KR20150042856A - 클라빈-유형 알칼로이드의 생산을 위한 유전자 및 방법 - Google Patents

클라빈-유형 알칼로이드의 생산을 위한 유전자 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 원칙적으로 클라빈-유형 알칼로이드, 예컨대 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 및 카노클라빈 알데히드의 재조합 제조의 분야에 속한다. 본 발명은 클라빈-유형 알칼로이드의 제조를 위한 방법에 적용될 수 있는 클라빈-유형 알칼로이드 및 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 제조를 위한 미생물 및 공정을 제공한다.

Description

클라빈-유형 알칼로이드의 생산을 위한 유전자 및 방법{GENES AND PROCESSES FOR THE PRODUCTION OF CLAVINE-TYPE ALKALOIDS}
본원은 그 전문을 본원에 참조로 포함하는 US 61/691848, EP 12181388.5, US 61/786841, EP 13159444.2 및 EP 13178008.2를 기초로 한 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 원칙적으로 클라빈-유형 알칼로이드, 예컨대 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 및 카노클라빈 알데히드의 재조합 제조의 분야에 속한다. 본 발명은 클라빈-유형 알칼로이드의 제조를 위한 방법에 적용될 수 있는 클라빈-유형 알칼로이드 및 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 제조를 위한 미생물 및 공정을 제공한다.
맥각 알칼로이드는 다양한 구조 및 생리학적 활성을 갖는 복잡한 패밀리의 인돌 유도체이고 ([Flieger 1997, Folia Microbiol (Praha) 42:3-30]; [Schardl 2006, Chem Biol 63:45-86]), 클라비시피타세아에(Clavicipitaceae) (예를 들어 클라비셉스(Claviceps) 및 네오티포디움(Neotyphodium) 또는 에피클로에(Epichloee)) 및 트리코코마세아에(Trichocomaceae) (아스페르길루스(Aspergillus) 및 페니실리움(Penicillium) 포함) 과의 진균에 의해 생산된다. 클라비셉스, 페니실리움, 및 아스페르길루스 속의 진균이 중요한 천연 생산자이지만 ([Flieger 1997, 상기 문헌]; [Schradl 상기 문헌]), 스파셀리아(Sphacelia), 발란시아(Balansia) 또는 페리글란둘라(Periglandula) 속에서도 또한 발견된다 ([Pazoutova, S. et al., 2008, Fungal Diversity, 31: 95-110] 및 [Steiner, U. 2011, Mycologia, 103(5):1133-1145]). 천연 맥각 알칼로이드 및 그들의 반합성 유도체는 모두 현대 의학에서 널리 사용되고, 자궁수축 활성, 혈압의 조정, 뇌하수체 호르몬의 분비의 제어, 편두통 예방, 및 도파민작용성 및 신경이완 활성을 비롯한 광범위한 약물학적 활성을 나타낸다 ([de Groot 1998, Drugs 56:523-535]; [Haarmann 2009, Mol Plant Pathol 10:563-577]; [Schardl 2006, 상기 문헌]). 맥각 알칼로이드는 그들의 구조적 특징에 따라 2개의 클래스로 나누어질 수 있으며, 즉 D-리세르그산의 아미드 유도체 및 클라빈-유형 알칼로이드 ([Flieger 1997, 상기 문헌];, [Groger 1998, Alkaloids Chem Biol 50:171-218]). 첫 번째 군의 구성원은 대체로 리세르그산 및 펩티드 모이어티로 구성된다. 이들은 또한 에르고펩틴으로도 칭해진다. 에르고펩틴의 중요한 구성원은 예를 들어, 에르고타민 및 에르고발린이다. 클라빈-유형 알칼로이드, 예를 들어 시클로클라빈, 아그로클라빈, 푸미가클라빈 및 유사한 물질, 예를 들어 엘리모클라빈, 피로클라빈, 코스타클라빈 또는 엡코스타클라빈 및 그들의 전구체 카노클라빈-I 및 카노클라빈 알데히드는 단지 에르고펩틴처럼 동일한 또는 유사한 트리시클릭 또는 테트라시클릭 고리 시스템으로만 이루어지지만, 펩티드 모이어티는 결핍된다. 그러나, 클라빈-유형 알칼로이드는 또한 추가의 치환기를 포함할 수 있고, 따라서 상기 언급된 클라빈-유형 알칼로이드에 제한되지는 않는다. 상기 유도체의 예는 푸미가클라빈의 군이고, 예를 들어 푸미클라빈 A, B 또는 C, 이소푸미가클라빈 A 또는 B, 또는 9-데아세틸푸미가클라인 C (Wallwey, C. and Li, S.M. 2011, Nat. Prod. Rep., 28:496-510)는 페스투클라빈과 기본 구조를 공유하지만, 추가의 치환기를 포함한다. 푸미가클라빈은 예를 들어, 페니실리움 및 아스페르길루스, 예를 들어, 에이. 푸미가투스(A. fumigatus)에 의해 생산된다 (Flieger 1997, 상기 문헌). 그러나, 클라비시피타세아에의 진균 과, 예를 들어 씨. 푸르푸레아(C. purpurea) (Flieger 1997, 상기 문헌)는 리세르그산의 유도체인 것으로 간주될 수 있는 에르고펩틴을 생산하는 능력을 갖고, 그의 전구체 중 하나는 클라빈-유형 알칼로이드 아그로클라빈이다. 에르고펩티드 및 클라빈-유형 알칼로이드의 전구체를 비교하면 그들의 생합성 경로의 초기 단계는 매우 유사하고, 마찬가지로 예를 들어 에이. 푸미가투스 및 씨. 푸르푸레아에 의해 공유되는 반면, 경로의 나중의 단계는 2개의 진균 종에서 상이함을 가르킨다 ([Li 2006, Chembiochem 7:158-164]; [Panaccione 2005, FEMS Microbiol Lett 251:9-17]; [Schardl 2006, 상기 문헌]).
클라빈-유형 알칼로이드 및 심지어 맥각 알칼로이드의 발효 생산은 일반적으로 맥각 알칼로이드의 천연 생산자가 대규모 배양하기 어려운 경향이 있다는 문제를 극복해야 한다. 이에 대한 하나의 이유는 사상 진균을 침수 배양으로 발효시키는 기술적 문제이다. 일부 천연 맥각 알칼로이드 생산자는 심지어 식물 속, 예를 들어 이포모에아(Ipomoea), 투르비나(Turbina), 아르기레이아(Argyreia) 및 스트릭토카르디아(Strictocardia) (예를 들어, 페리글란둘라 종) 또는 특정 초본 종, 예를 들어 롤리움(Lolium), 소르굼(Sorghum) 또는 페스투카(Festuca) (예를 들어 네오티포디움 및 에피클로에 종)의 내부 기생식물이다. 또한, 많은 천연 맥각 알칼로이드 생산자는 이들 알칼로이드를 단지 특수한 조건 하에서 또는 특정 발생기 동안에 생산하고, 심지어 대체로 낮은 생산 속도로 생산한다. 많은 천연 맥각 알칼로이드 생산자는 상이한 맥각 알칼로이드들의 집합체를 생산하고, 이것은 주어진 알칼로이드를 비용 효과적인 방식으로 단리하는데 문제를 일으키고, 관심있는 특정 알칼로이드의 생산을 더욱 저하시킨다. 맥각 알칼로이드 또는 훨씬 덜 복잡한 클라빈-유형 알칼로이드의 총 화학적 합성은 지금까지, 여전히 상당한 도전 과제를 갖고, 대체로 라세미 혼합물의 합성을 일으킨다.
이들 문제를 극복하기 위해, 본 발명은 재조합 미생물 및 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 및 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 및 이들 재조합 미생물 및 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 사용하는 방법, 및 클라빈-유형 알칼로이드의 생산을 위한 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 벡터를 제공한다.
본 발명은
a) 적어도 하나의 EasH 활성, 또는
b) 적어도 하나의 EasH 및 EasD 활성, 또는
c) 적어도 하나의 EasH 및 EasA 리덕타제 활성, 또는
d) 적어도 하나의 EasH, EasD 및 EasA 활성, 또는
e) 적어도 하나의 EasH 및 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
f) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 또는
g) 적어도 하나의 EasD, EasA 및 EasG 활성, 또는
h) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
i) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
j) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성,
k) a) 내지 j) 중 적어도 2개의 조합
을 포함하는 재조합 미생물을 제공하고,
여기서 재조합 미생물은 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 아니다.
본 발명은 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성으로 이루어지는 활성의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 상향조절된 활성을 갖는 추가의 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 제공하고, 여기서 EasA 활성은 EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasA 리덕타제 및 EasA 이소머라제 활성이다.
재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는
a) 적어도 하나의 EasH 활성, 또는
b) 적어도 하나의 EasH 및 EasD, 또는
c) 적어도 하나의 EasH 및 EasA 리덕타제 활성, 또는
d) 적어도 하나의 EasH, EasD 및 EasA 활성, 또는
e) 적어도 하나의 EasH 및 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
f) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 또는
g) 적어도 하나의 EasD, EasA 및 EasG 활성, 또는
h) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
i) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
j) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성
의 군 중의 하나 이상의 활성으로부터 선택되는 적어도 하나의 상향조절된 활성을 포함한다.
추가로, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 하향조절된 활성을 갖는 상기 설명한 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제공된다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 DMAPP의 확대된 공급 및/또는 Me-DMAT의 확대된 공급을 포함하는, 바람직하게는 적어도 하나의 하향조절된 ERG9 또는 ERG20 활성, 또는 적어도 하나의 상향조절된 HMG-CoA 리덕타제 활성을 포함하는, 또는 적어도 하나의 하향조절된 ERG9 또는 ERG20 활성 및 적어도 하나의 상향조절된 HMG-CoA 리덕타제 활성을 포함하는, 본원에서 설명되는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체이다.
본 발명의 다른 실시양태는 다음을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 포함한다:
a) 적어도 하나의 EasH 활성, 또는
b) 적어도 하나의 EasH 및 EasD 활성, 또는
c) 적어도 하나의 EasA 리덕타제 또는 적어도 하나의 EasA 이소머라제 활성, 또는
d) 적어도 하나의 EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
e) 적어도 하나의 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
f) 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
g) 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
h) 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
i) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성, 또는
j) a) 내지 i) 중 적어도 2개의 조합.
본 발명은 또한 다음을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
a) 적어도 하나의 EasH 활성, 또는
b) 적어도 하나의 EasH 및 EasD 활성, 또는
c) 적어도 하나의 EasA 리덕타제 또는 적어도 하나의 EasA 이소머라제 활성, 또는
d) 적어도 하나의 EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
e) 적어도 하나의 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
f) 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
g) 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
h) 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
i) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성
j) a) 내지 i) 중 적어도 2개의 조합.
추가로, DmaW 활성이 다음에 의한 것인, 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 또는 설명된 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
a) 서열 145 및 146에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
b) 서열 147 또는 190에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 1, 19, 20, 179, 또는 180에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 1, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 102, 122 또는 123에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
f) 서열 129 또는 137에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
g) 서열 102, 122 또는 123에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
h) 엄격한 조건 하에 서열 102, 122 또는 123에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 b) 및 c)에 따른 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 a) 내지 i) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
추가의 실시양태는 EasF 활성이 다음에 의한 것인, 본원에서 설명되는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 또는 상기 설명한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
a) 서열 154에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
b) 서열 6, 75 또는 76에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 6, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 또는 85에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 107 또는 120에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 134 또는 142에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
f) 서열 107 또는 120에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
g) 엄격한 조건 하에 서열 107 또는 120에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드, 또는
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
본 발명의 다른 부분은 EasE 활성이 다음에 의한 것인, 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 또는 상기 설명한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
a) 서열 153, 185 또는 191에 적어도 90% 서열 동일성, 바람직하게는 서열 191에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는,
b) 서열 5 또는 64에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 5, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 또는 서열 5, 64, 175, 66, 67, 68, 69, 176, 71, 177, 73 또는 178에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 106에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 133 또는 141에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
f) 서열 106, 133 또는 141에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는
g) 엄격한 조건 하에 서열 106, 133 또는 141에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는
h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드, 또는
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
추가의 부분은 EasC 활성이 다음에 의한 것인, 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 또는 상기 설명한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
a) 서열 151 또는 192에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는,
b) 서열 3 또는 41에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 3, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 104에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 131 또는 139에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
f) 서열 104, 131 또는 139에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
g) 엄격한 조건 하에 서열 104, 131 또는 139에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
h) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드, 또는 a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
본 발명은 EasD 활성이 다음에 의한 것인, 상기 설명한 추가의 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 또는 상기 설명한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
a) 서열 152에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는,
b) 서열 4 또는 53에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 4, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 또는 63에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 105에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 132 또는 140에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
f) 서열 105, 132 또는 140에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
g) 엄격한 조건 하에 서열 105, 132 또는 140에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
h) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드, 또는 a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
본 발명의 다른 부분은 EasH 활성이 다음에 의한 것인, 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 또는 상기 설명한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
a) 서열 156에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
b) 서열 8 및/또는 95에 적어도 60% 서열 동일성을 갖고 서열 156에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 8 및/또는 95에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 109, 및/또는 157에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 109, 136, 144 및/또는 157에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
f) 서열 109, 136, 144 및/또는 157에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는
g) 엄격한 조건 하에 서열 109, 136, 144 및/또는 157에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는
h) a) 내지 g) 중 적어도 2개에 따른 폴리펩티드, 또는
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
추가의 실시양태는 EasA 리덕타제 활성이 다음에 의한 것인, 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 또는 상기 설명한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
a) 서열 148, 149 및 150에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 서열 149의 아미노산 위치 18에 티로신을 갖는 폴리펩티드, 또는
b) 서열 2 또는 31에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 2, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 103에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 130 또는 138에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
f) 서열 103에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
g) 엄격한 조건 하에 서열 103에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드, 또는
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
다른 실시양태는 EasA 이소머라제 활성이 다음에 의한 것인, 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 또는 상기 설명한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
a) 서열 148, 149 및 150에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 서열 149의 아미노산 위치 18에 페닐알라닌을 갖는 폴리펩티드, 또는
b) 서열 2 또는 31에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 2, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 103에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 130 또는 138에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
f) 서열 103에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
g) 엄격한 조건 하에 서열 103에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드, 또는
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
추가의 실시양태는 EasG 활성이 다음에 의한 것인, 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 또는 상기 설명한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
a) 서열 155 또는 183에 적어도 90% 서열 동일성, 바람직하게는 서열 183에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는,
b) 서열 7 또는 86에 적어도 39% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 또는 94에 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 181, 92, 93 또는 94에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 108에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 135 또는 143에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
f) 서열 108에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
g) 엄격한 조건 하에 서열 108에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드, 또는
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
본 발명은 ERG9 활성이 서열 9에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의한 것이거나, 또는 ERG20 활성이 서열 10에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의한 것이거나, 또는 HMG-CoA 리덕타제 활성이 서열 11에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의한 것이거나, 또는 ERG9, ERG20 및 HMG-CoA 리덕타제 활성 중 적어도 2개가 서열 9, 10 또는 11에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의한 것이거나, 또는 ERG9, ERG20 및 HMG-CoA 리덕타제 활성이 서열 9, 10 또는 11에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의한 것인, 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 추가로 제공한다. 추가의 실시양태는
a) 시클로클라빈,
b) 페스투클라빈,
c) 아그로클라빈,
d) 카노클라빈 알데히드,
e) 카노클라빈 I
의 화합물의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 재조합 미생물을 포함하고, 여기서 재조합 미생물은 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 아니다.
본 발명은 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 동일한 조건 하에 성장할 때 비-재조합 야생형 유기체에 비해 보다 많은 양으로 포함하고/하거나 생산하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 제공한다. 추가의 실시양태는
a) 시클로클라빈,
b) 페스투클라빈,
c) 아그로클라빈,
d) 카노클라빈 알데히드,
e) 카노클라빈 I
의 화합물의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는, 상기 설명한 본 발명의 부분 및 실시양태의 임의의 하나에서 설명되는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 포함한다.
본 발명의 다른 부분은 본 발명의 부분 및 실시양태의 임의의 하나에서 설명되는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 재조합 발현 카세트 또는 적어도 하나의 상기 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 추가의 부분은
a) 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에서 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산을 허용하는 조건 하에 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 배양하는 단계; 및
b) 상기 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I을 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 및/또는 배양 배지로부터 얻는 단계
를 포함하는, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산 방법이다.
본 발명의 다른 방법은
a) 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에서 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산을 허용하는 조건 하에 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 배양하는 단계;
b) 상기 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에게 IPP, 트립토판, DMAPP, DMAT, Me-DMAT 또는 카노클라빈 I의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 배양 배지를 통해 제공하는 단계; 및
c) 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 및/또는 배양 배지로부터 상기 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I을 얻는 단계
를 포함하는, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산 방법을 제공한다.
상기 설명한 방법의 변형은 시클로클라빈이 생산되고 얻어지는, 또는 페스투클라빈이 생산되고 얻어지는 또는 아그로클라빈이 생산되고 얻어지는, 또는 카노클라빈 I이 배지에 공급되고 시클로클라빈이 생산되고 얻어지는, 또는 카노클라빈 I이 생산되고 얻어지는, 또는 카노클라빈 알데히드가 생산되고 얻어지는 방법을 포함한다. 상기 설명한 방법은 상이한 배양 온도를 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 부분은 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 10℃ 내지 40℃, 바람직하게는 15℃ 내지 35℃, 보다 바람직하게는 18℃ 내지 32℃, 보다 더 바람직하게는 20℃ 내지 30℃의 온도에서 배양되는 방법을 포함한다. 방법은 10℃ 내지 32℃, 13℃ 내지 32℃, 15℃ 내지 32℃, 16℃ 내지 32℃, 17℃ 내지 32℃, 18℃ 내지 32℃, 19℃ 내지 32℃, 20℃ 내지 32℃, 15℃ 내지 31℃, 15℃ 내지 30℃, 15℃ 내지 29℃, 15℃ 내지 28℃, 15℃ 내지 27℃, 15℃ 내지 26℃, 15℃ 내지 25℃의 온도에서 배양된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 이용할 수 있다. 상기 방법의 변형은 배양 온도의 변화를 포함한다. 따라서, 본 발명은 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 먼저 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 25℃ 내지 35℃의 온도에서, 이어서 10℃ 내지 25℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃의 온도에서 배양되는, 또는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 먼저 10℃ 내지 25℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃의 온도에서, 이어서 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 25℃ 내지 35℃의 온도에서 배양되는 상기 설명한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 하나의 생산된 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I이 추출을 통해 얻어지는 상기 설명한 방법을 제공한다. 상기 방법은 적어도 하나의 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I이 에틸 아세테이트 (EA), tert-부틸 메틸에테르 (TBME), 클로로포름 (CHCl3) 및 디클로로메탄 (DCM)의 군으로부터 선택되는 화합물을 사용한 추출을 포함하는 추출 방법을 통해 얻어지는 방법 및 적어도 하나의 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I이 pH=10에서 에틸 아세테이트를 사용한 액체/액체 추출, 바람직하게는 pH가 NaOH로 조정되는, pH=10에서 에틸 아세테이트를 사용한 액체/액체 추출을 포함하는 추출 방법을 통해 얻어지는 방법을 포함한다. 상기 방법의 추가의 변형은 적어도 하나의 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I이 바람직하게는 pH=3의 HLB 수지, pH=3의 디아이온(Diaion) 수지, pH=3의 앰벌라이트(Amberlite) 1180 수지, pH=10의 앰벌라이트 1180 수지, pH=3의 앰벌라이트 16N 수지 또는 pH=10의 앰벌라이트 16N 수지의 군으로부터 선택되는 실리카계 수지 물질을 사용한 고상 추출을 사용한 추출을 포함하는 추출 방법을 통해 얻어지는 방법을 포함한다. 본 발명의 추가의 부분은 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물의 생산을 위한 또는 상기 설명한 임의의 방법에서, 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 용도 또는 상기 설명한 재조합 폴리뉴클레오티드의 용도, 또는 상기 설명한 벡터의 용도를 포함한다. 본 발명은 상기 설명한 임의의 방법에 의해 생산된 추가의 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I을 포함한다. 본 발명의 다른 부분은 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나를 포함하지만, 다른 맥각 알칼로이드는 존재하지 않거나 낮은 함량으로 존재하는, 상기 설명한 방법에서 생산된 배양 배지, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나를 포함하지만, 다른 맥각 알칼로이드는 존재하지 않거나 낮은 함량으로 존재하는 배양 배지이다. 본 발명은 상기 설명한 본 발명의 임의의 일부 및 실시양태에서 사용될 수 있는 추가의 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
따라서, 본 발명은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
a) 서열 129, 또는 130, 131, 132, 133, 134, 135 또는 136에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 서열;
b) 서열 20, 31, 41, 53, 64, 75, 86 또는 95에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
c) 서열 129, 또는 130, 131, 132, 133, 134, 135 또는 136에 제시된 핵산 서열에 적어도 70% 동일하고 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
d) DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖고 서열 20, 31, 41, 53, 64, 75, 86 또는 95에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열; 및
e) 엄격한 조건 하에 a) 내지 d) 중 임의의 하나에 혼성화할 수 있고 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열.
본 발명의 추가의 부분은 폴리뉴클레오티드가 상기 설명한 본 발명의 임의의 부분 또는 실시양태에서 설명된 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 추가로 포함하는 상기 설명한 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 본 발명의 추가의 실시양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 발현 카세트 및 이들 발현 카세트 및/또는 본 발명에서 설명된 임의의 하나의 폴리펩티드에 대한 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함한다. 본 발명의에 포함되는 임의의 하나의 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 벡터 및 상기 벡터 또는 상기 설명한 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 본 발명에 추가로 포함된다. 이들 숙주 세포는 박테리아 세포, 진균 세포, 특히 사상 진균 세포, 또는 효모 세포일 수 있다. 본 발명은
a) 상기 설명한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 생산을 허용하는 조건 하에 상기 설명한 숙주 세포 또는 파에실로미세스 디바리카투스(Paecilomyces divaricatus) 세포를 배양하는 단계; 및
b) 단계 a)의 숙주 세포로부터 폴리펩티드를 얻는 단계
를 포함하는, 상기 설명한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 제조를 위한 방법을 추가로 제공한다.
따라서, 본 발명은 상기 설명한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되거나, 또는 상기 폴리펩티드의 생산 방법에 의해 얻을 수 있는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 다른 부분은 상기 설명한 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 추가의 실시양태는
a) 상기 설명한 숙주 세포 또는 파에실로미세스 디바리카투스 세포를 상기 숙주 세포에서 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
b) 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나를 상기 숙주 세포 또는 파에실로미세스 디바리카투스 세포 또는 배양 배지로부터 얻는 단계
를 포함하는, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I의 제조 방법, 또는 이들의 조합물의 제조 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물의 제조를 위한, 상기 설명한 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 설명한 벡터 또는 상기 설명한 숙주 세포 또는 파에실로미세스 디바리카투스 세포의 용도를 포함한다.
도 1은 시클로클라빈, 또는 경로의 다른 가지 상에서 아그로클라빈 및/또는 페스투클라빈을 생성하는 대사 경로의 상이한 단계의 개략도를 보여준다. 경로의 분기점은 카노클라빈 I이 합성된 후에 위치하고, 이어서 이것은 EasH, EasD, EasA 및 EasG 활성의 조합에 의해 추가로 변형되어 시클로클라빈을 생산하거나, 카노클라빈 I은 EasD 활성을 통해 카노클라빈 알데히드로 전환되고, 존재하는 EasA 활성에 따라 EasA 및 EasG 활성의 조합을 통해 아그로클라빈 및/또는 페스투클라빈으로 추가로 변형된다. EasA 활성은 아그로클라빈의 경우에 EasA 이소머라제 활성, 또는 페스투클라빈의 경우에 EasA 리덕타제 활성일 수 있다.
도 2는 카노클라빈 I으로부터 EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성의 조합을 통해 시클로클라빈으로, 또는 카노클라빈으로부터 EasD 활성을 통해 카노클라빈 알데히드로, 및 카노클라빈 알데히드로부터 "EasA (Tyr176)"에 의해 매개된 EasG 및 EasA 리덕타제 활성의 조합을 통해 페스투클라빈으로, 또는 카노클라빈 알데히드로부터 "EasA (Phe176)"에 의해 매개된 EasG 및 EasA 이소머라제 활성의 조합을 통해 아그로클라빈으로 이르는 대사 경로의 단계에 관여된 상이한 단계 및 상이한 Eas 활성의 개략도를 보여준다. 도 2는 또한 클라빈-유형 알칼로이드를 생산하는 몇몇 예시적 천연 맥각 생산자 유기체를 거명한다. 상기 천연 맥각 생산자 유기체는 시클로클라빈의 경우에 아스페르길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus) (에이. 자포니쿠스), 아그로클라빈의 경우에 클라비셉스 푸르푸레아(Claviceps purpurea) (씨. 푸르푸레아), 및 페스투클라빈의 경우에 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) (에이. 푸미가투스)이다.
도 3a 내지 3d는 DmaW 활성을 갖는 아스페르길루스 자포니쿠스 폴리펩티드에 대한 몇몇 상동체 폴리펩티드의 아미노산 서열 정렬의 연속적인 파트를 도시한 것이다. 아미노산은 표준 단일 문자 아미노산 코드에 따라 표시된다. 상이한 서열의 명칭은 그로부터 이들 상동체 폴리펩티드가 얻어질 수 있는 유기체의 명칭, 및 이들 서열이 서열 목록에 나열되는 서열 번호를 포함한다. 아미노산 서열 정렬은 상기 군의 서열 내에서 또한 보존된, 덜 보존된 및 훨씬 덜 보존된 아미노산을 도시하고, 여기서, 흑색 음영표시의 아미노산 위치는 강한 보존, 즉, 100% 보존되는 것을 나타내고, 회색 음영표시의 아미노산 위치는 더 적은 보존을 나타내고, 백색 배경을 갖는 아미노산은 훨씬 덜 보존된 아미노산 위치를 나타낸다. 정렬 내의 아미노산 서열 내의 획은 특정 서열 내에 포함되지 않은 아미노산 위치를 나타낸다. 아미노산 위치의 군 위 또는 아래의 흑색 막대는 강한 서열 보존의 영역을 도시하고, 이것은 보존된 서열 모티프를 나타낸다. 정렬은 또한 각각의 아미노산 위치에서 고도로 보존된 아미노산을 확인하기 위해 상기 군의 유전자에 대한 컨센서스 서열 (서열 190)을 포함한다. 상기 아미노산 서열 정렬에 의해 제공된 보존된 및 덜 보존된 아미노산에 대한 정보는 아미노산 서열 정렬에 의해 구성되지 않은 아미노산 서열이 아스페르길루스 자포니쿠스 폴리펩티드의 진정한 상동체일 것인지 결정하기 위해 사용될 수 있다. 잠재적인 상동체 또는 자연 발생 또는 인공 생산된 돌연변이체의 아미노산 서열은 아마도 DmaW 활성을 가질 것이고, 보다 보존된 아미노산 위치는 문제의 아미노산 서열로 구성될 것이다.
도 4a 내지 4c는 EasF 활성을 갖는 아스페르길루스 자포니쿠스 폴리펩티드에 대한 몇몇 상동체 폴리펩티드의 아미노산 서열 정렬의 연속적인 파트를 도시한 것이다. 서열 명칭 및 기호, 예를 들어 흑색 또는 회색 음영표시 또는 컨센서스 서열 (서열 154)은 도 3a 내지 3d에 사용된 서열 명칭 및 기호에 대해 설명된 것과 동일한 의미를 갖는다.
도 5a 내지 5e는 EasE 활성을 갖는 아스페르길루스 자포니쿠스 폴리펩티드에 대한 몇몇 상동체 폴리펩티드의 아미노산 서열 정렬의 연속적인 파트를 도시한 것이다. 서열 명칭 및 기호, 예를 들어 흑색 또는 회색 음영표시, 또는 (서열 191)에 도시된 코어 컨센서스를 포함한 컨센서스 서열 (서열 185)은 도 3a 내지 3d에 사용된 서열 명칭 및 기호에 대해 설명된 것과 동일한 의미를 갖는다.
도 6a 내지 6d는 EasC 활성을 갖는 아스페르길루스 자포니쿠스 폴리펩티드에 대한 몇몇 상동체 폴리펩티드의 아미노산 서열 정렬의 연속적인 파트를 도시한 것이다. 서열 명칭 및 기호, 예를 들어 흑색 또는 회색 음영표시 또는 컨센서스 서열 (서열 151)은 도 3a 내지 3d에 사용된 서열 명칭 및 기호에 대해 설명된 것과 동일한 의미를 갖는다.
도 7a 내지 7b는 EasD 활성을 갖는 아스페르길루스 자포니쿠스 폴리펩티드에 대한 몇몇 상동체 폴리펩티드의 아미노산 서열 정렬의 연속적인 파트를 도시한 것이다. 서열 명칭 및 기호, 예를 들어 흑색 또는 회색 음영표시 또는 컨센서스 서열 (서열 152)는 도 3a 내지 3d에 사용된 서열 명칭 및 기호에 대해 설명된 것과 동일한 의미를 갖는다. 도 7a에서 4개의 흑색 화살표 및 도 7b에서 2개의 흑색 화살표는 EasD 활성을 갖는 단백질의 보조인자-결합 모티프 TGxxxGxG (서열 188)의 보존된 아미노산 및 활성 부위 모티프 YxxxK (서열 198)의 보존된 아미노산을 지시한다 (Kavanagh 2008, Cell Mol Life Sci 65:3895-3906).
도 8은 EasH 활성을 갖는 아스페르길루스 자포니쿠스 폴리펩티드에 대한 상동체 폴리펩티드의 아미노산 서열 정렬을 도시한 것이다. 서열 명칭 및 기호, 예를 들어 흑색 또는 회색 음영표시 또는 컨센서스 서열 (서열 183)은 도 3a 내지 3d에 사용된 서열 명칭 및 기호에 대해 설명된 것과 동일한 의미를 갖는다.
도 9a 내지 9d는 EasA 활성을 갖는 아스페르길루스 자포니쿠스 폴리펩티드에 대한 몇몇 상동체 폴리펩티드의 아미노산 서열 정렬의 연속적인 파트를 도시한 것이다. 서열 명칭 및 기호, 예를 들어 흑색 또는 회색 음영표시, 흑색 막대 또는 컨센서스 서열 (서열 184)는 도 3a 내지 3d에 사용된 서열 명칭 및 기호에 대해 설명된 것과 동일한 의미를 갖는다. 도 9b는 Y (아미노산 티로신을 나타냄) 또는 F (아미노산 페닐알라닌을 나타냄)를 포함하는 아미노산 위치를 지시하는 추가의 흑색 화살표를 포함한다. 상기 위치에서 Y를 갖는 아미노산 서열은 EasA 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 나타내는 반면, 상기 위치에서 F를 갖는 아미노산 서열은 EasA 이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 이들 활성은 때때로 EasA 리덕타제 및 EasA 이소머라제 활성에 대해 각각 EasA (Tyr176) 및 EasA (Phe176)로서도 또한 설명되고, 여기서 숫자 176은 각각 EasA 리덕타제 또는 EasA 이소머라제 활성을 갖는, 아스페르길루스 푸미가투스의 폴리펩티드 내에서 Y 또는 F를 갖는 상응하는 아미노산 위치를 의미한다 (Cheng et al.; 2010, J. AM. CHEM. SOC, 132: p12835-12837).
도 10a 내지 10c는 EasG 활성을 갖는 아스페르길루스 자포니쿠스 폴리펩티드에 대한 몇몇 상동체 폴리펩티드의 아미노산 서열 정렬의 연속적인 파트를 도시한 것이다. 서열 명칭 및 기호, 예를 들어 흑색 또는 회색 음영표시 또는 컨센서스 서열 (서열 183)은 도 3a 내지 3d에 사용된 서열 명칭 및 기호에 대해 설명된 것과 동일한 의미를 갖는다.
도 11은 상단부터 하단까지 효모 균주의 상청액의 크로마토그램을 보여준다: EYS1849: 총 이온 크로마토그램; EYS1849: m/z=239.1543+/-0.01 Da의 추출된 이온 크로마토그램; EYS1849: m/z=241.1699+/-0.01 Da의 추출된 이온 크로마토그램; EYS1851: 총 이온 크로마토그램; EYS1851: m/z=239.1543+/-0.01 Da의 추출된 이온 크로마토그램; EYS1851: m/z=241.1699+/-0.01 Da의 추출된 이온 크로마토그램.
도 12는 LC-MS에 의해 분석된 CEY2871 및 CEY3631의 상청액의 분석을 보여준다. 카노클라빈 I의 질량 (m/z = 257.164+/-0.01 Da)을 TIC (총 이온 크로마토그램)으로부터 추출하였고, 이것은 CEY3631 내에서 2.0 min+/-0.1 min의 체류 시간에서 피크를 보여주고, 이것은 CEY2871 내에서 부재하였다. 피크를 정제하고 NMR에 의해 분석하였다.
도 13은 LC-MS에 의해 분석한 균주 CEY3631 및 CEY3645의 상청액의 분석을 보여준다. 카노클라빈 I의 질량 (m/z = 257.164+/-0.01 Da)을 TIC (총 이온 크로마토그램)로부터 추출하였고, 이것은 CEY3631 및 CEY3645 내에서 체류 시간 2.0+/-0.1 min에서 피크를 보여준다. 피크 하 면적을 통합하였고 (삽입도), 이것은 EY3631에 비해 CEY3645 내에서 카노클라빈 I의 증가를 밝혔다.
도 14: 균주 CEY2557 및 CEY2625를 LC-MS에 의해 분석하였다. 피크는 두 균주 모두에서 7.8 min+/-0.2 min의 체류 시간에서 보였고, 이것은 Me-DMAT의 예측된 질량 (m/z = 287.175+/-0.01 Da)을 가졌다. 정체는 NMR에 의해 확인하였다. 피크 하 면적을 통합하였고, 이것은 CEY2557에 비해 CEY2625 내에서 Me-DMAT의 2배 초과의 증가를 밝혔다.
도 15: 균주 CEY2557 및 CEY2625를 LC-MS에 의해 분석하였다 (도 6 참조). 피크 하 면적을 통합하였고, 이것은 CEY2557에 비해 CEY2625 내에서 Me-DMAT의 2배 초과의 증가를 밝혔다. DMAT의 면적을 또한 도시한다.
도 16: 균주 CEY2557, CEY2563 및 CEY2575를 LC-MS에 의해 분석하였다. 모든 균주에서, 피크는 7.8 min+/-0.2 min의 체류 시간에서 보였고, 이것은 Me-DMAT의 예측된 질량 (m/z = 287.175+/-0.01 Da)을 가졌다. 피크 하 면적을 통합하였고, 이것은 3가지 모든 균주에서 유사한 수준의 화합물 (삽입도)을 보여준다. 화합물의 정체는 NMR에 의해 확인하였다.
도 17: ERG20 유전자 내로 통합을 위해 사용된 PCR 산물, 및 효모 게놈 내의 표적 영역의 개략도이다. HR1 및 HR2는 게놈 서열에 상동성이고, NatR-ScKex2 프로모터 구축물의 상동성 재조합에 의한 통합을 허용하여, 천연 ERG20 프로모터를 파괴시킨다
도 18: 균주 EYS1538 및 EYS1926을 LC-MS에 의해 분석하였다. 피크 하 면적을 통합하였고, 이것은 EYS1538에 비해 EYS1926 내에서 Me-DMAT의 2배 초과의 증가를 밝혔다.
도 19: EYS2098 및 EYS2099로부터 배양 상청액의 분석은 이들 균주에 의해 생산된 카노클라빈 I 및 시클로클라빈의 상대적인 양 (곡선 하 면적)을 보여준다.
도 20a 및 20b: EYS2055 및 EYS2056에서 DMAT 및 Me-DMAT의 생산. 둘 모두 Me-DMAT에 대해 2-단계 이종 경로를 발현한다. 또한, EYS2056은 여분의, 구성적으로 발현된 카피의 ScIdi1을 함유한다.
도 21: EYS1934 (대조군) 및 EYS2206 (EasC) 내에서 시클로클라빈 (CCL) 및 페스투클라빈 (MW241)의 생산을 분석하였고, 이것은 추가의 카피의 유전자 AjEasC의 발현 때문에 EYS2206 내에서 증가된 생산을 보여주었다.
도 22: EYS2124 (에이. 자포니쿠스로부터 EasE) 및 EYS2125 (엔. 롤리이로부터 EasE)로부터 배양 상청액의 분석은 이들 균주에 의해 생산된 시클로클라빈 및 페스투클라빈 (MW241)의 상대적인 양 (곡선 하 면적)을 보여준다.
도 23: 각각 상이한 DNA 코돈 용법을 갖는 EasE 유전자를 갖지만 모두 에이. 자포니쿠스로부터 상응하는 효소를 코딩하는, 전장 시클로클라빈 경로를 갖는 효모 균주로부터 배양 상청액의 분석. 상이한 코돈 사용은 이들 균주에 의해 생산되는 다양한 양 (곡선 하 면적으로서 도시됨)의 시클로클라빈 및 페스투클라빈 (MW241)을 생성시킨다.
도 24: EYS2006을 글리세롤 없이 (대조군) 또는 각각 2.5%, 5%, 및 10% 글리세롤과 함께 성장시켰다. 시클로클라빈 및 페스투클라빈 (MW241)의 생산은 증가하는 농도의 글리세롤과 함께 증가하였다.
도 25: EYS2209에 비해 EYS1934 (좌측), 및 EYS2297에 비해 EYS2209 내에서 시클로클라빈의 생산.
도 26: 유가식 발효에서 CCL 및 FCL의 생산. 화합물의 농도 (mg/L), 및 측정된 OD600을 발효의 지속 시간에 대해 보여준다.
도 27: 상이한 유전적 배경을 갖는 7개의 효모 균주 (사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)) 내에서 CCL 및 FCL의 생산 (표 58 참조).
일반적인 정의
용어 "시클로클라빈"은 하기 화학식 I의 화합물을 의미한다.
