CN107250163A - 修饰的葡糖淀粉酶和具有增强的生物产物产生的酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能够将显著量的葡糖淀粉酶分泌至发酵培养基中的非天然酵母。所述葡糖淀粉酶可以促进生成葡萄糖的淀粉材料的降解，用于发酵成期望的生物产物，诸如乙醇。所述葡糖淀粉酶可以以具有酿酒酵母交配因子α2(Sc MFα2)或抑制性酸性磷酸酶(Sc PHO5)分泌信号的葡糖淀粉酶融合蛋白的形式提供。

Description

修饰的葡糖淀粉酶和具有增强的生物产物产生的酵母菌株

相关申请的交叉引用

本申请要求在2015年2月6日提交的题为Modified Glucoamylase Enzymes andYeast Strains Having Enhanced Ethanol Production的具有系列号62/112,807的共同拥有的美国临时申请的权益，所述申请以其整体通过引用并入本文。此外，在2015年2月6日创建的具有78千字节大小的题为“CAR0178P1_Sequence_Listing_ST25.txt”的ASCII文本文件的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及修饰的葡糖淀粉酶、表达这些酶的微生物和用于产生乙醇的发酵方法。

背景技术

通过发酵生产乙醇是众所周知的工业过程。然而，增加乙醇产量在技术上可能是困难的。存在各种因素，其使得微生物在设计用于增加的乙醇生产的发酵条件下生长具有挑战性。例如，发酵培养基可以具有较高的底物浓度以促进乙醇生产，但这些条件可以对细胞生长具有负面影响。此外，增加的乙醇浓度和不期望的副产物的积累也可以对细胞健康有害。已经针对对这些条件的耐受性选择酵母菌株，其可导致改善的乙醇产量。具体而言，酵母酿酒(Saccharomyces cerevisiae)酵母的乙醇耐受菌株已经作为用于生产乙醇的主要微生物用于工业环境中。

分子技术已经导致与乙醇耐受性相关的基因的鉴定。例如，Kajiwara(ApplMicrobiol Biotechnol.2000；53:568-74.)报道，参与不饱和脂肪酸(UFA)合成的OLE1基因的过表达导致细胞中的较高不饱和脂肪酸水平和较高乙醇产量。其它研究已经发现，通过破坏海藻糖水解酶、酸性海藻糖酶(ATH)来积累海藻糖(Kim等人,Appl EnvironMicrobiol.1996；62:1563-1569)或通过携带PRO1γ-谷氨酰激酶突变的菌株积累脯氨酸L-脯氨酸(Takagi,等人,Appl Environ Microbiol.2005；71:8656-8662.)改善酵母中的乙醇耐受性。麦角固醇与酿酒酵母的乙醇耐受性密切相关(Inoue,等人,Biosci BiotechnolBiochem.2000；64:229-236)。尽管在这方面已经取得进步，但使用表明乙醇耐受性的遗传修饰菌株可能单独不足以在发酵过程期间提供期望水平的乙醇。

除了发酵微生物的遗传概况以外，发酵培养基的组分可以对乙醇产量具有显著影响。在发酵过程中，培养基中存在碳水化合物或碳水化合物混合物。淀粉是广泛可用和廉价的碳水化合物来源。其可得自各种各样的植物来源，诸如玉米、小麦、大米、大麦等。许多生物体不能直接代谢淀粉，也不能缓慢且低效地代谢淀粉。

因此，通常在将淀粉加入发酵过程之前处理淀粉，以便将其分解成生物体容易发酵的单糖。通常，淀粉被水解以形成主要含葡萄糖(即右旋糖)的混合物。然而，用于发酵的制备物中的淀粉组合物的预处理可以是昂贵且费力的，因为其通常涉及向淀粉材料中添加纯化的淀粉降解酶，并且在实施发酵之前需要额外的步骤。此外，完全水解成葡萄糖增加显著的成本，所以大多数市售的葡萄糖产品倾向于含有少量各种寡聚多糖。

生产基于淀粉的乙醇的成本的很大部分是将淀粉分解成可发酵糖的酶。已经在酿酒酵母中尝试了各种分子技术以减少或消除将淀粉分解酶添加至发酵培养基的需求，但这些方法已经产生不同程度的成功。影响工程改造的菌株的商业可行性的潜在限制因素是酿酒酵母分泌大量外来蛋白的能力。

发明内容

本发明涉及包括非天然酵母的发酵方法，其在发酵培养基中提供高水平的葡糖淀粉酶活性。本发明还涉及葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，其被修饰以便用异源分泌序列部分或完全替代其天然分泌序列。本发明还涉及编码这些分泌序列修饰的葡糖淀粉酶的基因以及表达这些基因的微生物。本发明还涉及用于产生由生物体制造的生物衍生产物(发酵产物)诸如乙醇的方法。本发明还涉及可用于其它类型的组合物如动物饲料组合物的发酵副产物。

在与本申请相关的实验研究中，已经发现酿酒酵母交配因子α2(ScMFα2)分泌信号和酿酒酵母抑制性酸性磷酸酶(ScPHO5)分泌信号，当连接至葡糖淀粉酶并表达于微生物细胞中时，可以在发酵期间促进高水平的乙醇生产。令人惊讶的是，发现向天然分泌的酵母葡糖淀粉酶中添加ScMFα2分泌信号或ScPHO5分泌信号允许表达此类修饰酶的细胞在发酵培养基中产生显著更多的乙醇。本发明的一些方面使用扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)葡糖淀粉酶(本文中为“Sf GA”)，或其淀粉分解活性部分，诸如与SEQ ID NO:1的氨基酸27-515具有90％或更高序列相同性的Sf GA，用于制备Sc MFα2或Sc PHO5分泌信号-葡糖淀粉酶。

因此，本发明的方面提供了多肽，其包含(a)与SEQ ID NO:3(Sc MFα2分泌信号)或SEQ ID NO:5(Sc PHO5分泌信号)具有90％或更高相同性的分泌信号氨基酸序列和(b)来自酵母、真菌或细菌葡糖淀粉酶多肽的葡糖淀粉酶氨基酸序列，其中所述多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一些方面，葡糖淀粉酶氨基酸序列基于来自扣囊复膜酵母的葡糖淀粉酶序列。在一些方面，葡糖淀粉酶氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸27-515具有90％或更高序列相同性，其包括称为“Sf GA-1”的Sf GA葡糖淀粉酶的淀粉分解活性部分。在一些方面，多肽与SEQ ID NO:7(Sc MFα2 SS-Sf GA-1)具有95％或更高序列相同性或与SEQ ID NO:9(ScPHO5 SS-Sf GA-1)具有95％或更高序列相同性。

本发明的方面还提供了编码Sc MFα2分泌信号-葡糖淀粉酶或Sc PHO5分泌信号-葡糖淀粉酶的核酸序列。方面包括与SEQ ID NO:8(编码Sc MFα2 SS-Sf GA-1)具有75％或更高相同性或与SEQ ID NO:10(编码Sc PHO5 SS-Sf GA-1)具有75％或更高相同性的核酸。这些方面包括其中核酸存在于载体构建体上的构建体，其可以包括以下序列中的一种或多种：启动子序列、终止子序列、选择性标记序列、基因组整合序列和/或复制起点序列。核酸可以整合至宿主基因组DNA的一个或多个位置中，或者可以存在于细胞内而不是整合的，诸如在质粒或附加体构建体上。本发明还提供可用于检测细胞中的具有Sc MFα2或Sc PHO5分泌序列的葡糖淀粉酶基因的核酸，诸如DNA寡聚体(例如，单链DNA PCR引物或更长的线性DNA片段)。

本发明的方面还提供了表达Sc MFα2分泌信号-葡糖淀粉酶或Sc PHO5分泌信号-葡糖淀粉酶的宿主细胞。在一些方面，宿主细胞能够将酶分泌至存在细胞的培养基中。宿主细胞还可以耐受衍生自由酶的淀粉分解活性导致的前体的细胞的生物衍生产物，诸如乙醇或另一种产物。例如，宿主细胞可以是商购的菌株或具有一种或多种特定遗传修饰的菌株，所述遗传修饰提供对生物衍生产物的耐受性增加，例如增加的乙醇耐受性。示例性宿主细胞包括真菌细胞诸如酿酒酵母。

本发明的方面还提供了用于产生生物衍生产物的方法。所述方法包括提供发酵培养基，其包含表达Sc MFα2分泌信号-葡糖淀粉酶或Sc PHO5分泌信号-葡糖淀粉酶的宿主细胞，其中生物衍生产物由发酵方法产生。生物衍生产物可以是衍生自葡萄糖聚合物诸如淀粉、直链淀粉或支链淀粉的产物的酶促降解的产物。在一种示例性方法中，醇(即乙醇)由发酵方法产生。在另一种示例性方法中，有机酸(即乳酸)由发酵方法产生。

本发明的方面还提供了用于处理包含葡萄糖聚合物诸如淀粉、直链淀粉或支链淀粉的培养基的方法。所述方法包括提供培养基，其包含葡萄糖聚合物和表达Sc MFα2分泌信号-葡糖淀粉酶或Sc PHO5分泌信号-葡糖淀粉酶的宿主细胞。在所述方法中，葡萄糖聚合物与由细胞分泌的葡糖淀粉酶接触，并且葡萄糖聚合物降解成葡萄糖。处理的培养基可用于使用不同细胞的发酵过程，或可用于非发酵过程。

本发明的另一个方面是用于产生发酵产物的发酵方法。所述方法包括发酵包含淀粉材料和非天然酵母的液体培养基的步骤，所述非天然酵母包含编码包含葡糖淀粉酶的多肽的外源核酸。非天然酵母为培养基提供2.25U或更大/克生物量的量的葡糖淀粉酶活性。

本发明的方面还提供了用于通过发酵产生乙醇的方法，其中乙醇以90g/L或更高的浓度存在于发酵培养基中。在所述方法中，发酵包含淀粉材料和非天然酵母的液体培养基，所述非天然酵母包含编码多肽的外源核酸，所述多肽包含葡糖淀粉酶部分和与葡糖淀粉酶异源的信号序列。发酵可以提供液体培养基中约90g/L或更高的乙醇浓度，诸如约90g/L至约170g/L的范围内。

在另一个方面，本发明提供了可用于制备饲料组合物的方法和组合物。饲料组合物包括获得自发酵培养基的发酵培养基副产物，所述发酵培养基衍生自本公开的非天然酵母。例如，在已经完成发酵过程之后，可以从发酵培养基除去生物产物中的一些或全部，以提供包含非生物产物固体的精制组合物。非生物产物固体可以包括非天然酵母、培养基中未被酵母利用的原料以及发酵副产物。精制组合物可用于形成饲料组合物，诸如家畜饲料组合物。包含非生物产物固体的精制组合物可以提供碳水化合物和蛋白补充剂以改善饲料组合物的营养含量。

附图说明

图1是比较来自本公开的菌株的浓缩提取物的蛋白凝胶的图片。

具体实施方式

下面描述的本发明的方面并不意欲是穷举的，或者将本发明限于以下详述中公开的精确形式。相反，所选择和描述的方面的目的使得可以便于本领域技术人员对本发明的原理和实践的欣赏和理解。

本发明的方面涉及被修饰成用异源分泌序列替代其天然分泌序列的葡糖淀粉酶基因，所述异源分泌序列是酿酒酵母交配因子α2(Sc MFα2)分泌信号或酿酒酵母抑制性酸性磷酸酶(Sc PHO5)分泌信号。能够充当这些酶表达的模板的核酸也是本发明的方面。

本发明的方面还涉及作为表达这些酶的微生物，特别是真菌生物诸如酵母(例如酿酒酵母)。此类生物体可以表达具有Sc MFα2或Sc PHO5分泌信号的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可以从细胞分泌至发酵培养基中，其中所述酶可以对存在于发酵培养基中的葡萄糖聚合酶具有淀粉分解活性。进而，所述酶可以引起葡萄糖聚合物降解成葡萄糖，其可以进入细胞并用作用于产生靶化合物诸如乙醇的碳源。

如本文所用的术语“外源”意味着分子，诸如核酸，或活性，诸如酶活性，被引入宿主生物体。外源核酸可以通过众所周知的技术引入宿主生物体中，并且可以在宿主染色体材料外部维持(例如，维持在非整合载体上)，或可以整合至宿主的染色体中，诸如通过重组事件。外源核酸可以编码与宿主生物体同源或异源的酶或其部分。

术语“异源”是指来自不同于参考的分子或生物体的来源的分子或活性。例如，在本公开的上下文中，“异源信号序列”是指不同于参考的多肽或酶的信号序列。因此，当从葡糖淀粉酶除去天然信号序列并用来自不同多肽的信号序列替换时，修饰的葡糖淀粉酶具有“异源信号序列”。因此，与参考的生物体异源的基因或蛋白是在该生物体中未发现的基因或蛋白。例如，在第一真菌物种中发现且外源引入作为宿主生物体的第二真菌物种的特定葡糖淀粉酶基因是第二真菌生物体“异源的”。

葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)是淀粉分解酶，其从寡糖链和多糖链的非还原末端依次水解1,4-连接的a-D-葡萄糖基残基，且释放D-葡萄糖。

葡糖淀粉酶还可以在支链淀粉分支点上切割α-1,6键。如本文所用，关于Sc MFα2或Sc PHO5分泌信号-葡糖淀粉酶的术语“淀粉分解活性”涉及这些酶促机制。葡糖淀粉酶多肽可以是天然存在的葡糖淀粉酶的变体，或天然存在的葡糖淀粉酶的部分(例如在其N-端、其C-端或两者被截短的葡糖淀粉酶)，而葡糖淀粉酶多肽保留淀粉分解活性。

葡糖淀粉酶的替代名称包括淀粉葡糖苷酶；γ-淀粉酶；溶酶体α-葡萄糖苷酶；酸性麦芽糖酶；外-1,4-α-葡萄糖苷酶；葡糖淀粉酶；γ-1,4-葡聚糖葡糖水解酶；酸性麦芽糖酶；1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶。

大多数葡糖淀粉酶是多结构域酶。许多葡糖淀粉酶包括经由O-糖基化连接区连接至催化结构域的淀粉结合结构域。淀粉结合结构域可以折叠为反平行β-桶，并且可以具有淀粉或β-环糊精的两个结合位点。然而，一些葡糖淀粉酶不包括淀粉结合结构域(例如参见Hostinova等人,Archives of Biochemistry and Biophysics,411:189–195,2003)，或包括非规范淀粉结合结构域。例如，米根霉(Rhizopus oryzae)葡糖淀粉酶具有C-端生淀粉结合结构域，并且扣囊复膜酵母IFO 0111葡糖淀粉酶缺乏明确的淀粉结合结构域(Hostinova等人，同上)。因此，本发明的一些方面涉及不包括淀粉结合结构域且具有用Sc MFα2或ScPHO5分泌信号修饰的N-端的葡糖淀粉酶，并且其它方面涉及包括淀粉结合结构域且具有用Sc MFα2或Sc PHO5分泌信号修饰的N-端的葡糖淀粉酶。

葡糖淀粉酶还可以具有催化结构域，其具有含有中心漏斗形活性位点的配置的扭曲(α/α)(6)-桶的构型。葡糖淀粉酶可以具有大约450个残基的结构保守的催化结构域。在一些葡糖淀粉酶中，催化结构域通常随后为接头区域，由连接至大约100个残基的淀粉结合结构域的30至80个残基组成。

葡糖淀粉酶特性可以与其结构特征相关。使用来自催化和淀粉结合结构域模型的信息构建基于结构的多重序列比对(参见例如，Coutinho,P.M.,和Reilly,P.J.,1994.Protein Eng.7:393–400和749–760)。已经显示，基于结构-功能关系研究，催化和淀粉结合结构域在功能上是独立的，并且在微生物葡糖淀粉酶中存在结构相似性。从其它研究来看，已经显示特定葡糖淀粉酶残基参与指导蛋白构象变化、底物结合、热稳定性和催化活性(参见例如，Sierks,M.R.,等人1993.Protein Eng.6:75–79；和Sierks,M.R.,和Svensson,B.1993.Biochemistry 32:1113–1117)。因此，本领域理解葡糖淀粉酶序列与蛋白功能之间的相关性，并且本领域技术人员可以设计和表达具有一个或多个氨基酸缺失、取代和/或添加的淀粉分解活性葡糖淀粉酶的变体。例如，在一些方面，Sc MFα2或Sc PHO5分泌信号-葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶部分可以含有天然存在的葡糖淀粉酶的截短形式，具有如本文所述的淀粉分解活性的至少具有催化和任选淀粉结合结构域的截短版本。

