乳酸类似物；以及

(d)从所述酵母细胞的群体选择酵母菌株。

16.一种被基因工程改造以生产乳酸的酵母菌株，包括消除或降低PCK1基因或其同源物或类似物的功能的突变。

17.一种被基因工程改造以生产乳酸的酵母菌株，包括消除或降低NDE1基因或其同源物或类似物的功能的突变。

18.一种被基因工程改造以生产乳酸的酵母菌株，包括消除或降低PDC基因或其同源物或类似物的功能的突变。

19.一种被基因工程改造以生产乳酸的酵母菌株，包括消除或降低GPP1基因或其同源物或类似物的功能的突变。

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