<화학식 I>
Figure pct00001
용어 "페스투클라빈"은 하기 화학식 II의 화합물을 의미한다.
<화학식 II>
Figure pct00002
용어 "아그로클라빈"은 하기 화학식 III의 화합물을 의미한다.
<화학식 III>
Figure pct00003
용어 "카노클라빈 알데히드"는 하기 화학식 IV의 화합물을 의미한다.
<화학식 IV>
Figure pct00004
용어 "카노클라빈 I"은 하기 화학식 V의 화합물을 의미한다.
<화학식 V>
Figure pct00005
용어 "ME-DMAT"는 하기 화학식 VI의 화합물을 의미한다.
<화학식 VI>
Figure pct00006
용어 "DMAT"는 하기 화학식 VII의 화합물을 의미한다.
<화학식 VII>
Figure pct00007
용어 "DMAPP"는 하기 화학식 VIII의 화합물을 의미한다.
<화학식 VIII>
Figure pct00008
용어 "트립토판"은 아미노산 트립토판, 바람직하게는 L-트립토판, 또는 그의 염 중의 하나를 의미한다.
용어 "IPP"는 화학식 IX의 화합물인 이소펜테닐 피로인산염 또는 그의 염 중의 하나를 의미한다.
용어 "DmaW 활성"은 서열 1의 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 기능을 충족하는, 즉, 디메틸알릴트립토판 신타제 활성을 갖고 위치 C4에서 L-트립토판의 프레닐화를 촉매하여 4-디메틸알릴트립토판 ((S)-4-(3-메틸-2-부테닐)-트립토판, 또는 DMAT)의 형성을 야기하는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다.
용어 "EasF 활성"은 서열 6의 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 기능을 충족하는, 즉, N-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖고 DMAT의 Me-DMAT로의 메틸화를 촉매하는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다.
용어 "EasE 활성"은 서열 5의 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 기능을 충족하는, 즉, EasC 활성이 또한 존재하는 경우에 Me-DMAT의 카노클라빈 I으로의 전환을 촉매하는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다.
용어 "EasC 활성"은 서열 3의 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 기능을 충족하는, 즉, EasE 활성이 또한 존재하는 경우에 Me-DMAT의 카노클라빈 I으로의 전환을 촉매하는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다.
용어 "EasD 활성"은 서열 4의 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 기능을 충족하는, 즉, 옥시도리덕타제 활성을 갖고 카노클라빈 I의 카노클라빈 알데히드로의 전환을 촉매하는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다.
용어 "EasH 활성"은 서열 8의 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 기능을 충족하는, 즉, EasD, EasA 및 EasG 활성이 또한 존재하는 경우에 카노클라빈 I의 시클로클라빈으로의 전환을 촉매하는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다.
용어 "EasA 리덕타제 활성"은 서열 2의 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 기능을 충족하는, 즉, 리덕타제 활성을 갖고 EasG 활성이 존재하는 경우에 카노클라빈 알데히드의 페스투클라빈으로의 전환을 촉매하는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다.
용어 "EasA 이소머라제 활성"은 서열 37의 폴리펩티드 (씨. 푸르푸레아 EasA)와 동일한 또는 유사한 기능을 충족하는, 즉, 이소머라제 활성을 갖고 EasG 활성이 존재하면 카노클라빈 알데히드의 아그로클라빈으로의 전환을 촉매하는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다.
용어 "EasA 활성"은 예를 들어 서열 149의 위치 18에 Y의 F로의 돌연변이를 포함하는 서열 33의 네오티포디움 롤리이(Neotyphodium lolii)의 폴리펩티드처럼, 서열 2 또는 37의 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 기능을 충족하는, 즉, EasA 리덕타제 또는 EasA 이소머라제 활성을 갖거나 또는 두 활성을 모두 갖는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다.
용어 "EasG 활성"은 서열 7의 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 기능을 충족하는, 즉, 옥시도리덕타제 활성을 갖고 존재하는 EasA 활성에 따라 카노클라빈 알데히드의 아그로클라빈 및/또는 페스투클라빈으로의 전환을 촉매하는, 및/또는 EasA, EasD 및 EasH 활성이 또한 존재할 경우 카노클라빈 I의 시클로클라빈으로의 전환을 촉매하는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다.
용어 "ERG9 활성"은 2개의 파르네실 피로인산염 (FPP) 모이어티를 연결하여 스테롤 생합성 경로에서 스쿠알렌을 형성하는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다. ERG9 활성은 대체로 스쿠알렌 신타제에 의헤 제공된다.
용어 "ERG20 활성"은 이소프레노이드 및 스테롤 생합성을 위한 C15 파르네실 피로인산염 단위의 형성을 촉매하는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다.
용어 "HMG-CoA 리덕타제 활성"은 HMG-CoA의 메발로네이트로의 전환을 촉매하는, 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 능력을 의미한다.
용어 "약"은 대체로, 대략, 쯤, 또는 가까이에를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 이것은 경계를 제시된 수치 값 위 및 아래로 확장함으로써 그 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은 수치 값을 언급된 값의 20%, 바람직하게는 15%, 보다 바람직하게는 10%, 가장 바람직하게는 5%의 변동만큼 위 및 아래로 (더 높게 또는 더 낮게) 변경하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "게놈" 또는 "게놈 DNA"는 숙주 유기체의 유전가능한 유전 정보를 의미한다. 상기 게놈 DNA는 핵의 DNA (염색체 DNA), 염색체외 DNA, 및 소기관 DNA (예를 들어, 미토콘드리아의)를 포함하는 세포 또는 유기체의 전체 유전 물질을 포함한다. 바람직하게는, 용어 게놈 또는 게놈 DNA는 핵의 염색체 DNA를 의미한다.
용어 "염색체 DNA" 또는 "염색체 DNA 서열"은 세포 주기 상태와 무관한 세포 핵의 게놈 DNA로서 이해되어야 한다. 염색체 DNA는 따라서 염색체 또는 염색질 내에 조직화될 수 있고, 압축되거나 또는 감기지 않을 수 있다. 염색체 DNA 내로의 삽입은 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 분석, 서던 블롯 분석, 형광 계내 혼성화 (FISH), 계내 PCR 및 차세대 서열결정 (NGS)처럼 관련 기술 분야에 알려진 다양한 방법에 의해 입증되고 분석될 수 있다.
용어 "프로모터"는 mRNA를 생산하기 위해 구조 유전자의 전사를 지시하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일반적으로, 프로모터는 구조 유전자의 출발 코돈에 근접하게 유전자의 5' 영역에 위치한다. 프로모터가 유도가능 프로모터일 경우, 전사 속도는 유도제에 반응하여 증가한다. 이와 대조적으로, 전사 속도는 프로모터가 구성적 프로모터이면 유도제에 의해 조절되지 않는다.
용어 "인핸서"는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 인핸서는 전사 출발 부위에 대한 인핸서의 거리 또는 배향과 무관하게 특정 유전자가 mRNA로 전사되는 효율을 증가시킬 수 있다. 대체로, 인핸서는 프로모터, 5'-비번역 서열에 근접하게 또는 인트론 내에 위치한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 그 서열이 외래 종으로부터 기원하거나, 또는 동일한 종으로부터 기원하지만 그의 본래 형태로부터 변형될 경우, 유기체 또는 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 "이종성"이다. 예를 들어, 이종성 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 프로모터가 유래되는 것과 상이한 종으로부터 유래하는 코딩 서열 또는 동일한 종으로부터 유래하지만 프로모터와 천연적으로 회합하지 않는 코딩 서열 (예를 들어 유전자 조작된 코딩 서열 또는 상이한 생태형 또는 변종으로부터의 대립유전자)을 의미한다.
"트랜스진", "트랜스제닉" 또는 "재조합"은 인간에 의해 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 인간에 의해 조작된 폴리뉴클레오티드의 카피 또는 상보체를 의미한다. 예를 들어, 제2 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 트랜스제닉 발현 카세트는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산의 인간에 의한 조작 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)]에 기재된 방법에 의해)의 결과로서 제2 폴리뉴클레오티드에 이종성인 프로모터를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 재조합 발현 카세트는 폴리뉴클레오티드가 자연에서 발견될 가능성이 극히 낮은 방식으로 조합된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간에 의해 조작된 제한 부위 또는 플라스미드 벡터 서열은 제2 폴리뉴클레오티드의 측면에 인접하거나 프로모터를 제2 폴리뉴클레오티드로부터 분리할 수 있다. 통상의 기술자는 폴리뉴클레오티드가 많은 방식으로 조작될 수 있고 상기 예로 제한되지 않음을 알 것이다. 용어 "재조합"이 유기체 또는 세포, 예를 들어 미생물을 구체화하기 위해 사용되는 경우에, 이것은 유기체 또는 세포가 대체로 추후에 구체화되는 적어도 하나의 "트랜스진", "트랜스제닉" 또는 "재조합" 폴리뉴클레오티드를 포함함을 표현하기 위해 사용된다.
개개의 유기체에 "외인성"인 폴리뉴클레오티드는 유성 교배 이외의 다른 임의의 수단에 의해 유기체 내로 도입되는 폴리뉴클레오티드이다.
용어 "작동가능한 연결" 또는 "작동가능하게 연결된"은 일반적으로 유전자 제어 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서 또는 종결인자가, 그가 작동가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 그의 기능을 발휘할 수 있는 배열을 의미하는 것으로서 이해된다. 상기 맥락에서, 기능은 예를 들어 핵산 서열의 발현, 즉, 전사 및/또는 번역의 제어를 의미할 수 있다. 상기 맥락에서, 제어는 예를 들어 발현, 즉, 전사 및, 적절한 경우 번역의 개시, 증가, 조절 또는 억제를 포함한다. 다시, 제어는 예를 들어, 조직- 및/또는 시간-특이적일 수 있다. 또한, 제어는 예를 들어 특정 화학물질, 스트레스, 병원체 등에 의해 유도가능한 것일 수 있다. 바람직하게는, 작동가능한 연결은 예를 들어 핵산 서열이 발현될 때 각각의 조절 요소가 그의 기능을 수행할 수 있도록 프로모터, 발현되는 핵산 서열, 및 적절한 경우 추가의 조절 요소, 예컨대, 예를 들어, 종결인자의 순차적인 배열을 의미하는 것으로 이해된다. 작동가능한 연결은 화학적 의미에서 반드시 직접적인 연결을 필요로 하지는 않는다. 예를 들어, 인핸서 서열과 같은 유전자 제어 서열은 또한 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 일정 거리에 존재하는 위치로부터 표적 서열에 대한 그의 기능을 발휘할 수 있다. 바람직한 배열은 발현되는 핵산 서열이 2개의 서열이 서로 공유 연결되도록 프로모터로서 기능하는 서열 다음에 위치하는 것이다. 프로모터 서열과 발현 카세트 내의 핵산 서열 사이의 거리는 바람직하게는 200개 염기쌍 미만, 특히 바람직하게는 100개 염기쌍 미만, 매우 특히 바람직하게는 50개 염기쌍 미만이다. 통상의 기술자는 상기 발현 카세트를 얻기 위한 다양한 방식에 친숙하다. 그러나, 발현 카세트는 또한 발현되는 핵산 서열이 예를 들어 상동성 재조합에 의해 또는 무작위 삽입에 의해 내인성 유전자 제어 요소, 예를 들어 내인성 프로모터의 제어 하에 존재하는 방식으로 구축될 수 있다. 상기 구축물도 본 발명의 목적을 위한 발현 카세트로서 이해된다.
용어 "발현 카세트"는 발현되는 폴리뉴클레오티드 서열이 그의 발현 (즉, 전사 및/또는 번역)을 가능하게 하거나 조절하는 적어도 하나의 유전자 제어 요소에 작동가능하게 연결된 구축물을 의미한다. 발현은 예를 들어 안정한 또는 일시적인, 구성적 또는 유도성 발현일 수 있다.
용어 "발현하다", "발현하는", "발현된" 및 "발현"은 코딩되는 단백질의 생성되는 효소 활성, 또는 언급되는 본원에서 규정되고 설명된 경로 또는 반응이 상기 유전자/경로가 발현되는 유기체에서 상기 경로 또는 반응을 통한 대사 흐름을 허용하는 수준에서 유전자 산물 (예를 들어, 본원에서 규정되고 설명되는 경로 또는 반응의 유전자의 생합성 효소)의 발현을 의미한다. 발현은 출발 유기체로서 사용하는 미생물의 유전자 변경에 의해 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 미생물은 출발 미생물에 의해 또는 변경되지 않은 대등한 미생물에서 생산된 것에 비해 증가된 수준에서 유전자 산물을 발현하도록 유전적으로 변경 (예를 들어, 유전자 조작)될 수 있다. 유전자 변경은 특정 유전자의 발현과 연관된 조절 서열 또는 부위의 변경 또는 변형 (예를 들어 강한 프로모터, 유도가능 프로모터 또는 다중 프로모터의 부가에 의한 또는 발현이 구성적이도록 조절 서열의 제거에 의한), 특정 유전자의 염색체 위치의 변경, 특정 유전자, 예컨대 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자에 인접한 핵산 서열의 변경, 특정 유전자의 카피수의 증가, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 산물의 번역에 연관되는 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성제 등)의 변형, 또는 관련 기술 분야에 통상적인 기술을 사용하여 특정 유전자의 발현을 탈조절하는 임의의 다른 통상적인 수단 (예를 들어, 리프레서 단백질의 발현을 차단하기 위한 안티센스 핵산 분자의 사용을 포함하고 이로 제한되지 않음)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 미생물은 비변경된 미생물에서의 유전자 산물의 발현 수준에 비해 증가되거나 더 낮은 수준에서 유전자 산물을 발현하도록 물리적으로 또는 환경적으로 변경될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 전사 및/또는 번역이 향상되거나 증가되도록 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 산물의 번역을 증가시키는 것으로 알려지거나 의심되는 물질로 처리되거나 이 물질의 존재 하에 배양될 수 있다. 대안적으로, 미생물은 전사 및/또는 번역이 향상되거나 증가되도록 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 산물의 번역을 증가시키기 위해 선택된 온도에서 배양될 수 있다.
용어 "탈조절하다", "탈조절된" 및 "탈조절"은 미생물에서 적어도 하나의 유전자의 변경 또는 변형을 의미하고, 여기서 변경 또는 변형은 변경 또는 변형의 부재 하에서의 생산에 비해 미생물에서 제시된 화합물의 생산 효율을 증가시킨다. 몇몇 실시양태에서, 변경 또는 변형된 유전자는 미생물에서 생합성 효소의 수준 또는 활성이 변경 또는 변형되도록, 또는 수송 특이성 또는 효율이 변경 또는 변형되도록 생합성 경로의 효소, 또는 수송 단백질을 코딩한다. 몇몇 실시양태에서, 생합성 경로의 효소, 즉, 생합성 경로의 특이적 활성, 예를 들어 EasH 활성을 유도하는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 유전자는 효소의 수준 또는 활성이 비변경된 또는 야생형 유전자의 존재 하의 수준에 비해 향상되거나 증가되도록 변경 또는 변형된다. 탈조절은 또한 예를 들어 피드백 저항성이거나 또는 더 높거나 더 낮은 특이적 활성을 갖는 효소를 생성하기 위해 하나 이상의 유전자의 코딩 영역을 변경하는 것을 포함한다. 또한, 탈조절은 효소 또는 수송 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자 (예를 들어, 활성제, 리프레서)를 코딩하는 유전자의 유전자 변경을 추가로 포함한다. 용어 "탈조절하다", "탈조절된" 및 "탈조절"은 존재하는 탈조절의 유형에 대해 추가로 구체화될 수 있다. 특정 활성, 예를 들어 EasH 활성이, 효소의 수준 또는 활성이 비변경된 또는 야생형 유전자의 존재 하의 수준에 비해 향상되거나 증가되도록 변경 또는 변형된 경우에, 용어 "상향조절된"이 사용된다. 특정 활성, 예를 들어 ERG9 활성이, 효소의 수준 또는 활성이 비변경된 또는 야생형 유전자의 존재 하의 수준에 비해 저하되거나 감소되도록 변경 또는 변형된 경우에, 용어 "하향조절된"이 사용된다.
용어 "과다발현하다", "과다발현하는", "과다발현된" 및 "과다발현"은 출발 미생물의 유전자 변경 전에 존재하는 것보다 더 큰 수준에서 유전자 산물의 발현, 특히 유전자 산물의 발현의 향상을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 미생물은 출발 미생물에 의해 생산된 것에 비해 증가된 수준에서 유전자 산물을 발현하도록 유전적으로 변경 (예를 들어, 유전자 조작)될 수 있다. 유전자 변경은 특정 유전자의 발현과 연관된 조절 서열 또는 부위의 변경 또는 변형 (예를 들어 강한 프로모터, 유도가능 프로모터 또는 다중 프로모터의 부가에 의한 또는 발현이 구성적이도록 조절 서열의 제거에 의한), 특정 유전자의 염색체 위치의 변경, 특정 유전자, 예컨대 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자에 인접한 핵산 서열의 변경, 특정 유전자의 카피수의 증가, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 산물의 번역에 연관되는 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성제 등)의 변형, 또는 관련 기술 분야에 통상적인 기술을 사용하여 특정 유전자의 발현을 탈조절하는 임의의 다른 통상적인 수단 (예를 들어, 리프레서 단백질의 발현을 차단하기 위한 안티센스 핵산 분자의 사용을 포함하고 이로 제한되지 않음)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 유전자 산물을 과다발현하기 위한 또 다른 방법은 그의 수명을 증가시키기 위해 유전자 산물의 안정성을 향상시키는 것이다.
용어 "탈조절된"은 미생물의 조작 전에 또는 조작되지 않은 대등한 미생물에서 발현되는 것보다 더 낮거나 더 높은 수준의 유전자 산물의 발현을 포함한다. 한 실시양태에서, 미생물은 미생물의 조작 전에 또는 조작되지 않은 대등한 미생물에서 발현되는 것보다 더 낮거나 더 높은 수준의 유전자 산물을 발현하기 위해 유전적으로 조작 (예를 들어, 유전자 조작)될 수 있다. 유전자 조작은 특정 유전자의 발현과 연관된 조절 서열 또는 부위의 변경 또는 변형 (예를 들어 강한 프로모터, 유도가능 프로모터 또는 다중 프로모터의 제거에 의한), 특정 유전자의 염색체 위치의 변경, 특정 유전자, 예컨대 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자에 인접한 핵산 서열의 변경, 특정 유전자의 카피수의 증가, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 산물의 번역에 연관되는 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성제 등)의 변형, 또는 관련 기술 분야에 통상적인 특정 유전자의 발현을 탈조절하는 임의의 다른 통상적인 수단 (예를 들어, 안티센스 핵산 분자의 사용 또는 표적 단백질의 발현을 녹-아웃 (knock-out) 또는 차단하는 다른 방법을 포함하고 이로 제한되지 않음)을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 용어 "탈조절된 유전자 활성"은 또한 이전에 관찰되지 않은 각각의 유전자 활성, 예를 들어 라이신 데카르복실라제 활성이 바람직하게는 유전자 조작에 의해 미생물 내로 재조합 유전자, 예를 들어 이종 유전자를 하나 이상의 카피로 도입함으로써 미생물 내로 도입됨을 의미한다.
문구 "탈조절된 경로 또는 반응"은 적어도 하나의 생합성 효소의 수준 또는 활성이 변경 또는 변형되도록 생합성 경로 또는 반응의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 유전자가 변경 또는 변형된 생합성 경로 또는 반응을 의미한다. 문구 "탈조절된 경로"는 하나 초과의 유전자가 변경 또는 변형되어, 상응하는 유전자 산물/효소의 수준 및/또는 활성을 변경하는 생합성 경로를 포함한다. 몇몇 경우에, 미생물에서 경로를 "탈조절하는" (예를 들어, 제시된 생합성 경로에서 하나 초과의 유전자를 동시에 탈조절하는) 능력은 하나 초과의 효소 (예를 들어, 2개 또는 3개의 생합성 효소)가 "클러스터" 또는 "유전자 클러스터"로 불리는 유전 물질의 인접하는 부분 상에 서로 인접하여 존재하는 유전자에 의해 코딩되는 미생물의 특정 현상에 의해 발생한다. 다른 경우에, 경로를 탈조절하기 위해, 많은 유전자가 일련의 순차적인 조작 단계에서 탈조절되어야 한다.
본 발명에 따른 탈조절된 유전자를 발현하기 위해, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 발현 벡터에서 전사 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 후, 미생물 내로 도입되어야 한다. 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서에 추가로, 발현 벡터는 번역 조절 서열 및 발현 벡터를 보유하는 세포의 선택에 적합한 마커 유전자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한 단백질" 또는 화합물은 폴리아크릴아미드-나트륨 도데실 술페이트 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 후에 단일 밴드에 의해 단백질에 대해 입증되는 바와 같이, 요구되는 정제된 단백질 또는 화합물에 본질적으로 오염시키는 세포 성분이 존재하지 않음을 의미한다. 용어 "실질적으로 순수한"은 추가로 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 사용되는 하나 이상의 순도 또는 균일성 특성에 의해 균일한 분자를 설명하고자 의도된다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 단백질 또는 화합물은 다음과 같은 파라미터에 대한 표준 실험 편차 내에서 일정하고 재현가능한 특성을 보일 것이다: 분자량, 크로마토그래피 이동, 아미노산 조성, 아미노산 서열, 차단된 또는 비차단된 N-말단, HPLC 용리 프로파일, 생물학적 활성, 및 다른 상기 파라미터. 그러나, 상기 용어는 단백질의 인공 또는 합성 변이체 또는 2개 이상의 선택된 화합물의 인공 혼합물을 배제하는 의미가 아니다. 특히, 이 용어는 재조합 숙주로부터 단리된 융합 단백질, 예를 들어 친화도 정제를 위한 태그 (tag)에 대한 단백질의 융합체를 배제하는 의미가 아니다.
용어 2개의 핵산 서열 사이의 "서열 동일성"은 각각의 경우에 다음 파라미터를 설정한 프로그램 알고리즘 GAP (위스콘신 패키지 버전 10.0, 유니버시티 오브 위스콘신 (University of Wisconsin), 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group) (GCG), USA 매디슨)을 사용한 정렬에 의해 계산된 전체 서열 길이에 걸친 핵산 서열의 동일성 비율을 의미하는 것으로 이해된다:
갭 가중치: 12 길이 가중치: 4
평균 매치: 2,912 평균 미스매치:-2,003
용어 2개의 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 각각의 경우에 다음 파라미터를 설정한 프로그램 알고리즘 GAP (위스콘신 패키지 버전 10.0, 유니버시티 오브 위스콘신, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (GCG), USA 매디슨)을 사용한 정렬에 의해 계산된 전체 서열 길이에 걸친 아미노산 서열의 동일성 비율을 의미하는 것으로 이해된다:
갭 가중치: 8 길이 가중치: 2
평균 매치: 2,912 평균 미스매치:-2,003
용어 "도메인"은 진화상 관련된 단백질의 서열 정렬을 따라 특정 위치에서 보존된 아미노산의 세트를 의미한다. 다른 위치의 아미노산은 상동체 사이에서 상이할 수 있지만, 특정 위치에서 고도로 보존된 아미노산은 단백질의 구조, 안정성 또는 기능에 필수적일 가능성이 있는 아미노산을 나타낸다. 단백질 상동체 패밀리의 정렬된 서열의 높은 보존도에 의해 확인되기 때문에, 이것은 문제의 임의의 폴리펩티드가 앞서 확인된 폴리펩티드 패밀리에 속하는지 결정하기 위한 식별자로서 사용될 수 있다.
용어 "모티프" 또는 "컨센서스 서열" 또는 "시그너처"는 진화상 관련된 단백질의 서열 내의 짧은 보존된 영역을 의미한다. 모티프는 도메인의 빈번하게 고도로 보존된 부분이지만, 또한 도메인의 일부만을 포함할 수 있거나, 또는 보존된 도메인의 외부에 위치할 수 있다 (모티프의 모든 아미노산이 규정된 도메인의 외부에 위치할 경우).
도메인 확인을 위한 전문 데이타베이스, 예를 들어, SMART ([Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864]; [Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244]), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite ([Bucher and Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94]; [Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAI Press, Menlo Park]; [Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)]), 또는 Pfam ([Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)] & [The Pfam protein families database: R.D. Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, J.E. Pollington, O.L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38:D211-222])가 존재한다. 단백질 서열의 인 실리코 분석을 위한 도구의 세트는 ExPASy 프로테오믹스 (proteomics) 서버 (스위스 인스티튜트 오브 바이오인포매틱스 (Swiss Institute of Bioinformatics) (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003))로부터 이용가능하다. 또한, 도메인 또는 모티프는 통상적인 기술을 사용하여, 예컨대 서열 정렬에 의해 확인될 수 있다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있고, 상기 방법은 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 포함한다. GAP는 매치의 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화하는 2개의 서열의 전체적인 (즉, 완전 서열에 걸치는) 정렬을 발견하기 위해 문헌 [Needleman and Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453)]의 알고리즘을 사용한다. BLAST 알고리즘 (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10)은 서열 동일성 비율을 계산하고, 2개의 서열 사이의 유사성의 통계적인 분석을 수행한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 (National Centre for Biotechnology Information) (NCBI)을 통해 공개적으로 이용가능하다. 상동체는 예를 들어, 디폴트 쌍별 정렬 파라미터를 사용하는 ClustalW 다중 서열 정렬 알고리즘 (버전 1.83), 및 비율 평가 방법을 사용하여 쉽게 확인될 수 있다. 또한, 전체적인 유사성 및 동일성 비율은 MatGAT 소프트웨어 패키지 (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)에서 이용가능한 방법 중의 하나를 사용 결정될 수 있다. 작은 수동 편집은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이 보존된 모티프 사이의 정렬을 최적화하기 위해 수행될 수 있다. 또한, 상동체의 확인을 위해 전장 서열을 사용하는 대신에, 특이적 도메인이 또한 사용될 수 있다. 서열 동일성 값은 디폴트 파라미터를 사용하는 상기 언급된 프로그램을 사용하여 전체 핵산 또는 아미노산 서열에 걸쳐 또는 선택된 도메인 또는 보존된 모티프(들)에 걸쳐 결정될 수 있다. 국소 정렬을 위해, 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 알고리즘이 특히 유용하다 (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1);195-7).
일반적으로, 이것은 임의의 서열 데이타베이스, 예컨대 공개적으로 이용가능한 NCBI 데이타베이스에 대해 질의 서열을 블라스팅 (BLASTing)하는 것을 수반하는 제1 BLAST를 포함한다. BLASTN 또는 TBLASTX (표준 디폴트 값을 이용)는 일반적으로 뉴클레오티드 서열로부터 출발할 때 사용되고, BLASTP 또는 TBLASTN (표준 디폴트 값을 이용)은 단백질 서열로부터 출발할 때 사용된다. BLAST 결과는 임의로 여과될 수 있다. 여과된 결과 또는 비-여과된 결과의 전장 서열은 이어서 질의 서열이 유래되는 유기체로부터의 서열에 대해 다시 블라스팅된다 (제2 BLAST). 이어서, 제1 및 제2 BLAST의 결과를 비교한다. 제1 BLAST로부터의 고득점 히트가 질의 서열이 유래되는 것과 동일한 종으로부터 유도되면 파라로그가 확인되고, 이상적으로는 질의 서열에서 다시 블라스팅한 한 결과가 최고 히트 중에 존재하고; 제1 BLAST의 고득점 히트가 질의 서열이 유래되는 것과 동일한 종으로부터 유도되지 않으면 오르토로그가 확인되고, 바람직하게는 질의 서열에서 다시 블라스팅한 결과가 최고 히트 중에 존재한다.
고득점 히트는 낮은 E-값을 갖는 것이다. E-값이 낮을수록, 보다 유의한 점수이다 (또는, 달리 말해서 히트가 우연히 발견될 가능성이 더 낮다). E-값의 계산은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. E-값에 추가로, 비교는 또한 동일성 비율에 의해 평가된다. 동일성 비율은 특정 길이에 걸친 2개의 비교된 핵산 (또는 폴리펩티드) 서열 사이의 동일한 뉴클레오티드 (또는 아미노산)의 수를 의미한다. 큰 패밀리의 경우에, ClustalW를 사용한 후, 관련 유전자의 클러스터링의 가시화를 돕고 오르토로그 및 파라로그를 확인하기 위해 이웃 연결 계통수를 사용할 수 있다.
본원에서 규정되는 용어 "혼성화"는 실질적으로 상동성 상보성 뉴클레오티드 서열이 서로 어닐링하는 과정이다. 혼성화 과정은 전적으로 용액 내에서 발생할 수 있고, 즉, 두 상보성 핵산은 용액 내에 존재한다. 혼성화 과정은 또한 상보성 핵산 중의 하나가 매트릭스, 예컨대 자기 비드, 세파로스 비드 또는 임의의 다른 수지에 고정된 상태에서 발생할 수 있다. 혼성화 과정은 또한 상보성 핵산 중의 하나가 고체 지지체, 예컨대 니트로셀룰로스 또는 나일론 막에 고정된 또는 예를 들어 사진평판술에 의해, 예를 들어 규산질 유리 지지체에 고정된 상태에서 발생할 수 있다 (후자는 핵산 어레이 또는 마이크로어레이 또는 핵산 칩으로서 알려짐). 혼성화 발생을 허용하기 위해, 핵산 분자는 일반적으로 이중 가닥을 2개의 단일 가닥으로 용융시키기 위해 및/또는 단일 가닥 핵산으로부터 머리핀 또는 다른 2차 구조를 제거하기 위해 열에 의해 또는 화학적으로 변성된다.
용어 "엄격성"은 혼성화가 일어나는 조건을 나타낸다. 혼성화의 엄격성은 온도, 염 농도, 이온 강도 및 혼성화 완충제 조성과 같은 조건에 의해 영향받는다. 일반적으로, 저 엄격성 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대해 열 융점 (Tm)보다 약 30℃ 더 낮도록 선택된다. 중등 엄격성 조건은 온도가 Tm보다 20℃ 더 낮고, 고 엄격성 조건은 온도가 Tm보다 10℃ 더 낮다. 고 엄격성 혼성화 조건은 일반적으로 표적 핵산 서열에 높은 서열 유사성을 갖는 혼성화 서열을 단리하기 위해 사용된다. 그러나, 핵산은 서열이 차이가 날 수 있고, 유전자 코드의 축중성 때문에 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 계속 코딩할 수 있다. 따라서, 중등 엄격성 혼성화 조건이 상기 핵산 분자를 확인하기 위해 때때로 필요할 수 있다.
Tm은 50%의 표적 서열이 완전히 매치된 프로브에 혼성화하는, 규정된 이온 강도 및 pH 하의 온도이다. Tm은 용액 상태 및 프로브의 염기 조성 및 길이에 의존한다. 예를 들어, 보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 최대 혼성화 속도는 Tm보다 약 16℃ 내지 32℃ 더 낮은 온도에서 얻는다. 혼성화 용액 내의 1가 양이온의 존재는 2개의 핵산 가닥 사이의 정전기적 척력을 감소시켜 하이브리드 형성을 촉진하고; 이러한 효과는 0.4 M 이하의 나트륨 농도에서 가시적이다 (보다 높은 농도에서, 상기 효과는 무시될 수 있다). 포름아미드는 1%의 포름아미드마다 0.6 내지 0.7℃씩 DNA-DNA 및 DNA-RNA 이중체의 융점을 저하시키고, 50% 포름아미드의 첨가는 혼성화가 30 내지 45℃에서 수행되도록 허용하지만, 혼성화 속도는 저하될 것이다. 염기쌍 미스매치는 혼성화 속도 및 이중체의 열 안정성을 감소시킨다. 평균적으로 큰 프로브에 대해, Tm은 1% 염기 미스매치당 약 1℃ 감소한다. Tm은 하이브리드의 유형에 따라 다음 식을 사용하여 계산될 수 있다:
1) DNA-DNA 하이브리드 (Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):
Tm= 81.5℃ + 16.6xlog10[Na+]a + 0.41x%[G/Cb] - 500x[Lc]-1 - 0.61x% 포름아미드
2) DNA-RNA 또는 RNA-RNA 하이브리드:
Tm= 79.8℃+ 18.5 (log10[Na+]a + 0.58 (%G/Cb) + 11.8 (%G/Cb)2 - 820/Lc
3) 올리고-DNA 또는 올리고-RNAd 하이브리드:
20개 미만의 뉴클레오티드에 대해: Tm= 2 (ln)
20-35개의 뉴클레오티드에 대해: Tm= 22 + 1.46 (ln)
a 또는 다른 1가 양이온에 대해, 그러나 0.01-0.4 M 범위에서만 정확함.
b 단지 30% 내지 75% 범위에서 %GC에 대해서 정확함.
c L = 염기쌍 내의 이중체의 길이.
d 올리고, 올리고뉴클레오티드; ln, = 프라이머의 효과적인 길이 = 2x(G/C의 수)+(A/T의 수).
비-특이적 결합은 많은 공지의 기술 중의 하나, 예컨대, 단백질 함유 용액을 사용한 막의 차단, 이종 RNA, DNA, 및 SDS의 혼성화 완충제에 대한 첨가, 및 Rnase를 사용한 처리를 사용하여 제어할 수 있다. 비-상동성 프로브에 대해, 일련의 혼성화가 다음 중의 하나를 변경함으로써 수행될 수 있다:
(i) 어닐링 온도의 점진적인 저하 (예를 들어 68℃에서 42℃로) 또는
(ii) 포름아미드 농도의 점진적인 저하 (예를 들어 50%로부터 0%로).
통상의 기술자는 혼성화 동안 변경될 수 있고 엄격성 조건을 유지하거나 변경할 다양한 파라미터를 잘 알고 있다. 혼성화 조건 이외에, 혼성화의 특이성은 또한 일반적으로 혼성화 후 세척의 기능에 따라 결정된다. 비특이적 혼성화에 의한 배경을 제거하기 위해, 샘플을 묽은 염 용액으로 세척한다. 상기 세척의 핵심 인자는 최종 세척 용액의 이온 강도 및 온도를 포함하고, 염 농도가 낮을수록 및 세척 온도가 높을수록, 세척 엄격성은 더 높아진다. 세척 조건은 일반적으로 혼성화 엄격성에서 또는 그 미만에서 수행된다. 양성 혼성화는 배경보다 적어도 2배의 신호를 제시한다. 일반적으로, 핵산 혼성화 검정 또는 유전자 증폭 검출 절차에 적합한 엄격한 조건은 상기 제시된 바와 같다. 더 높거나 더 낮은 엄격한 조건도 선택될 수 있다. 통상의 기술자는 세척 동안 변경될 수 있고 엄격성 조건을 유지하거나 변경할 다양한 파라미터를 알고 있다. 예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오티드 길이의 DNA 하이브리드에 대한 전형적인 고 엄격성 혼성화 조건은 1x SSC 내의 65℃에서 또는 1x SSC 및 50% 포름아미드 내의 42℃에서의 혼성화, 이어서 0.3x SSC 내의 65℃에서의 세척을 포함한다. 50개 초과의 뉴클레오티드 길이의 DNA 하이브리드에 대한 중등 엄격성 혼성화 조건의 예는 4x SSC 내의 50℃에서 또는 6x SSC 및 50% 포름아미드 내의 40℃에서의 혼성화, 이어서 2x SSC 내의 50℃에서의 세척을 포함한다. 하이브리드의 길이는 혼성화 핵산에 대해 예상된 길이다. 서열이 알려진 핵산이 혼성화할 때, 하이브리드 길이는 서열을 정렬하고 본원에서 설명된 보존된 영역을 확인함으로써 결정될 수 있다. 1xSSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트르산나트륨이고; 혼성화 용액 및 세척 용액은 추가로 5x 덴하르트 (Denhardt) 시약, 0.5-1.0% SDS, 100 ㎍/ml의 변성된, 단편화된 연어 정자 DNA, 0.5% 피로인산나트륨을 포함할 수 있다. 엄격성 수준을 규정하기 위해, 문헌 [Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.] (1989 및 매년 업데이트)을 참조할 수 있다.
단백질의 "상동체"는 문제의 변형되지 않은 단백질에 비해 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고 이들이 유래되는 비변경된 단백질과 유사한 생물학적 및 기능적 활성을 갖는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및 효소를 포함한다.
결실은 단백질로부터 하나 이상의 아미노산의 제거를 의미한다.
삽입은 하나 이상의 아미노산 잔기가 단백질 내의 미리 결정된 부위 내로 도입됨을 의미한다. 삽입은 N-말단 및/또는 C-말단 융합 및 단일 또는 다중 아미노산의 서열내 삽입을 포함할 수 있다. 일반적으로, 약 1 내지 10 잔기 정도의 아미노산 서열 내의 삽입은 N- 또는 C-말단 융합보다 더 작을 것이다. N- 또는 C-말단 융합 단백질 또는 펩티드의 예는 효모 2-하이브리드 시스템에서 사용되는 바와 같은 전사 활성제의 결합 도메인 또는 활성화 도메인, 파지 코트 단백질, (히스티딘)-6-태그, 글루타티온 S-트랜스퍼라제-태그, 단백질 A, 말토스-결합 단백질, 디히드로폴레이트 리덕타제, 태그·100 에피토프, c-myc 에피토프, FLAG®-에피토프, lacZ, CMP (칼모둘린-결합 펩티드), HA 에피토프, 단백질 C 에피토프 및 VSV 에피토프를 포함한다.
치환은 단백질의 아미노산을 유사한 특성 (예컨대 유사한 소수성, 친수성, 항원성, α-나선 구조 또는 β-시트 구조를 형성하거나 파괴하는 경향)을 갖는 다른 아미노산으로의 교체를 의미한다. 아미노산 치환은 일반적으로 단일 잔기 치환이지만, 폴리펩티드에 대한 기능적 제한에 따라 연속적으로 발생할 수 있고, 1 내지 10개 아미노산일 수 있고; 삽입은 대체로 약 1 내지 10개 아미노산 잔기 정도일 것이다. 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 치환 표는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds)] 및 아래 표 1 참조).