Hostinova等人(Archives of Biochemistry and Biophysics,411:189–195,2003)描述了酵母菌株扣囊复膜酵母IFO 0111(本文中称为“Sf GA-1”)中葡糖淀粉酶基因Glm的核苷酸序列。根据Hostinova等人，扣囊复膜酵母Glm基因被转录成1.7kb RNA转录物，其编码515氨基酸蛋白，并且由SEQ ID NO:1表示。在515氨基酸长多肽链中，26个N-端氨基酸残基构成信号肽，且随后489个氨基酸残基构成成熟蛋白。缺乏信号序列且489个氨基酸长的成熟的Glm具有呈去糖基化形式的54,590Da的预测分子量。与其它葡糖淀粉酶一致，显示Glm在催化结构域中具有同源性。

Itoh等人(J.Bacteriol.169:4171-4176)描述了酵母扣囊复膜酵母中另一种葡糖淀粉酶基因GLU1(本文中称为“Sf GA-2”)的核苷酸序列。扣囊复膜酵母GLU1基因被转录成2.1kb RNA转录物，其编码519氨基酸蛋白，且具有57,000Da的分子量。GLU1具有四个潜在的糖基化位点(对于具有2000Da的分子量的天冬酰胺连接的糖苷)。GLU1具有四个潜在的糖基化位点(对于具有2000Da的分子量的天冬酰胺连接的糖苷)。GLU1具有可能在蛋白输出期间被切除的天然分泌信号序列。切割位点之前是碱性氨基酸Lys-Arg，其被认为是产生成熟蛋白的蛋白水解加工信号。

Itoh等人(同上)还描述了来自酵母和真菌的葡糖淀粉酶的氨基酸序列的比对。比对扣囊复膜酵母、黑曲霉(A.niger)、米根霉和糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)和酿酒酵母，其显示出五个高度同源的区段(S1-S5)。各保守区段的这些部分被显示为彼此构象相似。通常位于羧基端的S5区段似乎对淀粉分解活性是不必要的，因为来自酵母属菌种的葡糖淀粉酶缺乏该区域。

在这方面，本发明还考虑具有葡糖淀粉酶活性的Sf GA的变体和部分。表1和2呈现各种真菌和细菌葡糖淀粉酶基因的列表，其包括葡糖淀粉酶的天然信号序列和一些序列中前肽的氨基酸位置。

表1：真菌葡糖淀粉酶

表2：细菌葡糖淀粉酶

如本文和表1和2中所示，来自各种真菌和细菌物种的葡糖淀粉酶通常也包括天然的“信号序列”。各种其它术语可用于指示如本领域已知的“信号序列”，诸如其中词语“信号”被“分泌”或“靶向”或“定位”或“转化”或“前导(leader)”替换，且词语“序列”被“肽”或“信号”替换。通常，信号序列是位于新合成的蛋白的氨基端的短氨基酸区段(通常在5-30个氨基酸的范围内)。大多数信号肽包括碱性N-端区域(n-区域)、中央疏水区域(h-区域)和极性C-端区域(c-区域)(例如，参见von Heijne,G.(1986)Nucleic Acids Res.14,4683-4690)。信号序列可以将蛋白靶向至细胞的特定部分，或者可以靶向蛋白用于从细胞分泌。例如，已经显示，糖化酵母葡糖淀粉酶STAI基因的天然N-端信号序列可以将其靶向至分泌装置的内质网(例如，参见Yamashita,I.等人,(1985)J.Bacteriol.161,567-573)。

在一个方面，本发明提供了用Sc MFα2或Sc PHO5分泌信号部分或完全替换葡糖淀粉酶的天然信号序列。在另一个方面，本发明除了其天然分泌信号之外还提供了将Sc MFα2或Sc PHO5分泌信号添加至葡糖淀粉酶。鉴于异源分泌信号的添加，蛋白可以被称为“融合蛋白”，并且如下注释：[Sc MFα2-SS]-[GA]和[Sc PHO5-SS]-[GA]。

酿酒酵母交配因子α2(Sc MFα2)分泌信号描述于美国专利号4,546,082(Kurjan等人)。Sc MFα2 SS序列如下：MKFISTFLTFILAAVSVTA(SEQ ID NO.10)。Sc MFα2序列来自基因YGL089C(YGL089C)，而MFα1由基因YPL187W MFα1编码，且MFα2是由MATa细胞分泌的信息素。在一个方面，葡糖淀粉酶融合蛋白包含与SEQ ID NO:10具有90％或更高相同性的分泌信号序列。例如，SEQ ID NO:10的一个氨基酸可以被氨基酸、诸如保守氨基酸取代。

酿酒酵母抑制性酸性磷酸酶(Sc PHO5)分泌信号描述于美国专利号5,521,086(Scott等人)和Meyhack等人(EMBO J.6:675-680,1982)。Sc PHO5 SS序列如下：MFKSVVYSILAASLANA(SEQ ID NO.11)。Sc PHO5序列来自PHO5，其是编码酿酒酵母酸性磷酸酶的结构基因，其由培养基中的浓度或无机磷酸盐(Pi)调节。在一个方面，葡糖淀粉酶融合蛋白包含与SEQ ID NO.11具有90％或更高相同性的分泌信号序列。例如，SEQ ID NO.11的一个氨基酸可以被氨基酸、诸如保守氨基酸取代。

可以进行分子技术以产生核酸序列，其是表达Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因的模板(如果葡糖淀粉酶蛋白/核苷酸序列是本领域已知的)。作为一般情况，制备核酸以编码包含Sc PHO5 SS-或Sc MFα2 SS序列和葡糖淀粉酶序列的蛋白。

可以使用编码功能性葡糖淀粉酶多肽的任何序列。在一些方面，葡糖淀粉酶序列可以是葡糖淀粉酶基因的天然(“野生型”)序列，其中Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因的葡糖淀粉酶部分的序列在任何氨基酸位置都不同于天然序列。在其它方面，Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因的葡糖淀粉酶部分的序列在一个或多个氨基酸位置不同于天然序列。差异可以是例如(a)从野生型序列去除一个或多个氨基酸，(b)向野生型序列中添加一个或多个氨基酸，(c)野生型序列的取代，(a)和(c)的组合，或(b)和(c)的组合。

例如，在一个方面，在添加Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS序列之前，葡糖淀粉酶的天然序列可以在其N-端改变。在一些方面，在连接Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS序列之前，除去天然葡糖淀粉酶信号序列的全部或部分。例如，葡糖淀粉酶的天然前导序列的一部分可以通过缺失天然分泌信号的一个或多个、但不是全部氨基酸(例如，缺失最高达50％、60％、70％、80％、90％或95％的天然前导序列)来改变。此类天然前导序列的一部分的缺失可引起天然葡糖淀粉酶前导序列失去其天然功能性，其被由Sc MFα2或Sc PHO5分泌信号提供的功能性所替换。在其它方面，所有天然分泌信号都可以从葡糖淀粉酶除去，并用Sc MFα2 SS或ScPHO5 SS序列替换。

例如，且参考表1，在制备融合蛋白构建体中，去除扣囊复膜酵母IFO 0111葡糖淀粉酶(Sf GA-1)的前18个氨基酸，其对应于使用CBS预测服务器预测的前导序列(即，SEQ IDNO:12的氨基酸1-18)。因此，扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶天然分泌信号的一部分用Sc MFα2SS序列(SEQ ID NO:10；19个氨基酸)或用Sc PHO5 SS序列(SEQ ID NO:11；17个氨基酸)替换，其然后可以直接或间接地连接至扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶多肽的剩余部分(例如，SEQID NO:1的氨基酸19-515)。这提供了516个氨基酸的Sc MFα2 SS-Sf GA(SEQ ID NO:13)或514个氨基酸的Sc PHO5 SS-Sf GA(SEQ ID NO:14)。

作为另一个实例，葡糖淀粉酶的天然前导序列的一个或多个氨基酸可以通过取代来改变，所述取代是天然葡糖淀粉酶前导序列中的特定位置处的天然氨基酸用不同于天然氨基酸的氨基酸来替换。例如，葡糖淀粉酶的天然前导序列的一部分可以通过取代天然分泌信号的一个或多个(例如，最高达50％、60％、70％、80％、90％或95％的天然前导序列可被取代)来改变。一个或多个氨基酸的取代可引起天然葡糖淀粉酶前导序列失去其天然功能性，其被由Sc MFα2或Sc PHO5分泌信号提供的功能性所替换。

在其它方面，包含Sc PHO5 SS-或Sc MFα2 SS序列和葡糖淀粉酶序列的融合多肽任选地包含天然葡糖淀粉酶多肽或Sc PHO5 SS-或Sc MFα2 SS序列中不存在的额外序列。额外序列可以为天然多肽中不存在的分泌信号修饰的葡糖淀粉酶提供功能性。额外功能性包括，例如，蛋白酶位点或其它蛋白或材料的结合位点。

天然葡糖淀粉酶多肽或Sc PHO5 SS-或Sc MFα2 SS序列中可能不存在、但可添加的额外序列的实例是接头或间隔区序列。接头序列可以位于Sc PHO5 SS-或Sc MFα2 SS序列和葡糖淀粉酶序列之间。此类融合多肽[分泌信号修饰的多肽]可以如下注释：[Sc MFα2-SS]-[L]-[GA]和[Sc PHO5-SS]-[L]-[GA]，其中“L”表示将信号序列与葡糖淀粉酶连接的一个或多个氨基酸。示例性接头包括最多达5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。接头可以包括引起接头刚性且防止葡糖淀粉酶的分泌信号和其它部分之间的相互作用的氨基酸。刚性接头可以包括残基诸如Pro、Arg、Phe、Thr、Glu和Gln。或者，融合多肽可以包括柔性接头。柔性接头可以包括甘氨酸残基并将信号序列连接至融合蛋白的葡糖淀粉酶部分，而不会干扰它们各自的功能。在一些方面，多肽包括具有蛋白酶切割序列的接头。示例性蛋白酶切割序列包括凝血酶、因子Xa、鼻病毒3C、TEV蛋白酶、Ssp DnaB、内含肽、Sce VMA1内含肽、肠激酶和KEX2的蛋白酶切割序列(参见例如，Waugh,D.S.,Protein Expr Purif.80(2):283–293,2011；Zhou等人,Microbial Cell Factories 13:44,2014；和Bourbonnais等人,J.Bio.Chem.263(30):15342,1988)。

天然葡糖淀粉酶多肽或Sc PHO5 SS-或Sc MFα2 SS序列中可能不存在、但可添加的额外序列的另一实例是标签序列。标签序列可以位于葡糖淀粉酶序列的C-端，并且此类蛋白可以如下注释：[Sc MFα2-SS]-[GA]-[T]和[Sc PHO5-SS]-[GA]-[T]，其中“T”表示提供标签序列的一个或多个氨基酸。示例性肽标签包括最多达5、10、15或20个氨基酸。肽标签可用于各种目的中的任何一种或多种。例如，标签可以允许通过标签-结合成员与标签特异性相互作用的能力来从培养基纯化酶。标签还可以允许使用具有可检测标记的标签-结合成员来检测或鉴定蛋白。示例性短肽标签是多-Arg、FLAG、多-His、c-myc、S和Strep II。

本公开的分泌信号修饰的多肽也可以具有除了天然分泌序列之外的天然葡糖淀粉酶多肽的一个或多个区域的缺失，其中所述缺失不影响多肽的淀粉分解活性。缺失可以基于关于天然葡糖淀粉酶的结构和功能的已知信息，包括突变研究和序列比对(例如，参见Coutinho，同上，和Sierks，同上)。在一些方面，分泌信号修饰的多肽具有葡糖淀粉酶多肽的序列的最多达1％、最多达2％、最多达4％、最多达6％、最多达8％、最多达10％、最多达12％、最多达14％、最多达16％、最多达18％、最多达20％或最多达25％的缺失。在一些方面，本公开的分泌信号修饰的多肽具有对应于天然葡糖淀粉酶多肽的C-端的部分的缺失。

已经生成了葡糖淀粉酶的截短形式，并且其已显示具有酶促活性。例如，Evans等人(Gene,91:131；1990)生成了一系列的葡糖淀粉酶的截短形式，以研究多少O-糖基化区域是GAII(酶的缺乏生淀粉-结合结构域的完全活性形式)的活性或稳定性所必要的。已发现，C-端的大部分可以从GAII缺失，对酶的活性、热稳定性或分泌具有不显著的影响。

与引起葡糖淀粉酶活性变化相关的各种氨基酸取代也是本领域已知的。已显示葡糖淀粉酶序列中各个位置处的氨基酸取代影响特性诸如热稳定性、淀粉水解活性、底物使用和蛋白酶抗性。因此，本公开考虑使用Sc MF 2或Sc PHO5分泌信号与在多肽的葡糖淀粉酶部分中包括一个或多个氨基酸取代的葡糖淀粉酶序列，其中所述取代不同于葡糖淀粉酶的野生型序列。

例如，美国专利号8,809,023描述了在淀粉水解期间降低异麦芽糖合成和淀粉水解活性的比率(IS/SH比率)的方法。具体而言，描述了里氏木霉葡糖淀粉酶(Tr GA)(具有携带信号肽的N-端的632个氨基酸的总长度)，其在如下氨基酸位置被修饰：D44R和A539R；或D44R、N61I和A539R。据报道，该葡糖淀粉酶变体在淀粉水解期间与所述亲本葡糖淀粉酶相比表现出降低的IS/SH比率。作为实例，本公开考虑替换期望的葡糖淀粉酶(例如，具有ScMFα2或Sc PHO5分泌信号的Sf GA)的天然前导序列，其中期望的葡糖淀粉酶还具有对应于修饰的Tr GA的D44R和A539R；或D44R、N61I和A539R取代的氨基酸取代。在更广泛的意义上，Sc MFα2或Sc PHO5分泌信号可以与具有以下氨基酸取代的葡糖淀粉酶变体一起使用：D44R和A539R；或D44R、N61I和A539R，所述位置对应于TrGA序列中的相应位置，其中所述葡糖淀粉酶变体与TrGA序列的整个长度具有至少90％氨基酸序列相同性，模板葡糖淀粉酶序列与TrGA序列相应的“各自位置”可以通过例如已知葡糖淀粉酶多肽序列(构建Sc PHO5 SS-或Sc MFα2 SS葡糖淀粉酶融合体的模板)与TrGA序列的序列比对来理解。

作为另一个实例，与野生型葡糖淀粉酶变体相比，美国专利号8,592,194描述了具有增加的热稳定性的葡糖淀粉酶变体。在本公开中还描述了里氏木霉葡糖淀粉酶，但对天然Tr GA序列在以下位置处具有一个或多个氨基酸取代：10、14、15、23、42、45、46、59、60、61、67、68、72、73、97、98、99、102、108、110、113、114、122、124、125、133、140、144、145、147、152、153、164、175、182、204、205、214、216、219、228、229、230、231、236、239、240、241、242、244、263、264、265、268、269、276、284、291、300、301、303、310、311、313、316、338、342、344、346、349、359、361、364、379、382、390、391、393、394、408、410、415、417和418。作为实例，本公开考虑用Sc MFα2或Sc PHO5分泌信号替换Sf GA的天然前导序列，其中Sf GA还具有在提供增加的热稳定性中表现的氨基酸取代中的任何一种或多种。在更广泛的意义上，Sc MFα2或Sc PHO5分泌信号可以与具有提供增加的热稳定性的氨基酸取代的葡糖淀粉酶变体一起使用，所述位置对应于TrGA序列中的相应位置。

来自两种或更多种葡糖淀粉酶的“相应”氨基酸的测定可以通过其氨基酸序列的全部或部分的比对来确定。序列比对和序列相同性的生成包括全局比对和局部比对，其通常使用计算方法。为了提供全局比对，使用跨越所有查询序列的整个长度的全局优化迫使序列比对。相比之下，在局部比对中，鉴定长序列内较短的相似性区域。

如本文所用，“等同位置”意指基于一种葡糖淀粉酶的氨基酸序列的比对或作为三维结构的比对的两个序列(例如，具有期望的取代的Sf GA序列和GA序列)共有的位置。因此，序列比对或结构比对或两者可用于确定等同性。

在一些实践模式中，BLAST算法用于比较和确定序列相似性或相同性。此外，可以确定可以分配权重或评分的序列中的缺口的存在或显著性。这些算法也可用于确定核苷酸序列相似性或相同性。用于确定相关性的参数基于本领域已知用于计算确定的匹配的统计学相似性和显著性的方法来计算。预期相关的基因产物具有高相似性，诸如大于50％序列相同性。用于使用BLAST算法确定两个或更多个序列相关性的示例性参数可以如下。

在一些实践模式下，使用具有默认参数的BLAST(National Center forBiological Information(NCBI)Basic Local Alignment Search Tool)版本2.2.29软件进行比对。使用具有默认参数的BLAST版本2.2.29算法的相对于参考序列具有XX％(例如，80％)的相同性评分的序列被认为与参考序列具有至少XX％相同性或者等效地具有XX％序列相同性。全局比对可以将与例如扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶具有显著相同性的序列进行比对，以确定如果使用葡糖淀粉酶变体，靶序列(例如，葡糖淀粉酶直向同源物)中何种相应的氨基酸位置可以被一个或多个氨基酸取代。

编码Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶多肽的核酸序列，以及任何调节序列(例如终止子、启动子等)和载体序列(例如，包括选择标记物、整合标记物、复制序列等)可以在一些实践模式中使用已知的分子技术来制备。用于制备DNA构建体(例如，对于包括ScMFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因的DNA构建体)的方法的一般指导可见于Sambrook等人Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；和Ausubel等人Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,N.Y.,1993。

当在PCR中使用少量葡糖淀粉酶模板DNA作为起始材料时，可以使用包括MFα2 SS或Sc PHO5 SS序列和葡糖淀粉酶序列在其天然信号序列3'的部分的引物以生成相对大量的特异性DNA片段，其包括MFα2 SS或Sc PHO5 SS序列和葡糖淀粉酶基因。

PCR技术可以用于修饰天然葡糖淀粉酶核酸序列以添加Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS序列，或者在葡糖淀粉酶核酸序列中引入一个或多个突变以提供变体。PCR技术描述于例如Higuchi,(1990)于PCR Protocols,pp.177-183,Academic Press；Ito等人(1991)Gene102:67-70；Bernhard等人(1994)Bioconjugate Chem.5:126-132；和Vallette等人(1989)Nuc.Acids Res.17:723-733。所述技术可以任选地包括先前制备的编码葡糖淀粉酶多肽的DNA的位点定向的(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒式诱变。

或者，核酸分子可以由定制的基因合成提供者诸如DNA2.0(Menlo Park,CA)或GeneArt(Life Technologies,Thermo Fisher Scientific)生成。

可以构建表达载体以包括可操作连接至在宿主生物体中有功能的表达控制序列的Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶核酸序列。适用于宿主生物体的表达载体包括例如质粒、附加体和人造染色体。载体可以包括可操作以稳定整合入宿主染色体的选择序列或标记物。另外，载体可以包括一种或多种选择标记基因和适当的表达控制序列。也可以包括选择性标记基因，例如，提供对抗生素或毒素的抗性，补充营养缺陷型缺陷，或提供不在培养基中的关键营养物。表达控制序列可以包括本领域众所周知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。

在一些方面，核酸可以进行密码子优化。用于Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶部分的核酸模板可以是编码葡糖淀粉酶的天然DNA序列，或者模板可以是优化用于在期望的宿主细胞中表达的密码子优化的版本。提供关于特定宿主生物体中期望的密码子使用的信息的数据库是本领域已知的。

根据本公开的一个方面，包含Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶的DNA构建体可操作连接至启动子序列，其中启动子序列在选择的宿主细胞中有功能。在一些方面，启动子在真菌宿主细胞中显示转录活性，并且可以衍生自与宿主细胞同源或异源的编码蛋白的基因。在一些方面，启动子可用于在酿酒酵母中表达。众所周知的组成型启动子的实例包括但不限于细胞色素c启动子(pCYC)、翻译延长因子启动子(pTEF)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(pGPD)、磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)和醇脱氢酶启动子(pADH)。任选地，还可以在载体上包括控制表达的额外因子，如增强子等。

包括Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因的表达载体还可以包括在宿主细胞中有功能的任何终止序列。例如，终止序列和启动子序列可以来自相同的细胞，或终止序列与宿主细胞同源。终止序列可以对应于使用的任何启动子。

可以使用载体将DNA构建体引入宿主细胞。载体可以是当引入宿主细胞时稳定引入的任何载体。在一些方面，载体被整合至宿主细胞基因组中并复制。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。在一些方面，载体是包含与葡糖淀粉酶编码序列可操作连接的调节序列的表达载体。

包含Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因的DNA构建体可以进一步包括选择性标记物，从而便于宿主细胞中的选择。例如，可选择标记物可用于转化的酵母。酵母选择性标记物的实例包括通常用于选择转化的酵母细胞的标记物。可以使用控制营养缺陷型的基因使用营养缺陷型标记物，这意味着该基因使得酵母产生酵母生长所需的营养物。控制营养缺陷型的实例基因包括亮氨酸营养缺陷型(LEU2)、组氨酸营养缺陷型(HIS3)、尿嘧啶营养缺陷型(URA3、URA5)和色氨酸营养缺陷型(TRP1)。

DNA构建体可以是整合至基因组中并与其已被整合至其中的染色体一起复制的构建体。例如，可以用编码葡糖淀粉酶并将DNA构建体以一个或多个拷贝整合至宿主染色体中的DNA构建体转化真菌细胞。该整合通常被认为是有利的，因为DNA序列更可能被稳定地维持。可以根据常规方法，诸如通过同源或异源重组，进行DNA构建体整合至宿主染色体中。

非天然酵母还可以包括不同于用异源信号序列修饰葡糖淀粉酶的一种或其它遗传修饰。例如，一种或多种额外修饰可以包括提供不同的多糖降解酶，诸如外源或修饰的α-淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶或环糊精糖基转移酶；外源或修饰的糖转运蛋白基因(诸如异麦芽糖转运蛋白)；和/或异源或修饰的将低分子量非葡萄糖糖转化为葡萄糖的基因，诸如异麦芽糖酶的那些。

可以用包括Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因的核酸转化各种宿主细胞。在一些方面，包括Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因的核酸存在于细菌细胞中。细菌细胞可用于例如繁殖核酸序列或用于产生一些量的多肽。

在其它方面，宿主细胞是真核细胞，诸如真菌细胞。

在一些方面，宿主细胞在发酵培养基中具有对较高量的生物衍生的产物(诸如乙醇)的耐受性。在一些方面，宿主细胞是“工业酵母”，其是指常规用于乙醇发酵中的任何酵母。实例包括清酒酵母、烧酒酵母、葡萄酒酵母、啤酒酵母、面包酵母等。清酒酵母表现出高乙醇发酵能力和高乙醇抗性和遗传稳定性。通常，工业酵母具有高乙醇抗性，并且优选在10％或更高的乙醇浓度下存活。

在示例性方面，宿主细胞是酿酒酵母。一些酿酒酵母具有对乙醇的高耐受性。乙醇耐受酵母的各种菌株是市售的，诸如RED和ETHANOL酵母(Fermentis/Lesaffre,USA)、FALI(Fleischmann's Yeast,USA)、SUPERSTART和酵母(Ethanol Technology,Wis.,USA)、BIOFERM AFT和XR(NABC--North AmericanBioproducts Corporation,GA,USA)、GERT STRAND(Gert Strand AB,Sweden)和FERMIOL(DSM Specialties)。

工业酵母通常是原养型的，因此没有适于选择转化体的营养缺陷型标记物。如果宿主细胞没有否则将有助于在转化后在细胞内保留Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因的遗传背景，则宿主细胞可被工程改造以引入一种或多种遗传突变以建立与细胞中的Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因相关的标记基因的使用并在细胞内维持Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因。例如，市售的乙醇耐受性酵母细胞可以在细胞内引入Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因之前进行遗传修饰。

可以通过破坏控制营养缺陷型的基因来提供不同营养缺陷型的标记物。在一种实践模式中，将酵母的乙醇耐受性菌株工程改造为破坏控制营养缺陷型的一种或多种基因的拷贝，诸如LEU2、HIS3、URA3、URA5和TRP1。在提供尿嘧啶营养缺陷型的情况下，例如，乙醇耐受性酵母的正常ura3基因可以用获得自尿嘧啶营养缺陷突变体(例如，酿酒酵母MT-8菌株)的ura3^-片段替代以破坏正常ura3基因。在ura3基因破坏的菌株的情况下，可以通过利用以下事实来容易地鉴定或选择标记物的存在/不存在：ura3基因破坏的菌株能够在含有5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基中生长，而正常ura3菌株(野生型酵母或常规工业酵母)不能生长。在lys2基因破坏的菌株的情况下，可以通过利用以下事实来容易地鉴定或选择标记物的存在/不存在：lys2基因破坏的菌株能够在含有α-氨基己二酸的培养基中生长，而正常lys2菌株(野生型酵母或常规工业酵母)不能生长。根据所采用的营养缺陷型，可以使用用于破坏营养缺陷型控制基因和用于选择性分离营养缺陷型控制基因突变体的方法。或者，可以采用显性选择标记物，诸如来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的amdS(US5876988)，其允许在作为唯一氮源的乙酰胺上生长；或ARO4-OFP，其允许在氟-苯丙氨酸存在的情况下生长(Fukuda等人)。这些标记物可以通过重复使用可循环的cre-loxP系统来使用，或者可以用于产生允许利用额外标记物的营养缺陷型菌株。

在宿主细胞已被工程改造为提供期望的遗传背景用于引入Sc MFα2 SS或Sc PHO5SS-葡糖淀粉酶基因之后，将基因构建体引入细胞以允许表达。用于将基因构建体引入宿主细胞的方法包括转化、转导、转染、共转染、电穿孔。具体而言，可以使用乙酸锂方法、原生质体法等实施酵母转化。待引入的基因构建体可以以质粒的形式或通过插入宿主的基因或通过与宿主的基因的同源重组而并入染色体中。可以用选择性标记物(例如，如上所提及的营养缺陷型标记)选择其中已引入基因构建体的转化的酵母。可以通过测量表达的蛋白的活性来进行进一步证实。

可以使用本领域众所周知的方法来证实包括Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因的外源核酸序列的转化。此类方法包括例如核酸分析，诸如mRNA的Northern印迹或聚合酶链式反应(PCR)扩增，或基因产物表达的免疫印迹，或测试引入的核酸序列或其相应的基因产物的表达的其它合适的分析方法。本领域技术人员应理解，外源核酸以足够的量表达以产生期望的产物，并且还应理解，可以使用本领域众所周知和如本文公开的方法优化表达水平以获得足够的表达。

本公开的非天然酵母可以以任何合适的形式提供。在一些方面，将非天然酵母脱水以形成干酵母组合物。干酵母组合物可以具有比湿组合物更高的保质期。

可以在含有淀粉和/或糖的植物材料(是指可衍生自任何植物和植物部分，诸如块茎、根、茎、叶和种子的含有淀粉和/或糖的植物材料)存在的情况下进行使用表达Sc MFα2SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因的宿主细胞的发酵。包含淀粉和/或糖的植物材料可以获得自谷物，诸如大麦、小麦、玉米、黑麦、高粱、小米、大麦、马铃薯、木薯或稻米及其任何组合。可以加工包含淀粉和/或糖的植物材料，诸如通过方法诸如研磨、麦粒发芽或部分麦粒发芽来实现。在一些方面，淀粉材料来自玉米粉、碾磨的玉米胚乳、高粱粉、大豆粉、小麦粉、生物量衍生的淀粉、大麦粉及其组合。

在一些方面，发酵培养基包括处理的淀粉。例如，发酵培养基可以包括部分水解的淀粉。部分水解的淀粉可以包括高分子量糊精和高分子量麦芽糖糊精。在一些实践模式中，在发酵培养基中使用具有约5至约95或更优选约45至约65范围内的右旋糖当量(“DE”)的部分水解的淀粉产物。部分水解的淀粉及其制备是本领域众所周知的。可以通过在高温下用酸诸如盐酸或硫酸加热淀粉，然后用合适的碱诸如碳酸钠中和水解混合物来制备部分水解的淀粉。或者，可以通过酶促方法，诸如通过向淀粉制备物中添加α-淀粉酶来制备部分水解的淀粉。α淀粉酶可以引起含有三个或更多个(1→4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中(1→4)-α-D-糖苷键的内水解。可以使用具有期望范围内的量的淀粉和淀粉降解产物的部分水解的淀粉产物。

在本公开的方面，鉴于葡糖淀粉酶从工程改造的酵母产生和分泌至发酵培养基中，发酵方法可以省略向培养基中添加纯化或富集的商业葡糖淀粉酶，或至少允许在发酵方法中使用显著较少的商业葡糖淀粉酶。例如，本公开的工程改造的酵母可以允许消除商业葡糖淀粉酶的添加或至少减少约50％、60％、70％、80％、90％或95％。在不使用葡糖淀粉酶分泌工程改造的酵母的发酵方法中，通常将使用约7单位至约50单位/升范围内的量的葡糖淀粉酶。

发酵液体培养基包括水，优选包括营养物，诸如氮源(诸如蛋白)、维生素和盐。缓冲剂也可以存在于发酵培养基中。其它组分也可以在发酵期后存在于发酵液体培养基中，诸如随着发酵过程可积累的发酵产物和其它代谢产物。任选地，发酵液体培养基可以用碱诸如氢氧化钙或碳酸钙、氨或氢氧化铵、氢氧化钠或氢氧化钾缓冲，以保持生物体功能发挥良好的pH。

也可以在工程改造的酵母的比生长速率的方面来描述本发明的工程改造的酵母。以使用本领域已知的技术测量的单位/小时来测量比生长速率。

在使得可以发生发酵的条件下实施发酵。尽管条件可以根据具体生物体和期望的发酵产物而变化，但典型的条件包括约20℃或更高的温度，更通常在约30℃至约50℃的范围内。在发酵期间，可以混合或搅拌反应混合物。在一些实践模式中，混合或搅拌可以通过向发酵液体培养基喷射气体的机械作用来发生。或者可以在发酵期间使用直接机械搅拌，诸如通过叶轮或通过其它方式。

非天然酵母可以对于在比酵母(例如酿酒酵母)通常生长的温度更高的温度下的生长具有增加的耐受性。例如，酿酒酵母通常在30℃-33℃的温度范围内具有最佳生长。在一些方面，本公开的非天然酵母对于在34℃-40℃的温度下的生长表现出改善的耐受性。

例如，与没有遗传修饰的参考酵母相比，本公开的非天然酵母在34℃-40℃的范围内的温度下可以具有以下比生长速率，即比没有遗传修饰的参考酵母的生长速率大10％、20％、30％、40％或50％。

在一些情况下，在工业容量发酵罐中实施发酵，以实现商业规模的经济效益和控制。在一个方面，发酵在具有约10,000升或更高的容量的发酵罐中实施。

可以调节发酵培养基的pH以提供葡糖淀粉酶活性、细胞生长和发酵活性的最佳条件，以提供期望的产物，诸如乙醇。例如，可以将溶液的pH调节至3至5.5的范围。在一种实践模式中，发酵培养基的pH在4至4.5的范围内。

如上所示，本发酵方法使用表达Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶基因且能够将产生的酶分泌至发酵培养基中的遗传修饰的微生物。因此，这些酶直接暴露于液体培养条件且影响发酵培养基中的碳水化合物组成。在发酵培养基中，葡糖淀粉酶可以通过切割α-(1,4)和α-(1,6)糖苷键来引起从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原性末端的D-葡萄糖的水解和释放。

也可以通过发酵培养基中存在的一种或多种其它淀粉酶(例如α-淀粉酶)来对淀粉起作用。例如，如果α-淀粉酶存在于发酵培养基中，则其可以通过水解内部α-(1,4)-键来引起前体淀粉的部分水解并引起淀粉分子的部分分解。

在一些实践模式中，发酵作为单一批次实施，直至完成。

在其它实践模式中，发酵作为补料分批发酵方法实施。在该实践模式中，将待发酵的淀粉材料的总量的第一部分添加至发酵培养基，其中葡糖淀粉酶对淀粉起作用以引起待用作发酵底物的葡萄糖的形成。以一份或多份添加额外淀粉材料以便在培养基中提供更多葡糖淀粉酶的底物。可以调节淀粉的添加，且可以监测葡萄糖的形成以提供有效的发酵。

优选地，发酵以连续的操作模式实施。在该模式中，多个发酵罐串联操作，其中在第一发酵罐中供应淀粉水解产物，将其供应至第二发酵罐等，直到淀粉水解产物转化成乙醇。连续操作可以使用2-7个发酵罐操作。

在一些实践模式中，使用可变速率添加系统将淀粉材料的总量的一部分添加至发酵液体培养基。此类系统的实例包括可操作连接至泵的可变速度泵或计量阀(诸如节流阀)，所述泵或阀可用于随着时间改变引入发酵液体培养基的淀粉材料的量。在一些实践模式中，在添加淀粉材料的一部分期间，通过实时监测系统监测葡萄糖浓度。