<표 1>
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본원에서 "내인성" 유전자의 언급은 그의 천연 형태로 (즉, 임의의 인간에 의한 개입이 없는) 유기체에서 발견되는 문제의 유전자를 나타낼 뿐만 아니라, 또한 후속적으로 미생물 내로 (재)도입되는 단리된 형태의 동일한 유전자 (또는 실질적으로 상동성 핵산/유전자) (트랜스진)를 나타낸다. 예를 들어, 상기 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 미생물은 트랜스진 발현의 실질적 감소 및/또는 내인성 유전자의 발현의 실질적 감소를 경험할 수 있다. 단리된 유전자는 유기체로부터 단리될 수 있거나 또는 예를 들어 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.
용어 "오르토로그" 및 "파라로그"는 유전자의 선조의 관계를 설명하기 위해 사용되는 진화 개념을 포함한다. 파라로그는 선조의 유전자의 복제를 통해 기원되는 동일한 종 내의 유전자이고; 오르토로그는 종 분화를 통해 기원되는 상이한 유기체로부터의 유전자이고 또한 공통적인 선조의 유전자로부터 유래된다.
본원에서 사용되는 용어 "스플라이스 변이체"는 선택된 인트론 및/또는 엑손이 절제, 교체, 대체 또는 부가되거나, 또는 인트론이 단축되거나 또는 연장된 핵산 서열의 변이체를 포함한다. 상기 변이체는 단백질의 생물학적 활성이 실질적으로 보유되는 것일 것이고, 이것은 단백질의 기능적 분절을 선택적으로 보유함으로써 달성될 수 있다. 상기 스플라이스 변이체는 자연에서 발견될 수 있거나 또는 제조될 수 있다. 상기 스플라이스 변이체의 예측 및 단리 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어 문헌 [Foissac and Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25] 참조).
대립유전자 또는 대립유전자 변이체는 제시된 유전자의 대체 형태이고, 동일한 염색체 위치에 존재한다. 대립유전자 변이체는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 및 작은 삽입/결실 다형성 (INDEL)을 포함한다. INDEL의 크기는 대체로 100 bp 미만이다. SNP 및 INDEL은 대부분의 유기체의 천연 생성 다형성 균주에서 최대 서열 변이체 세트를 형성한다.
바람직한 실시양태의 상세한 설명
제1 측면에서, 본 발명은 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 포함하는 재조합 미생물을 제공하고, 여기서 EasA 활성은 EasA 리덕타제 또는 EasA 이소머라제 활성일 수 있거나 또는 EasA 리덕타제 및 EasA 이소머라제 활성일 수 있고, 재조합 미생물은 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 아니다.
바람직하게는 재조합 미생물은 적어도 하나의 EasH 및 EasD 활성을 포함하거나, 또는 적어도 하나의 EasH 및 EasA 리덕타제 활성을 포함하거나, 또는 적어도 하나의 EasH, EasA 리덕타제 및 EasD 활성을 포함하거나, 또는 적어도 하나의 EasH 및 EasD, EasA 및 EasG 활성, 보다 더 바람직하게는 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 미생물은 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 바람직하게는 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 재조합 미생물은 적어도 하나의 EasD, EasA 및 EasG 활성, 또는 적어도 하나의 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는 적어도 하나의 EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는 적어도 하나의 EasD, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 포함한다.
재조합 미생물은 또한 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 재조합 미생물은 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성, 또는 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC 및 EasD 활성을 포함한다.
한 실시양태에서, 재조합 미생물은 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성의 군으로부터 선택된 적어도 2개의 활성을 포함하고, 여기서 EasA 활성은 EasA 리덕타제 또는 EasA 이소머라제 활성일 수 있거나 또는 EasA 리덕타제 및 EasA 이소머라제 활성일 수 있고, 여기서 상기 활성은 동일한 또는 상이한 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는 폴리펩티드에 의해 매개되고, 예를 들어, 한 실시양태에서, 재조합 미생물은 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 하나의 종으로부터 또는 상이한 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는 적어도 EasH 및 EasD, 또는 적어도 EasH 및 EasA, 또는 적어도 EasH, EasD 및 EasA 활성을 포함한다. 추가의 예시적인 실시양태에서, 재조합 유기체는 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 하나의 종으로부터 얻을 수 있는 적어도 EasF 및 EasE, 또는 적어도 EasF 및 EasC, 또는 적어도 EasF, EasE 및 EasC 활성을 포함한다.
천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 자연에서 발생하는 유기체이고, 적어도 하나의 유형의 맥각 알칼로이드를 생산하는 능력을 갖는다. 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 클라비시피타세아에, 아르트로더마타세애 (Arthrodermataceae) 및 트리코코마세아에, 특히 아르트로더마 벤하미아에(Arthroderma benhamiae), 클라비셉스 종, 네오티포디움 종, 에피클로에 종, 스파셀리아 종, 발란시아 종 또는 페리글란둘라 종, 아스페르길루스 종 및 페니실리움 종, 파에실로미세스(Paecylomyces) 종, 트리코피톤(Trichophyton) 종, 아르토더마(Arthoderma) 종, 메타리지움 (Metarhizium) 종, 하이포크레아(Hypocrea) 종, 아젤로미세스(Ajellomyces) 종, 뉴로스포라(Neurospora) 종, 파라콕시디오이데스(Paracoccidioides) 종, 보트리오티니아(Botryotinia) 종에 속한다. 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 개개의 종의 예는 본 발명의 개시내용 전체에 걸쳐 설명된다.
천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 및 맥각 알칼로이드 생산을 위한 유전자 클러스터는 예를 들어 문헌 [Schardl CL, Young CA, Hesse U, Amyotte SG, Andreeva K, et al. (2013) Plant-Symbiotic Fungi as Chemical Engineers: Multi-Genome Analysis of Clavicipitaceae Reveals Dynamics of Alkaloid Loci. PLoS Genet 9(2): e1003323. doi:10.1371/journal.pgen.1003323], 및 [Schardl CL, et al.: "The epichloae: alkaloid diversity and roles in symbiosis with grasses", Curr Opin Plant Biol (2013), 16:1-9]에서 볼 수 있다.
바람직하게는, 상기 재조합 미생물은 박테리아, 효모, 방선균, 또는 사상 진균이고, 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 아니다. 상기 사상 진균은 자낭균, 불완전균류, 또는 담자균일 수 있고, 바람직한 종은 쉬조필룸 콤뮨(Schizophyllum commune)이다.
본 발명의 숙주 세포로서 사용되는 바람직한 박테리아는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacilus subtilis)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 효모는 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 사카로미세스, 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 야로위아(Yarrowia) 및 피키아(Pichia)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로미세스 세레비지아에, 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 및 피키아 스티피테스(Pichia stipites)로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 미생물이 보다 바람직하다.
보다 더 바람직한 재조합 미생물은 사카로미세스 세레비지아에이다.
본 발명은 또한 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 상향조절된 활성을 갖는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 포함한다.
한 실시양태에서, 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 적어도 상향조절된 EasH 및 EasD, EasA 및 EasG 활성, 보다 더 바람직하게는 상향조절된 EasH, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 적어도 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 바람직하게는 적어도 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 적어도 상향조절된 EasD, EasA 및 EasG 활성, 또는 적어도 상향조절된 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는 적어도 상향조절된 EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는 적어도 상향조절된 EasD, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 포함한다.
재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 또한 적어도 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 적어도 상향조절된 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성, 또는 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC 및 EasD 활성을 포함한다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 하향조절된 활성을 포함한다.
한 실시양태에서, 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 상향조절된 활성을 포함하고, 여기서 EasA 활성은 EasA 리덕타제 또는 EasA 이소머라제 활성일 수 있거나 또는 EasA 리덕타제 및 EasA 이소머라제 활성일 수 있고, 상기 활성은 동일한 또는 상이한 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는 폴리펩티드에 의해 매개되고, 예를 들어, 한 실시양태에서, 재조합 미생물은 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 하나의 종으로부터 또는 상이한 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는 적어도 EasH 및 EasD, 또는 적어도 EasH 및 EasA, 또는 적어도 EasH, EasD 및 EasA 활성을 포함한다. 추가의 예시적인 실시양태에서, 재조합 유기체는 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 하나의 종으로부터 또는 상이한 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는 적어도 EasF 및 EasE, 또는 적어도 EasF 및 EasC, 또는 적어도 EasF, EasE 및 EasC 활성을 포함한다.
바람직하게는, 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 클라비시피타세아에, 아르트로더마타세애 및 트리코코마세아에, 특히 아르트로더마 벤하미아에, 클라비셉스 종, 네오티포디움 종, 에피클로에 종, 스파셀리아 종, 발란시아 종, 또는 페리글란둘라 종, 아스페르길루스 종, 및 페니실리움 종, 파에실로미세스 종, 트리코피톤 종, 아르트로더마 종, 메타리지움 종, 하이포크레아 종, 아젤로미세스 종, 뉴로스포라 종, 파라콕시디오이데스 종, 보트리오티니아 종의 군으로부터 선택되거나, 또는 속 아스페르길루스, 특히 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus), 아스페르길루스 카에시엘루스(Aspergillus caesiellus), 아스페르길루스 칸디두스(Aspergillus candidus), 아스페르길루스 카르네우스(Aspergillus carneus), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 데플렉투스(Aspergillus deflectus), 아스페르길루스 피셔리아누스(Aspergillus fischerianus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 글라우쿠스(Aspergillus glaucus), 아스페르길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스페르길루스 페니실로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스페르길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus), 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae), 아스페르길루스 타마리(Aspergillus tamari), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 우스투스(Aspergillus ustus), 아스페르길루스 베르시콜로르(Aspergillus versicolor)로 이루어진 군으로부터 선택되고; 보다 바람직한 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니둘란스 및 아스페르길루스 오리자에, 또는
속 페니실리움, 예컨대 페니실리움 아우란티오그리세움, 페니실리움 빌라이아에(Penicillium bilaiae), 페니실리움 카멤베르티(Penicillium camemberti), 페니실리움 칸디둠(Penicillium candidum), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 페니실리움 클라비포르메(Penicillium claviforme), 페니실리움 콤뮨(Penicillium commune), 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum), 페니실리움 코릴로피눔(Penicillium corylophinum), 페니실리움 코뮨(Penicillium comune), 페니실리움 펠루타눔(Penicillium fellutanum), 페니실리움 와크스마니이(Penicillium waksmanii), 페니실리움 크루스토숨(Penicillium crustosum), 페니실리움 디기타툼(Penicillium digitatum), 페니실리움 엑스판숨(Penicillium expansum), 페니실리움 푸니쿨로숨(Penicillium funiculosum), 페니실리움 글라브룸(Penicillium glabrum), 페니실리움 글라우쿰, 페니실리움 이탈리쿰(Penicillium italicum), 페니실리움 라쿠싸르미엔테이(Penicillium lacussarmientei), 페니실리움 마르네페이(Penicillium marneffei), 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 페니실리움 로쿠에포르티(Penicillium roqueforti), 페니실리움 스톨로니페룸(Penicillium stoloniferum), 페니실리움 울라이엔세(Penicillium ulaiense), 페니실리움 베루코숨(Penicillium verrucosum), 페니실리움 비리디카툼(Penicillium viridicatum); 또는
속 클라비셉스, 예컨대 클라비셉스 아프리카나(Claviceps africana), 클라비셉스 기간테아(Claviceps gigantea), 클라비셉스 그로히이(Claviceps grohii), 클라비셉스 사이페리(Claviceps cyperi), 클라비셉스 푸시포르미스(Claviceps fusiformis), 클라비셉스 히르텔라(Claviceps hirtella), 클라비셉스 니그리칸스(Claviceps nigricans), 클라비셉스 파스팔리(Claviceps paspali), 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스클라비셉스 소르기(Claviceps sorghi), 클라비셉스 지자니아에(Claviceps zizaniae), 바람직하게는 클라비셉스 아프리카나, 클라비셉스 파스팔리, 또는 클라비셉스 푸르푸레아, 또는
속 파에실로미세스, 예컨대 파에실로미세스 디바리카투스, 속 아르트로더마, 예컨대 아르트로더마 벤하미아에, 또는 속 트리코피톤, 예컨대 트리코피톤 베루코숨(Trichophyton verrucosum), 또는 속 미크로스포룸(Microsporum), 예컨대 미크로스포룸 카니스(Microsporum canis)
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 아프리카나, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 지자니에아(Claviceps zizaniea), 페니실리움 크리소게눔, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 코릴로피눔, 페니실리움 펠루타눔, 페니실리움 와크스마니이, 페니실리움 로쿠에포르티, 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 바이러스 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 아프리카나, 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 보다 더 바람직하다.
재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드, 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나를 생산하기 위해 사용될 수 있고, 보다 많은 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드, 및/또는 카노클라빈 I을 제공하기 위해 활성이 상향조절 및/또는 하향조절되어야 하는지에 대한 추가의 지침은 도 1 및 도 2에 포함되어 있다. 예를 들어, 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 상향조절된 EasH 활성을 갖는, 바람직하게는 상향조절된 EasH 및 EasA 리덕타제 활성 및 하향조절된 EasA 이소머라제 활성을 갖는 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 푸르푸레아, 또는 클라비셉스 아리카나(Claviceps aricana) 세포이다.
상기 설명한 모든 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 바람직하게는 트립토판 및/또는 DMAPP의 확대된 세포 내부 공급원 및/또는 Me-DMAT의 확대된 세포 내부 공급원을 포함한다. 상기 DMAPP 및/또는 Me-DMAT의 확대된 세포 내부 공급원은 메발로네이트 경로의 유전자 또는 폴리펩티드 또는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 활성을 상향조절함으로써 제공될 수 있다. 사카로미세스 세레비지아에의 메발로네이트 경로의 유전자 및 폴리펩티드의 예는 서열 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18에 의해 설명된다. 상기 유전자의 상동체 및 그의 서열 변이체는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 쉽게 이용가능하다.
예를 들어, 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 ERG9 및 ERG20 활성의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 하향조절된 활성을 포함할 수 있거나, 또는 적어도 하나의 상향조절된 HMG-CoA 리덕타제 활성을 포함할 수 있거나, 또는 ERG9 및 ERG20 활성의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 하향조절된 활성 및 적어도 하나의 상향조절된 HMG-CoA 리덕타제 활성을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 추가로, 본원에서 언급되는 클라빈-유형 알칼로이드의 합성을 위한 출발 물질로서의 트립토판의 합성을 위해 필요하거나 이를 용이하게 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 고려한다. 보다 바람직하게는, 그러한 효소는 트립토판신타제이다. 트립토판의 생합성에 대한 보다 상세한 내용은 예를 들어 문헌 [Radwanski 1995, Plant Cell 7(7): 921-934]에서 볼 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 적어도 하나의 EasH 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasH 및 EasD 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasA 리덕타제 또는 적어도 하나의 EasA 이소머라제 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성을 코딩하는, 또는 상기 설명한 것 중 적어도 2개를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는 적어도 하나의 EasH 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasH 및 EasD 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasA 리덕타제 또는 적어도 하나의 EasA 이소머라제 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 코딩하는, 또는 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성을 코딩하는, 또는 상기 설명한 것 중 적어도 2개를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 하나의 DmaW 활성은 바람직하게는 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드에 의한 것이다:
a) 서열 145 및 146에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 147 및 또는 190에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
c) 서열 1, 19, 20 179, 및/또는 180에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 1, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및/또는 28에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
e) 서열 102, 122 및/또는 123에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
f) 서열 129 및/또는 137에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
g) 서열 102, 122, 123, 129 및/또는 137에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
h) 엄격한 조건 하에 서열 102, 122, 123, 129 및/또는 137에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
i) a) 내지 h) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 b) 및 c)에 따른 폴리펩티드 및
j) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 i) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
DmaW 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 원칙적으로, 본원에 언급된 임의의 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻을 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
아스페르길루스 테레우스, 발란시아 안드로포고니스(Balansia andropogonis), 발란시아 사이페리(Balansia cyperi )), 발란시아 오브텍타(Balansia obtecta), 발란시아 필루아에포르미스(Balansia pilulaeformis), 클라비셉스 아프리카나, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 히르텔라, 스파셀리아 에리오클로아에(Sphacelia eriochloae), 스파셀리아 텍센시스(Sphacelia texensis), 스파셀리아 로벨레시이(Sphacelia lovelessii), 네오티포디움 종 Lp1, 네오티포디움 코에노피알룸(Neotyphodium coenophialum), 네오티포디움 롤리이, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 콤뮨, 페니실리움 코릴로필룸(Penicillium corylophillum), 페니실리움 크루스토숨, 페니실리움 펠루타눔 및 페니실리움 팔리탄스(Penicillium palitans)로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 지자니아에, 페니실리움 크리소게눔, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 코릴로피눔, 페니실리움 펠루타눔, 페니실리움 와크스마니이, 페니실리움 로쿠에포르티 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
아르트로더마 벤타미아에(Arthroderma benthamiae), 아르트로더마 오타에(Arthroderma otae), 에피클로에 브라키엘리트리(Epichloe brachyelytri), 에피클로에 페스투카에(Epichloe festucae), 에피클로에 글리세리아에(Epichloe glyceriae), 에피클로에 티프니아(Epichloe typhina), 말브란케아 아우란티아카(Malbranchea aurantiaca), 미크로스포룸 카니스, 메타리지움 아크리둠(Metarhizium acridum), 메타리지움 로베르트시이(Metarhizium robertsii), 페리글란둘라 이포모에아에(Periglandula ipomoeae), 트리코피톤 에퀴늄(Trichophyton equinum), 및 트리코피톤 톤수란스(Trichophyton tonsurans)로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
상기 군의 임의의 하나의 조합인 군으로 이루어지는 군
으로부터 선택되는 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻어진다.
DmaW 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 DmaW 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 서열 정보에 의해 제공되는 서열 정보를 기촐로 하여 설계된 PCR-프라이머를 사용하는 PCR-방법을 통해 게놈 단편 또는 cDNA 단편을 증폭함으로써 상기 나열된 유기체로부터 얻을 수 있다. 대체로, 상기 방법에 사용되는 PCR-프라이머의 세트는 DmaW 활성을 갖고 본원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 28개, 그러나 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 또는 30개 미만의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머로 이루어진다. 바람직하게는, PCR-프라이머는 증폭할 폴리뉴클레오티드의 서열에 대한 임의의 뉴클레오티드 미스매치가 없이 결합할 것이다. 동일한 방법은 또한 각각의 활성을 갖는 폴리펩티드에 대해 본원에서 제공되는 서열 정보를 사용하여 EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 증폭에 적용될 것이다.
바람직하게는, 적어도 하나의 DmaW 활성을 갖는 폴리펩티드는 표 2에 나열된 서열, 또는 상기 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택된다.
<표 2>
Figure pct00010
바람직하게는, DmaW 활성을 갖는 폴리펩티드는 아래에서 설명되는 적어도 하나의 DmaW 시그너처 서열을 포함하거나 또는 DmaW 컨센서스 서열을 포함한다. 바람직하게는, 이것은 두 DmaW 시그너처 서열을 모두 포함하고, 심지어 두 DmaW 시그너처 서열 및 DmaW 컨센서스 서열을 포함한다. DmaW 시그너처 및 컨센서스 서열은 각각의 개별적인 아미노산이 관련 기술 분야에서 사용되는 단일 문자 아미노산 코드에 의해 특정되는 연속적인 아미노산 서열을 설명한다. "X"로 특정된 아미노산은 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 표 2에 표시되고 도 3a 내지 3d에 제시된 서열의 DmaW 서열 정렬의 적어도 하나의 아미노산 서열에서 동일한 위치를 갖는 아미노산을 나타낸다.
DmaW 시그너처 서열 1 (서열 124):
Figure pct00011
DmaW 시그너처 서열 2 (서열 125):
Figure pct00012
DmaW 컨센서스 서열 (서열 126):
Figure pct00013
DmaW 컨센서스 서열 2 (서열 190):
Figure pct00014
본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 DmaW 활성은 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 19에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 19에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 190에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 89% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 3에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
c) 서열 180에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 180에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 190에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 89% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 3에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및
e) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 d) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 하나의 EasF 활성은 바람직하게는 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 154에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 6, 75 및/또는 76에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 6, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 및/또는 85에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 107 및/또는 120에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
e) 서열 134 및/또는 142에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
f) 서열 107, 120, 134 및/또는 142에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
g) 엄격한 조건 하에 서열 107, 120, 134 및/또는 142에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드 및
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
EasF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 원칙적으로, 본원에 언급된 임의의 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻을 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
아스페르길루스 테레우스, 발란시아 안드로포고니스, 발란시아 사이페리, 발란시아 오브텍타, 발란시아 필루아에포르미스, 클라비셉스 아프리카나, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 히르텔라, 스파셀리아 에리오클로아에, 스파셀리아 텍센시스, 스파셀리아 로벨레시이, 네오티포디움 종 Lp1, 네오티포디움 코에노피알룸, 네오티포디움 롤리이, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 콤뮨, 페니실리움 코릴로필룸, 페니실리움 크루스토숨, 페니실리움 펠루타눔 및 페니실리움 팔리탄스로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 지자니아에, 페니실리움 크리소게눔, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 코릴로피눔, 페니실리움 펠루타눔, 페니실리움 와크스마니이, 페니실리움 로쿠에포르티 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
아르트로더마 벤타미아에, 아르트로더마 깁세움(Arthroderma gypseum), 아르트로더마 오타에, 에피클로에 브라키엘리트리, 에피클로에 페스투카에, 에피클로에 글리세리아에, 에피클로에 티프니아, 말브란케아 아우란티아카, 미크로스포룸 카니스, 메타리지움 아크리둠, 메타리지움 로베르트시이, 페리글란둘라 이포모에아에, 트리코피톤 에퀴늄, 트리코피톤 루브룸(Trichophyton rubrum), 트리코피톤 톤수란스, 및 트리코피톤 베루코숨으로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
상기 군의 임의의 하나의 조합인 군으로 이루어지는 군
으로부터 선택된 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻어진다.
바람직하게는, EasF 활성을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드는 표 3에 나열된 서열, 또는 상기 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택된다.
<표 3>
Figure pct00015
바람직하게는, EasF 활성을 갖는 폴리펩티드는 EasF 컨센서스 서열을 포함한다. EasF 컨센서스 서열은 각각의 개별적인 아미노산이 관련 기술 분야에서 사용되는 단일 문자 아미노산 코드에 따라 특정되는 연속적인 아미노산 서열을 설명한다. "X"로 특정된 아미노산은 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 표 3에 표시되고 도 4a 내지 4c에 제시된 서열의 EasF 서열 정렬의 적어도 하나의 아미노산 서열에서 동일한 위치를 갖는 아미노산을 나타낸다.
EasF 시그너처 서열 (서열 154):
Figure pct00016
바람직하게는, 본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 EasF 활성은 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 6에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 6에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 154에 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 79% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 4에 제시된 정렬에 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
c) 서열 75에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 6에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 154에 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 83% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 4에 제시된 정렬에 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
e) 서열 76에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
f) 서열 76에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 154에 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 78% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 4에 제시된 정렬에 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및
g) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 f) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 하나의 EasE 활성은 바람직하게는 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 153, 185 및/또는 191에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 바람직하게는 서열 191에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 5 및/또는 64에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
c) 서열 5, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 및/또는 74에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 또는 서열 5, 64, 175, 66, 67, 68, 69, 176, 71, 177, 73 및/또는 178에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 106에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
e) 서열 133 및/또는 141에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
f) 서열 106, 133 및/또는 141에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
g) 엄격한 조건 하에 서열 106, 133 및/또는 141에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드 및
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
바람직하게는, 코딩된 폴리펩티드는 소포체로의 분류 신호로 기능할 수 있는 N-말단 서열을 갖는다.
EasE 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 원칙적으로 본원에 언급된 임의의 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻을 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
아스페르길루스 테레우스, 발란시아 안드로포고니스, 발란시아 사이페리, 발란시아 오브텍타, 발란시아 필루아에포르미스, 클라비셉스 아프리카나, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 히르텔라, 스파셀리아 에리오클로아에, 스파셀리아 텍센시스, 스파셀리아 로벨레시이, 네오티포디움 종 Lp1, 네오티포디움 코에노피알룸, 네오티포디움 롤리이, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 콤뮨, 페니실리움 코릴로필룸, 페니실리움 크루스토숨, 페니실리움 펠루타눔 및 페니실리움 팔리탄스로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 지자니아에, 페니실리움 크리소게눔, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 코릴로피눔, 페니실리움 펠루타눔, 페니실리움 와크스마니이, 페니실리움 로쿠에포르티 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
아르트로더마 벤타미아에, 아르트로더마 깁세움, 아르트로더마 오타에, 에피클로에 브라키엘리트리, 에피클로에 페스투카에, 에피클로에 글리세리아에, 에피클로에 티프니아, 말브란케아 아우란티아카, 미크로스포룸 카니스, 메타리지움 아크리둠, 메타리지움 로베르트시이, 페리글란둘라 이포모에아에, 트리코피톤 에퀴늄, 트리코피톤 루브룸, 트리코피톤 톤수란스, 및 트리코피톤 베루코숨으로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
상기 군의 임의의 하나의 조합인 군으로 이루어지는 군
으로부터 선택된 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻어진다.
바람직하게는, EasE 활성을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드는 표 4에 나열된 서열, 또는 상기 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택된다.
<표 4>
Figure pct00017
바람직하게는, EasE 활성을 갖는 폴리펩티드는 EasE 컨센서스 서열을 포함한다. EasE 컨센서스 서열은 각각의 개별적인 아미노산이 관련 기술 분야에서 사용되는 단일 문자 아미노산 코드에 따라 특정되는 연속적인 아미노산 서열을 설명한다. "X"로 특정된 아미노산은 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 표 4에 표시되고 도 5a 내지 5e에 제시된 서열의 EasE 서열 정렬의 적어도 하나의 아미노산 서열에서 동일한 위치를 갖는 아미노산을 나타낸다.
EasE 시그너처 서열 (서열 153):
Figure pct00018
EasE 컨센서스 서열 2 (서열 153):
Figure pct00019
EasE 코어 컨센서스 서열 (서열 191):
Figure pct00020
바람직하게는, 본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 EasE 활성은 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 5에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 5에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 191에 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 73% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 5에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
c) 서열 64에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 64에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 191에 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 79% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 5에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및
e) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 d) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 하나의 EasC 활성은 바람직하게는 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 151 및/또는 192에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는,
b) 서열 3 및/또는 41에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 3 또는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및/또는 52에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 104에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 131 또는 139에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
f) 서열 104, 131 및/또는 139에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
g) 엄격한 조건 하에 서열 104, 131 및/또는 139에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는
h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드 및
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
EasC 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 원칙적으로 본원에 언급된 임의의 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻을 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
아스페르길루스 테레우스, 발란시아 안드로포고니스, 발란시아 사이페리, 발란시아 오브텍타, 발란시아 필루아에포르미스, 클라비셉스 아프리카나, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 히르텔라, 스파셀리아 에리오클로아에, 스파셀리아 텍센시스, 스파셀리아 로벨레시이, 네오티포디움 종 Lp1, 네오티포디움 코에노피알룸, 네오티포디움 롤리이, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 콤뮨, 페니실리움 코릴로필룸, 페니실리움 크루스토숨, 페니실리움 펠루타눔 및 페니실리움 팔리탄스로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 지자니아에, 페니실리움 크리소게눔, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 코릴로피눔, 페니실리움 펠루타눔, 페니실리움 와크스마니이, 페니실리움 로쿠에포르티 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
아르트로더마 벤타미아에, 아르트로더마 깁세움, 아르트로더마 오타에, 에피클로에 브라키엘리트리, 에피클로에 페스투카에, 에피클로에 글리세리아에, 에피클로에 티프니아, 메타리지움 아크리둠, 메타리지움 로베르트시이, 페리글란둘라 이포모에아에, 트리코피톤 에퀴늄, 트리코피톤 루브룸 및 트리코피톤 베루코숨으로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
상기 군의 임의의 하나의 조합인 군으로 이루어지는 군
으로부터 선택된 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻어진다.
바람직하게는, EasC 활성을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드는 표 5에 나열된 서열, 또는 상기 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택된다.
<표 5>
Figure pct00021
바람직하게는, EasC 활성을 갖는 폴리펩티드는 EasC 컨센서스 서열을 포함한다. EasC 컨센서스 서열은 각각의 개별적인 아미노산이 관련 기술 분야에서 사용되는 단일 문자 아미노산 코드에 따라 특정되는 연속적인 아미노산 서열을 설명한다. "X"로 특정된 아미노산은 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 표 5에 표시되고 도 6a 내지 6d에 제시된 서열의 EasC 서열 정렬의 적어도 하나의 아미노산 서열에서 동일한 위치를 갖는 아미노산을 나타낸다.
EasC 컨센서스 서열 (서열 151):
Figure pct00022
EasC 컨센서스 코어 서열 (서열 192):
Figure pct00023
바람직하게는, 본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 EasC 활성은 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 3에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 3에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 192에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 87% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 6에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
c) 서열 41에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 41에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 192에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 6에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및
e) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 d) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 하나의 EasD 활성은 바람직하게는 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 152에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는,
b) 서열 4 및/또는 53에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 4, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 및/또는 63에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 105에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 132 및/또는 140에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
f) 서열 105, 132 및/또는 140에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
g) 엄격한 조건 하에 서열 105, 132 및/또는 140에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드 및
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
EasD 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 원칙적으로 본원에 언급된 임의의 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻을 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
아스페르길루스 테레우스, 발란시아 안드로포고니스, 발란시아 사이페리, 발란시아 오브텍타, 발란시아 필루아에포르미스, 클라비셉스 아프리카나, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 히르텔라, 스파셀리아 에리오클로아에, 스파셀리아 텍센시스, 스파셀리아 로벨레시이, 네오티포디움 종 Lp1, 네오티포디움 코에노피알룸, 네오티포디움 롤리이, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 콤뮨, 페니실리움 코릴로필룸, 페니실리움 크루스토숨, 페니실리움 펠루타눔 및 페니실리움 팔리탄스로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 지자니아에, 페니실리움 크리소게눔, 페니실리움 코릴로피눔, 페니실리움 펠루타눔, 페니실리움 와크스마니이, 페니실리움 로쿠에포르티 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
아르트로더마 벤타미아에, 아르트로더마 깁세움, 아르트로더마 오타에, 에피클로에 브라키엘리트리, 에피클로에 페스투카에, 에피클로에 글리세리아에, 에피클로에 티프니아, 미크로스포룸 카니스, 메타리지움 아크리둠, 메타리지움 로베르트시이, 페리글란둘라 이포모에아에, 트리코피톤 에퀴늄, 트리코피톤 루브룸, 트리코피톤 톤수란스, 트리코피톤 베루코숨 및 트리코더마 비렌스 (Trichoderma virens)로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
상기 군의 임의의 하나의 조합인 군으로 이루어지는 군
으로부터 선택된 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻어진다.
바람직하게는, EasD 활성을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드는 표 6에 나열된 서열, 또는 상기 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택된다.
<표 6>
Figure pct00024
바람직하게는, EasD 활성을 갖는 폴리펩티드는 EasD 컨센서스 서열을 포함한다. EasD 컨센서스 서열은 각각의 개별적인 아미노산이 관련 기술 분야에서 사용되는 단일 문자 아미노산 코드에 따라 특정되는 연속적인 아미노산 서열을 설명한다. "X"로 특정된 아미노산은 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 표 6에 표시되고 도 7a 및 7b에 제시된 서열의 EasD 서열 정렬의 적어도 하나의 아미노산 서열에서 동일한 위치를 갖는 아미노산을 나타낸다.
EasD 컨센서스 서열 (서열 152):
Figure pct00025
바람직하게는, 본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 EasD 활성은 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 4에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 4에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 152에 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 7에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
c) 서열 53에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 53에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 152에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 86% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 7에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및
e) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 d) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 하나의 EasH 활성은 바람직하게는 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 156에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
b) 서열 8 및/또는 95에 적어도 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 156에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는
c) 서열 8 및/또는 95에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 109 및/또는 157에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 109, 136 또는 144 및/또는 157에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
f) 서열 109, 136, 144 및/또는 157에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
g) 엄격한 조건 하에 서열 109, 136, 144 및/또는 157에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
h) a) 내지 g) 중 적어도 2개에 따른 폴리펩티드, 및
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
EasH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 원칙적으로 본원에 언급된 임의의 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻을 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 아스페르길루스 자포니카스(Aspergillus japonicas) 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻어진다.
EasH 활성을 갖는 추가의 폴리펩티드는 문헌 [Stauffacher D. et al. (1969) Tetrahedron Vol.25: p5879-5887)]에 개시된 이포모에아 힐데브란티이 (Ipomoea hildebrandtii) 바트케 (Vatke))의 씨드에 포함된 내부 기생식물에 포함될 것이다.
바람직하게는, EasH 활성을 갖는 폴리펩티드는 EasH 컨센서스 서열을 포함한다. EasH 컨센서스 서열은 각각의 개별적인 아미노산이 관련 기술 분야에서 사용되는 단일 문자 아미노산 코드에 따라 특정되는 연속적인 아미노산 서열을 설명한다. "X"로 특정된 아미노산은 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 서열 8 및 95에 의해 설명되고 도 8에 제시된 서열의 EasH 서열 정렬의 적어도 하나의 아미노산 서열에서 동일한 위치를 갖는 아미노산을 나타낸다.
EasH 컨센서스 서열 (서열 156):
Figure pct00026
바람직하게는, 본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 EasH 활성은 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 8에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 8에 적어도 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 156에 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 8에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
c) 서열 95에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 95에 적어도 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 156에 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 8에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
e) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 d) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 하나의 EasA 리덕타제 활성은 바람직하게는 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 148, 149 및 150에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 서열 149의 아미노산 위치 18에 티로신을 갖는 폴리펩티드, 또는
b) 서열 193, 194 및 195에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 서열 194의 아미노산 위치 18에 티로신을 갖는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 2 및/또는 31에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 2, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및/또는 40에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 103에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
f) 서열 130 및/또는 138에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
g) 서열 103, 130 및/또는 138에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 (서열 목록에 포함된 상동체),
h) 엄격한 조건 하에 서열 103, 130 및/또는 138에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
i) a) 내지 h) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 b) 및 c)에 따른 폴리펩티드 및
j) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 i) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
EasA 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 원칙적으로 본원에 언급된 임의의 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻을 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
아스페르길루스 테레우스, 발란시아 안드로포고니스, 발란시아 사이페리, 발란시아 오브텍타, 발란시아 필루아에포르미스, 클라비셉스 아프리카나, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 히르텔라, 스파셀리아 에리오클로아에, 스파셀리아 텍센시스, 스파셀리아 로벨레시이, 네오티포디움 종 Lp1, 네오티포디움 코에노피알룸, 네오티포디움 롤리이, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 콤뮨, 페니실리움 코릴로필룸, 페니실리움 크루스토숨, 페니실리움 펠루타눔 및 페니실리움 팔리탄스로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 지자니아에, 페니실리움 크리소게눔, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 코릴로피눔, 페니실리움 펠루타눔, 페니실리움 와크스마니이, 페니실리움 로쿠에포르티 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
상기 군의 임의의 하나의 조합인 군으로 이루어지는 군
으로부터 선택된 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻어진다.
바람직하게는, EasA 활성을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드는 표 7에 나열된 서열, 또는 상기 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택된다.
<표 7>
Figure pct00027
바람직하게는, EasA 활성을 갖는 폴리펩티드는 아래에서 설명되는 적어도 하나의 EasA 시그너처 서열을 포함한다. 바람직하게는, 이것은 적어도 2개의 EasA 시그너처 서열을 포함하고, 보다 더 바람직하게는 3개의 모든 EasA 시그너처 서열을 포함한다.
EasA 시그너처 및 컨센서스 서열은 각각의 개별적인 아미노산이 관련 기술 분야에서 사용되는 단일 문자 아미노산 코드에 따라 특정되는 연속적인 아미노산 서열을 설명한다. "X"로 특정된 아미노산은 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 표 7에 표시되고 도 9a 내지 9d에 제시된 서열의 EasA 서열 정렬의 적어도 하나의 아미노산 서열에서 동일한 위치를 갖는 아미노산을 나타낸다. 보다 더 바람직하게는, EasA 활성을 갖는 폴리펩티드는 도 9a, 9b 및 9c에 흑색 막대로 표시된 전체 아미노산 서열을 포함하고, 도 9b에 흑색 화살표로 표시된 아미노산 위치에 페닐알라닌 (F) 또는 티로신 (Y)을 포함한다.
EasA 시그너처 서열 1.1 (서열 148):
Figure pct00028
EasA 시그너처 서열 2.1 (서열 149):
Figure pct00029
EasA 시그너처 서열 3.1 (서열 150):
Figure pct00030
EasA 시그너처 서열 1.2 (서열 193):
Figure pct00031
EasA 시그너처 서열 2.2 (서열 194):
Figure pct00032
EasA 시그너처 서열 3.2 (서열 195):
Figure pct00033
바람직하게는, 본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 EasA 활성은 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 2에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 티로신을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 2에 적어도 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 148, 149 및 150에 적어도 95%, 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 티로신을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
c) 서열 31에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 티로신을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 31에 적어도 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 148, 149 및 150에 적어도 95%, 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 티로신을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및
e) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 d) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
EasA 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 플라부스, 아스페르길루스 테레우스, 클라비셉스 히르텔라, 클라비셉스 아프리카나, 페니실리움 크리소게눔, 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군으로부터 선택된 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 군으로부터 얻어진다.