实时监测系统包括直接监测葡萄糖浓度的系统和间接监测葡萄糖浓度的系统。通常直接监测葡萄糖浓度的实时监测系统的实例包括基于红外(IR)光谱的系统、近红外(NIR)光谱系统、傅立叶变换红外(FTIR)系统、基于折射率的系统、基于自动化酶的测量系统诸如由YSI Life Sciences系统销售的YSI 2950 Biochemistry Analyzer、基于高效液相色谱(HPLC)的系统、基于气相色谱(GC)的系统以及本领域技术人员已知的其它实时监测系统。此外，间接监测/测量发酵过程的葡萄糖浓度的实时监测系统可以通过如下开发：确定特定发酵过程中典型的碳分布并将发酵液体培养基中存在的葡萄糖浓度与发酵表现出的另一参数相关联，诸如例如，将发酵液体培养基中存在的葡萄糖水平与二氧化碳排放速度的测量值以及来自发酵容器的废气流中存在的二氧化碳的量相关联。可以通过使用质谱仪或用于测量废气流的组分的其它合适的仪器技术容易地测量二氧化碳。在优选的方面，通过使用红外光谱的实时监测系统监测葡萄糖浓度。在另一个方面，通过使用近红外光谱的实时监测系统监测葡萄糖浓度。实时监测系统干扰这样的设备，其控制淀粉材料引入发酵液体培养基，以便将发酵液体培养基中的葡萄糖的形成调节至期望的浓度。

在发酵过程期间，可以取发酵培养基的样品来测定培养基中葡糖淀粉酶活性的量。培养基中的葡糖淀粉酶活性的量可以被称为细胞外葡糖淀粉酶活性，因为其对应于从工程改造的酵母分泌的葡糖淀粉酶。在一些测量模式中，培养基中的葡糖淀粉酶活性的量可以通过葡糖淀粉酶活性的量/生物量/培养基体积来确定。

如本文所用，“生物量”是指工程改造的酵母的重量，其可以以干燥细胞重量的克数/升培养基(DCW/L)来测量。

GA活性的单位(U)可以定义为催化从淀粉释放1mg葡萄糖/分钟的酶量。通过在两步终点测定中将淀粉水解与HXK/G6PDH反应混合物(Sigma G3293)偶联，在浓缩的液体培养物中测量葡糖淀粉酶活性。液体培养物可以从使用非葡萄糖碳源(即棉子糖)生长的预定量的细胞中浓缩，以避免干扰测定。

比活性等于给定体积的液体培养物中的活性除以相同体积的液体培养物中细胞的湿重。比活性具有以下单位：GA活性的U/克生物量(U/g生物量)。可以通过在通过过滤或离心除去液体培养基后测定湿细胞重量来测量测定中使用的生物量的量。

通过将1.1g玉米淀粉(S4126,Sigma)溶解于50mL接近沸水中，然后添加1mL 3M乙酸钠(pH5.2)来制备淀粉溶液。将通常在1-20ul范围内的体积的浓缩液体培养基(Vb)(通过使用10Kb Kd截止柱，Millipore#UFC901008制备)添加至200ul的总体积中的淀粉浆(Vs)中，并使其在37℃下孵育通常在5-60分钟之间的特定时间段(T)。选择参数，使得葡萄糖形成在所需时间内是线性的。将20μL每种样品添加至2μL 0.6N NaOH并充分混合。然后添加200μL HXK/G6PDH混合物，并在30℃下孵育30分钟。使用分光光度计(SpectraMax TM M2)测量340nm处的吸光度。使用已知葡萄糖标准品的回归分析用于计算每种样品中释放的葡萄糖的量。可以通过获得浓缩前使用的样品的重量(以克计)来计算比酶活性/克生物量(U/g生物量)。活性单位＝(mg葡萄糖/T)*((Vb+Vs)/(Vb))*(222/20)。比活度＝活性单位/g生物量。

在一些方面，在发酵方法中，所述培养基具有2.25U或更大/克生物量的量的葡糖淀粉酶活性。在一些方面，所述培养基具有约2.3U或更大、约2.35U或更大、约2.4U或更大、约2.45U或更大、约2.5U或更大、约2.6U或更大、约2.7U或更大、约2.8U或更大、约2.9U或更大、约3U或更大、约3.5U或更大、约4U或更大、约4.5U或更大、约5U或更大、约5.5U或更大、约6U或更大、约6.5U或更大、约7U或更大、约7.5U或更大或约8U或更大/克生物量的量的葡糖淀粉酶活性。在一些方面，所述培养基具有约2.3U至约15U、约2.4U至约15U、约2.5U至约15U、约3U至约15U、约3.5U至约15U、约4U至约15U、约4.5U至约15U、约5U至约15U、约5.5U至约15U、约6U至约15U、约6.5U至约15U、约7U至约15U、约7.5U至约15U或约8U至约15U/克生物量的量的葡糖淀粉酶活性。

在其它方面，可以相对于参考酵母描述由本公开的非天然酵母提供的发酵培养基中的葡糖淀粉酶活性的量。例如，可以将表达具有异源信号序列(例如，与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有90％或更高相同性)的外源葡糖淀粉酶的非天然酵母的葡糖淀粉酶活性的量与表达具有其天然信号序列的外源葡糖淀粉酶的在其它方面相同的酵母进行比较。

在一些方面，表达具有异源信号序列的外源葡糖淀粉酶的非天然酵母在发酵培养基中提供为参考酵母的至少1.125倍(高12.5％)的量的葡糖淀粉酶活性。在一些方面，非天然酵母中的葡糖淀粉酶活性的量是参考酵母中的至少1.15倍、至少1.175倍、至少1.225倍、至少1.25倍、至少1.3倍、至少1.35倍、至少1.4倍、至少1.45倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍。在一些方面，由非天然酵母提供的葡糖淀粉酶活性的量是参考酵母的约1.15至约7.5倍、约1.175至约7.5倍、约1.225至约7.5倍、约1.25至约7.5倍、约1.3至约7.5倍、约1.35至约7.5倍、约1.4至约7.5倍、约1.45至约7.5倍、约1.5至约7.5倍、约1.75至约7.5倍、约2至约7.5倍、约2.25至约7.5倍、约2.5至约7.5倍、约2.75至约7.5倍、约3至约7.5倍、约3.25至约7.5倍、约3.5至约7.5倍、约3.75至约7.5倍或约4至约7.5倍。

发酵培养基中葡糖淀粉酶活性的测量可以在发酵期间的期望时间点进行。例如，可以在发酵过程的进程的第约1/10、约2/10、约3/10、约4/10、约5/10、约6/10、约7/10、约8/10、约9/10，或在发酵过程结束时，从发酵培养基取样品，并且可以测试样品的葡糖淀粉酶活性。

在一些实践模式中，发酵时段为约30小时或更长、约40小时或更长、约50小时或更长或约60小时或更长，诸如约40至约120小时或50至约110小时范围内的时间段。

发酵产物(本文中也称为“生物衍生产物”或“生物产物”)可以是可以通过葡糖淀粉酶酶促降解淀粉材料、葡萄糖形成和葡萄糖发酵来制备的任何产物。在一个实施方案中，所述发酵产物选自：氨基酸、有机酸、醇、二醇、多元醇、脂肪酸、脂肪酸烷基酯(诸如脂肪酸甲酯或乙酯(例如C6至C12脂肪酸甲酯(优选C8至C10脂肪酸甲酯)))、单酰基甘油酯、二酰基甘油酯、三酰基甘油酯及其混合物。优选的发酵产物是有机酸、氨基酸、脂肪酸烷基酯(诸如脂肪酸甲酯(例如C8至C12脂肪酸甲酯(优选C8至C10脂肪酸甲酯)))及其盐，以及特别是其中所述有机酸选自羟基羧酸(包括单羟基和二羟基单羧酸、二羧酸和三羧酸)、单羧酸、二羧酸和三羧酸及其混合物。通过本方法制备的发酵产物的实例是有机酸或氨基酸诸如乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、赖氨酸、酮-戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸、乙酸、己酸甲酯、辛酸甲酯、壬酸甲酯、癸酸甲酯、十二烷酸甲酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、十二烷酸乙酯及其混合物及其衍生物及其盐。在一个优选方面，本公开的发酵方法产生乙醇作为生物产物。

从发酵液体培养基回收发酵产物。完成其的方式将取决于具体产物。然而，在一些实践模式中，通常经由过滤步骤或离心步骤将生物体与液相分离，并且经由例如蒸馏、萃取、结晶、膜分离、渗透、反渗透或其它合适的技术回收产物。

本方法提供以优异的产率和纯度以生产规模水平制备发酵产物的能力。在一个方面，该方法以至少25,000加仑的发酵液体培养基量实施。在一个方面，实施分批工艺以产生至少25,000加仑的最终发酵液体培养基的批次。添加至少200,000加仑的连续工艺容器。

包含Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶的组合物可以任选地与不同于葡糖淀粉酶的以下酶中的任何一种或任何组合使用。示例性的其它酶包括α淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(蛋白酶(proteases)、蛋白酶(proteinases)、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶、乙酰乳酸脱羧酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、颗粒淀粉水解酶和其它葡糖淀粉酶。

在一些方面，Sc MFα2 SS或Sc PHO5 SS-葡糖淀粉酶可用于淀粉转化过程，诸如用于生产右旋糖用于果糖糖浆、特殊糖以及醇和其它最终产物(例如有机酸、抗坏血酸和氨基酸)。使用本公开的葡糖淀粉酶从淀粉基质的发酵生产醇可以包括生产燃料醇或饮用醇。

与亲本或野生型葡糖淀粉酶相比，当在相同条件下使用Sc MFα2 SS或Sc PHO5SS-葡糖淀粉酶时，醇的产量可以更大。例如，使用本公开的葡糖淀粉酶的醇产量的增加可以是野生型菌株中的醇产量的1.1X或更大、1.2X或更大、1.3X或更大、1.4X或更大、1.5X或更大、1.6X或更大、1.7X或更大、1.7X或更大、1.8X或更大、1.9X或更大、2.0X或更大、2.1X或更大、2.2X或更大、2.3X或更大、2.4X或更大或2.5X或更大。

在一些方面，本发明提供了用于通过发酵产生乙醇的方法，其中乙醇以90g/L或更高的浓度存在于发酵培养基中。在所述方法中，发酵包含淀粉材料和非天然酵母的液体培养基，所述非天然酵母包含编码多肽的外源核酸，所述多肽包含葡糖淀粉酶部分和与葡糖淀粉酶异源的信号序列。发酵可以在液体培养基中提供约90g/L或更大、诸如约90g/L至约170g/L的范围内、约110g/L至约170g/L的范围内、约125g/L至约170g/L的范围内或约140g/L至约170g/L的范围内的乙醇浓度。

所述方法包括发酵包含淀粉材料和非天然酵母的液体培养基，所述非天然酵母包含编码多肽的外源核酸，所述多肽包含葡糖淀粉酶部分和与葡糖淀粉酶异源的信号序列，其中所述发酵在液体培养基中提供90g/L或更大的乙醇浓度。

本公开的非天然酵母的使用还可以提供关于增加的滴度、减少的挥发性有机酸(VOC)和减少的杂醇油化合物(挥发性有机酸、高级醇、醛、酮、脂肪酸和酯)的益处。

发酵产物可以首先用一种或多种试剂(处理系统)处理。然后将处理的发酵产物送至蒸馏系统。在蒸馏系统中，发酵产物可以蒸馏且脱水成乙醇。在一些方面，从发酵培养基中除去的组分包括水、可溶性组分、油和未发酵的固体。这些组分中的一些可以用于其它目的，诸如用于动物饲料产品。可以从釜馏物回收其它副产物，例如糖浆。

本公开还提供了用于生产食品、饲料或饮料产品，诸如酒精或非酒精饮料，诸如基于谷物或麦芽的饮料如啤酒或威士忌，诸如葡萄酒、苹果酒、醋、米酒、酱油或果汁的方法，所述方法包括用本文所述的组合物处理含有淀粉和/或糖的植物材料的步骤。在另一个方面，本发明还涉及试剂盒，其包含本公开的葡糖淀粉酶或如本文所考虑的组合物；以及使用所述葡糖淀粉酶或组合物的说明书。本发明还涉及通过使用葡糖淀粉酶的方法生产的发酵饮料。

发酵过程完全之后，可以使用发酵培养基中存在的材料。在一些方面，在发酵过程已经完成之后，或者在发酵过程正在进行的同时，可以从发酵培养基除去生物产物中的一些或全部，以提供包含非生物产物固体的精制组合物。非生物产物固体包括非天然酵母、培养基中未被酵母利用的原料以及发酵副产物。这些材料可以提供碳水化合物和蛋白的来源，其可用作补充剂以改善饲料组合物的营养含量。饲料材料可以是来自发酵过程的副产物，诸如釜馏物(完整釜馏物、稀釜馏物等)或由其制备的组合物，包括干燥蒸馏谷物(DDG)、具有可溶物的蒸馏干燥谷物(DDGS)、蒸馏湿谷物(DWG)和蒸馏可溶物(DS)。

可以进一步处理任选地除去部分或全部靶标生物产物的发酵培养基，诸如以除去水，或引起非生物产物固体的沉淀或其与培养基的分离。在一些情况下，培养基通过冷冻干燥或烘箱干燥处理。处理之后，精制组合物可以是例如液体浓缩物、半湿滤饼或干燥固体的形式。精制组合物可以用作饲料组合物本身，或者饲料组合物的制备物中的成分。在优选的制备物中，饲料组合物是家畜饲料组合物，诸如绵羊、牛、猪等饲料组合物。

发酵培养基中的固体可以提供一种或多种氨基酸的来源。引入动物饲料中，发酵副产物可以提供关于一种或多种必需氨基酸的提高的氨基酸含量。必需氨基酸可以包括组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和色氨酸。这些氨基酸可以作为游离氨基酸存在于饲料组合物中，或可以衍生自富含氨基酸的蛋白或肽。发酵培养基中的固体可以提供一种益生元的来源，其是不易消化的食物，诸如不易消化的寡糖，其选择性刺激肠中有利的细菌菌种的生长，从而有益于宿主。发酵培养基中的固体可以提供植酸酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶和木聚糖酶的来源。

饲料组合物可用于水产养殖(水生生物体诸如鱼、贝类或植物的养殖)中。水产养殖包括海洋和淡水物种的养殖，可以范围为陆基至公海生产。

除了从发酵培养基获得的材料之外，饲料组合物可以包括一种或多种饲料添加剂。可以使用饲料添加剂，例如以帮助提供平衡的饮食(例如维生素和/或痕量矿物质)，保护动物免受疾病和/或应激(例如抗生素、益生菌)和/或刺激或控制生长和行为(例如激素)。添加剂产品成分可以包括例如：生长促进剂、药用物质、缓冲剂、抗氧化剂、酶、防腐剂、沉淀结合剂、直接饲用的微生物等。添加剂产品成分还可以包括例如离子载体(例如莫能菌素、拉沙里菌素、莱特洛霉素等)、β-激动剂(齐帕特罗、莱克多巴胺等)、抗生素(例如金霉素(CTC)、氧四环素、杆菌肽(bacitrain)、泰乐菌素、金霉素)、益生菌和酵母培养物、抗球虫药(例如amprollium、地考喹酯、拉沙里菌素、莫能菌素)和激素(例如生长激素或抑制发情和/或排卵的激素，例如乙酸美仑孕酮)、信息素、营养药物、药物、类黄酮、营养和非营养补充剂、解毒剂等。一些市售添加剂以商品名 和销售。

实施例1

淀粉分解酿酒酵母菌株的生成

菌株1-3：ura3Δ酿酒酵母基础菌株

菌株1用SEQ ID NO 1(pAV18)转化。SEQ ID NO 1含有以下元件：i)对应于核苷酸479-2647的来自酿酒酵母(ARO4-OFP)的3-脱氧-D-阿拉伯糖基-庚酮糖酸酯-7-磷酸酯(DAHP)合酶基因的突变体版本的表达盒；ii)对应于核苷酸445-478和2648-2681的loxP序列，和iii)用于靶向染色体整合入整合基因座A(URA3)的侧接DNA，其中核苷酸1-436对应于URA3 5’侧接区域，且核苷酸2691-3182对应于URA3 3’侧接区域。在含有3.5g/L对氟苯丙氨酸和1g/L L-酪氨酸的合成完全培养基(ScD-PFP)上选择转化体。将所得转化体划线，用于在ScD-PFP上进行单菌落分离。选择单菌落。在单菌落中通过PCR验证SEQ ID NO:1正确整合至基因座A的一个等位基因中。将PCR验证的分离株命名为菌株1-1。