본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 하나의 EasA 이소머라제 활성은 바람직하게는 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 148, 149 및 150에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 페닐알라닌을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
b) 서열 193, 194 및 195에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 194의 아미노산 위치 18에 페닐알라닌을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
c) 서열 2 및/또는 31에 적어도 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
d) 서열 2, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및/또는 40에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
e) 서열 103에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
f) 서열 130 및/또는 138에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
g) 서열 103, 130 및/또는 138에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
h) 엄격한 조건 하에 서열 103, 130 및/또는 138에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
i) a) 내지 h) 중 적어도 2개에 따른 폴리펩티드, 및
j) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 i) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
바람직하게는, 본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 EasA 활성은 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 2에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 페닐알라닌을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 2에 적어도 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 148, 149 및 150에 적어도 95%, 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 페닐알라닌을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
c) 서열 31에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 페닐알라닌을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 31에 적어도 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 148, 149 및 150에 적어도 95%, 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 페닐알라닌을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및
e) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 d) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
EasA 이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 아스페르길루스 테레우스, 발란시아 안드로포고니스, 발란시아 사이페리, 발란시아 오브텍타, 발란시아 필루아에포르미스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 히르텔라, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 지자니아에, 스파셀리아 에리오클로아에, 스파셀리아 텍센시스, 스파셀리아 로벨레시이, 네오티포디움 종 Lp1, 네오티포디움 코에노피알룸, 네오티포디움 롤리이, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 코릴로필룸, 페니실리움 펠루타눔 및 페리글란둘라 이포모에아에로 이루어지는 군, 또는 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 푸시포르미스, 네오티포디움 롤리이 및 페리글란둘라 이포모에아에로 이루어지는 군으로부터 선택된 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 군으로부터 얻어진다.
본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 하나의 EasG 활성은 바람직하게는 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 155 및/또는 183에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고, 바람직하게는 서열 183에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 7 및/또는 86에 적어도 39% 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%. 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
c) 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 및/또는 94에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 108에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
e) 서열 135 및/또는 143에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
f) 서열 108, 135 및/또는 143에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
g) 엄격한 조건 하에 서열 108, 135 및/또는 143에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드,
h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드, 및
i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 원칙적으로 본원에 언급된 임의의 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
아스페르길루스 테레우스, 발란시아 안드로포고니스, 발란시아 사이페리, 발란시아 오브텍타, 발란시아 필루아에포르미스, 클라비셉스 아프리카나, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 히르텔라, 스파셀리아 에리오클로아에, 스파셀리아 텍센시스, 스파셀리아 로벨레시이, 네오티포디움 종 Lp1, 네오티포디움 코에노피알룸, 네오티포디움 롤리이, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 콤뮨, 페니실리움 코릴로필룸, 페니실리움 크루스토숨, 페니실리움 펠루타눔 및 페니실리움 팔리탄스로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 지자니아에, 페니실리움 크리소게눔, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 코릴로피눔, 페니실리움 펠루타눔, 페니실리움 와크스마니이, 페니실리움 로쿠에포르티 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
에피클로에 페스투카에, 에피클로에 글리세리아에, 메타리지움 아크리둠, 메타리지움 로베르트시이 및 트리코피톤 베루코숨으로 이루어지는 군, 또는
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 및 파에실로미세스 디바리카투스로 이루어지는 군, 또는
상기 군의 임의의 하나의 조합인 군으로 이루어지는 군
으로부터 선택된 천연 맥각 알칼로이드 생산자로부터 얻어진다.
바람직하게는, EasG 활성을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드는 표 8에 나열된 서열, 또는 상기 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택된다.
<표 8>
Figure pct00034
바람직하게는, EasG 활성을 갖는 폴리펩티드는 EasG 컨센서스 서열을 포함한다. EasG 컨센서스 서열은 각각의 개별적인 아미노산이 관련 기술 분야에서 사용되는 단일 문자 아미노산 코드에 따라 특정되는 연속적인 아미노산 서열을 설명한다. "X"로 특정된 아미노산은 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 표 8에 표시되고 도 10a 내지 10b에 제시된 서열의 EasG 서열 정렬의 적어도 하나의 아미노산 서열에서 동일한 위치를 갖는 아미노산을 나타낸다.
EasG 컨센서스 서열 (서열 155):
Figure pct00035
바람직하게는, 본 발명을 위해 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 EasG 활성은 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 활성에 의한 것이다:
a) 서열 7에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
b) 서열 7에 적어도 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 183에 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 10에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
c) 서열 86에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
d) 서열 86에 적어도 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 183에 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 도 10에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및
e) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 d) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
본원에서 설명되는 모든 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 바람직하게는 상기 설명한 트립토판 및/또는 DMAPP의 확대된 세포 내부 공급원 및/또는 Me-DMAT의 확대된 세포 내부 공급원을 포함한다. 확대된 세포 내부 공급원을 제공하기 위해, 대부분의 경우에 각각의 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 내인성 유전자를 탈조절하는 것이 필요할 것이다.
재조합 미생물이 효모, 바람직하게는 사카로미세스 종으로부터 선택되는 경우에, 보다 더 바람직하게는 재조합 미생물이 사카로미세스 세레비지아에인 경우에, 본 발명의 하나의 바람직한 실시양태는 서열 9에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상기 재조합 미생물의 내인성 폴리펩티드를 하향조절함으로써 ERG9 활성 (EC 2.5.1.21)을 하향조절하는 것이다.
별법으로 또는 그에 추가로, 효모, 바람직하게는 사카로미세스 종, 보다 더 바람직하게는 사카로미세스 세레비지아에 세포의 DMAPP의 내부 공급원은 ERG20 활성을 갖는 폴리펩티드 (EC 2.5.1.1/2.5.1.10), 특히 서열 10에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 하향조절함으로써 확대될 수 있다.
또한, 효모, 바람직하게는 사카로미세스 종, 보다 더 바람직하게는 사카로미세스 세레비지아에 세포의 DMAPP의 내부 공급원은 예를 들어 서열 11에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의한 것인 HMG-CoA 리덕타제 활성을 조정함으로써 상기 유기체의 메발로네이트 경로의 유전자를 상향조절함으로써 확대될 수 있다.
세포 내의 클라빈-유형 알칼로이드의 전구체의 내부 공급원을 확대하는 또 다른 방법은 Me-DMAT의 배지 내로의 외수송을 제한하는 것이다. 이것은 메발로네이트 경로의 세포 내인성 폴리펩티드의 활성을 상향조절함으로써 달성될 수 있다. 재조합 미생물이 효모, 바람직하게는 사카로미세스 종, 보다 더 바람직하게는 사카로미세스 세레비지아에 세포인 경우에, 이것은 서열 12, 13, 14, 15 또는 16에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드의 활성을 하향조절함으로써 달성될 수 있다.
본 발명은 새로운 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 특히 맥각 알칼로이드를 생산하는 능력을 갖지 않는 유기체를 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 및/또는 벡터로 형질전환시킴으로써 클라빈-유형 알칼로이드를 생산할 수 있는 새로운 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 생성할 가능성을 제공한다.
많은 경우에, 각각의 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에서 재조합 발현된 폴리펩티드의 적합한 발현, 폴딩 및 안정성을 지지하는 유전자의 과다발현에 의해 상기 기능을 지지하는 것이 또한 유용하다.
상기 기능을 지지할 수 있는 유전자는 예를 들어, ScIdi1 (서열 158), ScPdi1 (서열 166) 및 ScFad1 (서열 167)이다.
따라서, 추가의 실시양태는 그에 추가로 서열 158, 166 또는 167에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드의 상향조절된 활성을 포함하는, 바람직하게는 서열 166 및 167에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드의 상향조절된 활성을 갖는, 본원에서 설명되는 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I의 생산을 위한 폴리펩티드를 발현하는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체이다.
한 실시양태에서 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 시클로클라빈의 생산을 위해 본원에서 설명되는 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성을 갖는 및/또는 적어도 하나의 페스투클라빈 또는 아그로클라빈의 생산을 위해 본원에서 설명되는 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 및 EasG 활성을 갖는 효모, 바람직하게는 에스. 세레비지아에(S. cerevisiaee)이다. 바람직하게는, 상기 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 또한 상기 설명한 DMAPP의 확대된 내부 공급원을 갖는다.
본 발명의 추가의 실시양태는 시클로클라빈의 생산을 위해 본원에서 설명되는 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성을 갖는 및/또는 적어도 하나의 페스투클라빈 또는 아그로클라빈의 생산을 위해 본원에서 설명되는 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 및 EasG 활성을 갖는 및 서열 158, 166 및/또는 167에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드의 상향조절된 활성을 갖는, 바람직하게는 서열 166 및 167에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드의 상향조절된 활성을 갖는 재조합 에스. 세레비지아에이다.
바람직하게는, 시클로클라빈, 페스투클라빈 및/또는 아그로클라빈의 생산을 위해 본원에서 설명되는 적어도 상향조절된 EasE 활성을 갖는 에스. 세레비지아에는 또한 서열 187에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드의 상향조절된 활성을 갖고, 바람직하게는, 서열 187에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 서열 186에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
바람직하게는, 상기 재조합 에스. 세레비지아에는 또한 바람직하게는 서열 9 또는 10에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 내인성 폴리펩티드를 하향조절함으로써, 또는 서열 9에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 내인성 폴리펩티드를 하향조절함으로써 및 서열 10에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 내인성 폴리펩티드를 하향조절함으로써 상기 설명한 DMAPP의 확대된 내부 공급원을 갖는다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는
a) 시클로클라빈,
b) 페스투클라빈,
c) 아그로클라빈,
d) 카노클라빈 알데히드, 및
e) 카노클라빈 I
의 화합물의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 재조합 미생물이고, 여기서 재조합 미생물은 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 아니다.
바람직하게는, 상기 재조합 미생물은 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 아닌 박테리아, 효모, 방선균, 또는 사상 진균이다. 상기 사상 진균은 자낭균, 불완전균류, 또는 담자균일 수 있다.
본 발명의 숙주 세포로서 사용되는 바람직한 박테리아는 에스케리키아 콜라이 및 바실러스 서브틸리스로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직한 재조합 미생물은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
바람직한 효모는 클루이베로미세스, 사카로미세스, 쉬조사카로미세스, 야로위아 및 피키아의 군으로부터 선택된다.
클루이베로미세스 락티스, 사카로미세스 세레비지아에, 쉬조사카로미세스 폼베, 야로위아 리폴리티카 및 피키아 스티피테스로 이루어지는 군으로부터 선택된 재조합 미생물이 보다 바람직하다.
보다 더 바람직한 재조합 미생물은 사카로미세스 세레비지아에이다.
상기 유기체의 상이한 균주, 예를 들어 공공 균주 기탁기관에 기탁된 균주는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 쉽게 이용가능하다. 사카로미세스 세레비지아에의 적합한 균주는 예를 들어 BY4742, cGY 1585, 에탄올 레드, CEN.PK 111-61A, FY1679-06C, BMA64 (W303), SEY 6210이고, 이로 제한되지 않는다.
재조합 미생물이 박테리아, 특히 이. 콜라이인 경우에, 메발로네이트 경로의 유전자의 과다발현이 유용할 수 있다. 메발로네이트 경로의 상향조절된 유전자를 포함하는 이. 콜라이는 관련 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어 US7172886, US7192751, US7667017, US7622282, US7736882, US7622283, US7915026, 및 US8288147에 기재되어 있다.
시클로클라빈을 포함하는 재조합 미생물은 바람직하게는 각각의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 보다 바람직하게는 각각의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 것이다.
페스투클라빈을 포함하는 재조합 미생물은 바람직하게는 각각의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 것이다.
아그로클라빈을 포함하는 재조합 미생물은 바람직하게는 각각의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 것이다.
카노클라빈 알데히드를 포함하는 재조합 미생물은 바람직하게는 각각의 DmaW, EasF, EasE, EasC 및 EasD 활성에 대한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 것이다.
카노클라빈 I을 포함하는 재조합 미생물은 바람직하게는 각각의 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성에 대한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 것이다.
Me-DMAT를 포함하는 재조합 미생물은 바람직하게는 각각의 DmaW 및 EasF 활성에 대한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 것이다.
DMAT를 포함하는 재조합 미생물은 바람직하게는 DmaW 활성에 대한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 것이다.
또한, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드, 또는 카노클라빈 I 또는 상기 화합물의 적어도 2개의 조합물을 포함하지만, 트립토판 및 DMAPP의 세포 내부 풀로부터 각각의 화합물 또는 화합물들을 생산하기 위해 필요한 것보다 작은 활성을 갖는 재조합 미생물을 생산할 수 있다. 상실된 활성은 재조합 미생물에게 다른 수단에 의해 필요한 전구체를 제공함으로써, 예를 들어 전구체를 성장 배지에 제공함으로써 보충될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 DMAT가 제공되고 각각의 EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 보다 바람직하게는 각각의 EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 시클로클라빈을 포함하는 재조합 미생물이다.
추가의 실시양태는 Me-DMAT가 제공되고 각각의 EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 보다 바람직하게는 각각의 EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 시클로클라빈을 포함하는 재조합 미생물이다.
또 다른 추가의 실시양태는 카노클라빈 I이 제공되고 각각의 EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 보다 바람직하게는 각각의 EasD, EasH, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 제공하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 시클로클라빈을 포함하는 재조합 미생물이다.
추가의 실시양태는 DMAT가 제공되고 각각의 EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 페스투클라빈을 포함하는 재조합 미생물이다.
Me-DMAT가 제공되고 각각의 EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 페스투클라빈을 포함하는 재조합 미생물이 제시된다.
카노클라빈 I이 제공되고 각각의 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 페스투클라빈을 포함하는 재조합 미생물이 제시된다.
카노클라빈 알데히드가 제공되고 각각의 EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 페스투클라빈을 포함하는 재조합 미생물이 제시된다.
DMAT가 제공되고 각각의 EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 아그로클라빈을 포함하는 재조합 미생물이 제시된다.
Me-DMAT가 제공되고 각각의 EasE, EasC, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 아그로클라빈을 포함하는 재조합 미생물이 제시된다.
카노클라빈 I이 제공되고 각각의 EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 아그로클라빈을 포함하는 재조합 미생물이 제시된다.
카노클라빈 알데히드가 제공되고 각각의 EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 아그로클라빈을 포함하는 재조합 미생물이 제시된다.
DMAT가 제공되고 각각의 EasF, EasE, EasC 및 EasD 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 카노클라빈 알데히드를 포함하는 재조합 미생물이 제시된다.
Me-DMAT가 제공되고 각각의 EasE, EasC 및 EasD 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 카노클라빈 알데히드를 포함하는 재조합 미생물이 제시된다.
카노클라빈 I이 제공되고 EasD 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 카노클라빈 알데히드를 포함하는 재조합 미생물이 제시된다.
DMAT가 제공되고 각각의 EasF, EasE 및 EasC 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 카노클라빈 I을 포함하는 재조합 미생물이 제시된다.
Me-DMAT가 제공되고 EasE 및 EasC 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 카노클라빈 I을 포함하는 재조합 미생물이 제시된다.
세포가 갖는 추가의 활성에 따라, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 또는 상기 화합물의 적어도 2개의 조합물의 함량은 적거나 많을 수 있다.
예를 들어, 아그로클라빈을 포함하지만 생성물, 예를 들어 엘리모클라빈 또는 세토클라빈을 생산하기 위해 추출물로서 아그로클라빈을 이용하는 활성을 또한 포함하거나, 또는 아그로클라빈의 주위 배지 내로의 외수송을 용이하게 하는 활성을 포함하는 재조합 미생물은 낮은 함량의 아그로클라빈을 포함할 수 있다.
유사하게, 페스투클라빈을 포함하지만 생성물, 예를 들어 푸미클라빈 B, A 또는 C를 생산하거나 또는 디히드로맥각 알칼로이드를 생산하기 위해 추출물로서 페스투클라빈을 이용하는 활성을 또한 포함하거나, 또는 페스투클라빈의 주위 배지 내로의 외수송을 용이하게 하는 활성을 포함하는 재조합 미생물은 낮은 함량의 페스투클라빈을 포함할 수 있다.
카노클라빈 알데히드를 포함하지만 생성물, 예를 들어 페스투클라빈 또는 아그로클라빈을 생산하기 위해 추출물로서 카노클라빈 알데히드를 이용하는 활성을 또한 포함하거나, 또는 카노클라빈 알데히드의 주위 배지 내로의 외수송을 용이하게 하는 활성을 포함하는 재조합 미생물은 낮은 함량의 카노클라빈 알데히드를 포함할 수 있다.
카노클라빈 I을 포함하지만 생성물, 예를 들어 시클로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 6,7-세콜리에르긴을 생산하기 위해 추출물로서 카노클라빈 I을 이용하는 활성을 또한 포함하거나, 또는 카노클라빈 I의 주위 배지 내로의 외수송을 용이하게 하는 활성을 포함하는 재조합 미생물은 낮은 함량의 카노클라빈 I을 포함할 수 있다.
그러나, 각각의 화합물을 추출물로서 이용하거나 또는 상기 화합물의 주위 배지 내로의 외수송을 용이하게 하는 활성이 하향조절되는 경우에, 재조합 미생물 내의 화합물의 함량은 높을 수 있다.
본 발명은 그들의 비-재조합 형태에 비해 하나 이상의 맥각 알칼로이드의 향상된 생산을 보이는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 생성할 가능성을 추가로 제공한다. 또한, 맥각 알칼로이드 생산을 위한 내인성 유전자를 하향조절함으로써 또는 본원에 개시된 하나 이상의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성을 도입함으로써, 천연 맥각 알칼로이드 생산자에 의해 대체로 생산되는 맥각 알칼로이드 유형의 변화, 특히 천연 맥각 알칼로이드 생산자에 의해 생산되는 클라빈-유형 알칼로이드의 생산의 변화도 가능하다.
하나 이상의 맥각 알칼로이드의 향상된 생산은 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현이 결여되고 바람직하게는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 구축하기 위해 사용된 동일한 종 및 바람직하게는 동일한 균주의 야생형 유기체, 즉, 비-재조합 유기체이고 대조군 유기체로서 사용될 때 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체와 동일한 조건 하에 성장하는 대조군 유기체에 비해 통계적으로 유의하다.
증가의 유의성 여부는 예를 들어 스튜던트 (Student) t-시험을 비롯하여 관련 기술 분야에 잘 알려진 통계적인 시험에 의해 결정될 수 있다. 보다 바람직하게는, 증가는 상기 대조군 유기체에 비해 각각의 맥각 알칼로이드의 양의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20% 또는 적어도 30%의 증가이다. 맥각 알칼로이드의 양을 측정하기 위한 적합한 검정은 첨부되는 실시예에서 설명되고, 관련 기술 분야에 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I의 화합물의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체이고, 여기서 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 자연에서 상기 화합물을 생산하지 않는 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터의 것이다.
그에 추가로, 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 또한 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 상향조절된 또는 적어도 하나의 하향조절된, 또는 적어도 하나의 상향조절된 및 적어도 하나의 하향조절된 활성을 갖는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 생성함으로써 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I의 생산을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 동일한 조건 하에 성장할 때 비-재조합 야생형 유기체에 비해 보다 많은 양으로 포함하고/하거나 생산하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체이다.
비교를 위해 사용된 각각의 야생형 유기체는 바람직하게는 각각의 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 생성하기 위해 사용된 것과 동일한 종의 것이고, 바람직하게는 동일한 균주의 것일 것이다.
시클로클라빈을 포함하거나 시클로클라빈을 생산하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 적어도 하나의 상향조절된 EasH 활성을 포함할 것이고, 바람직하게는 적어도 하나의 상향조절된 EasH 활성 및 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 및/또는 EasG 활성을 포함할 것이고, 보다 바람직하게는 적어도 하나의 상향조절된 EasH 활성 및 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및/또는 EasG 활성을 포함할 것이고, 보다 더 바람직하게는 적어도 하나의 상향조절된 EasH 활성 및 적어도 하나의 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및/또는 EasG 활성 및 적어도 하나의 하향조절된 EasA 이소머라제 활성을 포함할 것이다.
페스투클라빈을 포함하거나 페스투클라빈을 생산하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 적어도 하나의 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 또는 EasG 활성, 바람직하게는 적어도 하나의 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 또는 EasG 활성 및 적어도 하나의 하향조절된 EasA 이소머라제 및/또는 EasH 활성을 포함할 것이다.
아그로클라빈을 포함하거나 아그로클라빈을 생산하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 적어도 하나의 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 이소머라제 및/또는 EasG 활성, 바람직하게는 적어도 하나의 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 이소머라제 및/또는 EasG 활성 및 적어도 하나의 하향조절된 EasA 리덕타제 및/또는 EasH 활성을 포함할 것이다.
카노클라빈 알데히드를 포함하거나 카노클라빈 알데히드를 생산하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 적어도 하나의 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC 및/또는 EasD 활성 또는 적어도 하나의 하향조절된 EasA, EasG 및/또는 EasH 활성을 포함할 것이고, 바람직하게는 적어도 하나의 상향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC 및/또는 EasD 활성 및 적어도 하나의 하향조절된 EasA, EasG 및/또는 EasH 활성을 포함할 것이다.
카노클라빈 I을 포함하거나 카노클라빈 I을 생산하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 적어도 하나의 상향조절된 DmaW, EasF, EasE 및/또는 EasC 활성, 또는 적어도 하나의 하향조절된 EasD, EasA, EasG 및/또는 EasH 활성을 포함할 것이거나, 또는 적어도 하나의 상향조절된 DmaW, EasF, EasE 및/또는 EasC 활성 및 적어도 하나의 하향조절된 EasD, EasA, EasG 및/또는 EasH 활성을 포함할 것이다.
시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드, 카노클라빈 I 또는 상기 화합물의 적어도 2개의 조합물을 포함하고/하거나 생산하지만, 트립토판 및 DMAPP의 세포 내부 풀로부터 각각의 화합물 또는 화합물들을 생산하기 위해 필요한 것보다 작은 활성을 갖는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 생산할 수 있다. 상실된 활성은 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에게 다른 수단에 의해 필요한 전구체를 제공함으로써, 예를 들어 전구체를 성장 배지에 제공함으로써 보충될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 DMAT가 제공되고 각각의 EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 보다 바람직하게는 각각의 EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 시클로클라빈을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체이다.
추가의 실시양태는 Me-DMAT가 제공되고 각각의 EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 보다 바람직하게는 각각의 EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 시클로클라빈을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체이다.
또 다른 추가의 실시양태는 카노클라빈 I이 제공되고 각각의 EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 보다 바람직하게는 각각의 EasD, EasH, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 제공하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 시클로클라빈을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체이다.
추가의 실시양태는 DMAT가 제공되고 각각의 EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 페스투클라빈을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체이다.
Me-DMAT가 제공되고 각각의 EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 페스투클라빈을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제시된다.
카노클라빈 I이 제공되고 각각의 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 페스투클라빈을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제시된다.
카노클라빈 알데히드가 제공되고 각각의 EasA 리덕타제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 페스투클라빈을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제시된다.
DMAT가 제공되고 각각의 EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 아그로클라빈을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제시된다.
Me-DMAT가 제공되고 각각의 EasE, EasC, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 아그로클라빈을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제시된다.
카노클라빈 I이 제공되고 각각의 EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 아그로클라빈을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제시된다.
카노클라빈 알데히드가 제공되고 각각의 EasA 이소머라제 및 EasG 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 아그로클라빈을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제시된다.
DMAT가 제공되고 각각의 EasF, EasE, EasC 및 EasD 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 카노클라빈 알데히드를 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제시된다.
Me-DMAT가 제공되고 각각의 EasE, EasC 및 EasD 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 카노클라빈 알데히드를 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제시된다.
카노클라빈 I이 제공되고 EasD 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 카노클라빈 알데히드를 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제시된다.
DMAT가 제공되고 각각의 EasF, EasE 및 EasC 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 카노클라빈 I을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제시된다.
Me-DMAT가 제공되고 EasE 및 EasC 활성을 위한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 카노클라빈 I을 포함하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 제시된다.
바람직하게는, 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는
속 아스페르길루스, 예컨대 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 아쿨레아투스, 아스페르길루스 카에시엘루스, 아스페르길루스 칸디두스, 아스페르길루스 카르네우스, 아스페르길루스 클라바투스, 아스페르길루스 데플렉투스, 아스페르길루스 피셔리아누스, 아스페르길루스 플라부스, 아스페르길루스 글라우쿠스, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 오크라세우스, 아스페르길루스 파라시티쿠스, 아스페르길루스 페니실로이데스, 아스페르길루스 레스트릭투스, 아스페르길루스 소자에, 아스페르길루스 타마리, 아스페르길루스 테레우스, 아스페르길루스 우스투스, 아스페르길루스 베르시콜로르;
속 페니실리움, 예컨대 페니실리움 아우란티오그리세움, 페니실리움 빌라이아에, 페니실리움 카멤베르티, 페니실리움 칸디둠, 페니실리움 크리소게눔, 페니실리움 클라비포르메, 페니실리움 콤뮨, 페니실리움 크루스토숨, 페니실리움 디기타툼, 페니실리움 엑스판숨, 페니실리움 푸니쿨로숨, 페니실리움 글라브룸, 페니실리움 글라우쿰, 페니실리움 이탈리쿰, 페니실리움 라쿠싸르미엔테이, 페니실리움 마르네페이, 페니실리움 푸르푸로게눔, 페니실리움 로쿠에포르티, 페니실리움 스톨로니페룸, 페니실리움 울라이엔세, 페니실리움 베루코숨, 페니실리움 비리디카툼;
속 클라비셉스, 예컨대 클라비셉스 아프리카나, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 히르텔라, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스클라비셉스 소르기, 클라비셉스 지자니아에.
속 파에실로미세스, 예컨대 파에실로미세스 디바리카투스
로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 푸미가투스, 페니실리움 크리소게눔, 파에실로미세스 디바리카투스, 페니실리움 로쿠에포르티로 이루어지는 군으로부터 선택된 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 보다 더 바람직하다.
본 발명의 추가의 실시양태는 시클로클라빈을 포함하고/하거나 생산하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체이고, 여기서 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 종 아스페르길루스 자포니쿠스 또는 파에실로미세스 디바리카투스의 것이 아니거나, 또는 종, 아스페르길루스 푸미가투스, 또는 클라비셉스 푸르푸레아의 것이다.
본 발명의 추가의 실시양태는 페스투클라빈을 포함하고/하거나 생산하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체이고, 여기서 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 종 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 플라부스, 아스페르길루스 테레우스, 클라비셉스 히르텔라, 클라비셉스 아프리카나, 페니실리움 크리소게눔, 및 파에실로미세스 디바리카투스의 것이 아니거나, 또는
종 아스페르길루스 테레우스, 발란시아 안드로포고니스, 발란시아 사이페리, 발란시아 오브텍타, 발란시아 필루아에포르미스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 히르텔라, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 지자니아에, 스파셀리아 에리오클로아에, 스파셀리아 텍센시스, 스파셀리아 로벨레시이, 네오티포디움 종 Lp1, 네오티포디움 코에노피알룸, 네오티포디움 롤리이, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 코릴로필룸, 페니실리움 펠루타눔 및 페리글란둘라 이포모에아에의 것이거나, 또는 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 푸시포르미스, 네오티포디움 롤리이 및 페리글란둘라 이포모에아에로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시양태는 아그로클라빈을 포함하고/하거나 생산하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체이고, 여기서 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 종 아스페르길루스 테레우스, 발란시아 안드로포고니스, 발란시아 사이페리, 발란시아 오브텍타, 발란시아 필루아에포르미스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 히르텔라, 클라비셉스 푸시포르미스, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 지자니아에, 스파셀리아 에리오클로아에, 스파셀리아 텍센시스, 스파셀리아 로벨레시이, 네오티포디움 종 Lp1, 네오티포디움 코에노피알룸, 네오티포디움 롤리이, 페니실리움 시트리눔, 페니실리움 코릴로필룸, 페니실리움 펠루타눔 및 페리글란둘라 이포모에아에의 것이 아니거나, 또는 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 푸시포르미스, 네오티포디움 롤리이 및 페리글란둘라 이포모에아에로 이루어지거나,
또는 종 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 플라부스, 아스페르길루스 테레우스, 클라비셉스 히르텔라, 클라비셉스 아프리카나, 페니실리움 크리소게눔, 및 파에실로미세스 디바리카투스의 것이다.
바람직하게는 상기 설명한 임의의 하나의 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 적어도 하나의 상향조절된 또는 하향조절된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasH, EasD, EasA 또는 EasG 활성은 다음 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드, 또는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드에 의해 제공된다:
a) 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 20, 31, 41, 53, 64, 75, 86, 및/또는 95에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
d) 서열 102, 122 또는 123, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 및/또는 136에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는
e) 서열 102, 122, 123, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 및/또는 136에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는
f) 엄격한 조건 하에 서열 102, 122 또는 123, 123, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 및/또는 136에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 및
g) 아스페르길루스 자포니쿠스 또는 파에실로미세스 디바리카투스로부터 얻을 수 있는, a) 내지 f) 중의 적어도 하나에 따른 폴리펩티드.
표 9 내지 14는 각각의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasA, EasG, EasD 또는 EasH 활성을 갖는 폴리펩티드 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 표에 언급된 공급원 유기체에 의해 포함되는 나열된 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasA, EasG, EasD 또는 EasH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 조합의 예시적인 비-제한적인 예를 나열한다. 표 내의 각각의 X는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에 의해 포함되는 1개 카피의 재조합 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
<표 9>
Figure pct00036
<표 10>
Figure pct00037
<표 11>
Figure pct00038
<표 12>
Figure pct00039
<표 13>
Figure pct00040
<표 14>
Figure pct00041
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 표 9 내지 14에 나열된 것과 유사한 추가의 실시양태를 생성할 수 있을 것이다.
특정 바람직한 실시양태는 효모, 바람직하게는 에스. 세레비지아에, 및 시클로클라빈의 생산을 위한 재조합 미생물로서의 그의 용도이고, 여기서 효모, 바람직하게는 에스. 세레비지아에는 다음을 포함한다:
a) 서열 8 및/또는 95에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 8 및/또는 95에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 156에 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 더 바람직하게는 서열 8 및/또는 95에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 8에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
b) 서열 2, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및/또는 40에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 2, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및/또는 40에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 148, 149 및 150에 적어도 95%, 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 티로신을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasA 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
c) 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 181, 92, 93 및/또는 94에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 181, 92, 93 및/또는 94에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 183에 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 181, 92, 93 및/또는 94에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 10에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
d) 서열 4, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 및/또는 63에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 4, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 및/또는 63에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 152에 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 4, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 및/또는 63에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 7에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasD 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
e) 서열 3 또는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및/또는 52에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 3 또는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및/또는 52에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 192에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 3 또는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및/또는 52에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 6에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasC 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
f) 서열 5, 64, 175, 66, 67, 68, 69, 176, 71, 177, 73 및/또는 178에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 5, 64, 175, 66, 67, 68, 69, 176, 71, 177, 73 및/또는 178에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 191에 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 73% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 5, 64, 175, 66, 67, 68, 69, 176, 71, 177, 73 및/또는 178에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 5에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasE 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
g) 서열 6, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 및/또는 85에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 6, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 및/또는 85에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 154에 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 79% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 6, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 및/또는 85에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 4에 제시된 정렬에 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
h) 서열 1, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및/또는 28에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 1, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및/또는 28에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 190에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 1, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및/또는 28에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 3에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, DmaW 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트.
바람직하게는, EasE 활성을 제공하는 폴리펩티드는 효모에서 소포체로의 분류 신호로 기능할 수 있는 N-말단 서열을 갖는다. 재조합 미생물이 에스. 세레비지아에인 경우에, EasE 활성을 제공하는 폴리펩티드는 바람직하게는 에스. 세레비지아에에서 소포체로의 분류 신호로 기능할 수 있는 N-말단 서열을 포함할 것이다.
바람직하게는, DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제 및/또는 EasG 활성을 제공하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다. 이들 효모의 바람직한 변이체는 표 12에 기재된 실시양태이다.
이들 효모의 추가의 변이체는 아그로클라빈, 페스투클라빈을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 효모는 바람직하게는 EasH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하지 않을 것이다.
이들 효모의 바람직한 변이체는 표 13 및 14에 기재된 실시양태이다. 이들 효모의 추가의 변이체는 카노클라빈 I을 생산하기 위해 사용될 수 있지만, EasH, EasA, EasG 또는 EasD 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하지 않을 것이다.
이들 효모의 추가의 변이체는 EasH, EasA, EasG 및 EasD 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하지만, DmaW, EasF, EasE 또는 EasC 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트는 포함하지 않을 것이다. 이들 효모는 카노클라빈 I이 제공될 때 시클로클라빈을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
이들 효모의 추가의 변이체는 EasA, EasG 및 EasD 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하지만, DmaW, EasF, EasE, EasC 또는 EasH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트는 포함하지 않을 것이다. 이들 효모는 카노클라빈 I이 제공될 때 페스투클라빈 또는 아그로클라빈을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
바람직한 특정 실시양태는 효모, 바람직하게는 에스. 세레비지아에, 및 시클로클라빈의 생산을 위한 재조합 미생물로서의 그의 용도이고, 여기서 효모, 바람직하게는 에스. 세레비지아에는 다음을 포함한다:
a) 서열 8 및/또는 95에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 8 및/또는 95에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 156에 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 더 바람직하게는 서열 8 및/또는 95에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 8에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
b) 서열 2, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및/또는 40에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 2, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및/또는 40에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 148, 149 및 150에 적어도 95%, 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 티로신을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasA 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
c) 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 181, 92, 93 및/또는 94에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 181, 92, 93 및/또는 94에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 183에 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 181, 92, 93 및/또는 94에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 10에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
d) 서열 4, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 및/또는 63에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 4, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 및/또는 63에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 152에 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 4, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 및/또는 63에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 7에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasD 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
e) 서열 3 또는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및/또는 52에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 3 또는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및/또는 52에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 192에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 3 또는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및/또는 52에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 6에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasC 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 2개의 발현 카세트,
f) 서열 5, 64, 175, 66, 67, 68, 69, 176, 71, 177, 73 및/또는 178에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 5, 64, 175, 66, 67, 68, 69, 176, 71, 177, 73 및/또는 178에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 191에 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 73% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 5, 64, 175, 66, 67, 68, 69, 176, 71, 177, 73 및/또는 178에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 5에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasE 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 2개의 발현 카세트,
g) 서열 6, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 및/또는 85에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 6, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 및/또는 85에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 154에 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 79% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 6, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 및/또는 85에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 4에 제시된 정렬에 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
h) 서열 1, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및/또는 28에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 1, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및/또는 28에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 190에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 1, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및/또는 28에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 3에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, DmaW 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트.
바람직하게는, 효모는 다음을 포함한다:
a) 서열 28에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 28에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 190에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 28에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 3에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, DmaW 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트 및/또는
b) 서열 76에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 76에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 154에 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 79% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 76에 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 4에 제시된 정렬에 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트.
이들 효모의 추가의 변이체는 아그로클라빈, 페스투클라빈을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이들 효모는 바람직하게는 EasH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하지 않을 것이다.
이들 효모의 추가의 변이체는 카노클라빈 I을 생산하기 위해 사용될 수 있지만, EasH, EasA, EasG 또는 EasD 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하지 않을 것이다.
본원에 개시된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각-알칼로이드 생산자 유기체는 관련 기술 분야에서 사용되는 표준 형질전환 및/또는 돌연변이 프로토콜을 통해 생산될 수 있다. 각각의 종에 가장 효율적인 방법은 문헌, 예를 들어 [Turgeon (2010) Molecular and cell biology methods for fungi, p3-9], [Koushki, MM et al., (2011), AFRICAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY Vol.10 (41): p7939-7948], [Coyle et al. (2010) Appl Environ Microbiol 76:3898-3903], [Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 13. Eds Ausubel F.M. et al. Wiley & Sons, U.K.], 및 [Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cloning Systems. Volume 3. Edited by Birren B, Green ED, Klapholz S, Myers RM, Riethman H, Roskams J. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1999:297-565]에서 쉽게 이용가능하다.
이들 방법은 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 또는 EasG 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 수반한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 관심있는 미생물의 이미 존재하는 발현 카세트에 통합되도록 표적화될 수 있거나 또는 각각의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 전사 및 번역을 가능하게 하는 재조합 발현 카세트에 포함될 수 있다. 발현 카세트는 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성 제공 폴리펩티드 중 적어도 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 종결인자를 포함한다. 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 각각의 미생물의 코돈 사용 빈도에 적응될 것이다. 특정 미생물에 사용하기 적합한 프로모터, 종결인자 및 코돈 사용 빈도에 대한 정보는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
실시예에 나열된 것에 추가로 효모, 특히 사카로미세스 세레비지아에에 대해 적합한 구성적 프로모터는 예를 들어 trpC, gpdA, tub2 및 Tef1 프로모터이다.
효모, 특히 사카로미세스 세레비지아에에 대해 적합한 유도가능 프로모터는 예를 들어 Gal1, Gal10, Cup1, Pho5, 및 Met25 프로모터이다.
추가의 프로모터 및 종결인자, 및 클로닝 전략은 예를 들어, 문헌 [Shao et al. (2009) Nucleic Acids Research, Vol. 37, No. 2 e16 (10 pages)]에 설명되어 있다.
상기 설명한 발현 카세트는, 형질전환을 위해 사용될 수 있거나 또는 하나의 게놈 유전자좌 내의 또는 유전자좌에 근접한 몇몇 구축물의 표적화된 통합에 의해 생성될 수 있는 보다 큰 폴리뉴클레오티드에 의해 포함될 수 있거나 포함되지 않을 수 있다. 상기 보다 큰 폴리뉴클레오티드는 동일한 활성을 제공하는 하나 이상의 폴리펩티드를 위한 발현 카세트를 포함할 수 있거나 또는 상이한 활성을 제공하는 하나 이상의 폴리펩티드를 위한 발현 카세트를 포함할 수 있거나, 또는 동일한 활성을 제공하는 하나 이상의 폴리펩티드를 위한 발현 카세트를 포함하고 상이한 활성을 제공하는 하나 이상의 폴리펩티드를 위한 발현 카세트를 포함할 수 있다. 별법으로 또는 상기 설명한 방법 및 폴리뉴클레오티드에 추가로, 재조합 미생물은 수 회 형질전환될 수 있거나, 몇몇 상이한 폴리뉴클레오티드로 동시에 형질전환되어 재조합 미생물의 게놈 내에 2개 이상의 유전자좌에서 발현 카세트를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는 상기 실시양태의 임의의 하나에서 설명된 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 상기 실시양태의 임의의 하나에서 설명된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 발현 카세트 및 적어도 하나의 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트를 포함하는, 발현 및 형질전환 벡터를 포함하는 벡터이다.