菌株1-1用SEQ ID NO 2(pCM520a)转化。SEQ ID NO 2含有以下元件：i)对应于核苷酸638-2284的来自构巢曲霉的乙酰胺酶(amdS)基因的密码子优化的表达盒，其中TEF1启动子对应于核苷酸2285-2740，且TEF1终止子对应于核苷酸478-637；ii)对应于核苷酸444-477和2741-2774的loxP序列，和iii)用于靶向染色体整合入整合基因座A(URA3)的侧接DNA，其中核苷酸1-435对应于URA3 5’侧接区域，且核苷酸2783-3275对应于URA3 3’侧接区域。在含有80mg/L尿嘧啶和1g/L乙酰胺作为唯一氮源的酵母氮碱(不含硫酸铵或氨基酸)上选择转化体。将所得转化体划线，用于在含有80mg/L尿嘧啶和1g/L乙酰胺作为唯一氮源的酵母氮碱(不含硫酸铵或氨基酸)上分离单菌落。选择单菌落。在单菌落中通过PCR验证SEQID NO 2正确整合至基因座A的第二等位基因中。将PCR验证的分离株命名为菌株1-2。

菌株1-2与SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4共转化。SEQ ID NO 3含有以下元件：i)对应于核苷酸53-1084的来自P1噬菌体的cre重组酶的开放阅读框，和ii)与SEQ ID NO 4同源的对应于核苷酸1-47和1086-1132的侧接DNA。SEQ ID NO 4含有以下元件：i)对应于核苷酸2195-3350的2μ复制起点；ii)对应于核苷酸3785-4901的来自酿酒酵母的URA3选择标记物；和iii)含有对应于核苷酸5791-6376的PGK启动子和来自酿酒酵母的对应于核苷酸10-199的CYC1终止子的侧接DNA。对于SEQ ID NO 4的剩余部分，pUC复制起点对应于核苷酸386-1053；且氨苄青霉素抗性基因对应于核苷酸1204-2061。在缺乏尿嘧啶的合成退出培养基(ScD-Ura)上选择转化体。ScD-Ura琼脂平板含有：20g/L琼脂、6.7g/L酵母氮碱、2g缺乏尿嘧啶的合成完全退出混合物和20g/L右旋糖。将所得转化体划线，用于在ScD-Ura上进行单菌落分离。选择单菌落。筛选分离的菌落，用于在含有80mg/L尿嘧啶和1g/L乙酰胺作为唯一氮源的ScD-PFP和酵母氮碱(不含硫酸铵或氨基酸)上生长。通过PCR验证ARO4-OFP和amdS基因的损失。将PCR验证的分离株划线至含有5-FOA的YNB以选择2μ质粒的损失。将PCR验证的分离株命名为菌株1-3。

菌株1-4：表达扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶的酿酒酵母

菌株1-3用SEQ ID NO 5转化。SEQ ID NO 5含有以下元件：1)对应于核苷酸2769-4316的来自扣囊复膜酵母的葡糖淀粉酶基因的表达盒，其包括对应于核苷酸2022-2768的ADH1启动子和对应于核苷酸4318-4540的CYC1终止子，2)对应于核苷酸6798-7316的允许稳定复制的着丝粒，和3)对应于核苷酸195-1292的乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(URA3)的表达盒。在ScD-Ura上选择转化体。将所得转化体划线，用于在ScD-Ura上进行单菌落分离。选择单菌落。通过PCR验证质粒的存在。将PCR验证的分离株命名为菌株1-4a、b、c。

菌株1-5：表达含有来自α交配因子1(MFα1)的N-端分泌前导的修饰的扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶的酿酒酵母

菌株1-3用SEQ ID NO 6转化。SEQ ID NO 6含有以下元件：1)对应于核苷酸2769-4319的含有来自α交配因子1(MFα1)的N-端分泌前导的来自扣囊复膜酵母的修饰的葡糖淀粉酶基因的表达盒，其包括对应于核苷酸2023-2768的ADH1启动子和对应于核苷酸4320-4543的CYC1终止子，2)对应于核苷酸6801-7319的允许稳定复制的着丝粒(CEN6)，和3)对应于核苷酸195-1292的乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(URA3)的表达盒。SEQ ID NO 6还包括对应于核苷酸5809-6669的氨苄青霉素抗性基因。在ScD-Ura上选择转化体。将所得转化体划线，用于在ScD-Ura上进行单菌落分离。选择单菌落。通过PCR验证质粒的存在。将PCR验证的分离株命名为菌株1-5a、b、c。

菌株1-6：表达含有来自α交配因子2(MFα2)的N-端分泌前导的修饰的扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶的酿酒酵母

菌株1-3用SEQ ID NO 7转化。SEQ ID NO 7含有以下元件：1)对应于核苷酸2769-4319的含有来自α交配因子2(MFα2)的N-端分泌前导的来自扣囊复膜酵母的修饰的葡糖淀粉酶基因的表达盒，其包括对应于核苷酸2022-2768的ADH1启动子和对应于核苷酸4320-4543的CYC1终止子，2)对应于核苷酸6801-7319的允许稳定复制的着丝粒(CEN6)，和3)对应于核苷酸195-1229的乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(URA3)的表达盒。SEQ ID NO 7还包括对应于核苷酸5809-6669的氨苄青霉素抗性基因。在ScD-Ura上选择转化体。将所得转化体划线，用于在ScD-Ura上进行单菌落分离。选择单菌落。通过PCR验证质粒的存在。将PCR验证的分离株命名为菌株1-6a、b、c。

菌株1-7：表达含有来自酸性磷酸酶(PHO5)的N-端分泌前导的修饰的扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶的酿酒酵母

菌株1-3用SEQ ID NO 8转化。SEQ ID NO 8含有以下元件：1)对应于核苷酸2769-4313的含有来自酿酒酵母酸性磷酸酶(PHO5)的N-端分泌前导的来自扣囊复膜酵母的修饰的葡糖淀粉酶基因的表达盒，其包括对应于核苷酸2023-2768的ADH1启动子和对应于核苷酸4314-4537的CYC1终止子，2)对应于核苷酸6795-7313的允许稳定复制的着丝粒(CEN6)，和3)对应于核苷酸195-1292的乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(URA3)的表达盒。SEQ ID NO 8还包括对应于核苷酸5803-6663的氨苄青霉素抗性基因。在ScD-Ura上选择转化体。将所得转化体划线，用于在ScD-Ura上进行单菌落分离。选择单菌落。通过PCR验证质粒的存在。将PCR验证的分离株命名为菌株1-7a、b、c。

菌株1-8：酿酒酵母质粒对照

菌株1-3用SEQ ID NO 9转化。SEQ ID NO 9含有与SEQ ID NO 5-8相同的元件，除了其缺乏葡糖淀粉酶的表达盒。在ScD-Ura上选择转化体。将所得转化体划线，用于在ScD-Ura上进行单菌落分离。选择单菌落。通过PCR验证质粒的存在。将PCR验证的分离株命名为菌株1-8a、b、c。

菌株1-9：表达含有来自交配因子1(MFa1)的N-端分泌前导的修饰的扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶的酿酒酵母

菌株1-3用SEQ ID NO 15转化。SEQ ID NO 15含有以下元件：1)对应于核苷酸2769-4337的含有来自交配因子1(MFα1)的N-端分泌前导的来自扣囊复膜酵母的修饰的葡糖淀粉酶基因的表达盒，其包括对应于核苷酸2023-2768的ADH1启动子和对应于核苷酸4338-4561的CYC1终止子，2)对应于核苷酸6819-7337的允许稳定复制的着丝粒(CEN6)，和3)对应于核苷酸195-1292的乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(URA3)的表达盒。SEQ ID NO 15还包括对应于核苷酸5827-6687的氨苄青霉素抗性基因。将所得转化体划线，用于在ScD-Ura上进行单菌落分离。选择单菌落。通过PCR验证质粒的存在。将PCR验证的分离株命名为菌株1-9a、b、c。

表3工程改造的酵母的描述

菌株	描述	亲本
			菌株1	酿酒酵母(Lasaffre,乙醇红)	N/A
菌株1-1	ura3Δ/URA3,ARO4-OFP+	菌株1
			菌株1-2	ura3Δ,ARO4-OFP+,amdS+	菌株1-1
菌株1-3	ura3Δ	菌株1-2
			菌株1-4a、b、c	扣囊复膜酵母GLA1+	菌株1-3
菌株1-5a、b、c	扣囊复膜酵母GLA1+(w/MFα1前导)	菌株1-3
			菌株1-6a、b、c	扣囊复膜酵母GLA1+(w/MFα2前导)	菌株1-3
菌株1-7a、b、c	扣囊复膜酵母GLA1+(w/PHO5前导)	菌株1-3
			菌株1-8a、b、c	载体对照	菌株1-3
菌株1-9a、b、c	扣囊复膜酵母GLA+(w/MFa1前导)	菌株1-3

实施例2

在同时糖化和发酵摇瓶测定中评估淀粉分解酿酒酵母菌株

使用部分水解的玉米淀粉(AV_2014-08-20，改变Sf GA的分泌信号)评估摇瓶。

将表3中列出的菌株子集在ScD-Ura平板上划线，并且在30℃下孵育，直到单菌落可见(1-2天)。将来自ScD-Ura平板的细胞刮至无菌摇瓶培养基中，并测量光密度(OD600)。使用Genesys20型分光光度计(Thermo Scientific)，用1cm路径长度在600nm的波长处测量光密度。

用细胞浆料接种摇瓶以达到0.1-0.3的初始OD600。在接种之前，将50mL摇瓶培养基立即添加至配合有含有透气密封物的螺旋盖(corning 1395-45LTMC)的250mL无挡板摇瓶(Corning 4995-250)。摇瓶培养基由850g部分水解的玉米淀粉(％DS 30-37，DE 5-15)、150g过滤的淡浸泡水(light steep water)、25g葡萄糖和1g尿素(Sigma U6504)组成。

将接种的烧瓶在30℃下在100rpm的振荡下在定轨振荡器中孵育72小时。取样并在发酵期间通过具有折射率检测器的高效液相色谱仪分析液体培养基中的乙醇浓度。

表4中显示的摇瓶的结果表明，相对于表达天然的扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶的菌株，表达扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶上的MFα2或PHO5前导序列的菌株中的乙醇滴度的改善。

表4.表达具有和不具有改变的前导序列的扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶的菌株的乙醇滴度。

菌株	描述	在72小时的乙醇滴度(g/L)
			菌株1-4a、b、c	扣囊复膜酵母GLA1+	83.6、89.2、81.6
菌株1-5a	扣囊复膜酵母GLA1+(w/MFα1前导)	25.6、25.5、25.1
			菌株1-6a、b、c	扣囊复膜酵母GLA1+(w/MFα2前导)	156.3、158.7、158.5
菌株1-7a、b、c	扣囊复膜酵母GLA1+(w/PHO5前导)	156.7、156.8、157.1
			菌株1-8a、b、c	载体对照	25.6、25.8、25.6
菌株1-9a、b、c	扣囊复膜酵母GLA1+(w/MFa1前导)	26.4、26.5、26.3

实施例3

淀粉分解酿酒酵母菌株的酶产生

使用棉子糖生长细胞的摇瓶评估来评估酶产生。

将表3中列出的菌株子集在ScD-Ura平板上划线，并且在30℃下孵育，直到单菌落可见(1-2天)。将来自ScD-Ura平板的细胞刮至无菌摇瓶培养基中，并测量光密度(OD600)。使用Genesys20型分光光度计(Thermo Scientific)，用1cm路径长度在600nm的波长处测量光密度。

用细胞浆料接种摇瓶以达到0.1-0.3的初始OD600。临接种之前，将100mL摇瓶培养基添加至500mL带挡板的摇瓶中。摇瓶培养基由5％棉子糖(Sigma R0250)、6.7g酵母氮碱(Difco 291940)和1.9g合成完全氨基酸退出混合物(MP Biomedicals 4410-622)组成。

将接种的烧瓶在30℃下在250rpm的振荡下在定轨振荡器中孵育24小时。取样并分析OD600和细胞干重。通过离心除去细胞，并使用10K MWCO柱(Millipore UFC901024)将90ml液体培养基浓缩至1.0ml，并在分析前冷冻。

通过在两步终点测定(Sigma G3293)中将淀粉水解与HXK/G6PDH反应偶联，在浓缩的液体培养基中测量葡糖淀粉酶活性。GA活性的单位(U)可以定义为催化从淀粉释放1mg葡萄糖/分钟的酶量。通过在两步终点测定中将淀粉水解与HXK/G6PDH反应混合物(SigmaG3293)偶联，在浓缩的液体培养基中测量葡糖淀粉酶活性。液体培养基可以从使用非葡萄糖碳源(即棉子糖)生长的预定量的细胞中浓缩，以避免干扰测定。

比活性等于给定体积的液体培养基中的活性除以相同体积的液体培养基中细胞的湿重。比活性具有以下单位：每克生物量的GA活性的U(U/g生物量)。可以通过在通过过滤或离心除去液体培养基后测定湿细胞重量来测量测定中使用的生物量的量。

通过将1.1g玉米淀粉(S4126,Sigma)溶解于50mL接近沸水中、然后添加1mL 3M乙酸钠(pH5.2)来制备淀粉溶液。将通常在1-20ul范围内的体积的浓缩液体培养基(Vb)(通过使用10Kb Kd截止柱，Millipore#UFC901008制备)添加至200ul的总体积中的淀粉浆(Vs)中，并使其在37℃下孵育通常在5-60分钟之间的特定时间段(T)。选择参数，使得葡萄糖形成在所需时间内是线性的。将20μL每种样品添加至2μL 0.6N NaOH并充分混合。然后添加200μL HXK/G6PDH混合物，并在30℃下孵育30分钟。使用分光光度计(SpectraMax TM M2)测量340nm处的吸光度。使用已知葡萄糖标准品的回归分析用于计算每种样品中释放的葡萄糖的量。可以通过获得浓缩前使用的样品的重量(以克计)来计算每克生物量的比酶活性(U/g生物量)。活性单位＝(mg葡萄糖/T)*((Vb+Vs)/(Vb))*(222/20)。比活度＝活性单位/g生物量。

使用Advanced Protein Assay Reagent(Cytoskeleton ADV01)测定蛋白浓度。使用来自菌株1-4a、1-4b、1-6a、1-6b、1-7a、1-7b、1-8a和1-8b的16μl浓缩的液体培养基以及4μl上样缓冲液运行标准变性SDS-PAGE蛋白凝胶。

表5和图1中显示的摇瓶的结果表明MFα2和PHO5前导序列对扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶分泌和活性的有益效果。

表5.表达具有和不具有改变的前导序列的扣囊复膜酵母葡糖淀粉酶的菌株的酶产生。

序列表

<110> 嘉吉公司

C·K·米勒

A·瓦什

J·维尔多豪斯

A·内格雷特-雷蒙德

<120> 修饰的葡糖淀粉酶和具有增强的生物产物产生的酵母菌株

<130> CAR0178/P1

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3182

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAV18转化片段

<400> 1

cctactgcgc caattgatga caatacagac gatgataaca aaccgaagtt atctgatgta 60

gaaaaggatt aaagatgcta agagatagtg atgatatttc ataaataatg taattctata 120

tatgttaatt accttttttg cgaggcatat ttatggtgaa ggataagttt tgaccatcaa 180

agaaggttaa tgtggctgtg gtttcagggt ccataaagct tttcaattca tctttttttt 240

ttttgttctt ttttttgatt ccggtttctt tgaaattttt ttgattcggt aatctccgag 300

cagaaggaag aacgaaggaa ggagcacaga cttagattgg tatatatacg catatgtggt 360

gttgaagaaa catgaaattg cccagtattc ttaacccaac tgcacagaac aaaaacctgc 420

aggaaacgaa gataaagcgg ccgcataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatct 480

gccagtatac agctagcctt gaaagtgatg gaaaacattg tcatcggcac ataaataaaa 540

aaattatgaa tcacgtgatc aacagcaaat tatgtactcg tatatatgca agcgcattcc 600

ttatattgac actctttcat tgggcatgag gctgtgtaaa cataagctgt aacggtctca 660

cggaacactg tgtagttgca ttactgtcag gcagttatgt tgcttaatat aaaggcaaag 720

gcatggcaga atcactttaa aacgtggccc cacccgctgc accctgtgca ttttgtacgt 780

tactgcgaaa tgactcaacg atgaaatgaa aaaattttgc ttgaaatttt gaaaaaaaga 840

tgtgcgggac gcattgttag ctcattgaat acatcgtgat cgaatccaat caatgtttaa 900

tttcatatta atacagaaac tttttctcat actttcttct tcttttcatt ggtatattat 960

ctatatatcg tgttaattcc tctttcgtca tttttagcat cgttataaga gtaattaaga 1020

ataactagaa gagtctctct ttatattcgt ttattttata tatttaaccg ctaaatttag 1080

taaacaaaag aatctatcag aaatgagtga atctccaatg ttcgctgcca acggcatgcc 1140

aaaggtaaat caaggtgctg aagaagatgt cagaatttta ggttacgacc cattagcttc 1200

tccagctctc cttcaagtgc aaatcccagc cacaccaact tctttggaaa ctgccaagag 1260

aggtagaaga gaagctatag atattattac cggtaaagac gacagagttc ttgtcattgt 1320

cggtccttgt tccatccatg atctagaagc cgctcaagaa tacgctttga gattaaagaa 1380

attgtcagat gaattaaaag gtgatttatc catcattatg agagcatact tggagaagcc 1440

aagaacaacc gtcggctgga aaggtctaat taatgaccct gatgttaaca acactttcaa 1500

catcaacaag ggtttgcaat ccgctagaca attgtttgtc aacttgacaa atatcggttt 1560

gccaattggt tctgaaatgc ttgataccat ttctcctaaa tacttggctg atttggtctc 1620

cttcggtgcc attggtgcca gaaccaccga atctcaactg cacagagaat tggcctccgg 1680

tttgtctttc ccagttggtt tcaagaacgg taccgatggt accttaaatg ttgctgtgga 1740

tgcttgtcaa gccgctgctc attctcacca tttcatgggt gttactaagc atggtgttgc 1800

tgctatcacc actactaagg gtaacgaaca ctgcttcgtt attctaagag gtggtaaaaa 1860

gggtaccaac tacgacgcta agtccgttgc agaagctaag gctcaattgc ctgccggttc 1920

caacggtcta atgattgact actctcacgg taactccaat aaggatttca gaaaccaacc 1980

aaaggtcaat gacgttgttt gtgagcaaat cgctaacggt gaaaacgcca ttaccggtgt 2040

catgattgaa tcaaacatca acgaaggtaa ccaaggcatc ccagccgaag gtaaagccgg 2100

cttgaaatat ggtgtttcca tcactgatgc ttgtataggt tgggaaacta ctgaagacgt 2160

cttgaggaaa ttggctgctg ctgtcagaca aagaagagaa gttaacaaga aatagatgtt 2220

tttttaatga tatatgtaac gtacattctt tcctctacca ctgccaattc ggtattattt 2280

aattgtgttt agcgctattt actaattaac tagaaactca atttttaaag gcaaagctcg 2340

ctgacctttc actgatttcg tggatgttat actatcagtt actcttctgc aaaaaaaaat 2400

tgagtcatat cgtagctttg ggattatttt tctctctctc cacggctaat taggtgatca 2460

tgaaaaaatg aaaaattcat gagaaaagag tcagacatcg aaacatacat aagttgatat 2520

tcctttgata tcgacgacta ctcaatcagg ttttaaaaga aaagaggcag ctattgaagt 2580

agcagtatcc agtttaggtt ttttaattat ttacaagtaa agaaaaagag aatgccggtc 2640

gttcacgata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta tgcggccgcg agaagatgcg 2700

gccagcaaaa ctaaaaaact gtattataag taaatgcatg tatactaaac tcacaaatta 2760

gagcttcaat ttaattatat cagttattac ccgggaatct cggtcgtaat gatttctata 2820

atgacgaaaa aaaaaaaatt ggaaagaaaa agcttcatgg cctttataaa aaggaactat 2880

ccaatacctc gccagaacca agtaacagta ttttacgggg cacaaatcaa gaacaataag 2940

acaggactgt aaagatggac gcattgaact ccaaagaaca acaagagttc caaaaagtag 3000

tggaacaaaa gcaaatgaag gatttcatgc gtttgtactc taatctggta gaaagatgtt 3060

tcacagactg tgtcaatgac ttcacaacat caaagctaac caataaggaa caaacatgca 3120

tcatgaagtg ctcagaaaag ttcttgaagc atagcgaacg tgtagggcag cgtttccaag 3180

ag 3182

<210> 2

<211> 3310

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCM520转化片段

<400> 2

cctactgcgc caattgatga caatacagac gatgataaca aaccgaagtt atctgatgta 60

gaaaaggatt aaagatgcta agagatagtg atgatatttc ataaataatg taattctata 120

tatgttaatt accttttttg cgaggcatat ttatggtgaa gaataagttt tgaccatcaa 180

agaaggttaa tgtggctgtg gtttcagggt ccataaagct tttcaattca tcattttttt 240

tttattcttt tttttgattc cggtttcctt gaaatttttt tgattcggta atctccgaac 300

agaaggaaga acgaaggaag gagcacagac ttagattggt atatatacgc atatgtagtg 360

ttgaagaaac atgaaattgc ccagtattct taacccaact gcacagaaca aaaatctgca 420

ggaaacgaag ataaagcggc cgcataactt cgtatagcat acattatacg aagttatcgc 480

ctgttaagat ataactgaaa aaagagggga atttttagat actgaaatga tattttagaa 540

taaccagact atatataagg ataaattaca aaaaattaac taatagataa gatttaaata 600

taaaagatat gcaactagaa aagtcttatc aatctcctta tggagtgacg acgttaccca 660

acaatttacc gacttcttcg gcgatagcca aagttctctc ttcggacaat cttctaccaa 720

taacttgaac agcaacagga gcaccgtgat aagcctctgg gtcgtattct tcttgaacca 780

aagcatccaa ttcggaaaca gctttaaaag attcgttctt cttatcaata ttcttatcag 840

cgaaagtgac tgggacgaca acagaggtga aatccaataa gttaataacg gaggcgtaac 900

cgtagtatct gaattgatcg tgtctgacag cggcggtagg agtaattgga gcgataatag 960

cgtccaattc cttaccagct ttttcttcag cttcacgcca cttttccaag tattccattt 1020

gatagttcca cttttgtaaa tgagtgtccc acaattcgtt catgttaaca gccttaatat 1080

ttgggttcaa caagtcctta atgttaggga tggctggctc accagaggca gaaatgtctc 1140

tcatgacgtc ggcagaacca tcagcagcat agatgtggga aatcaagtca tgaccgaaat 1200

catgcttgta tggagtccat ggagtaacgg tgtgaccagc cttggccaaa gcggcaacgg 1260

tagtttcgac accacgtaaa attggtgggt gtggcaagac gttaccgtcg aaattgtaat 1320

aaccaatgtt caaaccacca ttcttaatct tagaggcaat gatgtcagat tcagattgtc 1380

tccatggcat tgggatgacc ttagagtcgt acttccaagg ttcttgaccc aagacagatt 1440

tggtgaacaa tctcaagtct tcgacggagt gagtgatagg accaacgacg gagtgaacgg 1500

tttcttgacc ttccatagag ttagccattt tagcatatgg caatctaccg tgagatggtc 1560

tcaaaccgta taaaaagttg aaagcagctg ggactctaat ggaaccacca atgtcagtac 1620

cgacaccaat aacaccacct ctaataccaa caatagcacc ttcaccacca gaagaaccac 1680

cacaggacca atttttgttt cttggattga cagttctacc aatgatgttg ttgacggttt 1740

cacagaccat caaggtttgt gggacagagg tcttaacgta gaaaacagca ccagcttttc 1800

tcaacatggt ggttaagacg gaatcacctt catcgtattt gtttaaccag gaaatgtaac 1860

ccatggaggt ttcgtaaccc ttaacacgca attggtcctt taaagagatt ggtaaaccgt 1920

gtaatggacc aactggtctc ttatgcttag cgtagtattc atctaattct ctagcttgag 1980

ctaaagcagc atctgggaag aattcgtgag cacagttggt taattgttga gcaatagcag 2040

ctctcttaca aaaagccaaa gtgacttcaa cagaagtcaa ctcaccagcg gccaacttgg 2100

agaccaaatc agcagcagag gcttcggtaa tcttcaattc agcctcagac aaaataccgg 2160

acttctttgg gaaatcaata acggaatctt cggcaggcaa agtttgaacc ttccattcgt 2220

caggaatggt tttagccaaa cgggcacgtt tgtcggcggc caattcttcc caggattgtg 2280

gcattttgta attaaaactt agattagatt gctatgcttt ctttctaatg agcaagaagt 2340

aaaaaaagtt gtaatagaac aagaaaaacg aaactgaaac ttgagaaatt gaagaccatt 2400

tattaactta aatatcaatg ggaggtcatc gaaagagaaa aaaatcaaaa aaaaaatttt 2460

tcaagaaaaa gaaacgtgat aaaaattttt attgcctttt tcgacgaaga aaaagaaacg 2520

aggcggtctc ttttttcttt tccaaacctt tagtacgggt aattaacgcc accctagagg 2580

aagaaagagg ggaaatttag tatgctgtgc ttgggtgttt tgaagtggta cggcgatgcg 2640

cggagtccga gaaaatctgg aagagtaaaa aaggagtaga aacattttga agctatggtg 2700

tgtgggggat cacttgtggg ggattgggtg tgatgtaagg ataacttcgt atagcataca 2760

ttatacgaag ttatgcggcc gcgagaagat gcggccagca aaactaaaaa actgtattat 2820

aagtaaatgc atgtatacta aactcacaaa ttagagcttc aatttaatta tatcagttat 2880

tacccgggaa tctcggtcgt aatgattttt ataatgacga aaaaaaaaaa attggaaaga 2940

aaaagcttca tggcctttat aaaaaggaac catccaatac ctcgccagaa ccaagtaaca 3000

gtattttacg gggcacaaat caagaacaat aagacaggac tgtaaagatg gacgcattga 3060

actccaaaga acaacaagag ttccaaaaag tagtggaaca aaagcaaatg aaggatttca 3120

tgcgtttgta ctctaatctg gtagaaagat gttttacaga ctgtgtcaat gacttcacaa 3180

catcaaagct aaccaataag gaacaaacat gcatcatgaa gtgctcagaa aagttcttga 3240

agcatagcga acgtgtaggg cagcgtttcc aagagagcat agcgaacgtg tagggcagcg 3300

tttccaagag 3310

<210> 3

<211> 1132

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cre PCR片段

<400> 3

ctctttttta cagatcatca aggaagtaat tatctacttt ttacaagaat tcatgtctaa 60

tttacttact gttcaccaaa acttgcctgc attaccagtt gacgcaacct ccgatgaagt 120

cagaaagaac cttatggata tgtttagaga tagacaagct ttctccgaac atacttggaa 180

aatgttatta tccgtttgta gatcctgggc cgcttggtgt aaacttaaca atagaaaatg 240

gtttcctgct gaaccagaag acgtcagaga ttacttactt tacttacaag ctagaggttt 300

ggctgttaaa actatccaac aacacttagg tcaattgaat atgttacaca gaagatccgg 360

tttaccaaga ccatccgatt ccaacgcagt ttcccttgtt atgagaagaa ttagaaaaga 420

aaatgttgac gctggtgaaa gagctaaaca agcattagca tttgaaagaa ccgatttcga 480

tcaagttaga tccttaatgg aaaattccga tagatgtcaa gatattagaa acttagcttt 540

cttaggtatt gcttacaaca cattattaag aatcgctgaa attgctagaa ttagagttaa 600

agatatttca agaaccgatg gcggtagaat gttaatccac attggcagaa caaaaacctt 660

agtctccaca gcaggcgtcg aaaaagcatt atcattaggt gttactaaat tagttgaacg 720

ttggatttcc gtttccggtg ttgcagatga cccaaacaac tacttattct gtcgtgttag 780

aaaaaatggt gttgccgctc cttccgctac ctcacaatta tccacaagag cattagaagg 840

catttttgaa gctacccaca gacttattta tggtgcaaaa gacgattccg gtcaaagata 900

tttagcttgg tctggtcatt ccgctagagt tggtgccgca agagacatgg caagagctgg 960

tgtttctatt cctgaaatta tgcaagccgg tggttggact aatgttaaca ttgttatgaa 1020

ctatatcaga aacttagatt ccgaaacagg tgctatggtt agattacttg aagacggtga 1080

ttaagctagc taagatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tg 1132

<210> 4

<211> 6376

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pGP52片段

<400> 4

ctagctaaga tccgctctaa ccgaaaagga aggagttaga caacctgaag tctaggtccc 60

tatttatttt tttatagtta tgttagtatt aagaacgtta tttatatttc aaatttttct 120

tttttttctg tacagacgcg tgtacgcatg taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa 180

ggttttggga cgctcgaaga tccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 240

cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 300

tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 360

aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 420

aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 480

tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 540

ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 600

cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 660

ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 720

ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 780

gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 840

agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 900

cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 960

aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 1020

aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 1080

ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 1140

aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 1200

ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 1260

agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 1320

cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 1380

ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 1440

gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 1500

cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 1560

cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 1620

ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 1680

catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 1740

tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 1800

ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 1860

catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 1920

cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 1980

cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 2040

acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 2100

ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 2160

tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgaacgaagc atctgtgctt cattttgtag 2220

aacaaaaatg caacgcgaga gcgctaattt ttcaaacaaa gaatctgagc tgcattttta 2280

cagaacagaa atgcaacgcg aaagcgctat tttaccaacg aagaatctgt gcttcatttt 2340

tgtaaaacaa aaatgcaacg cgagagcgct aatttttcaa acaaagaatc tgagctgcat 2400

ttttacagaa cagaaatgca acgcgagagc gctattttac caacaaagaa tctatacttc 2460

ttttttgttc tacaaaaatg catcccgaga gcgctatttt tctaacaaag catcttagat 2520

tacttttttt ctcctttgtg cgctctataa tgcagtctct tgataacttt ttgcactgta 2580

ggtccgttaa ggttagaaga aggctacttt ggtgtctatt ttctcttcca taaaaaaagc 2640

ctgactccac ttcccgcgtt tactgattac tagcgaagct gcgggtgcat tttttcaaga 2700

taaaggcatc cccgattata ttctataccg atgtggattg cgcatacttt gtgaacagaa 2760

agtgatagcg ttgatgattc ttcattggtc agaaaattat gaacggtttc ttctattttg 2820

tctctatata ctacgtatag gaaatgttta cattttcgta ttgttttcga ttcactctat 2880

gaatagttct tactacaatt tttttgtcta aagagtaata ctagagataa acataaaaaa 2940

tgtagaggtc gagtttagat gcaagttcaa ggagcgaaag gtggatgggt aggttatata 3000

gggatatagc acagagatat atagcaaaga gatacttttg agcaatgttt gtggaagcgg 3060

tattcgcaat attttagtag ctcgttacag tccggtgcgt ttttggtttt ttgaaagtgc 3120

gtcttcagag cgcttttggt tttcaaaagc gctctgaagt tcctatactt tctagagaat 3180

aggaacttcg gaataggaac ttcaaagcgt ttccgaaaac gagcgcttcc gaaaatgcaa 3240

cgcgagctgc gcacatacag ctcactgttc acgtcgcacc tatatctgcg tgttgcctgt 3300

atatatatat acatgagaag aacggcatag tgcgtgttta tgcttaaatg cgtacttata 3360

tgcgtctatt tatgtaggat gaaaggtagt ctagtacctc ctgtgatatt atcccattcc 3420

atgcggggta tcgtatgctt ccttcagcac taccctttag ctgttctata tgctgccact 3480

cctcaattgg attagtctca tccttcaatg ctatcatttc ctttgatatt ggatcatact 3540

aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc 3600

gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg 3660

tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg 3720

gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 3780

tgcaccatac cacagctttt caattcaatt catcattttt tttttattct tttttttgat 3840

ttcggtttct ttgaaatttt tttgattcgg taatctccga acagaaggaa gaacgaagga 3900

aggagcacag acttagattg gtatatatac gcatatgtag tgttgaagaa acatgaaatt 3960

gcccagtatt cttaacccaa ctgcacagaa caaaaacctg caggaaacga agataaatca 4020

tgtcgaaagc tacatataag gaacgtgctg ctactcatcc tagtcctgtt gctgccaagc 4080

tatttaatat catgcacgaa aagcaaacaa acttgtgtgc ttcattggat gttcgtacca 4140

ccaaggaatt actggagtta gttgaagcat taggtcccaa aatttgttta ctaaaaacac 4200

atgtggatat cttgactgat ttttccatgg agggcacagt taagccgcta aaggcattat 4260

ccgccaagta caatttttta ctcttcgaag acagaaaatt tgctgacatt ggtaatacag 4320

tcaaattgca gtactctgcg ggtgtataca gaatagcaga atgggcagac attacgaatg 4380

cacacggtgt ggtgggccca ggtattgtta gcggtttgaa gcaggcggca gaagaagtaa 4440

caaaggaacc tagaggcctt ttgatgttag cagaattgtc atgcaagggc tccctatcta 4500

ctggagaata tactaagggt actgttgaca ttgcgaagag cgacaaagat tttgttatcg 4560

gctttattgc tcaaagagac atgggtggaa gagatgaagg ttacgattgg ttgattatga 4620

cacccggtgt gggtttagat gacaagggag acgcattggg tcaacagtat agaaccgtgg 4680

atgatgtggt ctctacagga tctgacatta ttattgttgg aagaggacta tttgcaaagg 4740

gaagggatgc taaggtagag ggtgaacgtt acagaaaagc aggctgggaa gcatatttga 4800

gaagatgcgg ccagcaaaac taaaaaactg tattataagt aaatgcatgt atactaaact 4860

cacaaattag agcttcaatt taattatatc agttattacc ctatgcggtg tgaaataccg 4920

cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggaaattgt aaacgttaat attttgttaa 4980

aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca 5040

aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga 5100

acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc 5160

agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc 5220

gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc 5280

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aattccacac aacataggag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt 4740

gaggtaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 4800

gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 4860

ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 4920

atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 4980

gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 5040

gtttttccat aggctcggcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 5100

gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttc ccccctggaa gctccctcgt 5160

gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 5220

aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 5280

ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 5340

taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 5400

tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 5460

gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 5520

taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 5580

tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 5640

tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 5700

ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 5760

taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 5820

tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactgcccgt 5880

cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 5940

gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 6000

cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 6060

ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 6120

aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 6180

atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgaaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 6240