상기 임의의 실시양태에서 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 또한 본 발명에 포함되는, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드, I 및 카노클라빈 중의 적어도 하나의 생산을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태는
a) 상기 임의의 하나의 실시양태에서 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에서 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산을 허용하는 조건 하에 상기 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 배양하는 단계; 및
b) 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I을 상기 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 및/또는 배양 배지로부터 얻는 단계
를 포함하는, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산 방법을 포함한다.
본 발명의 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 표면-배양, 침수-배양, 고체-상태 배양, 부생 배양, 진탕 플라스크 배양 또는 의도된 목적에 맞는 임의의 다른 방식으로 성장시킬 수 있다. 바람직하게는, 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 침수-배양으로 배양된다.
재조합 미생물 및 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에 대한 성장 조건 및 성장 배지는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있고, 예를 들어 비-재조합 미생물 및 천연 맥각 생산자 유기체의 배양을 위해 사용되는 조건이 적용될 수 있다. 상기 프로토콜 및 방법은 예를 들어 문헌 [Bacon CW (1985) Mycologia Vol 77:418-123], [Schulz B, et al. (1993) Mycol Res 97:1447-1450], [Banks, et al. (1974) Journal of General Microbiology Vol 82: p345-361], [Flieger, M. et al. (1997) Folia Microbiologica Vol. 42: p3-30], [Pazoutova, S. et al. (1981) Journal of Natural Products Vol. 44: p225-235]에 개시되어 있다.
천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 배양 방법 및 이에 의한 맥각 알칼로이드의 생산을 유도하거나 향상시키는 방법은 예를 들어 문헌 [Keller, U. and Tudzynski, P. (2002) in: Osiewacz, H.D. (Ed.), The Mycota, Vol. X. "Industrial Applications". Springer, Berlin, pp. 157-181], [Haarmann, T., et al., (2005), Phytochemistry Vol. 66, p1312-1320], 또는 [Furuta, T et al. (1982) Agricultural and Biological Chemistry, Vol 46 (7): p1921-1922], [Tudzynski P. et al., (2001) Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 57 (5-6) p593-605], [Kantorova, M., et al., (2002) Journal of Natural Products, Vol. 65 (7): p1039-1040], [Kozlovsky, A. G.; (2010) Applied Biochemistry and Microbiology, Vol. 46 (5): p525-529], [Kozlovsky, A. G.; (1999) Applied Biochemistry and Microbiology Vol. 35 (5): p477-485], [Narayan V. and Rao K.K., (1982) Biotechnology Letters Vol. 4 (3): p193-196], [Rehacek, Z. et al., (1970) Folia Microbiologica Vol 15 (3): p210-213], [Narayan V. and Rao K.K., (1982) Biotechnology Letters Vol. 4 (3): p193-196], [Rehacek, Z. et al., (1971) Folia Microbiologica Vol 15 (3): p35-40], [Janardhanan K. and Husain A. (1990) Indian Journal of Experimental Biology, Vol. 28(11): p 1054-1057], [Hernandesz M. et al., (1992) Letters in Applied Microbiology Vol. 15(4):p 156-159], [Hernandesz M. et al., (1993) Process Biochemistry Vol. 28(1): p23-27], [Sarkisova M. et al. (1991) Antibiotiki I Khimioperapiya Vol 36(12): p8-10], [Samdani G et al., (1998) Asian Journal of Chemistry Vol.10(2): p373-374]에 개시되어 있다.
예를 들어, 클라비셉스 푸르푸레아에 의한 맥각 알칼로이드의 생산은 바람직하게는 높은 삼투값 및 낮은 인산염 수준을 갖는 성장 배지에 트립토판을 전구체 및 유도자로서 첨가함으로써 개선될 수 있다.
또한, 감염된 호밀 이삭에서 성장한 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 푸시포르미스 또는 클라비셉스 파스팔리에 의한 맥각 알칼로이드의 생산은 맥각 알칼로이드 전구체를 첨가함으로써 개선될 수 있다.
맥각 알칼로이드의 생산을 위해 클라비셉스 푸르푸레아를 사용하는 방법에 대한 추가의 지침은 문헌 [Hulvova H. et al. "Parasitic fungus Claviceps as a source for biotechnological production of ergot alkaloids" Biotechnology Advances 31 (2013) 79-89]에서 볼 수 있다.
재조합 미생물 및 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 예를 들어 배양 배지를 위한 탄소원으로서 글루코스, 수크로스, 꿀, 덱스트린, 전분, 글리세롤, 당밀, 동물 또는 식물성 오일 등을 사용하여 배양될 수 있다. 또한, 콩가루, 맥아, 옥수수 침지액, 폐 목화씨, 고기 추출물, 폴리펩톤, 맥아 추출물, 효모 추출물, 황산암모늄, 질산나트륨, 우레아 등이 질소원으로 사용될 수 있다. 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산 (인산수소이칼륨 등), 황산 (황산마그네슘 등) 및 필요한 다른 이온을 생산할 수 있는 무기염의 첨가도 효과적이다. 또한, 다양한 비타민, 예컨대 티아민 (티아민 염산염 등), 아미노산, 예컨대 글루타민 (나트륨 글루타메이트 등), 아스파라긴 (DL-아스파라긴 등), 미량 영양소, 예컨대 뉴클레오티드 등, 및 선택 약물, 예컨대 항생제 등이 또한 필요한 만큼 첨가될 수 있다. 또한, 유기 물질 및 무기 물질은 유기체의 성장을 돕고 맥각 알칼로이드의 생산, 특히 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드, 및/또는 카노클라빈 I의 생산을 촉진하기 위해 적절하게 첨가될 수 있다. 배양 배지의 pH는 예를 들어 대략 pH 5.5 내지 pH 8이다. 배양은 호기 조건 하의 고체 배양 방법, 진탕 배양 방법, 통기 교반 배양 방법 또는 심부 호기 배양 방법과 같은 방법을 사용하여 수행할 수 있지만, 심부 호기 배양 방법이 가장 적합하다. 배양에 적절한 온도는 10℃ 내지 40℃이지만, 많은 경우에 성장은 22℃ 내지 30℃에서 발생한다. 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드, 및/또는 카노클라빈 I의 생산은 배양 배지 및 배양 조건, 또는 사용되는 숙주에 따라 상이하지만, 임의의 배양 방법을 사용하여 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I의 생산의 축적은 일반적으로 2 내지 10일 내에 최대치에 도달하고, 상당히 더 긴 시간, 예를 들어 15, 20, 25, 30, 40, 50일 또는 심지어 그 초과의 시간 동안 진행될 수 있다. 배양은 배양액 내의 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I의 생산량이 그의 최고 수준에 도달할 때 중지하고, 표적 물질은 배양액으로부터 단리되고, 배양 물질로부터 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I의 생성물을 단리하기 위해 정제된다. 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I의 생성물을 단리하기 위해 사용되는 표적 물질은 임의의 유용한 물질, 예를 들어 전체 유기체일 수 있는 유기체 자체 또는 단지 유기체 또는 유기체의 임의의 다른 부분에 의해 생산된 포자, 또는 유기체를 배양하기 위해 사용된 배양 배지일 수 있다. 배양 조건은 예를 들어 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드, 및/또는 카노클라빈 I의 하나 이상의 전구체를 제공함으로써 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드, 및/또는 카노클라빈 I의 생산을 향상시키기 위해 조정될 수 있고, 상기 전구체는 바람직하게는 IPP, 트립토판, DMAPP, DMAT, Me-DMAT 및 카노클라빈 I의 군으로부터 선택된다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는
a) 상기 임의의 하나의 실시양태에서 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에서 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산을 허용하는 조건 하에 상기 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 배양하는 단계;
b) 상기 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에게 IPP, 트립토판, DMAPP, DMAT, Me-DMAT 또는 카노클라빈 I의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 배양 배지를 통해 제공하는 단계, 및
c) 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 및/또는 배양 배지로부터 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나를 얻는 단계
를 포함하는, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산 방법이다.
상기 설명한 방법은 바람직하게는 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 얻기 위해 사용된다. 바람직하게는, 방법은 시클로클라빈을 얻기 위해 사용된다.
그러나, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드, 카노클라빈 I을 얻는 방법 단계는 특히 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 피로클라빈, 푸미클라빈 A 또는 C, 또는 에르고타민과 같은 다른 맥각 알칼로이드의 생산을 위해 추출물로서 적어도 하나의 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I을 사용하는 추가의 유전자를 포함하는 경우에, 생략될 수도 있다. 이어서, 상기 화합물을 유기체 또는 배양 배지로부터 얻는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 아스페르길루스 푸미가투스인 경우에, 푸미가클라빈 B, 푸미가클라빈 A 또는 푸미가클라빈과 같은 맥각 알칼로이드를 생산하고 얻는 것이 가능할 것이다. 또한, 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 클라비셉스 종, 바람직하게는 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 파스팔리 또는 클라비셉스 아프리카나인 경우에, 엘리모클라빈, 파스팔산, 리세르그산, 에르고펩탐 및 에르고펩틴의 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 생산하고 얻는 것이 가능할 것이다. 하나 이상의 맥각 알칼로이드를 생산하고 그 생산을 위한 전구체로서 적어도 하나의 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I을 이용하는 다른 재조합 천연 맥각 생산자 유기체에게 동일한 원리가 적용될 것이다. 바람직하게는, 천연 맥각 알칼로이드 생산자는 각각의 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 생성하기 위해 사용된 동일한 종 및 균주에 비해 적어도 하나의 상기 다른 맥각 알칼로이드를 보다 다량으로, 보다 고속으로 생산할 것이다. 보다 고속 또는 보다 다량은 동일한 조건 하에서 배양될 때 각각의 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 생성하기 위해 사용된 동일한 종 및 균주에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 100% 더 많거나 더 빠름을 의미한다.
배양 조건은 사용되는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에 대해 상이할 수 있다. 효모, 특히 사카로미세스 세레비지아에의 적합한 성장 조건은 실시예에서 제시된다. 그러나, 상기 성장 조건은 추가로 조정될 수 있다. 예를 들어, 성장 온도는 유기체의 성장을 느리게 하거나 빠르게 하기 위해 조정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 적어도 하나의 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I의 생산 방법을 포함하고, 여기서 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 10℃ 내지 40℃, 바람직하게는 15℃ 내지 35℃, 보다 바람직하게는 18℃ 내지 32℃, 보다 더 바람직하게는 20℃ 내지 30℃의 온도에서 배양되거나 또는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 10℃ 내지 32℃, 13℃ 내지 32℃, 15℃ 내지 32℃, 16℃ 내지 32℃, 17℃ 내지 32℃, 18℃ 내지 32℃, 19℃ 내지 32℃, 20℃ 내지 32℃, 15℃ 내지 31℃, 15℃ 내지 30℃, 15℃ 내지 29℃, 15℃ 내지 28℃, 15℃ 내지 27℃, 15℃ 내지 26℃, 15℃ 내지 25℃의 온도에서 배양되거나, 또는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 먼저 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 25℃ 내지 35℃의 온도에서, 이어서 10℃ 내지 25℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃의 온도에서 배양되거나, 또는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 먼저 10℃ 내지 25℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃의 온도에서, 이어서 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 25℃ 내지 35℃의 온도에서 배양된다.
대체로, 성장 조건은 각각의 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 선호도에 따라 선택되지만, 그로부터 벗어나는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I의 생산을 위해 15℃ 내지 25℃, 바람직하게는 20℃의 온도에서 에스. 세레비지아에를 성장시키는 것이 유리할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 각각의 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 예를 들어 에스. 세레비지아에의 성장 조건은 성장을 늦추도록 선택된다. 이것은 예를 들어 글리세롤, 트리메틸아민 N-옥시드 (TMAO) 또는 프롤린을 성장 배지에, 예를 들어, 글리세롤을 2.5%, 5% 또는 10%의 농도로, TMAO를 250 mM 또는 500 mM의 농도로, 또는 프롤린을 200 mM의 농도로 첨가함으로써 달성할 수 있다.
추가의 바람직한 실시양태는 높은 세포 밀도를 생성하고/하거나 발효를 연장하기 위해 사용될 수 있는 유가식 배양 조건을 사용한다.
본원에서 설명되는 방법에 의해 생산된 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I은 바람직하게는 추출을 통해 얻지만, 원칙적으로 다른 방법을 통해서도 얻을 수 있다.
한 실시양태에서, 추출은 에틸 아세테이트 (EA), tert-부틸 메틸에테르 (TBME), 클로로포름 (CHCl3) 및 디-클로로메탄 (DCM)의 군으로부터 선택된 화합물을 사용한 추출을 통해 수행한다.
바람직하게는, 추출 방법은 pH=10에서 에틸 아세테이트를 사용한 액체/액체 추출, 보다 바람직하게는 pH=10에서 에틸 아세테이트를 사용한 액체/액체 추출을 포함하고, 여기서 pH는 NaOH로 조정된다.
그러나, 적어도 하나의 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I을, 바람직하게는 pH=3의 HLB 수지, 바람직하게는 pH=3의 디아이온 수지, 바람직하게는 pH=3의 앰벌라이트 1180 수지, 바람직하게는 pH=10의 앰벌라이트 1180 수지, 바람직하게는 pH=3의 앰벌라이트 16N 수지 또는 바람직하게는 pH=10의 앰벌라이트 16N 수지의 군으로부터 선택되는 실리카계 수지 물질을 사용한 고상 추출을 사용한 추출을 포함하는 추출 방법을 통해 얻는 것도 가능하다.
시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I, 또는 다른 클라빈-유형 알칼로이드 또는 다른 맥각 알칼로이드를 얻기 위한 적합한 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 시클로클라빈을 얻는 방법은 문헌 [Furuta et al., (1982), Agricultural and Biological Chemistry Vol. 46 (7): p1921-1922] 또는 [Stauffacher D. et al. (1969) Tetrahedron Vol.25: p5879-5887]에 개시되어 있다.
맥각 알칼로이드의 분석 방법은 예를 들어, 문헌 [Flieger, M. et al., (1997) Folia Microbiolgica, Vol. 42(1) p 3-29] 및 [Halada, P. et al., (1998) Chemicke Listy Vol.92(7) p538-547]에 설명되어 있다.
본 발명은 적어도 하나의 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데하이드 및 카노클라빈 I의 생산을 위한 또는 상기 설명한 임의의 하나의 방법에서 상기 임의의 하나의 실시양태에서 설명된 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터의 용도를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태는 상기 설명한 임의의 하나의 방법에 의해 생산된 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I, 및 본 발명의 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 배양에 의해 생산된, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배양 배지를 포함한다.
바람직하게는, 배양 배지는 시클로클라빈을 포함하지만, 적어도 하나의 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I은 포함하지 않거나 비교적 낮은 함량으로 포함한다. 동등하게 바람직하게는, 배양 배지는 페스투클라빈을 포함하지만, 적어도 하나의 시클로클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I은 포함하지 않거나 비교적 낮은 함량으로 포함한다. 동등하게 바람직하게는, 배양 배지는 아그로클라빈을 포함하지만, 적어도 하나의 시클로클라빈, 페스투클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I은 포함하지 않거나 비교적 낮은 함량으로 포함한다. 또한 동등하게 바람직하게는, 배양 배지는 카노클라빈 알데히드를 포함하지만, 적어도 하나의 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈 및 카노클라빈 I은 포함하지 않거나 비교적 낮은 함량으로 포함한다. 또한 동등하게 바람직하게는, 배양 배지는 카노클라빈 I을 포함하지만, 적어도 하나의 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈 및 카노클라빈 알데히드는 포함하지 않거나 비교적 낮은 함량으로 포함한다.
비교적 낮은 함량은 문제의 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체의 각각의 대조군 유기체를 배양함으로써 생산된 배양 배지 내의 함량과 비교할 때 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 50%, 60%, 70%, 80%, 100% 더 적은 각각의 화합물의 함량을 의미한다.
본 발명은 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 생성하기 위해 사용될 수 있는, 파에실로미세스 디바리카투스로부터 단리된 폴리뉴클레오티드 및 그의 서열 변이체를 추가로 포함한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다:
a) 서열 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 또는 136에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 서열;
b) 서열 20, 31, 41, 53, 64, 75, 86, 95 또는 180에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
c) 서열 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 또는 136에 제시된 핵산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
d) DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖고 서열 20, 31, 41, 53, 64, 75, 86, 95 또는 180에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열; 및
e) 엄격한 조건 하에 a) 내지 d) 중 임의의 하나에 혼성화할 수 있고 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열.
본 발명의 추가의 실시양태는 상기 설명한 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 폴리펩티드 및 그의 서열 변이체를 포함한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다:
a) 서열 175, 176, 177 또는 178에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
b) EasE 활성을 갖고 서열 175, 176, 177 또는 178에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
c) 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및
d) DmaW 활성을 갖고 서열 181에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열.
파에실로미세스 디바리카투스로부터 단리된 상기 폴리뉴클레오티드 및 그의 서열 변이체 및 EasE 또는 DmaW 활성을 갖고 서열 175, 176, 177, 178, 또는 181에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 본원에서 설명되는 임의의 하나의 실시양태에서 설명되는 임의의 하나의 폴리뉴클레오티드와, 바람직하게는 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 조합될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 코딩되는 폴리펩티드의 전사 및 번역을 위한 발현 카세트를 생성하기 위해 프로모터 및 종결인자 서열과 추가로 작동가능하게 연결될 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 및 발현 카세트는 본 발명의 재조합 미생물 또는 형질전환 및/또는 발현 벡터 내로 도입되고, 예를 들어 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 생성하기 위해 또는 추가의 정제를 위해, 예를 들어 상기 폴리펩티드를 인식하는 항체를 생산하거나 또는 상기 폴리펩티드의 단백질 결정을 생산하기 위해, 또는 시험관내 시험 및 생산 방법을 위해 폴리펩티드를 사용하기 위해 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖는 코딩되는 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 원핵 및 진핵 숙주 세포를 포함한다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 진균 세포, 또는 효모 세포이다. 본 발명의 추가의 실시양태는 a) DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖고 서열 20, 31, 41, 53, 64, 75, 86 또는 95에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 대한 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포를 배양하거나 또는 폴리펩티드의 생산을 허용하는 조건 하에 파에실로미세스 디바리카투스 세포를 배양하는 단계; 및 b) 단계 a)의 숙주 세포 또는 파에실로미세스 디바리카투스 세포로부터 폴리펩티드를 얻는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법이다.
또한, a) 파에실로미세스 디바리카투스 세포를 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I의 생산을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 b) 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나를 파에실로미세스 디바리카투스 세포 및/또는 배양 배지로부터 얻는 단계를 포함하는, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I, 또는 이들의 조합물의 제조를 위한 방법이 본 발명에 포함된다.
본 발명의 다른 부분은 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물의 제조를 위한 또는 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 전구체로서 사용함으로써 생산되는 적어도 하나의 맥각 알칼로이드의 제조를 위한,
a) 서열 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 또는 136에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 서열;
b) 서열 20, 31, 41, 53, 64, 75, 86 또는 95에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
c) 서열 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 또는 136에 제시된 핵산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
d) DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖고 서열 20, 31, 41, 53, 64, 75, 86 또는 95에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열; 및
e) 엄격한 조건 하에 a) 내지 d) 중 임의의 하나에 혼성화할 수 있고 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 용도, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 숙주 세포 또는 파에실로미세스 디바리카투스 세포의 용도를 포함한다.
본 발명의 다른 부분은 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물의 제조를 위한 또는 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 전구체로서 사용하여 생산되는 적어도 하나의 맥각 알칼로이드의 제조를 위한,
a) 서열 175, 176, 177 또는 178에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
b) EasE 활성을 갖고, 서열 175, 176, 177 또는 178에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
c) 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및
d) DmaW 활성을 갖고 서열 181에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열
로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 용도, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 바람직하게는 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 파에실로미세스 디바리카투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 아프리카누스(Claviceps africanus) 또는 효모 세포의 용도를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드를 발현하는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체이다:
a) 서열 175, 176, 177 또는 178에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;
b) EasE 활성을 갖고 서열 175, 176, 177 또는 178에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;
c) 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및
d) DmaW 활성을 갖고 서열 181에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
바람직하게는, 상기 폴리펩티드를 발현하는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체는 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 푸미가투스, 파에실로미세스 디바리카투스, 클라비셉스 푸르푸레아, 클라비셉스 파스팔리, 클라비셉스 아프리카누스 또는 효모 세포이다.
실시예
실시예 1: 빵 효모 (사카로미세스 세레비지아에)에서 시클로클라빈의 생산.
물질 및 방법:
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
실시예 1에서 사용한 유전자를 표 15에 나열한다:
<표 15>
Figure pct00042
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자를 제조하였다. 유전자는 아미노산 서열 (서열 102-108) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. 유전자를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 프로모터 및 종결인자를 함유하는 효모 발현 카세트 (서열 110 및 111) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 110 및 111)는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
유전자 발현 카세트를 1 또는 2개의 카세트를 지정된 통합 벡터 (서열 114-118) 내로 서브-클로닝하기 위해 사용하였고, 이것은 또한 효모 선택가능 마커 유전자를 함유하였다. 2개의 발현 카세트의 경우에, 클로닝의 배향은 헤드 투 헤드 (head to head)였고, 이것은 프로모터가 반대 방향으로 전사를 허용할 것임을 의미한다. 마커 및 발현 카세트(들)은 숙주의 게놈 DNA에 상동성을 갖는 서열 (서열 114-118)이 측면에 접해있었다. 상동성 서열이 측면에 접하는, 발현 카세트(들) 및 선택 마커를 포함하는 전체 통합 구축물을, 통합 벡터를 NotI 및 SbfI 제한 효소로 소화시킴으로써 pUC18 기반 백본으로부터 방출시키고, 효모의 형질전환을 위해 사용하였다. 표준 리튬 아세테이트 형질전환 프로토콜을 사용하였다 (Current Protocols; Chapter 13). 정확한 통합을 PCR에 의해 확인하고, 문헌 [Sauer, 1987]에 설명된 바와 같이 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드로 세포를 형질전환시킨 후에 선택 마커를 제거하였다 (절제하였다). 통합을 위한 표적 부위는 문헌 [Flagfeldt, 2009]에 설명되어 있다. 통합 벡터 및 그들의 통합 구축물의 서열 번호를 표 16a 및 표 16b에 나열한다.
<표 16a>
Figure pct00043
<표 16b>
Figure pct00044
경로 어셈블리 :
완전 시클로클라빈 경로, 또는 유전자 EasH가 결여된 경로를 EYS1456 내로 통합함으로써 2개의 효모 균주를 제조하였다. EYS1849는 pEVE2294, pEVE2312, pEVE2343, 및 pEVE2344로부터 구축물을 통합함으로써 제조한 한편 (표 16a 및 16b), EYS1851은 pEVE2294, pEVE2312, pEVE2342, 및 pEVE2344로부터 구축물을 통합함으로써 제조하였다 (표 16a 및 16b). 따라서, 생성되는 균주는 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
EYS1849: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE, AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, 및 AjEasH.
EYS1851: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE, AjEasC, AjEasD, AjEasA, 및 AjEasG.
성장 조건 :
조작된 효모 균주 EYS1849 및 EYS1851을 2% 글루코스를 함유하는 표준 SC 브로쓰 (broth) (포미디엄 (ForMedium, 영국 헌스탄톤)) 내에서 성장시켰다. 배양액을 25 ml 배지를 담은 250 ml 진탕 플라스크 내에서 20℃에서 72시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하 (Bruker Daltonik GmbH), 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티(Waters Acquity)™ 초고성능 LC, 워터스 (Waters), 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 (Bridged) 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 17>
Figure pct00045
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인 (Gain): 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 (Nebulizer) 방식: 가열, 파워 (Power) 수준: 80%, 드리프트 (Drift) 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋(End Plate Offset): -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 (Scan) 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
예비 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 상청액을 10 M NaOH로 pH=10으로 조정하고, 동일 부피의 에틸 아세테이트를 사용하는 액체/액체 추출에 의해 추출하였다. 조 추출물을 진공 하에 건조시키고, 디메틸 술폭시드 (DMSO)로 재구성하여 100 mg/mL의 농도를 얻었다. 이어서, 예비 HPLC 시스템 (워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 상에서 정제하였다. 정지상: 컬럼은 XBridge™ 예비 C18, 5 ㎛, 19x250 mm 컬럼이었다.
액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 트리플루오로아세트산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 트리플루오로아세트산. 진행 조건:
<표 18>
Figure pct00046
ESI 파라미터: 전원 전압: 모세관: 3.00 kV. 콘(Cone): 30 V. 추출기: 3 V. RF 렌즈: 0.1 V.
전원 온도: 150℃. 탈용매화 온도: 350℃.
결과 :
EYS1849, EYS1851, 및 EYS1456을 상기 설명한 바와 같이 20℃에서 성장시켰다. 상청액을 LC-MS에 의해 분석하였고, EYS1849의 예상된 질량의 시클로클라빈 (m/z = 239.1543+/-0.01 Da)의 추출된 이온 크로마토그램은 5.5 min(+/-0.2)의 체류 시간을 갖는 피크를 보여주었고, 이것은 균주 EYS1851 (또는 EYS1456, 데이타를 제시하지 않음)에서 보이지 않았다. 또 다른 눈에 띄는 피크는 5.91 min의 체류 시간에서 m/z=241.1699+/-0.01 Da의 질량을 갖는 EYS1849 및 EYS1851 내에 존재하였다 (도 11 참조).
체류 시간 5.49 min에서 피크를 상기 설명한 바와 같이 정제하고, LC-MS 및 NMR 분광법에 의해 분석하고, 구조를 해석하였고, 이것은 화합물의 정체가 시클로클라빈임을 확인하였다.
EYS1849의 상청액 내에서 5.49 min에서 용리된 정제된 화합물의 NMR 데이타:
Figure pct00047
실시예 2: 에이. 푸미가투스 EasF , 및 에이. 자포니쿠스 DmaW _ altC , EasE 및 EasC를 사용한 빵 효모 (사카로미세스 세레비지아에) 내에서 카노클라빈 I의 생산 .
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
유전자 서열 :
실시예 2에서 사용한 유전자를 표 19에 나열한다.
<표 19>
Figure pct00048
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자를 제조하였다. 유전자는 아미노산 서열 (서열 102, 107, 106 및 104) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. 유전자를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 프로모터 및 종결인자를 함유하는 효모 발현 카세트 (서열 110 및 111) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 110 및 111)는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
AjDmaW_altC (서열 102) 및 AfEasF (서열 107)을 함유하는 유전자 발현 카세트를 통합 벡터 pEVE2294 (서열 114) 내로 서브-클로닝하기 위해 사용하였고, 이것은 또한 효모 선택가능 마커 유전자를 함유하였다 (표 16a 및 16b 참조). 2개의 발현 카세트는 헤드 투 헤드 배향을 가졌고, 이것은 프로모터가 반대 방향으로 전사를 허용할 것임을 의미한다. 마커 및 발현 카세트는 숙주의 게놈 DNA에 상동성을 갖는 서열이 측면에 접해있었다. 게놈 상동성 서열이 측면에 접하는, 발현 카세트 및 선택 마커를 포함하는 전체 통합 구축물을, NotI 및 SbfI 제한 효소로 소화시킴으로써 pUC18 기반 백본으로부터 방출시키고, 효모의 형질전환을 위해 사용하였다. 표준 리튬 아세테이트 형질전환 프로토콜을 사용하였다 (Current Protocols; Chapter 13). 정확한 통합을 PCR에 의해 확인하고, 문헌 [Sauer, 1987]에 설명된 바와 같이 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드로 세포를 형질전환시킨 후에 선택 마커를 제거하였다 (절제하였다). 통합을 위한 표적 부위는 문헌 [Flagfeldt, 2009]에 설명되어 있다. 통합 구축물 및 서열 번호를 표 16a 및 16b에 나열한다 (실시예 1 참조).
유전자 AjEasE (서열 106) 및 AjEasC (서열 104)를 PA 및 GC 발현 카세트 (각각 서열 110 및 111) 내로 클로닝한 후, 각각 효모 벡터 pRS315 및 pRS313의 백본 내로 삽입하여, 벡터 pCCL254 및 pCCL256을 제공하였다. pRS 벡터 pRS315 및 pRS313은 이들 원래의 벡터의 Pvu II 부위들 사이에 멀티 클로닝 부위 링커 (서열 113)를 삽입하여, 상기 링커의 AscI 부위 내로 발현 카세트의 클로닝을 허용함으로써 이미 변형되었다. pRS 벡터는 문헌 [Sikorski, 1989]에 설명되어 있다.
경로 어셈블리 :
EYS1456 내로, 카노클라빈 I에 대한 생합성 경로를 도입함으로써 효모 균주를 제조하였다. 먼저, pEVE2294로부터 구축물 (서열 114)을 EYS1456 내로 통합시킴으로써 중간체 균주를 제조하였다 (실시예 1에서 표 16a 및 16b 참조). 생성되는 균주를 빈 벡터 pRS315 및 pRS313으로 추가로 형질전환시켜 CEY2871을 제공하거나, 벡터 pCCL254 및 pCCL256으로 추가로 형질전환시켜 CEY3631을 제공하였다. 따라서, 생성되는 2개의 균주는 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
CEY2871: AjDmaW_altC, 및 AfEasF.
CEY3631: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE, 및 AjEasC.
성장 조건 :
조작된 효모 균주 CEY2871 및 CEY3631을 2% 글루코스를 함유하고 Leu (류신) 및 His (히스티딘)이 없는 표준 SC 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. 배양액을 25 ml 배지를 담은 250 ml 진탕 플라스크 내에서 30℃에서 72시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 20>
Figure pct00049
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
예비 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 상청액을 10 M NaOH로 pH=10으로 조정하고, 동일 부피의 에틸 아세테이트를 사용하는 액체/액체 추출에 의해 추출하였다. 조 추출물을 진공 하에 건조시키고, 디메틸 술폭시드 (DMSO)로 재구성하여 100 mg/mL의 농도를 얻었다. 이어서, 예비 HPLC 시스템 (워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 상에서 정제하였다. 정지상: 컬럼은 XBridge™ 예비 C18, 5 ㎛, 19x250 mm 컬럼이었다.
액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 트리플루오로아세트산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 트리플루오로아세트산. 진행 조건:
<표 21>
Figure pct00050
ESI 파라미터: 전원 전압: 모세관: 3.00 kV. 콘: 30 V. 추출기: 3 V. RF 렌즈: 0.1 V.
전원 온도: 150℃. 탈용매화 온도: 350℃.
결과 :
CEY2871 및 CEY3631의 상청액을 LC-MS에 의해 분석하였다. 예상된 질량의 카노클라빈 I (m/z = 257.164+/-0.01 Da)의 추출된 이온 크로마토그램은 4.4 min(+/-0.2)의 체류 시간을 갖는 균주 CEY3631에서 피크를 보여주었고, 이것은 균주 CEY2871에서 보이지 않았다 (도 12 참조).
체류 시간 4.4 min에서 피크를 상기 설명한 바와 같이 정제하고, LC-MS 및 NMR 분광법에 의해 분석하였다. 상응하는 화합물의 구조를 해석하였고, 이것은 화합물의 정체가 카노클라빈임을 확인하였다.
CEY3631로부터 4.4 min+/-0.2 min에서 용리된 정제된 화합물의 NMR 데이타:
Figure pct00051
실시예 3: 에이. 푸미가투스로부터 EasF , 에이. 자포니쿠스로부터 DmaW _ altC 및 EasC , 및 에이. 자포니쿠스로부터 EasE 또는 SUMO- EasE를 사용한 카노클라빈 I의 생산.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
유전자 서열 :
실시예 3에서 사용한 유전자를 표 22에 나열한다.
<표 22>
Figure pct00052
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자를 제조하였다. 유전자는 아미노산 서열 (서열 102, 107, 106, 119 및 104) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. 유전자를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 프로모터 및 종결인자를 함유하는 효모 발현 카세트 (서열 110 및 111) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 110 및 111)는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
AjDmaW_altC (서열 102) 및 AfEasF (서열 107)을 함유하는 유전자 발현 카세트를 통합 벡터 pEVE2294 (서열 114) 내로 서브-클로닝하기 위해 사용하였고, 이것은 또한 효모 선택가능 마커 유전자를 함유하였다 (실시예 1에서 표 16a 및 16b 참조). 2개의 발현 카세트는 헤드 투 헤드 배향을 가졌고, 이것은 프로모터가 반대 방향으로 전사를 허용할 것임을 의미한다. 마커 및 발현 카세트는 숙주의 게놈 DNA에 상동성을 갖는 서열이 측면에 접해있었다. 게놈 상동성 서열이 측면에 접하는, 발현 카세트 및 선택 마커를 포함하는 전체 통합 구축물을, NotI 및 SbfI 제한 효소로 소화시킴으로써 pUC18 기반 백본으로부터 방출시키고, 효모의 형질전환을 위해 사용하였다. 표준 리튬 아세테이트 형질전환 프로토콜을 사용하였다 (Current Protocols; Chapter 13). 정확한 통합을 PCR에 의해 확인하고, 문헌 [Sauer, 1987]에 설명된 바와 같이 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드로 세포를 형질전환시킨 후에 선택 마커를 제거하였다 (절제하였다). 통합을 위한 표적 부위는 문헌 [Flagfeldt, 2009]에 설명되어 있다. 통합 구축물 및 서열 번호를 표 16a 및 16b에 나열한다 (실시예 1 참조).
유전자 AjEasE (서열 106) 및 AjEasC (서열 104)를 PA 및 GC 발현 카세트 (각각 서열 110 및 111) 내로 클로닝한 후, 각각 효모 벡터 pRS315 및 pRS313의 백본 내로 삽입하여 벡터 pCCL254 및 pCCL256을 제공하였다. 벡터 pCCL254의 특유한 HindIII 부위 내로, SUMO-태그를 함유하는 합성 DNA 서열을 삽입하여 EasE 효소의 N-말단 SUMO화 버전 (서열 119)을 생성함으로써 벡터 pCCL255를 생성하였다. SUMO-태그의 사용은 예를 들어 문헌 [Peroutka, 2008]에 설명되어 있다.
pRS 벡터 pRS315 및 pRS313은 이들 원래의 벡터의 Pvu II 부위들 사이에 멀티 클로닝 부위 링커 (서열 113)를 삽입하여, 상기 링커의 AscI 부위 내로 발현 카세트의 클로닝을 허용함으로써 이미 변형되었다. pRS 벡터는 문헌 [Sikorski, 1989]에 설명되어 있다.
경로 어셈블리 :
EYS1456 내로, 카노클라빈 I에 대한 생합성 경로를 도입함으로써 효모 균주를 제조하였다. pEVE2294로부터 구축물 (서열 114)을 EYS1456 내로 통합함으로써 중간체 균주를 제조하였다. 생성되는 균주를 벡터 pCCL254 및 pCCL256으로 추가로 형질전환시켜 CEY3631을 제공하거나, 벡터 pCCL254 및 pCCL255로 추가로 형질전환시켜 CEY3645를 제공하였다. 따라서, 생성되는 2개의 균주는 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
CEY3631: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE, 및 AjEasC.
CEY3645: AjDmaW_altC, AfEasF, SUMO-AjEasE, 및 AjEasC.
성장 조건 :
조작된 효모 균주 CEY3631 및 CEY3645를 2% 글루코스를 함유하고 Leu 및 His이 없는 표준 SC 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. 배양액을 25 ml 배지를 담은 250 ml 진탕 플라스크 내에서 30℃에서 72시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 23>
Figure pct00053
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
결과 :
CEY3631 및 CEY3645의 상청액을 LC-MS에 의해 분석하였다. 카노클라빈 I의 질량 (m/z = 257.164+/-0.01 Da)을 TIC (총 이온 크로마토그램)로부터 추출하였다. 피크는 2.0 min(+/-0.1)의 체류 시간을 가지면서 검출되었고, 이것은 앞서 (실시예 2 참조) 해석된 카노클라빈 I에 대응한다 (도 13 참조).
카노클라빈 I에 대응하는 피크 하 면적을 통합하였고, 이것은 비-SUMO화 버전을 갖는 균주 (CEY3631)에 비해 SUMO화 버전의 EasE를 갖는 균주 (CEY3645) 내에서 대략 27% 증가를 보여주었다 (도 13, 삽입도 참조).
실시예 4: 에이. 푸미가투스 또는 에이. 자포니쿠스로부터 EasF와 조합한 AjDmaW_altC를 사용한 Me-DMAT의 생산.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
실시예 4에서 사용한 유전자를 표 24에 나열한다:
<표 24>
Figure pct00054
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자를 제조하였다. 유전자는 아미노산 서열 (서열 102, 107 및 120) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. 유전자를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 Cup1 프로모터 및 Adh1 종결인자를 함유하는 효모 CA 발현 카세트 (서열 121) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 121)는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
유전자 AjDmaW_altC (서열 102)를 CA 발현 카세트 (서열 121) 내로 클로닝한 후, 효모 벡터 pRS316의 백본 내로 삽입하여 벡터 pCCL100을 제공하였다. 유전자 AfEasF (서열 107) 및 AjEasF (서열 120)를 CA 발현 카세트 (서열 121) 내로 클로닝한 후, 개별적으로 효모 벡터 pRS315의 백본 내로 삽입하여 각각 벡터 pCCL98 및 pCCL91을 제공하였다. pRS 벡터 pRS316 및 pRS315는 이들 원래의 벡터의 Pvu II 부위들 사이에 멀티 클로닝 부위 링커 (서열 113)를 삽입하여, 상기 링커의 AscI 부위 내로 발현 카세트의 클로닝을 허용함으로써 이미 변형되었다. pRS 벡터는 문헌 [Sikorski, 1989]에 설명되어 있다.
경로 어셈블리 :
EYS1456 내로, Me-DMAT에 대한 생합성 경로를 도입함으로써 효모 균주를 제조하였다. EYS1456을 벡터 pCCL100 및 pCCL98로 형질전환시켜 CEY2557을 제공하거나, 벡터 pCCL100 및 pCCL91로 형질전환시켜 CEY2625를 제공하였다. 따라서, 생성되는 2개의 균주는 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
CEY2557: AjDmaW_altC 및 AjEasF.