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 6300

gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 6360

aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 6420

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 6480

ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 6540

tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 6600

aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 6660

catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 6720

atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 6780

aaaagtgcca cctgggtcct tttcatcacg tgctataaaa ataattataa tttaaatttt 6840

ttaatataaa tatataaatt aaaaatagaa agtaaaaaaa gaaattaaag aaaaaatagt 6900

ttttgttttc cgaagatgta aaagactcta gggggatcgc caacaaatac taccttttat 6960

cttgctcttc ctgctctcag gtattaatgc cgaattgttt catcttgtct gtgtagaaga 7020

ccacacacga aaatcctgtg attttacatt ttacttatcg ttaatcgaat gtatatctat 7080

ttaatctgct tttcttgtct aataaatata tatgtaaagt acgctttttg ttgaaatttt 7140

ttaaaccttt gtttattttt ttttcttcat tccgtaactc ttctaccttc tttatttact 7200

ttctaaaatc caaatacaaa acataaaaat aaataaacac agagtaaatt cccaaattat 7260

tccatcatta aaagatacga ggcgcgtgta agttacaggc aagcgatccg tcctaagaaa 7320

ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 7377

<210> 9

<211> 4887

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pRS316

<400> 9

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accacgcttt tcaattcaat tcatcatttt ttttttattc ttttttttga tttcggtttc 240

tttgaaattt ttttgattcg gtaatctccg aacagaagga agaacgaagg aaggagcaca 300

gacttagatt ggtatatata cgcatatgta gtgttgaaga aacatgaaat tgcccagtat 360

tcttaaccca actgcacaga acaaaaacct gcaggaaacg aagataaatc atgtcgaaag 420

ctacatataa ggaacgtgct gctactcatc ctagtcctgt tgctgccaag ctatttaata 480

tcatgcacga aaagcaaaca aacttgtgtg cttcattgga tgttcgtacc accaaggaat 540

tactggagtt agttgaagca ttaggtccca aaatttgttt actaaaaaca catgtggata 600

tcttgactga tttttccatg gagggcacag ttaagccgct aaaggcatta tccgccaagt 660

acaatttttt actcttcgaa gacagaaaat ttgctgacat tggtaataca gtcaaattgc 720

agtactctgc gggtgtatac agaatagcag aatgggcaga cattacgaat gcacacggtg 780

tggtgggccc aggtattgtt agcggtttga agcaggcggc agaagaagta acaaaggaac 840

ctagaggcct tttgatgtta gcagaattgt catgcaaggg ctccctatct actggagaat 900

atactaaggg tactgttgac attgcgaaga gcgacaaaga ttttgttatc ggctttattg 960

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tgggtttaga tgacaaggga gacgcattgg gtcaacagta tagaaccgtg gatgatgtgg 1080

tctctacagg atctgacatt attattgttg gaagaggact atttgcaaag ggaagggatg 1140

ctaaggtaga gggtgaacgt tacagaaaag caggctggga agcatatttg agaagatgcg 1200

gccagcaaaa ctaaaaaact gtattataag taaatgcatg tatactaaac tcacaaatta 1260

gagcttcaat ttaattatat cagttattac cctgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 1320

aaggagaaaa taccgcatca ggaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta 1380

aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat 1440

aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca 1500

ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc 1560

ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta 1620

aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg 1680

gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg 1740

gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcg 1800

cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg 1860

ctattacgcc agctggcgaa ggggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca 1920

gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta 1980

tagggcgaat tggagctcca ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggg 2040

ctgcaggaat tcgatatcaa gcttatcgat accgtcgacc tcgagggggg gcccggtacc 2100

cagcttttgt tccctttagt gagggttaat tccgagcttg gcgtaatcat ggtcatagct 2160

gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacataggag ccggaagcat 2220

aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gaggtaactc acattaattg cgttgcgctc 2280

actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 2340

cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 2400

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caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctcggcc cccctgacga 2580

gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 2640

ccaggcgttc ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 2700

cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg 2760

taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 2820

cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 2880

acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 2940

aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 3000

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 3060

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 3120

gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 3180

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 3240

ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 3300

ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 3360

tcgttcatcc atagttgcct gactgcccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 3420

accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 3480

atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 3540

cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 3600

tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 3660

tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 3720

gtgaaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 3780

agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 3840

aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 3900

gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 3960

tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 4020

gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 4080

tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 4140

aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 4200

catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 4260

acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgggtcct tttcatcacg 4320

tgctataaaa ataattataa tttaaatttt ttaatataaa tatataaatt aaaaatagaa 4380

agtaaaaaaa gaaattaaag aaaaaatagt ttttgttttc cgaagatgta aaagactcta 4440

gggggatcgc caacaaatac taccttttat cttgctcttc ctgctctcag gtattaatgc 4500

cgaattgttt catcttgtct gtgtagaaga ccacacacga aaatcctgtg attttacatt 4560

ttacttatcg ttaatcgaat gtatatctat ttaatctgct tttcttgtct aataaatata 4620

tatgtaaagt acgctttttg ttgaaatttt ttaaaccttt gtttattttt ttttcttcat 4680

tccgtaactc ttctaccttc tttatttact ttctaaaatc caaatacaaa acataaaaat 4740

aaataaacac agagtaaatt cccaaattat tccatcatta aaagatacga ggcgcgtgta 4800

agttacaggc aagcgatccg tcctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 4860

ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 4887

<210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MFalpha2 signal sequence

<400> 10

Met Lys Phe Ile Ser Thr Phe Leu Thr Phe Ile Leu Ala Ala Val Ser

1 5 10 15

Val Thr Ala

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PHO5信号序列

<400> 11

Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn

1 5 10 15

<210> 12

<211> 515

<212> PRT

<213> 扣囊复膜酵母

<400> 12

Met Ile Arg Leu Thr Val Phe Leu Thr Ala Val Phe Ala Ala Val Ala

1 5 10 15

Ser Cys Val Pro Val Glu Leu Asp Lys Arg Asn Thr Gly His Phe Gln

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Ala Tyr Ser Gly Tyr Thr Val Ala Arg Ser Asn Phe Thr Gln Trp Ile

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Thr Ala Ile Thr Phe Leu Ser Leu Ile Ala Glu Val Glu Asp His Ser

100 105 110

Phe Ser Asn Thr Thr Leu Ala Lys Val Val Glu Tyr Tyr Ile Ser Asn

115 120 125

Thr Tyr Thr Leu Gln Arg Val Ser Asn Pro Ser Gly Asn Phe Asp Ser

130 135 140

Pro Asn His Asp Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Asp Thr

145 150 155 160

Ala Tyr Thr Ala Ser Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala Leu

165 170 175

Arg Ala Tyr Ala Ile Ser Arg Tyr Leu Asn Ala Val Ala Lys His Asn

180 185 190

Asn Gly Lys Leu Leu Leu Ala Gly Gln Asn Gly Ile Pro Tyr Ser Ser

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Ala Ser Asp Ile Tyr Trp Lys Ile Ile Lys Pro Asp Leu Gln His Val

210 215 220

Ser Thr His Trp Ser Thr Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gln

225 230 235 240

Gly Thr His Phe Phe Thr Ala Leu Val Gln Leu Lys Ala Leu Ser Tyr

245 250 255

Gly Ile Pro Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Asp Pro Gly Phe Thr Ser Trp

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Leu Glu Lys Gln Lys Asp Ala Leu Asn Ser Tyr Ile Asn Ser Ser Gly

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Ser Arg Gly Gly Leu Asp Ser Ala Thr Tyr Ile Ala Ala Leu Ile Thr

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His Asp Ile Gly Asp Asp Asp Thr Tyr Thr Pro Phe Asn Val Asp Asn

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Ser Tyr Val Leu Asn Ser Leu Tyr Tyr Leu Leu Val Asp Asn Lys Asn

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Arg Tyr Lys Ile Asn Gly Asn Tyr Lys Ala Gly Ala Ala Val Gly Arg

355 360 365

Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Asn Gly Val Gly Thr Ser Glu Gly Asn Pro

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Tyr Asn Ser Leu Lys Asn Lys Lys Asn Leu Val Ile Glu Lys Leu Asn

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Tyr Asp Leu Tyr Asn Ser Phe Ile Ala Asp Leu Ser Lys Ile Asp Ser

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Ser Tyr Ala Ser Lys Asp Ser Leu Thr Leu Thr Tyr Gly Ser Asp Asn

435 440 445

Tyr Lys Asn Val Ile Lys Ser Leu Leu Gln Phe Gly Asp Ser Phe Leu

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Lys Val Leu Leu Asp His Ile Asp Asp Asn Gly Gln Leu Thr Glu Glu

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Ile Asn Arg Tyr Thr Gly Phe Gln Ala Gly Ala Val Ser Leu Thr Trp

485 490 495

Ser Ser Gly Ser Leu Leu Ser Ala Asn Arg Ala Arg Asn Lys Leu Ile

500 505 510

Glu Leu Leu

515

<210> 13

<211> 516

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MFalpha2- Sf GA蛋白

<400> 13

Met Lys Phe Ile Ser Thr Phe Leu Thr Phe Ile Leu Ala Ala Val Ser

1 5 10 15

Val Thr Ala Val Pro Val Glu Leu Asp Lys Arg Asn Thr Gly His Phe

20 25 30

Gln Ala Tyr Ser Gly Tyr Thr Val Ala Arg Ser Asn Phe Thr Gln Trp

35 40 45

Ile His Glu Gln Pro Ala Val Ser Trp Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Ile

50 55 60

Asp Tyr Pro Glu Gly Gln Phe Lys Ser Ala Lys Pro Gly Val Val Val

65 70 75 80

Ala Ser Pro Ser Thr Ser Glu Pro Asp Tyr Phe Tyr Gln Trp Thr Arg

85 90 95

Asp Thr Ala Ile Thr Phe Leu Ser Leu Ile Ala Glu Val Glu Asp His

100 105 110

Ser Phe Ser Asn Thr Thr Leu Ala Lys Val Val Glu Tyr Tyr Ile Ser

115 120 125

Asn Thr Tyr Thr Leu Gln Arg Val Ser Asn Pro Ser Gly Asn Phe Asp

130 135 140

Ser Pro Asn His Asp Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Asp

145 150 155 160

Thr Ala Tyr Thr Ala Ser Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala

165 170 175

Leu Arg Ala Tyr Ala Ile Ser Arg Tyr Leu Asn Ala Val Ala Lys His

180 185 190

Asn Asn Gly Lys Leu Leu Leu Ala Gly Gln Asn Gly Ile Pro Tyr Ser

195 200 205

Ser Ala Ser Asp Ile Tyr Trp Lys Ile Ile Lys Pro Asp Leu Gln His

210 215 220

Val Ser Thr His Trp Ser Thr Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Asn

225 230 235 240

Gln Gly Thr His Phe Phe Thr Ala Leu Val Gln Leu Lys Ala Leu Ser

245 250 255

Tyr Gly Ile Pro Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Asp Pro Gly Phe Thr Ser

260 265 270

Trp Leu Glu Lys Gln Lys Asp Ala Leu Asn Ser Tyr Ile Asn Ser Ser

275 280 285

Gly Phe Val Asn Ser Gly Lys Lys His Ile Val Glu Ser Pro Gln Leu

290 295 300

Ser Ser Arg Gly Gly Leu Asp Ser Ala Thr Tyr Ile Ala Ala Leu Ile

305 310 315 320

Thr His Asp Ile Gly Asp Asp Asp Thr Tyr Thr Pro Phe Asn Val Asp

325 330 335

Asn Ser Tyr Val Leu Asn Ser Leu Tyr Tyr Leu Leu Val Asp Asn Lys

340 345 350

Asn Arg Tyr Lys Ile Asn Gly Asn Tyr Lys Ala Gly Ala Ala Val Gly

355 360 365

Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Asn Gly Val Gly Thr Ser Glu Gly Asn

370 375 380

Pro Trp Gln Leu Ala Thr Ala Tyr Ala Gly Gln Thr Phe Tyr Thr Leu

385 390 395 400

Ala Tyr Asn Ser Leu Lys Asn Lys Lys Asn Leu Val Ile Glu Lys Leu

405 410 415

Asn Tyr Asp Leu Tyr Asn Ser Phe Ile Ala Asp Leu Ser Lys Ile Asp

420 425 430

Ser Ser Tyr Ala Ser Lys Asp Ser Leu Thr Leu Thr Tyr Gly Ser Asp

435 440 445

Asn Tyr Lys Asn Val Ile Lys Ser Leu Leu Gln Phe Gly Asp Ser Phe

450 455 460

Leu Lys Val Leu Leu Asp His Ile Asp Asp Asn Gly Gln Leu Thr Glu

465 470 475 480

Glu Ile Asn Arg Tyr Thr Gly Phe Gln Ala Gly Ala Val Ser Leu Thr

485 490 495

Trp Ser Ser Gly Ser Leu Leu Ser Ala Asn Arg Ala Arg Asn Lys Leu

500 505 510

Ile Glu Leu Leu

515

<210> 14

<211> 514

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MFa1-Sf GA蛋白序列

<400> 14

Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn

1 5 10 15

Ala Val Pro Val Glu Leu Asp Lys Arg Asn Thr Gly His Phe Gln Ala

20 25 30

Tyr Ser Gly Tyr Thr Val Ala Arg Ser Asn Phe Thr Gln Trp Ile His

35 40 45

Glu Gln Pro Ala Val Ser Trp Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Ile Asp Tyr

50 55 60

Pro Glu Gly Gln Phe Lys Ser Ala Lys Pro Gly Val Val Val Ala Ser

65 70 75 80

Pro Ser Thr Ser Glu Pro Asp Tyr Phe Tyr Gln Trp Thr Arg Asp Thr

85 90 95

Ala Ile Thr Phe Leu Ser Leu Ile Ala Glu Val Glu Asp His Ser Phe

100 105 110

Ser Asn Thr Thr Leu Ala Lys Val Val Glu Tyr Tyr Ile Ser Asn Thr

115 120 125

Tyr Thr Leu Gln Arg Val Ser Asn Pro Ser Gly Asn Phe Asp Ser Pro

130 135 140

Asn His Asp Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Asp Thr Ala

145 150 155 160

Tyr Thr Ala Ser Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala Leu Arg

165 170 175

Ala Tyr Ala Ile Ser Arg Tyr Leu Asn Ala Val Ala Lys His Asn Asn

180 185 190

Gly Lys Leu Leu Leu Ala Gly Gln Asn Gly Ile Pro Tyr Ser Ser Ala

195 200 205

Ser Asp Ile Tyr Trp Lys Ile Ile Lys Pro Asp Leu Gln His Val Ser

210 215 220

Thr His Trp Ser Thr Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gln Gly

225 230 235 240

Thr His Phe Phe Thr Ala Leu Val Gln Leu Lys Ala Leu Ser Tyr Gly

245 250 255

Ile Pro Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Asp Pro Gly Phe Thr Ser Trp Leu

260 265 270

Glu Lys Gln Lys Asp Ala Leu Asn Ser Tyr Ile Asn Ser Ser Gly Phe

275 280 285

Val Asn Ser Gly Lys Lys His Ile Val Glu Ser Pro Gln Leu Ser Ser

290 295 300

Arg Gly Gly Leu Asp Ser Ala Thr Tyr Ile Ala Ala Leu Ile Thr His

305 310 315 320

Asp Ile Gly Asp Asp Asp Thr Tyr Thr Pro Phe Asn Val Asp Asn Ser

325 330 335

Tyr Val Leu Asn Ser Leu Tyr Tyr Leu Leu Val Asp Asn Lys Asn Arg

340 345 350

Tyr Lys Ile Asn Gly Asn Tyr Lys Ala Gly Ala Ala Val Gly Arg Tyr

355 360 365

Pro Glu Asp Val Tyr Asn Gly Val Gly Thr Ser Glu Gly Asn Pro Trp

370 375 380

Gln Leu Ala Thr Ala Tyr Ala Gly Gln Thr Phe Tyr Thr Leu Ala Tyr

385 390 395 400

Asn Ser Leu Lys Asn Lys Lys Asn Leu Val Ile Glu Lys Leu Asn Tyr

405 410 415

Asp Leu Tyr Asn Ser Phe Ile Ala Asp Leu Ser Lys Ile Asp Ser Ser

420 425 430

Tyr Ala Ser Lys Asp Ser Leu Thr Leu Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Tyr