CEY2625: AjDmaW_altC 및 AfEasF.
성장 조건 :
조작된 효모 균주 CEY2557 및 CEY2625를 2% 글루코스를 함유하고 Leu (류신) 및 Ura (우라실)이 없는 표준 SC 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. 황산구리를 200 μΜ의 최종 농도로 첨가하였다. 배양액을 25 ml 배지를 담은 250 ml 진탕 플라스크 내에서 30℃에서 72시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 25>
Figure pct00055
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
예비 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 상청액을 10 M NaOH로 pH=10으로 조정하고, 동일 부피의 에틸 아세테이트를 사용하는 액체/액체 추출에 의해 추출하였다. 조 추출물을 진공 하에 건조시키고, 디메틸 술폭시드 (DMSO)로 재구성하여 100 mg/mL의 농도를 얻었다. 이어서, 예비 HPLC 시스템 (워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 상에서 정제하였다: 정지상: 컬럼은 XBridge™ 예비 C18, 5 ㎛, 19x250 mm 컬럼이었다.
액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 트리플루오로아세트산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 트리플루오로아세트산. 진행 조건:
<표 26>
Figure pct00056
ESI 파라미터:
전원 전압: 모세관: 3.00 kV. 콘: 30 V. 추출기: 3 V. RF 렌즈: 0.1 V.
전원 온도: 150℃. 탈용매화 온도: 350℃.
결과 :
CEY2557 및 CEY2625의 상청액을 LC-MS에 의해 분석하였다. 예상된 질량의 Me-DMAT (m/z = 287.175+/-0.01 Da)의 추출된 이온 크로마토그램은 체류 시간 7.8+/-0.2min에서 피크를 보여주었다 (도 14 참조). 상기 피크를 상기 설명한 바와 같이 정제하고, LC-MS 및 NMR 분광법에 의해 분석하고, 구조를 해석하였고, 이것은 화합물의 정체가 Me-DMAT임을 확인하였다.
Me-DMAT에 대응하는 피크 하 면적을 통합하였고, 이것은 에이. 자포니쿠스 버전 (CEY2557)을 갖는 균주에 비해 에이. 푸미가투스 버전의 EasF (CEY2625)을 갖는 균주 (도 15 참조) 내에서 2배 초과의 증가를 보여주었다.
Me-DMAT; CEY2557의 상청액 내에서 5.49 min에서 용리된 정제된 화합물의 NMR 데이타:
Figure pct00057
실시예 5: CpDmaW , AjDmaW _ altC , 또는 AjDmaW _ trcC와 함께 에이. 푸미가투스로부터 EasF를 사용한 Me- DMAT의 생산.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
실시예 5에서 사용한 유전자를 표 27에 나열한다:
<표 27>
Figure pct00058
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자를 제조하였다. 유전자는 아미노산 서열 (서열 102 내지 107, 및 서열 122 내지 123) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. 유전자를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 Cup1 프로모터 및 Adh1 종결인자를 함유하는 효모 CA 발현 카세트 (서열 121) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 121)는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
유전자 AjDmaW_altC (서열 102), AjDmaW_trcC (서열 122) 및 CpDmaW (서열 123)을 CA 발현 카세트 (서열 121) 내로 클로닝한 후, 효모 벡터 pRS316의 백본 내로 삽입하여 벡터 각각 pCCL100, pCCL99, 및 pCCL95를 제공하였다. 유전자 AfEasF를 CA 발현 카세트 (서열 121) 내로 클로닝한 후, 효모 벡터 pRS315의 백본 내로 삽입하여 벡터 pCCL98을 제공하였다. pRS 벡터 pRS316 및 pRS315는 이들 원래의 벡터의 Pvu II 부위들 사이에 멀티 클로닝 부위 링커 (서열 113)를 삽입하여, 상기 링커의 AscI 부위 내로 발현 카세트의 클로닝을 허용함으로써 이미 변형되었다. pRS 벡터는 문헌 [Sikorski, 1989]에 설명되어 있다.
경로 어셈블리 :
EYS1456 내로, Me-DMAT에 대한 생합성 경로를 도입함으로써 효모 균주를 제조하였다. EYS1456을 벡터 pCCL100 및 pCCL98로 형질전환시켜 CEY2557을 제공하거나, 벡터 pCCL99 및 pCCL98로 형질전환시켜 CEY2563을 제공하거나, 벡터 pCCL95 및 pCCL98로 형질전환시켜 CEY2575를 제공하였다. 따라서, 생성되는 3개의 균주는 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
CEY2557: AjDmaW_altC 및 AfEasF.
CEY2563: AjDmaW_trcC 및 AfEasF.
CEY2575: CpDmaW 및 AfEasF.
성장 조건 :
조작된 효모 균주 CEY2557, CEY2563, 및 CEY2575를 2% 글루코스를 함유하고 Leu (류신) 및 Ura (우라실)이 없는 표준 SC 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. 황산구리를 200 μΜ의 최종 농도로 첨가하였다. 배양액을 25 ml 배지를 담은 250 ml 진탕 플라스크 내에서 30℃에서 72시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 28>
Figure pct00059
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
예비 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 상청액을 10 M NaOH로 pH=10으로 조정하고, 동일 부피의 에틸 아세테이트를 사용하는 액체/액체 추출에 의해 추출하였다. 조 추출물을 진공 하에 건조시키고, 디메틸 술폭시드 (DMSO)로 재구성하여 100 mg/mL의 농도를 얻었다. 이어서, 예비 HPLC 시스템 (워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 상에서 정제하였다: 정지상: 컬럼은 XBridge™ 예비 C18, 5 ㎛, 19x250 mm 컬럼이었다.
액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 트리플루오로아세트산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 트리플루오로아세트산. 진행 조건:
<표 29>
Figure pct00060
ESI 파라미터:
전원 전압: 모세관: 3.00 kV. 콘: 30 V. 추출기: 3 V. RF 렌즈: 0.1 V.
전원 온도: 150℃. 탈용매화 온도: 350℃.
결과 :
CEY2557, CEY2563, 및 CEY2575의 상청액을 LC-MS에 의해 분석하였다. 피크의 추출된 이온 크로마토그램은 예상된 질량의 Me-DMAT (m/z = 257.164+/-0.01 Da)를 갖는 화합물을 나타냈다 (도 16 참조). 체류 시간 7.8 min에서 상기 피크를 상기 설명한 바와 같이 정제하고, LC-MS 및 NMR 분광법에 의해 분석하였고, 구조를 해석하였고, 이것은 화합물의 정체가 Me-DMAT임을 확인하였다. Me-DMAT에 대응하는 피크 하 면적을 통합하였고 (도 16, 삽입도), 이것은 3가지 모든 균주에 대해 유사한 수준의 Me-DMAT 생산을 보여준다.
실시예 6: 감소된 파르네실 피로인산염 신타제 활성을 갖는 숙주 균주 내에서 에이. 자포니쿠스로부터 DmaW _ altC 및 에이. 푸미가투스로부터 EasF를 사용한 Me-DMAT의 생산.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
실시예 6에서 사용한 유전자를 표 30에 나열한다 :
<표 30>
Figure pct00061
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자를 게네아트 아게 (GeneArt AG, 독일 로젠부르크)에 의해 제조하였다. 유전자는 아미노산 서열 (서열 102 및 107) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. AjDmaW (서열 102)를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 Pgk1 프로모터 및 Adh2 종결인자를 함유하는 효모 PA 발현 카세트 (서열 110) 내로 클로닝하였다. AfEasF를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 Tef1 프로모터 및 Eno2 종결인자를 함유하는 효모 TE 발현 카세트 (서열 124) 내로 클로닝하였다. 두 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 110 및 124)는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
이어서, 유전자 AjDmaW 및 AfEasF를 벡터 pESC-Ura 상에 기반한 단일 2 μΜ 벡터 (애질런트 테크놀로지스 (쉬바이즈) 아게 (Agilent Technologies (Schweiz) AG, 스위스 바젤)) 내로 클로닝하였다: Pgk1 프로모터 및 AfEasF 코딩 서열을 포함하는 PA 발현 카세트의 Bgl II/SacII 단편을 Bgl II 및 SacII로 소화시킨 pESC-Ura 내로 삽입하였다. 이것은 Adh2 종결인자를 pESC-Ura의 Cyc1 종결인자로 대체시킨다. 생성되는 벡터를 Bgl II 및 Sac I로 소화시키고, 벡터 백본을 TE 발현 카세트로부터 Tef1 프로모터를 포함하는, 유사하게 소화시킨 PCR 산물에 라이게이션시켰다. PCR 산물은 5'-단부에 Bgl II 부위, 및 3'-단부에 3개의 부위 Aar I, Pme I, 및 Sac I을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 제조하였다. 마지막으로, 생성되는 벡터를 Aar I 및 Pme I로 소화시켰다. Aar I은 Bgl II 소화시킨 서열과 일치성인 오버행을 남기도록 설계되었고, Pme I은 평활 말단을 남겼다. 이어서, AjDmaW_altC를 갖는 TE 발현 카세트를 T4 DNA 중합효소를 사용하여 평활하게 만들어진 SacII로 및 이어서 Bgl II로 소화시켰다. 이어서, Tef 1 프로모터 및 AjDmaW_altC 코딩 서열을 포함하는 상기 단편을 백본에 라이게이션시키고, 바로 위에서 설명한 바와 같이 Aar I 및 Pme I로 소화시켰다. 이것은 Eno2 종결인자를 pESC-Ura의 Adh1 종결인자로 대체시켰다. pEVE2075 (서열 125)로 명명한 최종 벡터는 Tef1 프로모터 및 Adh1 종결인자 사이에 AjDmaW, 및 Pgk1 프로모터 및 Cyc1 종결인자 사이에 AfEasF를 함유한다.
감소된 ERG20 활성을 갖는 효모 숙주의 제조 :
효모 균주 EYS1456을 ERG20 조절 영역의 일부를 결실시키고 이를 ScKex2 유전자의 비교적 약한 구성적 천연 프로모터로 대체함으로써 변형시켰다. 먼저, 선택가능 노우르세오스리신 내성 마커 유전자 NatR에 이어, ScKex2 프로모터를 포함하는 벡터 pEVE2049 (서열 126)를 제조하였다. 이어서, NatR-ScKex2 단편을 2개의 프라이머 서열 127 및 128을 사용하는 PCR에 의해 증폭하였다. 서열 127의 5'-단부는 ERG20 번역 출발 부위에 비해 위치 -768 내지 -724에서 효모 숙주의 게놈 서열과 동일하고 (도 17에서 HR1), 3'-단부는 NatR 선택가능 마커의 상류의 pEVE2049 내의 서열과 동일하다. 서열 128의 5'-단부는 ERG20 코딩 서열의 역 상보체 서열과 동일하고 (도 17에서 HR2), 3'-단부는 ScKex2 프로모터의 3'-단부의 역 상보체 서열과 동일하다. PCR 산물을 사용하여 EYS1456을 형질전환시켜, ERG20 프로모터 영역을 ScKEX2 프로모터로 대체시켰다. NatR 선택가능 마커의 사용에 의해 성공적인 통합을 갖는 클론을 선택하였다. 도 17은 통합 구축물 및 게놈 표적 영역의 개략도를 보여준다. 상기 클론, EYS1456을 플라스미드 pEVE2075로 추가로 형질전환시켜 균주 EYS1538 (천연 ERG20 프로모터 영역을 갖는 대조군 균주) 및 EYS1926를 생성하고, 이것은 ScKex2 프로모터로 대체된 천연 ERG20 프로모터를 가졌다.
경로 어셈블리 :
플라스미드 pEVE2075를 보유하는 2개의 효모 균주, EYS1538 및 EYS1926을 상기 설명한 바와 같이 제조하여, Me-DMAT에 대한 생합성 경로로 생성하였다. 따라서, 생성되는 균주는 둘 모두 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
EYS1538 및 EYS1926: AjDmaW_altC 및 AfEasF.
성장 조건:
조작된 효모 균주 EYS1538 및 EYS1926을 2% 글루코스를 함유하고 Ura (우라실)이 없는 표준 SC 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. 배양액을 25 ml 배지를 담은 250 ml 진탕 플라스크 내에서 30℃에서 72시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 31>
Figure pct00062
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
결과 :
EYS1538 및 EYS1926의 상청액을 LC-MS에 의해 분석하였다. 추출된 이온 크로마토그램은 체류 시간 7.8 min에서 예상된 질량의 Me-DMAT (m/z = 257.164+/-0.01 Da)에 대응하는 피크를 나타냈다. 피크는 앞서 정제된 화합물 (실시예 4 참조)을 참조로 Me-DMAT로서 확인되었다. Me-DMAT에 대응하는 피크 하 면적을 통합하였고, 이것은 EYS1538에 비해 EYS1926 내에서 Me-DMAT의 2배 초과의 증가를 보여주었다 (도 18 참조). 상기 증가는 EYS1926 내에서 프로모터 대체의 결과이었고, 이것은 ERG20 하향 조절 및 따라서 Me-DMAT 합성을 위한 DMAPP의 증가된 이용률을 유발하였다.
실시예 7: 피. 디바리카투스 EasH를 포함한 8-단계 이종 경로를 발현함으로써 빵 효모 (사카로미세스 세레비지아에) 내에서 시클로클라빈의 생산.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
실시예 7에서 사용한 유전자를 표 32에 나열한다:
<표 32>
Figure pct00063
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자를 디엔에이2.0 인크. (DNA2.0 Inc., 미국 캘리포니아주 멘로 파크) 또는 게네아트 아게 (독일 로젠부르크)에 의해 제조하였다. 유전자는 아미노산 서열 (서열 102 내지 109 및 157) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. 유전자를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 프로모터 및 종결인자를 함유하는 효모 발현 카세트 (서열 110 및 111) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 110 및 111)는 발현 카세트의 추가의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
유전자 발현 카세트를 1 또는 2개의 카세트를 지정된 통합 벡터 (서열 114 내지 118) 내로 서브-클로닝하기 위해 사용하였고, 이것은 또한 효모 선택가능 마커 유전자를 함유하였다. 2개의 발현 카세트의 경우에, 클로닝의 배향은 헤드 투 헤드였고, 이것은 프로모터가 반대 방향으로 전사를 허용할 것임을 의미한다. 마커 및 발현 카세트(들)은 숙주의 게놈 DNA에 상동성을 갖는 서열 (서열 114 내지 118)이 측면에 접해있었다. 상동성 서열이 측면에 접하는, 발현 카세트(들) 및 선택 마커를 포함하는 전체 통합 구축물을, 통합 벡터를 SbfI 제한 효소로 소화시킴으로써 pUC18 기반 백본으로부터 방출시키고, 효모의 형질전환을 위해 사용하였다. 표준 리튬 아세테이트 형질전환 프로토콜을 사용하였다 (Current Protocols; Chapter 13). 정확한 통합을 PCR에 의해 확인하고, 문헌 [Sauer, 1987]에 설명된 바와 같이 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드로 세포를 형질전환시킨 후에 선택 마커를 제거하였다 (절제하였다). 통합을 위한 표적 부위는 문헌 [Flagfeldt, 2009]에 설명되어 있다. 통합 벡터 및 그들의 통합 구축물의 서열 번호를 표 33에 나열한다.
<표 33>
Figure pct00064
또한, 아스페르길루스 자포니쿠스로부터 AjEasH 유전자 (서열 109) 또는 파에실로미세스 디바리카투스로부터 PdEasH 유전자 (서열 번호 028)를 함유하는 2개의 플라스미드를 구축하고, GPD1 프로모터 및 CYC1 종결인자를 사용하는, 발현 카세트 (서열 111)가 설치된 pRS315 벡터 내로 클로닝하였다. 클로닝은 실시예 2에 설명된 바와 같이 수행하였다.
경로 어셈블리 :
EYS1456 내로, pEVE2294, pEVE2312, pEVE2342, 및 pEVE2344로부터의 구축물을 통합함으로써 효모 균주, EYS1851을 제조하였다 (표 33). EYS1851을 각각 PdEasH 또는 AjEasH를 함유하는 pRS 벡터 (상기 참조)로 형질전환시킴으로써 2개의 균주, EYS2098 및 EYS2099를 제조하였다. 따라서, 생성되는 균주는 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
EYS2098: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE, AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, PdEasH.
EYS2099: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE, AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, AjEasH.
성장 조건 :
조작된 효모 균주 EYS2098 및 EYS2099를 2% 글루코스를 함유하고 류신이 없는 표준 SC 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. 배양액을 25 ml 배지를 담은 250 ml 진탕 플라스크 내에서 20℃에서 72시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 34>
Figure pct00065
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
결과 :
EYS2098 및 EYS2099로부터 상청액을 LC-MS에 의해 분석하고, 카노클라빈 I (미소량) 및 시클로클라빈의 생산은 순수한 화합물을 참조하여 입증하였다 (화합물 확인에 대해 실시예 1 및 2 참조). 두 균주 내에서 시클로클라빈의 생산 (도 19 참조)은 상기 화합물의 생산에 기여하는 피. 디바리카투스 또는 에이. 자포니쿠스 모두로부터 EasH 유전자의 능력을 보여주고, 이것은 모 균주 EYS1851에 의해 시클로클라빈이 생산되지 않기 때문이다 (실시예 1 참조).
실시예 8: 증가된 이소펜테닐 이인산염:디메틸 -알릴 이인산염 이소머라제 활성 ( Idi1 )을 갖는 숙주 균주 내에서, 에이. 자포니쿠스로부터 DmaW _ altC 및 에이. 푸미가투스로부터 EasF를 사용한 Me-DMAT의 증가된 생산.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
실시예 8에서 사용한 유전자를 표 35에 나열한다:
<표 35>
Figure pct00066
유전자의 클로닝 :
번역 중지 코돈을 포함하는, AjDmaW_altC (서열 102) 및 AfEasF (서열 107)의 아미노산 서열을 코딩하는, 효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 2개의 합성 유전자를 게네아트 아게 (독일 로젠부르크)에 의해 제조하였다. ScIdi1 (이소펜테닐 이인산염:디메틸알릴 이인산염 이소머라제) (서열 158)를 코딩하는 유전자를 주형으로서 에스. 세레비지아에로부터 게놈 DNA를 사용하는 PCR에 의해 증폭하였다. 합성 (AjDmaW_altC 및 AfEasF) 또는 PCR 증폭 (ScIdi1) 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다.
유전자를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 프로모터 (각각 Gpd1, Tef1, 및 Tef2) 및 종결인자 (각각 Cyc1, Eno2, 및 Pgi1)를 함유하는 효모 발현 카세트 (서열 110, 124 및 159) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다. 마지막으로, 유전자를 함유하는 발현 카세트를 AscI 단편으로서 각각 효모 벡터 pRS316, pRS315 및 pRS313의 백본 내로 클로닝하였다. pRS 벡터 pRS316, pRS315 및 pRS313은 이들 원래의 벡터의 Pvu II 부위들 사이에 멀티 클로닝 부위 링커 (서열 113)를 삽입하여, 상기 링커의 AscI 부위 내로 발현 카세트의 클로닝을 허용함으로써 이미 변형되었다. pRS 벡터는 문헌 [Sikorski, 1989]에 설명되어 있다.
경로 어셈블리 :
EYS1456 내로, 유전자 AjDmaW_altC 및 AfEasF를 포함하는 상기 설명한 pRS 벡터를 사용하여 Me-DMAT에 대한 생합성 경로를 도입함으로써 효모 균주, EYS2055를 제조하였다. 상기 균주를 ScIdi1 유전자를 포함하는 제3 pRS 벡터로 추가로 형질전환시켜, 균주 EYS2056을 생성하였다. 따라서, 생성되는 2개의 균주는 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
EYS2055: AjDmaW_altC, 및 AfEasF.
EYS2056: AjDmaW_altC, AfEasF, 및 ScIdi1.
성장 조건 :
조작된 효모 균주 EYS2055 및 EYS2056을 2% 글루코스를 함유하고 His (히스티딘), Leu (류신) 및 Ura (우라실)이 없는 표준 SC 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. 배양액을 25 ml 배지를 담은 250 ml 진탕 플라스크 내에서 20℃ 또는 30℃에서 72시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 36>
Figure pct00067
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
결과 :
EYS2055 및 EYS2056의 상청액을 LC-MS에 의해 분석하였다. 예상된 질량의 DMAT (m/z = 273.159+/-0.01 Da) 및 Me-DMAT (m/z = 287.175+/-0.01 Da)의 이온 크로마토그램을 추출하고, 피크 하 면적을 통합하였다. 결과 (도 20a 및 20b 참조)는 두 온도에서 EYS2055에 비해 균주 EYS2056 내에서 Me-DMAT 생산의 증가를 보여주었다. 증가는 EYS2055의 정상 야생형 발현 수준에 비해 ScIdi1의 과다발현에 대응하였다.
실시예 9: 전체 길이 이종 경로의 추가의 카피의 유전자를 발현함으로써 시클로클라빈의 증가된 생산.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
실시예 9에서 사용한 유전자를 표 37에 나열한다:
<표 37>
Figure pct00068
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자를 디엔에이2.0 인크. (미국 캘리포니아주 멘로 파크) 또는 게네아트 아게 (독일 로젠부르크)에 의해 제조하였다. 유전자는 아미노산 서열 (서열 102 내지 109) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. 유전자를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 프로모터 및 종결인자를 함유하는 효모 발현 카세트 (서열 110 및 111) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 110 및 111)는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
유전자 발현 카세트를 1 또는 2개의 카세트를 지정된 통합 벡터 (서열 114, 115, 117, 118 및 160) 내로 서브-클로닝하기 위해 사용하였고, 이것은 또한 효모 선택가능 마커 유전자를 함유하였다. 클로닝의 배향은 헤드 투 헤드였고, 이것은 프로모터가 반대 방향으로 전사를 허용할 것임을 의미한다. 마커 및 발현 카세트(들)은 숙주의 게놈 DNA에 상동성을 갖는 서열이 측면에 접해있었다. 상동성 서열이 측면에 접하는, 발현 카세트(들) 및 선택 마커를 포함하는 최종 통합 구축물 (서열 114, 115, 117, 118 및 160)을, 통합 벡터를 SbfI 제한 효소로 소화시킴으로써 pUC18 기반 백본으로부터 방출시키고, 효모의 형질전환을 위해 사용하였다. 표준 리튬 아세테이트 형질전환 프로토콜을 사용하였다 (Current Protocols; Chapter 13). 정확한 통합을 PCR에 의해 확인하고, 문헌 [Sauer, 1987]에 설명된 바와 같이 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드로 세포를 형질전환시킨 후에 선택 마커를 제거하였다 (절제하였다). 통합을 위한 표적 부위는 문헌 [Flagfeldt, 2009]에 설명되어 있다. 통합 벡터 및 그들의 통합 구축물의 서열 번호를 표 38에 나열한다.
<표 38>
Figure pct00069
경로 어셈블리 :
EYS1456 내로, 단일 카피의 완전 시클로클라빈 경로 (EYS1934) 또는 완전 경로 + 추가의 카피의 유전자 AjEasC (EYS2206)를 통합함으로써 2개의 효모 균주를 제조하였다. EYS1934는 pEVE2294, pEVE2312, pEVE2343, 및 pEVE2344로부터 구축물을 통합시킴으로써 제조한 한편 (표 38), EYS2206은 pEVE2294, pEVE2312, pEVE2343, pEVE2344, 및 pEVE2656으로부터 구축물을 통합시킴으로써 제조하였다 (표 38). 따라서, 생성되는 균주는 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
EYS1934: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE, AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, 및 AjEasH.
EYS2206: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE, 2 x AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, 및 AjEasH.
성장 조건 :
조작된 효모 균주 EYS1934 및 EYS2206을 2% 글루코스를 함유하는 표준 SC 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. 배양액을 25 ml 배지를 담은 250 ml 진탕 플라스크 내에서 30℃에서 72시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 39>
Figure pct00070
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
결과 :
EYS1934 및 EY2206을 상기 설명한 바와 같이 30℃에서 성장시켰다. 상청액을 LC-MS에 의해 분석하고, 예상된 질량의 시클로클라빈 (m/z = 239.1543+/-0.01 Da)의 이온 크로마토그램을 추출하였다. 또한, 약 241의 m/z (m/z = 241.1699+/-0.01 Da) 후에 MW241로 명명한 경로의 제2 산물의 크로마토그램을 추출하였다. 피크 하 면적을 통합하였고, 결과의 비교는 EYS1934에 비해 EYS2206 내에서 시클로클라빈 (CCL) 및 페스투클라빈 (MW241) 모두의 증가된 생산을 보여주었다. 상기 증가 (도 21 참조)는 EYS1934에 비해 EYS2206 내에서 추가의 카피의 AjEasC의 발현 효과인 것으로 여겨졌다.
실시예 10: 엔. 롤리이 EasE를 포함한 8-단계 이종 경로를 발현함으로써 빵 효모 (사카로미세스 세레비지아에) 내에서 시클로클라빈의 생산.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
실시예 10에서 사용한 유전자를 표 40에 나열한다:
<표 40>
Figure pct00071
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자. 유전자는 아미노산 서열 (서열 102 내지 109 및 161) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. 유전자 (서열 102, 107, 105, 109, 103, 및 108)를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 프로모터 및 종결인자를 함유하는 효모 발현 카세트 (서열 110 및 111) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 110 및 111)는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
유전자 발현 카세트를 지정된 통합 벡터 (서열 114, 117, 및 118) 내로 카세트를 쌍으로 서브-클로닝하기 위해 사용하였고, 이것은 또한 효모 선택가능 마커 유전자를 함유하였다. 클로닝의 배향은 헤드 투 헤드였고, 이것은 프로모터가 반대 방향으로 전사를 허용할 것임을 의미한다. 마커 및 발현 카세트(들)은 숙주의 게놈 DNA에 상동성을 갖는 서열이 측면에 접해있었다. 상동성 서열이 측면에 접하는, 발현 카세트(들) 및 선택 마커를 포함하는 전체 통합 구축물 (서열 114, 117, 및 118)을, 통합 벡터를 SbfI 제한 효소로 소화시킴으로써 pUC18 기반 백본으로부터 방출시키고, 효모의 형질전환을 위해 사용하였다. 표준 리튬 아세테이트 형질전환 프로토콜을 사용하였다 (Current Protocols; Chapter 13). 정확한 통합을 PCR에 의해 확인하고, 문헌 [Sauer, 1987]에 설명된 바와 같이 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드로 세포를 형질전환시킨 후에 선택 마커를 제거하였다 (절제하였다). 통합을 위한 표적 부위는 문헌 [Flagfeldt, 2009]에 설명되어 있다. 통합 벡터 및 그들의 통합 구축물의 서열 번호를 표 41에 나열한다.
<표 41>
Figure pct00072
또한, 3개의 플라스미드를 구축하였다: 하나는 pRS313 내로 클로닝된 AjEasC 유전자 (서열 104)를 포함하였다. pRS313에는 천연 효모 Cup1 프로모터 및 Adh1 종결인자를 포함하는, C/A 발현 카세트 (서열 121)가 이미 설치되었다. 아스페르길루스 자포니쿠스로부터 AjEasE 유전자 (서열 106) 또는 네오티포디움 롤리이로부터 NIEasE 유전자 (서열 161)를 함유하는 다른 2개의 플라스미드를, C/A 발현 카세트 (서열 121)가 또한 설치된 pRS315 벡터 내로 각각의 유전자를 클로닝함으로써 제조하였다. 클로닝은 실시예 2에 설명된 바와 같이 수행하였다.
경로 어셈블리 :
EYS1456 내로, pEVE2294, pEVE2343, 및 pEVE2344로부터 구축물을 통합시킴으로써 효모 균주, EYS1937을 제조하였다 (표 41). 이어서, EYS1937을, 각각 AjEasE 또는 NIEasE와 함께 AjEasC를 함유하는 pRS 벡터 (상기 참조)로 형질전환시킴으로써 2개의 균주, EYS2124 및 EYS2125를 제조하였다. 따라서, 생성되는 균주는 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
EYS2124: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE, AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, AjEasH.
EYS2125: AjDmaW_altC, AfEasF, NIEasE, AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, AjEasH.
성장 조건 :
조작된 효모 균주 EYS2124 및 EYS2125를 2% 글루코스를 함유하고 류신 및 히스티딘이 없는 표준 SC 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. 황산구리를 200 μΜ의 최종 농도로 첨가하였다. 배양액을 25 ml 배지를 담은 250 ml 진탕 플라스크 내에서 20℃에서 72시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 42>
Figure pct00073
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
결과 :
EYS2124 및 EYS2125로부터 상청액을 LC-MS에 의해 분석하고, 예상된 질량의 시클로클라빈 (m/z = 239.1543+/-0.01 Da)의 이온 크로마토그램을 추출하였다. 또한, 약 241의 m/z (m/z = 241.1699+/-0.01 Da) 후에 MW241 (페스투클라빈)로 명명한 경로의 제2 산물의 크로마토그램을 추출하였다. 피크 하 면적을 통합하였고, 결과의 비교는 2개의 균주 내에서 시클로클라빈 (CCL) 및 페스투클라빈 모두의 생산을 보여주었고, 여기서 생산 수준은 EYS2125에 비해 EYS2124 내에서 더 높았다 (도 22 참조). 이것은 사용된 조건 하에, 에이. 자포니쿠스로부터 EasE 유전자가 엔. 롤리이로부터 EasE보다 더 효율적이지만, 2개의 EasE 상동체는 모두 기능적이고 CCL 및 MW241의 생산을 일으켰음을 보여준다.
실시예 11: 상이한 코돈 사용 빈도를 갖는 합성 EasE 유전자를 포함한 8-단계 이종 경로를 발현함으로써 빵 효모 ( 사카로미세스 세레비지아에) 내에서 시클로클라 빈의 생산.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
실시예 11에서 사용한 유전자를 표 43에 나열한다:
<표 43>
Figure pct00074
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자. 유전자는 아미노산 서열 (서열 102 내지 109, 및 162 내지 165) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. 유전자 (서열 102, 107, 105, 109, 103, 및 108)를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 프로모터 및 종결인자를 함유하는 효모 발현 카세트 (서열 110 및 111) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 110 및 111)는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
유전자 발현 카세트를 지정된 통합 벡터 (서열 114, 117 및 118) 내로 카세트를 쌍으로 서브-클로닝하기 위해 사용하였고, 이것은 또한 효모 선택가능 마커 유전자를 함유하였다. 클로닝의 배향은 헤드 투 헤드였고, 이것은 프로모터가 반대 방향으로 전사를 허용할 것임을 의미한다. 마커 및 발현 카세트(들)은 숙주의 게놈 DNA에 상동성을 갖는 서열이 측면에 접해있었다. 상동성 서열이 측면에 접하는, 발현 카세트(들) 및 선택 마커를 포함하는 전체 통합 구축물 (서열 114, 117 및 118)을, 통합 벡터를 SbfI 제한 효소로 소화시킴으로써 pUC18 기반 백본으로부터 방출시키고, 효모의 형질전환을 위해 사용하였다. 표준 리튬 아세테이트 형질전환 프로토콜을 사용하였다 (Current Protocols; Chapter 13). 정확한 통합을 PCR에 의해 확인하고, 문헌 [Sauer, 1987]에 설명된 바와 같이 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드로 세포를 형질전환시킨 후에 선택 마커를 제거하였다 (절제하였다). 통합을 위한 표적 부위는 문헌 [Flagfeldt, 2009]에 설명되어 있다. 통합 벡터 및 그들의 통합 구축물의 서열 번호를 표 44에 나열한다.
<표 44>
Figure pct00075
또한, 6개의 플라스미드를 구축하였다: 하나는 pRS313 내로 클로닝된 AjEasC 유전자 (서열 104)를 포함하였다. pRS313에는 천연 효모 Cup1 프로모터 및 Adh1 종결인자를 포함하는 C/A 발현 카세트 (서열 121)가 이미 설치되었다. 5개의 별도의 코돈 사용 빈도를 갖는 합성된 아스페르길루스 자포니쿠스로부터 AjEasE 유전자의 변이체를 함유하는 (서열 106 및 162 내지 165) 다른 5개는 C/A 발현 카세트 (서열 121)가 또한 설치된 pRS315 벡터 내로 클로닝함으로써 제조하였다. 클로닝은 실시예 2에 설명된 바와 같이 수행하였다.
경로 어셈블리 :
EYS1456 내로, pEVE2294, pEVE2343, 및 pEVE2344로부터 구축물을 통합시킴으로써 효모 균주, EYS1937을 제조하였다 (표 44). 이어서, EYS1937을 각각의 AjEasE 유전자의 1개의 버전과 함께 AjEasC를 함유하는 pRS 벡터 (상기 참조)로 형질전환시킴으로써 5개의 균주, EYS2124, EYS2127, EYS2147, EYS2148 및 EYS2149를 제조하였다. 따라서, 생성되는 균주는 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
EYS2124: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE (서열 106), AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, AjEasH.
EYS2127: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE (서열 162), AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, AjEasH.
EYS2147: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE (서열 163), AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, AjEasH.
EYS2148: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE (서열 164), AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, AjEasH.
EYS2149: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE (서열 165), AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, AjEasH.
성장 조건 :
조작된 효모 균주 EYS2124, EYS2127, EYS2147, EYS2148 및 EYS2149를 2% 글루코스를 함유하고 류신 및 히스티딘이 없는 표준 SC 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. 황산구리를 200 μΜ의 최종 농도로 첨가하였다. 배양액을 25 ml 배지를 담은 250 ml 진탕 플라스크 내에서 30℃에서 72시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 45>
Figure pct00076
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
결과 :
EYS2124, EYS2127, EYS2147, EYS2148 및 EYS2149로부터 상청액을 LC-MS에 의해 분석하고, 예상된 질량의 시클로클라빈 (m/z = 239.1543+/-0.01 Da)의 이온 크로마토그램을 추출하였다. 또한, 약 241의 m/z (m/z = 241.1699+/-0.01 Da) 때문에 MW241로 명명한 경로의 제2 산물의 크로마토그램을 추출하였다. 피크 하 면적을 통합하였고, 결과는 5개의 모든 균주 내에서 시클로클라빈 (CCL) 및 페스투클라빈 (MW241) 모두의 다양한 수준의 생산을 보여주었다 (도 23 참조). 시험된 모든 EasE 유전자 버전은 동일한 아미노산 서열을 코딩하고, 따라서, 화합물 생산 수준의 변동은 상기 합성 EasE 유전자에서 사용된 상이한 DNA 코돈 선택을 반영한다.
실시예 12: 빵 효모 ( 사카로미세스 세레비지아에) 내에서 8-단계 이종 경로를 발현하고, 효모를 삼투물질의 존재 하에 성장시킴으로써 시클로클라빈의 증가된 생산.
삼투물질의 존재는 몇몇 경우에 단백질의 정확한 폴딩을 개선하는 것으로 나타났다 (Bandyopadhyay 2012, Burkewitz 2012). 여기서, 본 발명자들은 삼투물질 글리세롤이 성장 배지에 첨가될 때 효모 내에서 이종 발현된 경로에 기반한 시클로클라빈의 생산을 개선시킬 수 있음을 보여준다.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
실시예 12에서 사용한 유전자를 표 46에 나열한다:
<표 46>
Figure pct00077
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자를 디엔에이2.0 인크. (미국 캘리포니아주 멘로 파크) 또는 게네아트 아게 (독일 로젠부르크)에 의해 제조하였다. 유전자는 아미노산 서열 (서열 102 내지 109) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. 유전자를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 프로모터 및 종결인자를 함유하는 효모 발현 카세트 (서열 110 및 111) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 110 및 111)는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
유전자 발현 카세트를 2개의 카세트를 각각 지정된 통합 벡터 (서열 114, 115, 117 및 118) 내로 서브-클로닝하기 위해 사용하였고, 이것은 또한 효모 선택가능 마커 유전자를 함유하였다. 클로닝의 배향은 헤드 투 헤드였고, 이것은 프로모터가 반대 방향으로 전사를 허용할 것임을 의미한다. 마커 및 발현 카세트(들)은 숙주의 게놈 DNA에 상동성을 갖는 서열이 측면에 접해있었다. 상동성 서열이 측면에 접하는, 발현 카세트(들) 및 선택 마커를 포함하는 최종 통합 구축물 (서열 114, 115, 117 및 118)을, 통합 벡터를 SbfI 제한 효소로 소화시킴으로써 pUC18 기반 백본으로부터 방출시키고, 효모의 형질전환을 위해 사용하였다. 표준 리튬 아세테이트 형질전환 프로토콜을 사용하였다 (Current Protocols; Chapter 13). 정확한 통합을 PCR에 의해 확인하고, 문헌 [Sauer, 1987]에 설명된 바와 같이 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드로 세포를 형질전환시킨 후에 선택 마커를 제거하였다 (절제하였다). 통합을 위한 표적 부위는 문헌 [Flagfeldt, 2009]에 설명되어 있다. 통합 벡터 및 그들의 통합 구축물의 서열 번호를 표 47에 나열한다.
<표 47>
Figure pct00078
경로 어셈블리 :
EYS1456 내로, pEVE2294, pEVE2312, pEVE2343, 및 pEVE2344로부터 구축물을 사용하여 (표 47) 단일 카피의 완전 시클로클라빈 경로를 통합시킴으로써, 및 추가로 3개의 빈 플라스미드 pRS313, pRS315, 및 pRS316 (상기 설명한)을 도입함으로써 효모 균주 (EYS2006)를 제조하였다. 따라서, 생성되는 균주는 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
EYS2006: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE, AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, 및 AjEasH.
성장 조건 :
조작된 효모 균주 EYS2006을 2% 글루코스를 함유하고 류신, 히스티딘 및 우라실이 없는 표준 SC 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. EYS2006의 배양액을 글리세롤 없이 또는 2.5%, 5%, 및 10% 글리세롤과 함께 성장시켰다. 0.8 mL의 배양액을 바이오렉터 (BioLector) 발효기 (엠2피-랩스 (M2P-labs, 독일 바에스바일러)) 내에서 30℃에서 72시간 동안 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 48>
Figure pct00079
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
결과 :
EYS2006을 상기 설명한 바와 같이 30℃에서 성장시켰다. 상청액을 LC-MS에 의해 분석하고, 예상된 질량의 시클로클라빈 (m/z = 239.1543+/-0.01 Da)의 이온 크로마토그램을 추출하였다. 또한, 약 241의 m/z (m/z = 241.1699+/-0.01 Da) 때문에 페스투클라빈 (MW241)인 경로의 제2 산물의 크로마토그램을 추출하였다. 피크 하 면적을 통합하고 비교하였다 (도 24 참조). 대조군 (글리세롤 없이 성장시킨 EYS2006)에 비교할 때, 글리세롤과 함께 성장시킨 배양액은 보다 많은 시클로클라빈 및 페스투클라빈을 생산하였다. 시험한 조건 하에, 화합물 생산의 수준은 증가하는 농도의 글리세롤과 함께 증가하였고, 여기서 최고 생산 수준은 10% 글리세롤에서 얻어졌다.
실시예 13: 이종 CCL 경로로부터 다중의 카피의 유전자를 발현시키고, 숙주 Pdi1 및 Fad1을 과다발현시킴으로써 시클로클라빈의 증가된 생산.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS1456은 다음 유전자형을 가졌다:
CEN.PK 111-61A (MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52).
실시예 13에서 사용한 유전자를 표 49에 나열한다:
<표 49>
Figure pct00080
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자. 유전자는 아미노산 서열 (서열 102 내지 109) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 천연 효모 (에스. 세레비지아에) 유전자 Pdi1 (서열 166) 및 Fad1 (서열 167)을 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. 유전자를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 프로모터 및 종결인자를 함유하는 효모 발현 카세트 (서열 110, 111, 159 및 168) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 110, 111, 159, 및 168)는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
유전자 발현 카세트를 1, 2 또는 3개의 카세트를 지정된 통합 벡터 (서열 114, 115, 117, 118, 160, 169, 170, 및 171) 내로 서브-클로닝하기 위해 사용하였고, 이것은 또한 효모 선택가능 마커 유전자를 함유하였다. 마커 및 발현 카세트(들)은 숙주의 게놈 DNA에 상동성을 갖는 서열이 측면에 접해있었다. 상동성 서열이 측면에 접하는, 발현 카세트(들) 및 선택 마커를 포함하는 최종 통합 구축물 (서열 114, 115, 117, 118, 160, 169, 170, 및 171)을, 통합 벡터를 SbfI 제한 효소로 소화시킴으로써 pUC18 기반 백본으로부터 방출시키고, 효모의 형질전환을 위해 사용하였다. 표준 리튬 아세테이트 형질전환 프로토콜을 사용하였다 (Current Protocols; Chapter 13). 정확한 통합을 PCR에 의해 확인하였다. 통합을 위한 표적 부위는 문헌 [Flagfeldt, 2009]에 설명되어 있다. 통합 벡터 및 그들의 통합 구축물의 서열 번호를 표 50a 및 50b에 나열한다.
<표 50a>
Figure pct00081
<표 50b>
Figure pct00082
경로 어셈블리 :
EYS1456 내로, 단일 카피의 완전 시클로클라빈 경로 (EYS1934), 또는 완전 경로 + 추가의 카피의 CCL 경로 유전자 및 숙주 유전자를 통합시킴으로써 3개의 효모 균주를 제조하였다. 따라서, EYS1934는 pEVE2294, pEVE2312, pEVE2343, 및 pEVE2344로부터 구축물을 통합시킴으로써 제조하고 (표 50), EYS2209는 pEVE2294, pEVE2312, pEVE2343, pEVE2344, pEVE2656, 및 pEVE2658로부터 구축물을 통합시킴으로써 제조하고 (표 50a 및 50b), EYS2297은 pEVE2294, pEVE2312, pEVE2343, pEVE2344, pEVE2656, pEVE2658, pEVE2682, 및 pEVE2723으로부터 구축물을 통합시킴으로써 제조하였다 (표 50a 및 50b). EYS1934에서는 Cre 재조합효소 (문헌 [Sauer, 1987]에 설명된)를 발현함으로써 선택 마커를 제거하였고 (절제하였고), EYS2209 및 EYS2297의 제조를 위한 중간체로서 역할을 하였다. 따라서, 생성되는 균주는 다음 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하였다:
EYS1934: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE, AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, 및 AjEasH.
EYS2209: AjDmaW_altC, AfEasF, AjEasE, 2 x AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, AjEasH, ScPdi1, 및 ScFad1.
EYS2325: 2 x AjDmaW_altC, AfEasF, 2 x AjEasE, 3 x AjEasC, AjEasD, AjEasA, AjEasG, 3 x AjEasH, ScPdi1, 및 ScFad1.
성장 조건 :
조작된 효모 균주 EYS1934 및 EYS2209를 바이오렉터 (엠2피 랩스, 독일 바에스바일러) 내에서 2% 글루코스를 함유하는 표준 SC+모든 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. 성장기를 연장하기 위해, 10% 글리세롤을 성장 배지에 첨가하였다. 배양액을 30℃에서 72시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다. 후속적으로, EYS2209 및 EYS2297을 동일한 조건에서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 51>
Figure pct00083
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
결과 :
EYS1934 및 EYS2209의 배양 상청액을 LC-MS에 의해 분석하고, 예상된 질량의 시클로클라빈 (m/z = 239.1543+/-0.01 Da)의 이온 크로마토그램을 추출하였다. 피크 하 면적을 통합하였고, 결과의 비교는 EYS1934에 비해 EYS2209 내에서 시클로클라빈의 증가된 생산을 보여주었고 (도 25, 좌측), 상기 조건 하에 거의 12 mg/L의 역가에 도달하였다. 상기 증가는 EYS1934에 비해 EYS2209 내에서 추가의 카피의 Aj_EasC, Sc_Pdi1, 및 Sc_Fad1의 발현 효과인 것으로 여겨졌다.
동일한 성장 조건, 및 추출 및 분석 방법을 이용하여, EYS2209 및 EYS2297을 비교하였고, 이것은 EYS2209에 비해 EYS2297 내에서 22 mg/L로 CCL 역가의 추가의 증가를 보여주었다 (도 25, 우측). 상기 증가는 EYS2209에 비해 EYS2297 내에서 추가의 카피의 Aj_DmaW_altC, Aj_EasC, Aj_EasE, 및 Aj_EasH (x2)의 발현 효과인 것으로 여겨졌다.
실시예 14: 글루코스의 연속 공급에 의한 시클로클라빈의 증가된 생산.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 기본 효모 균주 EYS2325는 다음 유전자형을 가졌다:
MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52 YERCΔ8::AjEasC/KanMX
YHRCΔ14::ScPdi1/ScFad1/BleR YMRWΔ15::AjEasH/AjDmaW/HygR YN-
RCΔ9::AjEasH/AjEasC/AjEasE/Nat YORWΔ17::AjDmaW/AfEasF
YORWΔ22::AjEasH/AjEasD YPRCt3::AjEasG/AjEasA YPRCΔ15::AjEasE/AjEasC
[ARS/CEN/URA3] [ARS/CEN/HIS3] [ARS/CEN/LEU2]
이것은 균주 EYS2297 (실시예 13에 설명된)을 3개의 빈 플라스미드 pRS313, pRS315, 및 pRS316 (Sikorski, 1989)로 형질전환시켜 균주 원영양체를 제조하였다.
균주 EYS2325를 사용한 CCL의 생산을 바이오매스 생산에 결합시키고 (내부 관찰), 따라서 본 발명자들은 높은 바이오매스를 생산하는 것을 목표로 하는 유가식 발효 공정을 설정하였다. 통상적인 공급 방식을 선택하였고, 통기 및 교반 방식은 발효적 대사를 피하고, 글루코스 축적 및 에탄올 및/또는 아세테이트 형성을 최소화하는 것을 목표로 하였다.
공정은 합성 완전 배지 (SC)를 사용하여 배치로서 출발하였고, 그 후에 글루코스, 염, 비타민, 미량 금속 및 아미노산을 함유하는 공급을 개시하였다. 설명된 발효 공정을 위해 사용된 플랫폼은 1 L의 최대 작업 부피를 갖는 용기를 사용하는 인포스 아게 (Infors AG, 스위스 모트밍겐)의 멀티포스(Multifors) 2이었다. 출발 부피는 0.32 L이고, 공급기 동안 미리 정해진 지수적 공급 방식을 이용하여 총 435.6 mL의 공급물을 첨가하여, 대략 755 mL의 발효 브로쓰의 최종 부피를 얻었다.
씨드 배양액
발효기의 접종 전에 2-단계 씨드 트레인을 선택하였다. 제1 씨드 배양액은 새로 성장시킨 플레이트로부터 출발하여, 4개의 배플 (홈)을 갖는 500 mL 진탕 플라스크 내에서 100 mL의 배지를 접종함으로써 제조하였다. 배지는 20 g/L 글루코스를 갖는 SC-His-Leu-Ura-배지 (포미디엄, 영국 헌스탄톤)로 이루어졌다. 진탕 플라스크를 30℃에서 160 rpm에서 진탕 테이블 상에 놓았다. 세포를 약 0.5의 OD600까지 지수기로 성장시켰고, 이것은 글루코스 고갈 전이었다. 이어서, 제1 씨드 배양액을 사용하여, 0.025의 초기 OD600에 도달하도록 충분한 접종물을 이용하여 4개의 배플 (홈)을 갖는 500 mL 진탕 플라스크 내에서 제2 100 mL SC-His-Leu-Ura-배지 씨드 배양액을 제조하였다. 세포를 OD600이 3.2에 도달할 때까지 지수기로 성장시켰고, 이것은 글루코스 고갈 전이었다.
발효 배치기
발효는 1 L의 최대 작업 부피를 갖는 멀티포스 2 발효기 (인포스 아게, 스위스 모트밍겐) 내에서 수행하였다. 발효기에는 2개의 러시턴(Rushton) 6-블레이드 (blade) 및 4개 배플이 설치되었다. 공기를 이용하여 발효기에 살포하였다. 온도, pH, 교반, 및 통기 속도는 배양 내내 제어하였다. 온도는 20℃에서 유지하였다. pH는 5 M NH4OH 또는 0.5 M HCl의 자동 첨가에 의해 5.85로 유지하였다. 교반기 속도는 800 rpm으로 설정하고, 통기 속도는 1 vvm [L 기체/(L 액체 x min)]로 유지하였다. 발효는 0.32 L SC-His-Leu-Ura, 20 g/L 글루코스 및 0.01% 소포제 용액 (AF204, 시그마 (Sigma))의 출발 부피를 갖는, 38시간의 배치로서 출발하였다. 접종 전에, 발효기 내의 10 mL의 배지를 제거하였다. 이어서, 10 mL의 제2-단계 씨드 배양액 (상기 참조)의 분취액을 발효기의 접종을 위해 사용하여 0.32 L의 최종 부피를 얻었다. 따라서, 접종비는 3% (v/v)이었고, 이에 의해 0.1의 출발 OD600을 얻는다.
공급물 조성 및 일반적인 조건
38 hr의 배치 발효 시간 후에, 글루코스, 비타민, 미량-금속 및 염의 혼합물로 공급을 개시하고, 아미노산을 추가로 보충하였다 (표 52, 53 및 54 참조).
<표 52>
Figure pct00084
<표 53>
Figure pct00085
<표 54>
Figure pct00086
상기 공급기 동안, 수산화암모늄 (5 M NH4OH)을 질소원으로서 및 pH를 제어하기 위해 염기로서 사용하였다. pH를 제어하기 위해 사용한 산은 0.5 M HCl이었다. 공기를 사용하여 생물반응기에 살포하였다. 온도, pH, 교반, 및 통기 속도는 배양 내내 제어하였다. 온도는 20℃에서 유지하였다. pH는 5 M NH4OH 또는 0.5 M HCl의 자동 첨가에 의해 5.85로 유지하였다. 교반기 속도는 초기에 800 rpm으로 설정하고, 통기 속도를 초기에 1.0 vvm으로 설정하였다. 교반기 속도는 최대 1200 rpm에 도달하는 시간 스케줄 (아래 참조)에 따라, 수동으로 단계별로 증가시켰다. 통기는 부피 및 바이오매스 증가 동안 충분한 통기 속도를 유지하기 위해 수동으로 단계별로 증가시켰다 (아래 참조). 통기 및 교반의 관리는 용존 산소 (DO)가 10-20% 미만으로 하락하는 것을 방지하는 것을 목표로 하였다. 유가식 시기 동안 일반적인 작동 조건은 다음과 같았다: 액체 부피: 0.32 - 0.755 L, 온도 20℃, pH 5.85, 교반 속도 800-1200 rpm, 및 공기 유속 1-2 vvm.
공급물의 예상된 총 첨가는 아래에 개략한 공급 방식에 따라 72 hr 내에 435.6 mL이었다. 기체의 정체는 과도하지 않았지만, 여전히 실제 부피를 10%만큼 많이 증대시키는 것으로 예상되었다. 거품 및 기체-정체의 형성은 유가식 배양의 초기 배치기에 사용된 "SC-His-Leu-Ura" 배지 내로 소포제 첨가에 의해 제어하였다. 샘플을 1일 2회 채취하고, CCL 생산에 대해 분석하였다. 바이오매스의 증가에는 주로 OD600의 증가가 따라 일어났다.
공급 방식
공급기를 위해, 미리 정해진 지수적 공급 방식을 사용하였고, 이것은 임의의 유형의 설정값, 예컨대 용존 산소 등에 의해 제어되지 않았다. 지수적 공급 프로파일을 표 55에 제시하고, 교반 및 통기 속도를 표 56에 제시한다.
<표 55>
Figure pct00087
<표 56>
Figure pct00088
분석 절차 :
샘플 제조: 발효 동안 취한 효모 샘플을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 57>
Figure pct00089
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
결과:
CCL 및 페스투클라빈 (FCL)의 생산을 측정하였고, 화합물 역가/시간을 세포 밀도 (OD600)에 대해 그래프로 작성하였다 (도 26 참조). 이것은 세포 질량의 증가와 상호관련된 두 화합물 모두에서 증가를 보여주었다. 바이오매스의 증가는 울트로스펙 (Ultrospec) 10 세포 밀도계 (아머샴 바이오사이언시스 (Amersham Biosciences))에서 OD600을 0.49의 팩터를 곱하여 건조 세포량 (CDW)으로 전환시킴으로써 추정하였다.
청정화된 브로쓰 내에서 측정된 (즉, 세포의 제거 후에), 상기 공정으로 얻어진 CCL의 농도는 약 789 mg/L이었다 (도 26 참조). CCL의 분획이 세포 내에서 또한 검출되었지만, 여전히 대부분의 CCL을 청정화된 브로쓰로부터 단리할 수 있었다. 또한, 약 114 mg/L의 FCL이 생산되었다.
요약하면, 결과는 제어된 유가식 발효 공정 동안 EYS2325의 세포 질량을 증가시키면 CCL 및 FCL의 생산을 증가시킴을 보여준다.
실시예 15: 상이한 유전적 배경을 갖는 효모 균주 내에서 시클로클라빈의 생산.
물질 및 방법 :
본 실험에서 사용한 효모 균주를 표 58에 나열한다:
<표 58>
Figure pct00090
실시예 15에서 사용한 유전자를 표 59에 나열한다:
<표 59>
Figure pct00091
유전자의 클로닝 :
효모 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자. 유전자는 아미노산 서열 (서열 123, 및 102 내지 109) + 번역 중지 코돈을 코딩한다. 합성 동안, 모든 유전자에는 5'-단부에 HindIII 제한 인식 부위를 포함하는 DNA 서열 AAGCTTAAA, 및 3'-단부에 SacII 제한 부위를 포함하는 DNA 서열 CCGCGG이 제공되었다. 유전자를 HindIII 및 SacII를 사용하여, HindIII 및 SacII를 포함하는 다중의 클로닝 부위에 의해 분리된 천연 효모 프로모터 및 종결인자를 함유하는 효모 발현 카세트 (서열 110, 111, 124, 및 172) 내로 클로닝하였다. 모든 카세트에는 AscI 제한 부위가 측면에 접해있었다. 유전자 발현 카세트 (서열 110, 111, 124, 및 172)는 발현 카세트의 클로닝을 위한 AscI 부위를 제공하기 위해 링커 (서열 113)가 그 내부에 삽입된 pUC18 기반 플라스미드 벡터 (서열 112) 상에 포함되었다.
유전자 발현 카세트를 pUC18 기반 재조합 벡터 내로 서브-클로닝하였고, 이들은 각각 중심에서 AscI 부위 및 Mlu I 부위가 측면에 접해 있는, 120 bp 상동성 재조합 태그 (HRT) 서열을 가졌다. 이들 HRT는 제1 태그의 제2 절반이 제2 태그의 제1 절반에 동일하고 그 등등이 되도록 설계되었다.
3개의 헬퍼 단편을 사용하여 2개의 플라스미드를 조립하였고, 이들은 함께 전체 CCL 경로를 구성하였다: 1개의 헬퍼 단편은 효모 영양요구성 마커 및 박테리아 pMB1 복제 기원을 포함하였다. 제2 헬퍼 단편은 효모 내에서 복제를 위한 ARS4/CEN6 서열 및 박테리아 클로람페니콜 내성 마커를 포함하였다. 두 단편은 측면 HRT를 가졌다. 제3 단편은 짧은 600 bp 스페이서 서열에 의해 분리된 HRT만을 사용하여 설계되었다. 모든 헬퍼 단편은 이. 콜라이 내에서 증폭을 위해 pUC18 기반 백본 내에 클로닝되었다. 모든 단편은 그들이 절제될 수 있는 AscI 부위 내에 클로닝되었다.
2개의 플라스미드 CCL-HRT1 및 CCL-HRT5 (서열 173 및 174)를 제조하기 위해, 3개의 헬퍼 플라스미드로부터 플라스미드 DNA를 CCL-HRT1에 대해 CpDmaW, AfEasF, AjEasE, 및 AjEasC, 또는 CCL-HRT5에 대해 AjEasD, AjEasG, AjEasH, 및 AjEasA를 포함하는 플라스미드 DNA와 혼합하였다. 플라스미드 DNA의 혼합물을 AscI로 소화시켰다. 이것은 모든 단편을 플라스미드 백본으로부터 방출시키고, 말단에서 HRT를 갖는 단편을 생산하고, 이것은 다음 단편의 HRT와 순차적으로 겹친다. 효모 균주 EYS1456을 각각의 소화된 혼합물로 형질전환시키고, 플라스미드 CCL-HRT1 및 CCL-HRT5를 문헌 [Shao 2009]에 설명된 바와 같이 상동성 재조합에 의해 생체 내에서 조립하였다. 2개의 플라스미드를 효모 형질전환체로부터 단리하고, 플라스미드 DNA의 용이한 증폭 및 정제를 허용하는 이. 콜라이 내로 역 형질전환시켰다. 2개의 플라스미드 CCL-HRT1 및 CCL-HRT5를 효모 균주의 패널 내로 동시-형질전화시켰다 (표 58).
성장 조건 :
2개의 벡터 CCL-HRT1 및 CCL-HRT5를 포함하는 조작된 효모 균주를 류신 및 우라실이 없는, 2% 글루코스를 갖는 3 mL 표준 SC 브로쓰 (포미디엄, 영국 헌스탄톤) 내에서 성장시켰다. 배양액을 20℃에서 96시간 동안 연속적으로 진탕하면서 성장시켰다.
분석 절차 :
샘플 제조: 효모 배양액을 10분 동안 1000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛 및 상청액을 분리하였다. 추가로 정제하지 않고, 5 ㎕의 상청액을 micrOTOF-Q II (브루커 달토닉 게엠베하, 독일 브레멘)에 결합된 UPLC-TOF (워터스 액퀴티™ 초고성능 LC, 워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내에 주입하였다. 정지상: 컬럼은 액퀴티 UPLC® 브릿지드 에틸 하이브리드 (BEH) C18 1.7 ㎛ 2.1x100 mm이었다. 액체 크로마토그래피 방법: 이동상 A: H2O + 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 진행 조건:
<표 60>
Figure pct00092
PDA 파라미터: λ 범위: 210 nm 내지 500 nm. 분리능: 1.2 nm. 샘플링 속도: 5 지점/sec. ELSD 파라미터: 게인: 50, 기체압: 40 psi, 네뷸라이저 방식: 가열, 파워 수준: 80%, 드리프트 튜브: 80℃. TOF 파라미터: 전원: 엔드 플레이트 오프셋: -500 V. 모세관: -4500 V. 네뷸라이저: 1.6 bar. 건조 기체: 8.0 L/min. 건조 온도: 180℃. 스캔 방식: MS 스캔. 질량 범위: 80 내지 1000 m/z.
결과 :
모든 균주의 배양 상청액을 LC-MS에 의해 분석하고, 예상된 질량의 시클로클라빈 (m/z = 239.1543+/-0.01 Da) 및 예상된 질량의 페스투클라빈 (m/z = 241.1699+/-0.01 Da)의 이온 크로마토그램을 추출하였다. 피크 하 면적을 통합하고, CCL 및 FCL의 생산을 내부 표준물에 기반하여 계산하였다. CCL 및 FCL의 양을 비교하였고 (도 27), 이것은 모든 균주 내에서 두 화합물의 생산을, 그러나 다양한 양으로의 생산을 보여주었다. 이들 결과는 CCL 및 FCL 생산이 에스. 세레비지아에의 특이적 균주 또는 유전자형에 의존하지 않음을 보여준다.
참고문헌:
Figure pct00093
Figure pct00094
SEQUENCE LISTING <110> BASF SE Evolva SA <120> Genes and Processes for the Production of Clavine-Type Alkaloids <130> PF 74187 <150> US 61/691848 <151> 08-22-2012 <150> EP 12181388.5 <151> 08-22-2012 <150> US 61/786841 <151> 03-15-2013 <150> EP 13159444.2 <151> 03-15-2013 <150> EP 13178008.2 <151> 07-25-2013 <160> 192 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 534 <212> PRT <213> Aspergillus japonicus <400> 1 Met Thr Ala Gly Gln Gly Ile Lys Thr Gly Asn Ala Ser Asp Cys Glu 1 5 10 15 Val Tyr Arg Thr Leu Ser Val Ala Leu Asp Phe Ala Asn Gln Asp Glu 20 25 30 Glu Leu Trp Trp His Ser Thr Ala Pro Met Phe Ala Gln Met Leu Gln 35 40 45 Ser Thr Asn Tyr Asn Leu His Ala Gln Tyr Lys His Leu Leu Ile Tyr 50 55 60 Lys Lys Asn Val Ile Pro Phe Leu Gly Val Tyr Pro Thr Asn Asp Lys 65 70 75 80 Pro Arg Trp Leu Ser Ile Leu Thr Arg Tyr Gly Thr Pro Phe Glu Leu 85 90 95 Ser Leu Asn Cys Ser Gly Pro Leu Val Arg Tyr Thr Tyr Glu Pro Ile 100 105 110 Asn Ala Ala Thr Gly Thr Ala Arg Asp Pro Phe Asn Thr His Ala Val 115 120 125 Trp Asp Ser Leu Glu Gln Leu Met Ala Leu Gln Ser Gly Ile Asp Leu 130 135 140 Asp Leu Phe Arg His Phe Lys Asn Asp Leu Thr Leu Ser Ala Glu Glu 145 150 155 160 Ser Glu Tyr Leu Tyr Lys Asn Asn Leu Val Gly Glu Gln Ile Arg Thr 165 170 175 Gln Asn Lys Leu Ala Leu Asp Leu Gln Asp Gly Glu Phe Val Val Lys 180 185 190 Thr Tyr Ile Tyr Pro Ala Leu Lys Ser Leu Ala Thr Gly Arg Ser Ile 195 200 205 His Glu Leu Val Phe Gly Ser Ala Phe Arg Trp Ser Lys Gln Tyr Pro 210 215 220 Glu Leu Arg Lys Pro Leu Asp Thr Leu Glu Gln Tyr Val Tyr Ser Arg 225 230 235 240 Gly Pro Ser Ser Thr Ala Ser Pro Arg Leu Leu Ser Cys Asp Leu Ile 245 250 255 Asp Pro Thr Lys Ser Arg Ile Lys Ile Tyr Leu Leu Glu Arg Met Val 260 265 270 Thr Leu Glu Ala Leu Glu Asp Leu Trp Thr Met Gly Gly Glu Arg Thr 275 280 285 Asp Ala Ser Thr Leu Ala Gly Leu Glu Met Ile Arg Glu Leu Trp Glu 290 295 300 Leu Ile Arg Leu Pro Ala Gly Leu Gln Ser Tyr Pro Ala Pro Tyr Leu 305 310 315 320 Pro Ile Gly Thr Ile Pro Asp Glu Gln Leu Pro Leu Met Ala Asn Tyr 325 330 335 Thr Ile His His Asp Asp Pro Val Pro Glu Pro Gln Val Tyr Phe Thr 340 345 350 Thr Phe Gly Arg Asn Asp Met Gln Ile Ala Asp Ala Leu Ala Thr Phe 355 360 365 Phe Glu Arg Arg Gly Trp His Glu Met Ala Arg Gln Tyr Lys Ala Glu 370 375 380 Leu Cys Ser His Tyr Pro His Ala Asp His Glu Thr Leu Asn Tyr Leu 385 390 395 400 His Ala Tyr Ile Ser Phe Ser Tyr Arg Lys Asn Lys Pro Tyr Leu Ser 405 410 415 Val Tyr Leu Gln Ser Leu Glu Thr Gly Asp Trp Val Thr Cys Lys Leu 420 425 430 Ser Pro Ser Val Phe Leu Ser Cys Thr Leu Pro His Arg Gly Tyr Ile 435 440 445 Pro Asp Asp Leu Thr Cys Ser Arg Ser Ile Leu Gln Leu Cys Pro Cys 450 455 460 Gly Pro Arg Pro Leu Ser His Arg Pro Arg Ala Val Gln Ala Asp Gln 465 470 475 480 Asp Arg Arg Asp His Arg Ser Arg Asp Glu Thr Pro Thr His Pro Gly 485 490 495 Trp Ile Gly Ala Arg Arg His His Pro Val Leu Gly Asn His Leu Val 500 505 510 Gly Pro Asp Leu Pro Ala Ser Arg Arg Gly Val Ala Ser Ala Leu Tyr 515 520 525 Val Gly Arg Gly Thr Arg 530 <210> 2 <211> 412 <212> PRT <213> Aspergillus japonicus <400> 2 Met Thr Ile Asp Pro Ser Ser Pro Gly Ala Pro Ala Ser Lys Leu Phe 1 5 10 15 Gln Pro Met Lys Ile Gly Leu Cys His Leu Gln His Arg Leu Ile Met 20 25 30 Ala Pro Thr Thr Arg Tyr Arg Ala Asp Ser Thr Ala Thr Pro Leu Pro 35 40 45 Phe Val Gln Glu Tyr Tyr Ala Gln Arg Ala Ala Val Pro Gly Thr Leu 50 55 60 Leu Ile Thr Glu Ala Thr Asp Ile Ser Pro Gln Ala Ala Gly Glu Pro 65 70 75 80 His Ile Pro Gly Leu Tyr Ser Ala Thr Gln Ile Ala Ala Trp Arg Gly 85 90 95 Ile Val Ser Ala Val His Arg Arg Gly Cys Tyr Ile Phe Cys Gln Leu 100 105 110 Trp Ala Thr Gly Arg Ala Ala Asp Pro Ala Leu Leu Lys Glu Lys Gly 115 120 125 Phe Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Val Pro Ile Glu Thr Glu Ser Gln 130 135 140 Gln Pro Gln Pro Leu Thr Gln Ala Glu Ile Glu Gly Tyr Ile Ala Asp 145 150 155 160 Phe Val Thr Ala Ala Arg Val Ala Val His Glu Val Gly Phe Asp Gly 165 170 175 Val Glu Leu His Gly Ala Asn Gly Tyr Leu Ile Asp Gln Phe Thr Gln 180 185 190 Trp Pro Cys Asn Gln Arg Thr Asp Cys Trp Gly Gly Ser Ile Glu Asn 195 200 205 Arg Ala Arg Phe Ala Leu Ala Val Thr Arg Ala Val Val Asp Ala Val 210 215 220 Gly Ala Glu Arg Val Gly Val Lys Leu Ser Pro Trp Ser Gln Tyr Ala 225 230 235 240 Gly Met Gly Val Met Ala Asp Leu Val Pro Gln Phe Glu Phe Leu Ile 245 250 255 Lys Arg Leu Arg Glu Glu Tyr Asn Asp Gly Pro Gly Leu Ala Tyr Leu 260 265 270 His Leu Ala Asn Ser Arg Trp Leu Asp Glu Glu Thr Ser His Pro Asp 275 280 285 Pro His His Glu Val Phe Val Arg Ala Trp Arg Gly Ser Gly Arg Asp 290 295 300 Gly Ile Glu Ala Lys Lys Glu Ala Pro Pro Val Ile Leu Ala Gly Gly 305 310 315 320 Tyr Asp Ala Val Ser Ala Pro Glu Val Ala Asp Lys Val Phe Lys Glu 325 330 335 Glu Asp Asn Val Ala Val Ala Phe Gly Arg Tyr Phe Ile Ser Thr Pro 340 345 350 Asp Leu Pro Phe Arg Met Gln Arg Gly Ile Pro Leu Gln Lys Tyr Asp 355 360 365 Arg Ala Ser Phe Tyr Thr Ser Leu Leu Lys Glu Gly Tyr Leu Asp Tyr 370 375 380 Pro Tyr Ser Ala Glu Tyr Val Ala Glu Phe Gly Gln Arg Leu Lys Lys 385 390 395 400 Lys Glu Ala Ala Ala Thr Gly Ser Ile Cys Gln Gly 405 410 <210> 3 <211> 509 <212> PRT <213> Aspergillus japonicus <400> 3 Met Ala Pro Asp Ser Lys Pro Thr Tyr Thr Thr Ala Asn Gly Cys Pro 1 5 10 15 Phe His Lys Pro Glu Gly Pro Pro Ala Asp Gly Arg Thr Leu Ala Leu 20 25 30 Ser Asp His His Leu Val Asp Thr Leu Ala His Phe Asn Arg Glu Lys 35 40 45 Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly Ala Tyr Gly Glu 50 55 60 Phe Glu Val Thr Ala Asp Ile Ser Asp Ile Cys Asp Ile Asp Met Leu 65 70 75 80 Val Gly Val Gly Lys Lys Thr Pro Cys Val Thr Arg Phe Ser Thr Thr 85 90 95 Gly Leu Glu Arg Gly Ser Asn Glu Gly Met Arg Asp Leu Lys Gly Met 100 105 110 Ala Cys Lys Phe Tyr Thr Thr Glu Gly Asn Trp Asp Trp Val Met Leu 115 120 125 Asn Phe Pro Phe Phe Phe Ile Arg Asp Pro Val Lys Phe Pro Ser Leu 130 135 140 Met His Ala Gln Arg Arg Asp Pro Gln Thr Asn Leu Leu Asn Pro Asn 145 150 155 160 Met Tyr Trp Asp Trp Val Thr Asn Asn His Glu Ser Leu His Met Val 165 170 175 Leu Leu Gln Phe Ser Asp Phe Gly Thr Met Phe Asn Trp Arg Ser Met 180 185 190 Ser Gly Tyr Met Ala His Ala Tyr Lys Trp Val Lys Pro Asp Gly Ser 195 200 205 Phe Lys Tyr Val His Ile Phe Leu Ser Ser Asp Arg Gly Pro Asn Phe 210 215 220 Thr Asp Gly Gln Gln Ala Lys Gly Thr Asn Asp Leu Asp Pro Asp His 225 230 235 240 Ala Thr Arg Asp Leu Tyr Glu Ala Ile Glu Arg Gly Glu Tyr Pro Thr 245 250 255 Trp Thr Ala Ser Val Gln Val Val Asp Pro Lys Asp Ala Pro Asn Leu 260 265 270 Gly Tyr Asn Ile Leu Asp Val Thr Lys His Trp Asn Leu Gly Thr Tyr 275 280 285 Pro Lys Asp Val Thr Leu Ile Pro Pro Lys Val Phe Gly Lys Leu Thr 290 295 300 Leu Lys Arg Asn Pro Ala Asn Tyr Phe Ala Glu Ile Glu Gln Leu Ala 305 310 315 320 Tyr Ser Pro Ser Asn Met Val Pro Gly Val Ala Pro Ser Glu Asp Pro 325 330 335 Ile Leu Gln Ala Arg Ile Phe Ala Tyr Pro Asp Ala Gln Arg Tyr Arg 340 345 350 Leu Gly Ala Asn His Gln Gln Ile Pro Val Asn Arg Ser Ala His Thr 355 360 365 Phe Asn Pro Ile Ala Arg Asp Gly Gln Gly Thr Phe Asp Ala Asn Tyr 370 375 380 Gly Ala His Pro Gly Phe Leu Thr Gln Gln Gln Pro Val Arg Phe Ala 385 390 395 400 Glu Pro Arg Glu Pro Asp Pro Lys Tyr Asn Glu Trp Leu Lys 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Phe Leu Gln Gly Gly Gly Val Ser 245 250 255 Ser Trp Leu Ser Tyr Ala His Gly Leu Ala Val Asp Asn Val Leu Glu 260 265 270 Tyr Glu Val Val Thr Ala Lys Gly Glu Ile Val Ile Ala Asn Ala His 275 280 285 Gln Asn Pro Asp Leu Phe Trp Ala Leu Arg Gly Gly Gly Gly Gly Thr 290 295 300 Phe Gly Val Val Thr Gln Ala Thr Leu Gln Val His Pro Asp Leu Pro 305 310 315 320 Val Ser Val Ala Asp Ala Val Val Thr Gly Ser Arg Ala Asp Ala Thr 325 330 335 Phe Trp Ser His Gly Val Ala Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Phe Leu 340 345 350 Asn Asn His Gly Thr Ala Gly Gln Phe Ile Leu Arg Asn Thr Asp Asp 355 360 365 Asp Thr Val Gln Ala Ser Leu Thr Met Tyr Phe Ser Asn Leu Thr Val 370 375 380 Pro Ala Val Ala Asp Glu Arg Met Asp Pro Leu Arg Arg Ala Leu Glu 385 390 395 400 His Asn Gly His Pro Tyr Gln Leu Thr Ser Arg Phe Leu Pro Gln Ile 405 410 415 Ser Ser Thr Phe Arg His Thr Ala Asp Arg Tyr Pro Glu Asp Tyr Gly 420 425 430 Ile Leu Met Gly Ser Val Leu Val Ser Leu Asp Leu Phe Asn Ser Ala 435 440 445 Thr Gly Pro Ala Ala Leu Ala Gln His Phe Ala Arg Leu Pro Met Thr 450 455 460 Pro Asp Asp Leu Leu Phe Thr Ser Asn Leu Gly Gly Arg Val Ser Ser 465 470 475 480 Leu Asn Arg Asp Pro Ala Ser Thr Ala Met His Pro Gly Trp Arg Asp 485 490 495 Ala Ala Gln Leu Leu Asn Phe Val Arg Gly Val Gly Ala Pro Ser Leu 500 505 510 Ala Ala Lys Ala Thr Ala Leu His Glu Leu Gln Thr Val Gln Met Ala 515 520 525 Arg Leu Tyr Glu Ile Glu Pro Ala Phe Gln Ile Ser Tyr Arg Asn Leu 530 535 540 Gly Asp Pro Ser Glu Arg Arg Ser Arg Glu Val Tyr Trp Gly Ser Asn 545 550 555 560 Tyr Ala Arg Leu Val Glu Val Lys Arg Arg Trp Asp Pro Glu Gly Leu 565 570 575 Phe Phe Ser Lys Leu Gly Ile Asp Gly Asp Ala Trp Asp Ala Glu Gly 580 585 590 Met Cys Arg Gln Thr Arg Gln Gly Ala Trp Asn Val Ala Val Lys Trp 595 600 605 Val Gln Ser Phe Leu Gly Ser Leu Ser Ala Ser Val Val 610 615 620 <210> 6 <211> 339 <212> PRT <213> Aspergillus japonicus <400> 6 Met Gly Ser Ile Asn Pro Pro Ile Leu Asp Ile Arg Gln Ser Thr Phe 1 5 10 15 Glu Thr Ser Ile Pro Gln Gln Val Thr Glu Gly Leu Thr Lys Asp Pro 20 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Gly Glu Gly Arg Val Phe Asp Glu Glu Glu Trp Tyr Phe His 245 250 255 Ser Glu Trp Asn Phe Ala Leu Gly Arg His Glu Ala Ala Leu Ile Pro 260 265 270 Arg Asp Arg Asp Ile Thr Leu Gly Pro Pro Leu Glu Gln Val Val Val 275 280 285 Arg Arg Gly Glu Lys Val Arg Phe Gly Cys Ser Tyr Lys Tyr Ser Ala 290 295 300 Ala Glu Arg Glu His Leu Phe Ala Gly Ala Gly Leu Glu Asn Val Ala 305 310 315 320 Ser Trp Ser Ala Lys Gly Cys Asp Val Ala Phe Tyr Gln Leu Lys Met 325 330 335 Arg Pro Glu <210> 7 <211> 284 <212> PRT <213> Aspergillus japonicus <400> 7 Met Thr Ile Leu Val Leu Gly Gly Arg Gly Lys Thr Ala Ser Arg Leu 1 5 10 15 Ser Ala Leu Leu His Glu Ala Gln Ile Pro Phe Val Val Gly Thr Ser 20 25 30 Ser Thr Ala Pro Ile Ala Thr Tyr Arg Thr Ala His Phe Asp Trp Leu 35 40 45 Asn Lys Asp Thr Trp Thr Asn Ala Trp Asp Gln Ala Pro Glu Pro Ile 50 55 60 Thr Ala Ile Tyr Leu Val Gly Ala His Ala Pro Glu Phe Val His Pro 65 70 75 80 Met Phe Glu Phe Ile Asp Leu Ala His Ser Arg Gly Val Arg Arg Tyr 85 90 95 Ala Leu Val Ser Ala Ser Asn 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Penicillium roqueforti <400> 29 Ser Met Ala Pro Met Phe Ala Glu Met Leu Lys Val Ala Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Ile His Ser Arg Tyr Lys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Lys Phe Ile Ile 20 25 30 Pro Phe Leu Gly Val Tyr Pro Thr Lys Thr Asn Asp Arg Trp Leu Ser 35 40 45 Ile Leu Thr Arg Tyr Gly Thr Pro Phe Glu Leu Ser Leu Asn Cys Thr 50 55 60 His Ser Val Val Arg Tyr Thr Phe Glu Pro Ile Asn Ala Ala Thr Gly 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asp Pro Phe Asn Thr His Ala Ile Trp Asp Ala Leu Asp 85 90 95 Thr Leu Ile Pro Leu Gln Lys Gly Ile Asp Leu Glu Phe Phe Ala His 100 105 110 Leu Lys Arg Asp Leu Thr Val Asn Asp Gln Asp Thr Ala Tyr Leu Leu 115 120 125 Glu Lys Lys Lys Val Gly Gly Gln Ile Arg Thr Gln Asn Lys Leu Ala 130 135 140 Leu Asp Leu Lys Gly Gly Glu Phe Val Leu Lys Ala Tyr Ile Tyr Pro 145 150 155 160 Ala Leu Lys Ser Leu Ala Thr Gly Lys Pro Val Gln Glu Leu Met Phe 165 170 175 Asp Ser Val His Arg Leu Ser His Gln Tyr Pro Thr Leu Ala Ala Pro 180 185 190 Leu Arg Lys Leu Glu Glu Tyr Val His Ser Arg Gly Thr Ser Ser Thr 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ttggtttttg gttctgcttt cagatggtct 660 aagcaatacc cagaattgag aaagccattg gataccttgg aacaatacgt ttattctaga 720 ggtccatctt ctactgcctc tccaagatta ttgtcttgcg atttgattga ccctaccaag 780 tccagaatca aaatctactt gttggaaaga atggtcactt tggaagcctt ggaagatttg 840 tggactatgg gtggtgaaag aactgatgct tctactttgg ctggtttgga aatgattaga 900 gaattgtggg aattgatcag attgccagct ggtttacaat cttatccagc tccatatttg 960 ccaatcggta ctattccaga tgaacaattg ccattgatgg ccaactacac catccatcat 1020 gatgatccag ttccagaacc acaagtttac tttactactt tcggtagaaa cgacatgcaa 1080 attgctgatg ctttggctac tttcttcgaa cgtcgtggtt ggcacgaaat ggctagacag 1140 tacaaagctg aattgtgctc tcattaccca catgctgatc acgaaacttt gaactacttg 1200 cacgcttaca tctcattctc ttacagaaag aacaagccat acttgtccgt ctacttgcaa 1260 tctttggaaa ctggtgattg ggttacctca tccttcaact ctgtccatgt ggaccctggc 1320 ctttcagcca ccgtccaaga gctgtccaag ctgaccaaga ccgccggaac caccgttagg 1380 gagacaaaac taccactaac cccagatgga tcagagcctg gcgtcatcac ccagtactag 1440 <210> 103 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EasA of A. japonicus codon optimized for S. cerrevisiae <400> 103 atgaccatcg atccatcttc tccaggtgct ccagcttcta agttgtttca acctatgaag 60 attggtttgt gccacttgca acatagattg attatggctc caactaccag atacagagct 120 gattctactg ctactccatt gccattcgtt caagaatatt atgctcaaag agctgctgtt 180 ccaggtactt tgttgattac tgaagctacc gatatttctc cacaagctgc tggtgaacca 240 catattccag gtctatattc tgctactcaa attgctgctt ggagaggtat agtttctgct 300 gttcatagaa gaggttgcta cattttctgt caattgtggg ctactggtag agcagctgat 360 cctgctttgt tgaaagaaaa aggtttccca ttggtcagtt cctccgatgt tccaattgaa 420 actgaatctc aacaaccaca accattgacc caagctgaaa ttgaaggtta cattgctgat 480 ttcgttaccg ctgctagagt tgctgttcat gaagttggtt ttgatggtgt tgaattgcat 540 ggtgctaacg gttacttgat tgatcaattc actcaatggc catgcaatca aagaactgat 600 tgctggggtg gttctattga aaacagagct agatttgctt tggctgttac tagagctgtt 660 gttgatgctg ttggtgctga aagagttgga gttaagttgt ctccatggtc acaatatgct 720 ggtatgggtg ttatggctga tttggttcca caattcgaat tcttgattaa gagattgaga 780 gaagagtaca acgacggtcc aggtttggct tacttgcatt tggctaattc tagatggttg 840 gacgaagaaa cttctcatcc agatccacat catgaagttt ttgttagagc ttggagaggt 900 tctggtagag atggtattga agctaaaaaa gaagccccac cagttatttt ggctggtggt 960 tatgatgctg tttctgctcc agaagttgct gacaaggttt tcaaagaaga agataacgtt 1020 gctgttgcct tcggtagata ctttatttct actccagatt tgccattcag aatgcaaaga 1080 ggtattccat tgcaaaagta cgatagagct tctttctaca cctccttatt gaaagaaggt 1140 tacttggact atccatactc cgctgaatat gttgctgaat tcggtcaaag attgaagaag 1200 aaagaagctg ctgctaccgg ttctatttgt caaggttaa 1239 <210> 104 <211> 1530 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EasC of A. japonicus codon optimized for S. cerrevisiae <400> 104 atggctccag attctaagcc aacttacact actgctaatg gttgtccatt tcataagcct 60 gaaggtccac cagctgatgg tagaactttg gctttgtctg atcatcattt ggttgatacc 120 ttggcccatt tcaacagaga aaagattcca