435 440 445

Lys Asn Val Ile Lys Ser Leu Leu Gln Phe Gly Asp Ser Phe Leu Lys

450 455 460

Val Leu Leu Asp His Ile Asp Asp Asn Gly Gln Leu Thr Glu Glu Ile

465 470 475 480

Asn Arg Tyr Thr Gly Phe Gln Ala Gly Ala Val Ser Leu Thr Trp Ser

485 490 495

Ser Gly Ser Leu Leu Ser Ala Asn Arg Ala Arg Asn Lys Leu Ile Glu

500 505 510

Leu Leu

<210> 15

<211> 7401

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MFa1-Sf GA

<400> 15

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accacgcttt tcaattcaat tcatcatttt ttttttattc ttttttttga tttcggtttc 240

tttgaaattt ttttgattcg gtaatctccg aacagaagga agaacgaagg aaggagcaca 300

gacttagatt ggtatatata cgcatatgta gtgttgaaga aacatgaaat tgcccagtat 360

tcttaaccca actgcacaga acaaaaacct gcaggaaacg aagataaatc atgtcgaaag 420

ctacatataa ggaacgtgct gctactcatc ctagtcctgt tgctgccaag ctatttaata 480

tcatgcacga aaagcaaaca aacttgtgtg cttcattgga tgttcgtacc accaaggaat 540

tactggagtt agttgaagca ttaggtccca aaatttgttt actaaaaaca catgtggata 600

tcttgactga tttttccatg gagggcacag ttaagccgct aaaggcatta tccgccaagt 660

acaatttttt actcttcgaa gacagaaaat ttgctgacat tggtaataca gtcaaattgc 720

agtactctgc gggtgtatac agaatagcag aatgggcaga cattacgaat gcacacggtg 780

tggtgggccc aggtattgtt agcggtttga agcaggcggc agaagaagta acaaaggaac 840

ctagaggcct tttgatgtta gcagaattgt catgcaaggg ctccctatct actggagaat 900

atactaaggg tactgttgac attgcgaaga gcgacaaaga ttttgttatc ggctttattg 960

ctcaaagaga catgggtgga agagatgaag gttacgattg gttgattatg acacccggtg 1020

tgggtttaga tgacaaggga gacgcattgg gtcaacagta tagaaccgtg gatgatgtgg 1080

tctctacagg atctgacatt attattgttg gaagaggact atttgcaaag ggaagggatg 1140

ctaaggtaga gggtgaacgt tacagaaaag caggctggga agcatatttg agaagatgcg 1200

gccagcaaaa ctaaaaaact gtattataag taaatgcatg tatactaaac tcacaaatta 1260

gagcttcaat ttaattatat cagttattac cctgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 1320

aaggagaaaa taccgcatca ggaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta 1380

aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat 1440

aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca 1500

ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc 1560

ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta 1620

aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg 1680

gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg 1740

gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcg 1800

cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg 1860

ctattacgcc agctggcgaa ggggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca 1920

gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta 1980

tagggcgaat tggagctcca ccgcggtggc ggccgcctcg agatctcccc taaaccgtgg 2040

aatatttcgg atatcctttt gttgtttccg ggtgtacaat atggacttcc tcttttctgg 2100

caaccaaacc catacatcgg gattcctata ataccttcgt tggtctccct aacatgtagg 2160

tggcggaggg gagatataca atagaacaga taccagacaa gacataatgg gctaaacaag 2220

actacaccaa ttacactgcc tcattgatgg tggtacataa cgaactaata ctgtagccct 2280

agacttgata gccatcatca tatcgaagtt tcactaccct ttttccattt gccatctatt 2340

gaagtaataa taggcgcatg caacttcttt tctttttttt tcttttctct ctcccccgtt 2400

gttgtctcac catatccgca atgacaaaaa aatgatggaa gacactaaag gaaaaaatta 2460

acgacaaaga cagcaccaac agatgtcgtt gttccagagc tgatgggggg tatctcgaag 2520

cacacgaaac tttttccttc cttcattcac gcacactact ctctaatgag caacggtata 2580

cggccttcct tccagttact tgaatttgaa ataaaaaaag tttgctgtct tgctatcaag 2640

tataaataga cctgcaatta ttaatctttt gtttcctcgt cattgttctc gttccctttc 2700

ttccttgttt ctttttctgc acaatatttc aagctatacc aagcatacaa tcaactatct 2760

catatacaat gcaaccatcc actgctactg ctgccccaaa ggaaaaaacc tcctctgaaa 2820

agaaagacaa tgttccagtt gaattggata agagaaacac cggtcatttc caagcttatt 2880

ctggttatac cgttgctaga tctaacttca cccaatggat tcatgaacaa ccagctgttt 2940

cttggtacta cttgttgcaa aacatcgatt acccagaagg tcaattcaaa tctgctaaac 3000

caggtgttgt tgttgcttct ccatctacat ctgaaccaga ttacttctac caatggacta 3060

gagataccgc tattaccttc ttgtccttga ttgctgaagt tgaagatcat tctttctcca 3120

acactacctt ggctaaggtt gtcgaatatt acatttccaa cacctacacc ttgcaaagag 3180

tttctaatcc atccggtaac ttcgattctc caaatcatga tggtttgggt gaacctaagt 3240

tcaacgttga tgatactgct tatacagctt cttggggtag accacaaaat gatggtccag 3300

ctttgagagc ttacgctatt tctagatact tgaacgctgt tgctaagcac aacaacggta 3360

aattattatt ggccggtcaa aacggtattc cttattcttc tgcttccgat atctactgga 3420

agattattaa gccagacttg caacatgttt ctactcattg gtctacctct ggttttgatt 3480

tgtgggaaga aaatcaaggt actcatttct tcaccgcttt ggttcaattg aaggctttgt 3540

cttacggtat tccattgtct aagacctaca atgatccagg tttcacttct tggttggaaa 3600

aacaaaagga tgccttgaac tcctacatta actcttccgg tttcgttaac tctggtaaaa 3660

agcacatcgt tgaatctcca caattgtcat ctagaggtgg tttggattct gctacttata 3720

ttgctgcctt gatcacccat gatatcggtg atgatgatac ttacacccca ttcaatgttg 3780

ataactccta cgttttgaac tccttgtatt acctattggt cgacaacaag aacagataca 3840

agatcaacgg taactacaaa gctggtgctg ctgttggtag atatcctgaa gatgtttaca 3900

acggtgttgg tacttctgaa ggtaatccat ggcaattggc tactgcttat gctggtcaaa 3960

ctttttacac cttggcctac aattccttga agaacaagaa gaacttggtc atcgaaaagt 4020

tgaactacga cttgtacaac tccttcattg ctgatttgtc caagattgat tcttcctacg 4080

cttctaagga ttctttgact ttgacctacg gttccgataa ctacaagaac gttatcaagt 4140

ccttgttgca attcggtgac tcattcttga aggttttgtt ggatcacatc gatgacaacg 4200

gtcaattgac tgaagaaatc aacagataca ccggttttca agctggtgca gtttctttga 4260

cttggtcatc tggttctttg ttgtctgcta atagagccag aaacaagttg atcgaattat 4320

tgtgtgttat tgcctaaaca ggcccctttt cctttgtcga tatcatgtaa ttagttatgt 4380

cacgcttaca ttcacgccct cctcccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac 4440

aacctgaagt ctaggtccct atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat 4500

ttatatttca aatttttctt ttttttctgt acaaacgcgt gtacgcatgt aacgggcaga 4560

cgaattcgat atcaagctta tcgataccgt cgacctcgag ggggggcccg gtaccagctt 4620

ttgttccctt tagtgagggt taattccgag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 4680

tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata ggagccggaa gcataaagtg 4740

taaagcctgg ggtgcctaat gagtgaggta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 4800

cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 4860

gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 4920

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 4980

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 5040

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc ggcccccctg acgagcatca 5100

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 5160

gttcccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 5220

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta 5280

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 5340

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 5400

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 5460

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 5520

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 5580

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 5640

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 5700

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 5760

ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 5820

tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 5880

atccatagtt gcctgactgc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 5940

tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 6000

aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 6060

catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 6120

gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 6180

ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgaaa 6240

aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 6300

atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 6360

cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 6420

gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 6480

agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 6540

gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 6600

caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 6660

ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 6720

tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 6780

aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctggg tccttttcat cacgtgctat 6840

aaaaataatt ataatttaaa ttttttaata taaatatata aattaaaaat agaaagtaaa 6900

aaaagaaatt aaagaaaaaa tagtttttgt tttccgaaga tgtaaaagac tctaggggga 6960

tcgccaacaa atactacctt ttatcttgct cttcctgctc tcaggtatta atgccgaatt 7020

gtttcatctt gtctgtgtag aagaccacac acgaaaatcc tgtgatttta cattttactt 7080

atcgttaatc gaatgtatat ctatttaatc tgcttttctt gtctaataaa tatatatgta 7140

aagtacgctt tttgttgaaa ttttttaaac ctttgtttat ttttttttct tcattccgta 7200

actcttctac cttctttatt tactttctaa aatccaaata caaaacataa aaataaataa 7260

acacagagta aattcccaaa ttattccatc attaaaagat acgaggcgcg tgtaagttac 7320

aggcaagcga tccgtcctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 7380

gtatcacgag gccctttcgt c 7401

Claims (43)

1.多肽，其包含(a)与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有90％或更高相同性的分泌信号氨基酸序列，和(b)来自酵母、真菌或细菌葡糖淀粉酶多肽的葡糖淀粉酶氨基酸序列，其中所述多肽具有葡糖淀粉酶活性。

2.多肽，其包含(a)与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有90％或更高相同性的分泌信号氨基酸序列，和(b)与SEQ ID NO:12的氨基酸19-515具有90％或更高序列相同性的葡糖淀粉酶氨基酸序列。

3.权利要求1或2的多肽，其与SEQ ID NO:13具有95％或更高序列相同性。

4.权利要求3的多肽，其包含SEQ ID NO:13。

5.权利要求1或2的多肽，其与SEQ ID NO:14具有95％或更高序列相同性。

6.权利要求5的多肽，其包含SEQ ID NO:14。

7.前述权利要求中任一项的多肽，其还包含不同于SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或所述葡糖淀粉酶氨基酸序列的第三序列，其中所述第三序列位于SEQ ID NO:10和所述葡糖淀粉酶氨基酸序列之间，或SEQ ID NO:11和所述葡糖淀粉酶氨基酸序列之间。

8.权利要求1的多肽，其中所述葡糖淀粉酶氨基酸序列来自酵母或真菌葡糖淀粉酶。

9.权利要求8的多肽，其中所述葡糖淀粉酶氨基酸序列来自选自Amorphothecaresinae、黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、川地曲霉(Aspergillus kawachii)、Aspergillus shirousami、Blastobotrys adeninivorans、白色念珠菌(Candida albicans)、米根霉(Rhizopusoryzae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、Brettanomycesbruxellensis和Cyberlindnera jadinii的酵母或真菌生物体。

10.权利要求1或9的多肽，其中所述葡糖淀粉酶氨基酸序列是酵母或真菌葡糖淀粉酶多肽的酶促活性部分。

11.权利要求2的多肽，其中所述葡糖淀粉酶氨基酸序列与SEQ ID NO:12的氨基酸19-515具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高序列相同性。

12.权利要求11的多肽，其中所述葡糖淀粉酶氨基酸序列与SEQ ID NO:12的氨基酸19-515具有100％相同性。

13.核酸，其包含编码权利要求1-12中任一项的多肽的核酸序列。

14.权利要求13的核酸，其与对应于SEQ ID NO:7的位置2769-4319的核苷酸序列具有75％或更高、或80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或99％或更高序列相同性。

15.权利要求13的核酸，其与对应于SEQ ID NO:8的位置2769-4313的核苷酸序列具有75％或更高、或80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或99％或更高序列相同性。

16.权利要求15-17中任一项的核酸，其还包含转录调节序列。

17.权利要求16的核酸，其中所述转录调节序列包含ADH启动子。

18.载体，其包含权利要求13-17中任一项的核酸。

19.权利要求18的载体，其包含用于在酵母中选择的营养缺陷型基因标记物。

20.宿主细胞，其表达权利要求1-12中任一项的多肽。

21.宿主细胞，其包含权利要求13-19中任一项的核酸或载体。

22.权利要求20或21的宿主细胞，其是酵母属(Saccharomyces)的物种。

23.权利要求22的宿主细胞，其为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

24.权利要求21-23中任一项的宿主细胞，其(a)对于在具有大于90g/L的乙醇浓度的发酵培养基中的生长耐受，(b)对于在高于33℃、诸如在34℃-40℃的范围内的温度下的生长耐受，或(a)和(b)两者。

25.发酵培养基，其包含权利要求1-12中任一项的多肽或权利要求20-24中任一项的宿主细胞。

26.权利要求1-12中任一项的多肽、权利要求20-24中任一项的宿主细胞或权利要求25的发酵培养基用于制备生物产物或饲料组合物的用途。

27.权利要求25的发酵培养基，其包含浓度为约90g/L或更高的乙醇。

28.权利要求27的发酵培养基，其包含浓度在90g/L至170g/L的范围内的乙醇。

29.从权利要求25、27或28中任一项的发酵培养基制备的饲料组合物。

30.权利要求29的饲料组合物，其通过包括以下步骤的方法制备：(a)从所述发酵培养基中除去生物产物的一些或全部以提供包含非生物产物固体的精制组合物，和(b)使用所述精制组合物用于形成饲料组合物。

31.用于生产发酵产物的发酵方法，其包括以下步骤：

发酵包含淀粉材料和非天然酵母的液体培养基，所述非天然酵母包含编码包含葡糖淀粉酶的多肽的外源核酸，

其中所述培养基具有2.25U或更大/克生物量的量的比葡糖淀粉酶活性，其中所述葡糖淀粉酶由非天然酵母提供。

32.权利要求31的发酵方法，其中所述培养基具有2.3U或更大、约2.35U或更大、约2.4U或更大、约2.45U或更大、约2.5U或更大、约2.6U或更大、约2.7U或更大、约2.8U或更大、约2.9U或更大、约3U或更大、约3.5U或更大、约4U或更大、约4.5U或更大、约5U或更大、约5.5U或更大、约6U或更大、约6.5U或更大、约7U或更大、约7.5U或更大或约8U或更大/克生物量的量的葡糖淀粉酶活性。

33.权利要求31的发酵方法，其中所述培养基具有约2.3U至约15U、约2.4U至约15U、约2.5U至约15U、约3U至约15U、约3.5U至约15U、约4U至约15U、约4.5U至约15U、约5U至约15U、约5.5U至约15U、约6U至约15U、约6.5U至约15U、约7U至约15U、约7.5U至约15U或约8U至约15U/克生物量的量的葡糖淀粉酶活性。

34.权利要求31-33中任一项的发酵方法，其中所述多肽包含葡糖淀粉酶部分和与所述葡糖淀粉酶部分异源的信号序列。

35.权利要求34的发酵方法，其中(a)所述信号序列与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有90％或更高相同性，(b)所述葡糖淀粉酶氨基酸序列与SEQ ID NO:12的氨基酸19-515具有90％或更高序列相同性；或(a)和(b)两者。

36.权利要求31-35中任一项的发酵方法，其中所述发酵产物是乙醇。

37.权利要求36的发酵方法，其中在培养基中产生浓度为90g/L或更高的乙醇。

38.用于在培养基中产生浓度为90g/L或更高的乙醇的发酵方法，其包括以下步骤：

发酵包含淀粉材料和非天然酵母的液体培养基，所述非天然酵母包含编码多肽的外源核酸，所述多肽包含葡糖淀粉酶部分和与所述葡糖淀粉酶异源的信号序列，其中所述发酵在液体培养基中提供90g/L或更高的乙醇浓度。

39.权利要求38的方法，其中所述发酵提供90g/L至170g/L范围内的乙醇。

40.权利要求39的方法，其中所述发酵提供110g/L至170g/L范围内的乙醇。

41.权利要求40的方法，其中所述发酵提供125g/L至170g/L范围内的乙醇。

42.权利要求41的方法，其中所述发酵提供140g/L至170g/L范围内的乙醇。

43.权利要求38-42中任一项的方法，其中所述信号序列包含SEQ IDNO:13或SEQ IDNO:14。