gaaagagttg ttcacgctaa aggtgctggt 180 gcttatggtg aatttgaagt tactgccgat atctccgata tttgcgatat cgatatgttg 240 gttggtgtcg gtaaaaagac tccatgtgtt actagattct ctaccactgg tttggaaaga 300 ggttctaacg aaggtatgag agatttgaaa ggtatggctt gtaagttcta cactactgaa 360 ggtaattggg attgggtcat gttgaatttc ccattcttct tcattcgtga tccagtcaag 420 ttcccatctt tgatgcacgc tcaaagaaga gatccacaaa ctaatttgtt gaacccaaac 480 atgtactggg attgggttac caacaatcat gaatccttgc acatggtctt gttgcaattt 540 tctgatttcg gtactatgtt caattggaga tccatgtctg gttatatggc tcatgcttac 600 aaatgggtta agccagatgg ttcttttaag tacgtccaca tcttcttgtc atctgataga 660 ggtccaaatt tcaccgatgg tcaacaagct aaaggtacaa atgatttgga tccagatcac 720 gctactagag acttgtatga agctattgaa agaggtgaat acccaacttg gactgcttct 780 gttcaagttg ttgatccaaa agatgctcca aacttgggtt acaacatttt ggatgttact 840 aagcactgga acttgggtac ttacccaaaa gatgttactt tgatcccacc aaaggttttc 900 ggtaagttga ctttgaaaag aaacccagct aactacttcg ccgaaattga acaattggct 960 tactctccat ctaacatggt tccaggtgtt gctccatctg aagatccaat tttacaagct 1020 agaattttcg cttacccaga cgctcaaaga tatagattgg gtgctaacca tcaacaaatc 1080 ccagttaata gatccgctca tacctttaac ccaattgcta gagatggtca aggtactttt 1140 gatgctaatt atggtgctca tccaggtttc ttgactcaac aacaaccagt tagatttgcc 1200 gaacctagag aaccagatcc aaagtataat gaatggttga aagaaatcca atccaagtcc 1260 tggttgcaaa ctactgaaca tgattacaag ttcgccagag atttctacga agttttgcca 1320 gattttagag gtcaagaatt ccaagatacc atggtccaaa acatggttga atctgttgct 1380 caaaccagag ccgaaattca aaagcaagtt tacgaaacct ggaagttggt ttctccagct 1440 ttggctgcta gaattcaaaa aggtgttgaa accttgttgc aaaagtctga agctccagct 1500 gaagaatctt ttattccagc tagattgtga 1530 <210> 105 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EasD of A. japonicus codon optimized for S. cerrevisiae <400> 105 atgaccgttg tcaactctag aattttcgct gttactggtg gtgcttctgg tattggtgct 60 gctacttgta gattattggc tgctagaggt gctgctgtta tatgcattgg tgatatttct 120 ccaaagggtt tcgaatccgt tacctctgat attcaagcct tgaatccagc tacaaaggtt 180 cattgcacta gattggatgt ttcttcatcc gctgaagttg atgcttggtt gcaaactatc 240 gttcaaactt ttggtgactt gcatggtttg gctaatgttg ctggtattgc tcaaccagct 300 ggtgctagac aagctccagc tttgttggaa gaaactgatg aagaatggca aagagttttc 360 aaggttaact tggacggtgt tttctactgt actagagctg gtattagagc tatgaaggct 420 ttgccaggtc caaaagatag agctatcgtt aacattggtt ccattgctgc ctttatccat 480 ttgccagatg cttatgctta cggtacttct aaaggtgctt gtgcttactt tacttcttgt 540 gctgctatgg atgcttggcc attgggtatt agaatcaatt ctgtttctcc aggtattacc 600 gatactccag ctttgccaca attcatgcca caagctaaat ctatcgacga agtaaaagaa 660 gcctacatca aagaaggttt cccaatcatt caacctgaag atgttgctag aactatcgtc 720 tggttgttgt ctgaagattc tagaccagtt tacggtgcca atattaacgt tggtgctgca 780 actccataa 789 <210> 106 <211> 1866 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EasE of A. japonicus codon optimized for S. cerrevisiae <400> 106 atgggtcaat ccagaggtat tttgggtggt gttagacaat tgatcttggt tattttggtt 60 ggtgcctact tgtctagatt gtctgctgtt gatgatgata gacatgattg cagatgtaga 120 ccaggtgaac catgttggcc aactgtttct cattggtcta ctttgaacga atctattggt 180 ggtgctttgg ctcatgttaa gccaattgct catgtttgtc atcaatccgg tcaagattct 240 tctgcttgcg aacaagtttt acaagaatcc ttggattcta agtggcgtgc ttctcatact 300 ggtgctttac aagattgggt ttgggaaggt ggtgctgaat ctaatcaaac ttgttactac 360 ttgagatcag gtccagctgg ttcttgtcat caaggtagaa ttccattata ttccgctgct 420 gttaagtccg cttctgatgt tcaaaaggtt gttgatttca ccagacaaca caacttgaga 480 ttggttatta gaaacaccgg tcatgatggt tctggtagat catctggtcc agattctgtt 540 gaaattcata cccatcactt gaactccgtt caataccatc caaattttag accagctggt 600 tcctctgaaa gacaatctgc tccaggtcaa ccagctgtta ctgttggtgc tggtattttg 660 ttgggtgact tgtatgctag aggtgcttct gaaggttgga tagttgttgg tggtgaatgt 720 ccaacagttg gtgctgctgg tggtttttta caaggtggtg gtgtttcttc ttggttgtct 780 tatgctcatg gtttggctgt tgataacgtc ttggaatacg aagttgttac tgctaagggt 840 gaaatcgtta ttgctaacgc tcatcaaaac ccagatttgt tttgggcttt gagaggcggt 900 ggtggtggta cttttggtgt tgttactcaa gctacattgc aagttcatcc agatttgcca 960 gtttctgttg ctgatgctgt tgttactggt tctagagctg atgctacttt ttggtcacat 1020 ggtgttgctg ctttgttgag agctttacaa ttcttgaaca accatggtac tgccggtcaa 1080 ttcattttga gaaacactga tgatgatacc 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optimized for S. cerrevisiae Af_optSc <400> 107 atgacaattt ctgctccacc tattattgat attagacaag cagggttgga aagttctata 60 ccagaccaag ttgtcgaagg tctaactaag gaagtcaaga cacttcctgc acttttgttt 120 tactcaacaa aaggcattca gcattggaat agacattccc acgctgctga tttctatcct 180 agacatgagg aactatgcat cctcaaagct gaagctagta agatggctgc ttcaatcgct 240 caagatagct tagtaatcga tatgggttct gccagtatgg ataaggttat cctcctgttg 300 gaagcgttag aggaacagaa aaagtccata acttactacg ccttggacct gtcctactct 360 gaattagcat ctaattttca agccattcca gtggacagat tccactatgt tagattcgca 420 gccttacatg gcacttttga cgatggactt cactggttac aaaacgctcc tgatattagg 480 aacagaccaa gatgtatact gttatttggg ttaaccatcg gtaacttctc acgagataat 540 gctgcatctt tcctcagaaa tatcgcccaa tctgctctgt ctacatcccc aactcaatca 600 tccattatag tgtctctaga ttcatgtaaa cttcctacga aaatcttaag agcctacacc 660 gcagatggag tagttccatt tgctcttgcc tcactaagct atgcgaattc attgtttcat 720 ccaaaaggcg acagaaagat tttcaatgaa gaggattggt actttcattc tgaatggaac 780 catgcattgg gtcgtcacga agctagtttg atcacacaat caaaagatat ccaattaggt 840 gcaccactag agactgttat agtcagacgt gatgaaaaga tcagatttgg atgctcttac 900 aaatacgaca aagctgaaag ggatcagttg tttcattcag cgggtttgga ggatgccgca 960 gtgtggacag caccagactg tgacgtagca ttctatcaat tgagactaag attgaactaa 1020 <210> 108 <211> 855 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EasG of A. japonicus codon optimized for S. cerrevisiae <400> 108 atgaccatct tggttttggg tggtagaggt aaaactgctt ctagattgtc tgctttgttg 60 catgaagctc aaatcccttt tgttgtcggt acttcttcta ctgctccaat tgctacttat 120 agaaccgctc attttgactg gttgaacaag gatacttgga ctaatgcttg ggatcaagct 180 ccagaaccta ttactgctat ctatttggtt ggtgctcatg ctccagaatt tgttcatcca 240 atgttcgaat tcatcgattt ggctcattct agaggtgtta gaagatacgc tttggtttct 300 gcttctaaca ctgaaaaagg tgatccaatg atgggtgaag ctcatgctca tttggattct 360 aaagaaggtg ttaagtacgt cgtcttaaga ccaacttggt ttatggaaaa ccacatcgaa 420 gatccacatt tgtcttggat taagaccgaa aacaaaatct actctgctac tggtccaggt 480 aagattccat ttgtttctgc tgatgatatt gccagagttg cttttcatgc tttgactcaa 540 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actaccttgg gtagacaatc tccagaatct atgttgaact tcttgactgc tttgactgat 480 ttcactgctg aaaatggtgc tactagagtt ttgccaggtt ctcatttgtg ggaagatttt 540 tctgctccac caccaaaagc tgatactgct attccagctg ttatgaatcc aggtgatgct 600 gttttgttta ctggtaaaac tttacatggt gccggtaaga acaacactac tgattttttg 660 agaagaggtt tcccattgat catgcaatct tgtcaattca ctccagttga agctagtgtt 720 gctttgccaa gagaattggt tgaaactatg actccattgg cccaaaaaat ggttggttgg 780 agaactgttt ctgctaaggg tgttgatatt tggacctacg atttgaagga tttggctacc 840 ggtattgact tgaagtctaa tcaagttgct aagaaggcct aa 882 <210> 110 <211> 1801 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P/A cassette including both Asc I sites <400> 110 ggcgcgccat gcagggatat cagatctacg cacagatatt ataacatctg cataataggc 60 atttgcaaga attactcgtg agtaaggaaa gagtgaggaa ctatcgcata cctgcattta 120 aagatgccga tttgggcgcg aatcctttat tttggcttca ccctcatact attatcaggg 180 ccagaaaaag gaagtgtttc cctccttctt gaattgatgt taccctcata aagcacgtgg 240 cctcttatcg agaaagaaat taccgtcgct cgtgatttgt ttgcaaaaag 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aaacaaaaga atggaatcaa agctaacttc aaaattcgcc acaacattga agatggatcc 1200 gttcaactag cagaccatta tcaacaaaat actccaattg gcgatggccc tgtcctttta 1260 ccagacaacc attacctgtc gacacaatct gccctttcga aagatcccaa cgaaaagcgt 1320 gaccacatgg tccttcttga gtttgtaact gctgctggga ttacacatgg catggatgag 1380 ctctacaaat aatgaattcg tcgaggccgt tcaggcctcg aggccgttca ggctcgaccc 1440 ggggatccgc ggatctctta tgtctttacg atttatagtt ttcattatca agtatgccta 1500 tattagtata tagcatcttt agatgacagt gttcgaagtt tcacgaataa aagataatat 1560 tctacttttt gctcccaccg cgtttgctag cacgagtgaa caccatccct cgcctgtgag 1620 ttgtacccat tcctctaaac tgtagacatg gtagcttcag cagtgttcgt tatgtacggc 1680 atcctccaac aaacagtcgg ttatagtttg tcctgctcct ctgaatcgtc tccctcgata 1740 tttctcattt tccttcgcat gcccatgggt taactgatca atgcatcctg catggcgcgc 1800 c 1801 <210> 111 <211> 1746 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G/C cassette including both AscI sites <400> 111 ggcgcgccat gcagggatat cagatctcag ttcgagttta tcattatcaa tactgccatt 60 tcaaagaata cgtaaataat taatagtagt gattttccta actttattta gtcaaaaaat 120 tagcctttta attctgctgt aacccgtaca tgcccaaaat agggggcggg ttacacagaa 180 tatataacat cgtaggtgtc tgggtgaaca gtttattcct ggcatccact aaatataatg 240 gagcccgctt tttaagctgg catccagaaa aaaaaagaat cccagcacca aaatattgtt 300 ttcttcacca accatcagtt cataggtcca ttctcttagc gcaactacag agaacagggg 360 cacaaacagg caaaaaacgg acacaacctc aatggagtga tgcaacctgc ctggagtaaa 420 tgatgacaca aggcaattga cccacgcatg tatctatctc attttcttac accttctatt 480 accttctgct ctctctgatt tggaaaaagc tgaaaaaaaa ggttgaaacc agttccctga 540 aattattccc ctacttgact aataagtata taaagacggt aggtattgat tgtaattctg 600 taaatctatt tcttaaactt cttaaattct acttttatag ttagtctttt ttttagtttt 660 aaaacaccaa gaacttagtt tcgaataaac acacataaac aaacaaaaag cttggcctgc 720 agggccagct tacccttaaa tttatttgca ctactggaaa actacctgtt ccatggccaa 780 cacttgtcac tactttctct tatggtgttc aatgcttttc ccgttatccg gatcatatga 840 aacggcatga ctttttcaag agtgccatgc ccgaaggtta tgtacaggaa cgcactatat 900 ctttcaaaga tgacgggaac tacaagacgc 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cggtcaattc attttgagaa acactgatga tgataccgtc 1440 caagctagtt tgactatgta cttctctaac ttgactgttc cagctgttgc tgacgaaaga 1500 atggatcctt tgagaagagc tttggaacat aatggtcatc cataccaatt gacctctaga 1560 ttcttgccac aaatctcttc tactttcaga cataccgctg atagataccc agaagattac 1620 ggtattttga tgggttccgt tttggtttcc ttggacttgt ttaattctgc tactggtcca 1680 gctgctttgg cacaacattt tgctagattg ccaatgactc cagatgattt gttgttcact 1740 tctaacttgg gtggtagagt ctcttcattg aatagagatc cagcttctac tgctatgcat 1800 ccaggttgga gagatgctgc tcaattattg aatttcgtta gaggtgttgg tgctccatct 1860 ttggctgcta aagctactgc tttacatgaa ttgcaaaccg ttcaaatggc cagattatac 1920 gaaattgaac cagccttcca aatctcctac agaaatttgg gtgatccatc cgaaagaaga 1980 tccagagaag tttattgggg ttctaactac gctagattgg ttgaagttaa gagaagatgg 2040 gatccagaag gtttgttctt ctccaaattg ggtattgatg gtgatgcttg ggatgctgaa 2100 ggtatgtgta gacaaacaag acaaggtgct tggaatgttg ctgttaagtg ggttcaatct 2160 ttcttgggtt ctttgtctgc ttccgttgtt tga 2193 <210> 120 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EasF of A. japonicus codon optimized for S. cerrevisiae <400> 120 atgggttcta ttaacccacc aatcttggac attagacaat ctactttcga aacctccatc 60 ccacaacaag ttactgaagg tttgactaag gatccaaaaa ctttgccagc tttgttgttc 120 tattccggtg atggtattca acattggacc agacattctt gtgctccaga tttttatcca 180 agaagagaag aaatcaacat cttgcattct gaagctgctc acatggctgc ttctatttct 240 caagattccg ttgttgttga tttgggttct gcttctttgg ataaggtctt gccattttta 300 catgctttgg aagcccaaca aaaaagagtt cattactacg ccttggactt gtcttatcca 360 gttttggctt ctaccttgtc cgaaattcca gttgctcaat tccaatacgt tcaaattgct 420 gcattgcacg gtactttcga agatggttta caatggttgc atgattcccc agaagttaga 480 gaaagaccac atcatttgtt gttgttcggt ttgaccattg gtaacttctc tagaccaaat 540 gctgctgctt tcttgagaaa cattgctgat agagctttgg ctgcttctcc agctgaatct 600 tctattttgt tgaccttgga ttcttgcaag atgccaacta aggttttgag agcttatact 660 gctgaaggtg ttgttccatt tgctttgaca tctttgtcct acgccaatca attattctgg 720 ccaggtggtg aaggtagagt ttttgatgaa gaagaatggt acttccactc cgaatggaat 780 tttgctttgg gtagacatga agctgctttg attccaagag atagagatat tactttgggt 840 ccaccattgg aacaagttgt tgttagaaga ggtgaaaagg ttagattcgg ttgctcttac 900 aaatactctg ctgctgaaag agaacatttg tttgctggtg ctggtttgga aaatgttgct 960 tcttggtctg ctaaaggttg tgatgttgct ttctaccaat tgaagatgag accagaatga 1020 <210> 121 <211> 1544 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA cassette including both AscI sites <400> 121 ggcgcgccat gcagggatat cagatctcca ttaccgacat ttgggcgcta tacgtgcata 60 tgttcatgta tgtatctgta tttaaaacac ttttgtatta tttttcctca tatatgtgta 120 taggtttata cggatgattt aattattact tcaccaccct ttatttcagg ctgatatctt 180 agccttgtta ctagttagaa aaagacattt ttgctgtcag tcactgtcaa gagattcttt 240 tgctggcatt tcttctagaa gcaaaaagag cgatgcgtct tttccgctga accgttccag 300 caaaaaagac taccaacgca atatggattg tcagaatcat ataaaagaga agcaaataac 360 tccttgtctt gtatcaattg cattataata tcttcttgtt agtgcaatat catatagaag 420 tcatcgaaat agatattaag aaaaacaaac tgtacaatca atcaatcaat catcacataa 480 agcttggcct gcagggccag cttaccctta aatttatttg cactactgga aaactacctg 540 ttccatggcc aacacttgtc actactttct cttatggtgt tcaatgcttt tcccgttatc 600 cggatcatat gaaacggcat gactttttca agagtgccat gcccgaaggt tatgtacagg 660 aacgcactat atctttcaaa gatgacggga actacaagac gcgtgctgaa gtcaagtttg 720 aaggtgatac ccttgttaat cgtatcgagt taaaaggtat tgattttaaa gaagatggaa 780 acattctcgg acacaaactc gagtacaact ataactcaca caatgtatac atcacggcag 840 acaaacaaaa gaatggaatc aaagctaact tcaaaattcg ccacaacatt gaagatggat 900 ccgttcaact agcagaccat tatcaacaaa atactccaat tggcgatggc cctgtccttt 960 taccagacaa ccattacctg tcgacacaat ctgccctttc gaaagatccc aacgaaaagc 1020 gtgaccacat ggtccttctt gagtttgtaa ctgctgctgg gattacacat ggcatggatg 1080 agctctacaa ataatgaatt cgtcgaggcc gttcaggcct cgaggccgtt caggctcgac 1140 ccggggatcc gcggccgcag gcctaaattg atctagagct ttggacttct tcgccagagg 1200 tttggtcaag tctccaatca aggttgtcgg cttgtctacc ttgccagaaa tttacgaaaa 1260 gatggaaaag ggtcaaatcg ttggtagata cgttgttgac acttctaaat aagcgaattt 1320 cttatgattt atgattttta ttattaaata agttataaaa aaaataagtg tatacaaatt 1380 ttaaagtgac tcttaggttt taaaacgaaa attcttgttc ttgagtaact ctttcctgta 1440 ggtcaggttg ctttctcagg tatagcatga ggtcgctctt attgaccaca cctctaccgg 1500 catgcccatg ggttaactga tcaatgcatc ctgcatggcg cgcc 1544 <210> 122 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-terminal truncated DmaW of A. japonicus codon optimized for S. cerrevisiae <400> 122 atgactgctg gtcaaggtat taagactggt aatgcttctg attgcgaagt ctacagaact 60 ttgtctgttg ctttggattt cgccaatcaa gatgaagaat tgtggtggca ttctactgct 120 ccaatgtttg ctcaaatgtt gcaatctacc aactacaact tacacgctca gtacaagcac 180 ttgttgatct acaagaagaa cgtcattcca ttcttgggtg tttacccaac taatgataag 240 ccaagatggt tgtccatttt gaccagatat ggtactccat tcgaattgtc tttgaactgt 300 tctggtccat tggttagata cacttacgaa cctattaacg ctgctactgg tactgctaga 360 gatccattca atactcatgc tgtttgggac tcattggaac aattgatggc tttacaatcc 420 ggtatcgatt tggatttgtt cagacacttc aagaacgact tgactttgtc tgctgaagaa 480 tccgaatact tgtacaagaa caacttggtc ggtgaacaaa tcagaaccca aaacaaattg 540 gctttggact tgcaagatgg tgaattcgtt gttaagactt acatctaccc agccttgaaa 600 tctttggcta ctggtagaag tatccacgaa ttggtttttg gttctgcttt cagatggtct 660 aagcaatacc cagaattgag aaagccattg gataccttgg aacaatacgt ttattctaga 720 ggtccatctt ctactgcctc tccaagatta ttgtcttgcg atttgattga ccctaccaag 780 tccagaatca aaatctactt gttggaaaga atggtcactt tggaagcctt ggaagatttg 840 tggactatgg gtggtgaaag aactgatgct tctactttgg ctggtttgga aatgattaga 900 gaattgtggg aattgatcag attgccagct ggtttacaat cttatccagc tccatatttg 960 ccaatcggta ctattccaga tgaacaattg ccattgatgg ccaactacac catccatcat 1020 gatgatccag ttccagaacc acaagtttac tttactactt tcggtagaaa cgacatgcaa 1080 attgctgatg ctttggctac tttcttcgaa cgtcgtggtt ggcacgaaat ggctagacag 1140 tacaaagctg aattgtgctc tcattaccca catgctgatc acgaaacttt gaactacttg 1200 cacgcttaca tctcattctc ttacagaaag aacaagccat acttgtccgt ctacttgcaa 1260 tctttggaaa ctggtgattg ggttacctga 1290 <210> 123 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DmaW of C. purpurea codon optimized for S. cerrevisiae <400> 123 atgagtactg ctaaagatcc aggaaatggc gtttatgaaa ttctgtctct catttttgat 60 ttcccttcta atgaacaaag actgtggtgg cattcaacag cacctatgtt cgcagctatg 120 ttagacaacg caggttacaa tattcacgat caatacagac atttggggat attcaaaaag 180 catatcatac cttttctggg tgtttaccca actaaagaca aggaaagatg gctttctatc 240 ttgactcgat gcggattgcc attagaacta tctttgaatt gtacagattc tgtggttaga 300 tacacgtacg agccaattaa cgaagtcaca ggtaccgaaa aagacacgtt taacaccttg 360 gccatcatga cttcagtcca aaaattggca caaattcaag ccggcattga cttagaatgg 420 tttagctact ttaaagacga gttaacatta gatgaatccg aatctgcaac cctgcaatct 480 aatgaattgg taaaggaaca aatcaaaact caaaataagt tggcactaga cttgaaggag 540 tctcagttcg ccctaaaggt atacttctat ccacatctca aaagtatagc gactggtaag 600 tccacacatg atctaatctt tgattctgtg cttaagttat cccaaaagca tgattccatt 660 cagcctgcct tccaagtatt gtgtgattac gtttcaagga gaaaccattc tgcggaggtc 720 gatcaacacg gtgctctaca cgctagattg ttgtcatgcg atctcattga tccagcaaaa 780 tcaagagtta aaatctacct cttagagaaa acagtgtctt tgtcagttat ggaagatttg 840 tggacacttg gtggacaaag agtagacgct agtacaatgg atggccttga tatgttaagg 900 gagttgtggt ccctgttaaa ggttccaaca ggacatcttg aataccctaa aggctatctt 960 gaattggggg aaataccaaa cgaacagcta ccatcaatgg ctaattacac ccttcaccac 1020 aatgacccta tgccagagcc tcaagtgtac tttacagttt tcggtatgaa tgacgctgag 1080 atatcaaatg ccctgactat ctttttccag agacatggat ttgacgatat ggctaaaaac 1140 tacagagtct ttttacaaga ttcataccct taccatgatt ttgaatccct caactatcta 1200 cacgcctata tcagcttcag ctatagacgt aataagccat acttatctgt ttacctgcat 1260 acttttgaaa ctggtcgttg gccagtcttt gctgattcac caatctcttt tgatgcttat 1320 agaagatgtg aacttagtac aaaataa 1347 <210> 124 <211> 1509 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TE cassette including both AscI sites <400> 124 ggcgcgccat gcagggatat cagatcttag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc 60 ttccagattt tctcggactc cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca 120 tactaaattt cccctctttc ttcctctagg gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg 180 gaaaagaaaa aagagaccgc ctcgtttctt tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt 240 ttatcacgtt tctttttctt gaaaattttt ttttttgatt tttttctctt tcgatgacct 300 cccattgata tttaagttaa taaacggtct tcaatttctc aagtttcagt ttcatttttc 360 ttgttctatt acaacttttt ttacttcttg ctcattagaa agaaagcata gcaatctaat 420 ctaagtttta attacaaaaa gcttggcctg cagggccagc ttacccttaa atttatttgc 480 actactggaa aactacctgt tccatggcca acacttgtca ctactttctc ttatggtgtt 540 caatgctttt cccgttatcc ggatcatatg aaacggcatg actttttcaa gagtgccatg 600 cccgaaggtt atgtacagga acgcactata tctttcaaag atgacgggaa ctacaagacg 660 cgtgctgaag tcaagtttga aggtgatacc cttgttaatc gtatcgagtt aaaaggtatt 720 gattttaaag aagatggaaa cattctcgga cacaaactcg agtacaacta taactcacac 780 aatgtataca tcacggcaga caaacaaaag aatggaatca aagctaactt caaaattcgc 840 cacaacattg aagatggatc cgttcaacta gcagaccatt atcaacaaaa tactccaatt 900 ggcgatggcc ctgtcctttt accagacaac cattacctgt cgacacaatc tgccctttcg 960 aaagatccca acgaaaagcg tgaccacatg gtccttcttg agtttgtaac tgctgctggg 1020 attacacatg gcatggatga gctctacaaa taatgaattc gtcgaggccg ttcaggcctc 1080 gaggccgttc aggctcgacc cggggatccg cggagtgctt ttaactaaga attattagtc 1140 ttttctgctt attttttcat catagtttag aacactttat attaacgaat agtttatgaa 1200 tctatttagg tttaaaaatt gatacagttt tataagttac tttttcaaag actcgtgctg 1260 tctattgcat aatgcactgg aaggggaaaa aaaaggtgca cacgcgtggc tttttcttga 1320 atttgcagtt tgaaaaataa ctacatggat gataagaaaa catggagtac agtcactttg 1380 agaaccttca atcagctggt aacgtcttcg ttaattggat actcaaaaaa gatggatagc 1440 atgaatcaca agatggaagg aaatgcatgc ccatgggtta actgatcaat gcatcctgca 1500 tggcgcgcc 1509 <210> 125 <211> 9453 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fwd primer for Seq ID 126, w. homology to ERG20 prom and pEVE2049 upstream of loxP <400> 125 ggctagctaa gatccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc 60 cctatttatt tttttatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt 120 cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag 180 aaggttttgg gacgctcgaa gatccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 240 ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 300 gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 360 tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 420 aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 480 aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 540 ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 600 tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 660 agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 720 gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 780 tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 840 acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 900 tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 960 caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 1020 aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 1080 aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 1140 ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 1200 agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 1260 atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 1320 cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 1380 aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 1440 cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 1500 aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 1560 ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 1620 gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 1680 ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 1740 tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 1800 tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 1860 ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 1920 tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 1980 agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 2040 acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 2100 ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 2160 gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgaacgaa gcatctgtgc ttcattttgt 2220 agaacaaaaa tgcaacgcga gagcgctaat ttttcaaaca aagaatctga gctgcatttt 2280 tacagaacag aaatgcaacg cgaaagcgct attttaccaa cgaagaatct gtgcttcatt 2340 tttgtaaaac aaaaatgcaa cgcgagagcg ctaatttttc aaacaaagaa tctgagctgc 2400 atttttacag aacagaaatg caacgcgaga gcgctatttt accaacaaag aatctatact 2460 tcttttttgt tctacaaaaa tgcatcccga gagcgctatt tttctaacaa agcatcttag 2520 attacttttt ttctcctttg tgcgctctat aatgcagtct cttgataact ttttgcactg 2580 taggtccgtt aaggttagaa gaaggctact ttggtgtcta ttttctcttc cataaaaaaa 2640 gcctgactcc acttcccgcg tttactgatt actagcgaag ctgcgggtgc attttttcaa 2700 gataaaggca tccccgatta tattctatac cgatgtggat tgcgcatact ttgtgaacag 2760 aaagtgatag cgttgatgat tcttcattgg tcagaaaatt atgaacggtt tcttctattt 2820 tgtctctata tactacgtat aggaaatgtt tacattttcg tattgttttc gattcactct 2880 atgaatagtt cttactacaa tttttttgtc taaagagtaa tactagagat aaacataaaa 2940 aatgtagagg tcgagtttag atgcaagttc aaggagcgaa aggtggatgg gtaggttata 3000 tagggatata gcacagagat atatagcaaa gagatacttt tgagcaatgt ttgtggaagc 3060 ggtattcgca atattttagt agctcgttac agtccggtgc gtttttggtt ttttgaaagt 3120 gcgtcttcag agcgcttttg gttttcaaaa gcgctctgaa gttcctatac tttctagaga 3180 ataggaactt cggaatagga acttcaaagc gtttccgaaa acgagcgctt ccgaaaatgc 3240 aacgcgagct gcgcacatac agctcactgt tcacgtcgca cctatatctg cgtgttgcct 3300 gtatatatat atacatgaga agaacggcat agtgcgtgtt tatgcttaaa tgcgtactta 3360 tatgcgtcta tttatgtagg atgaaaggta gtctagtacc tcctgtgata ttatcccatt 3420 ccatgcgggg tatcgtatgc ttccttcagc actacccttt agctgttcta tatgctgcca 3480 ctcctcaatt ggattagtct catccttcaa tgctatcatt tcctttgata ttggatcata 3540 ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt 3600 tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 3660 ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 3720 gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 3780 agtgcaccat accacagctt ttcaattcaa ttcatcattt tttttttatt cttttttttg 3840 atttcggttt ctttgaaatt tttttgattc ggtaatctcc gaacagaagg aagaacgaag 3900 gaaggagcac agacttagat tggtatatat acgcatatgt agtgttgaag aaacatgaaa 3960 ttgcccagta ttcttaaccc aactgcacag aacaaaaacc tgcaggaaac gaagataaat 4020 catgtcgaaa gctacatata aggaacgtgc tgctactcat cctagtcctg ttgctgccaa 4080 gctatttaat atcatgcacg aaaagcaaac aaacttgtgt gcttcattgg atgttcgtac 4140 caccaaggaa ttactggagt tagttgaagc attaggtccc aaaatttgtt tactaaaaac 4200 acatgtggat atcttgactg atttttccat ggagggcaca gttaagccgc taaaggcatt 4260 atccgccaag tacaattttt tactcttcga agacagaaaa tttgctgaca ttggtaatac 4320 agtcaaattg cagtactctg cgggtgtata cagaatagca gaatgggcag acattacgaa 4380 tgcacacggt gtggtgggcc caggtattgt tagcggtttg aagcaggcgg cagaagaagt 4440 aacaaaggaa cctagaggcc ttttgatgtt agcagaattg tcatgcaagg gctccctatc 4500 tactggagaa tatactaagg gtactgttga cattgcgaag agcgacaaag attttgttat 4560 cggctttatt gctcaaagag acatgggtgg aagagatgaa ggttacgatt ggttgattat 4620 gacacccggt gtgggtttag atgacaaggg agacgcattg ggtcaacagt atagaaccgt 4680 ggatgatgtg gtctctacag gatctgacat tattattgtt ggaagaggac tatttgcaaa 4740 gggaagggat gctaaggtag agggtgaacg ttacagaaaa gcaggctggg aagcatattt 4800 gagaagatgc ggccagcaaa actaaaaaac tgtattataa gtaaatgcat gtatactaaa 4860 ctcacaaatt agagcttcaa tttaattata tcagttatta ccctatgcgg tgtgaaatac 4920 cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggaaatt gtaaacgtta atattttgtt 4980 aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg 5040 caaaatccct tataaatcaa aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg 5100 gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta 5160 tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg 5220 ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa 5280 gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct 5340 ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct 5400 acagggcgcg tccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg 5460 gcctcttcgc tattacgcca gctgaattgg agcgacctca tgctatacct gagaaagcaa 5520 cctgacctac aggaaagagt tactcaagaa taagaatttt cgttttaaaa cctaagagtc 5580 actttaaaat ttgtatacac ttattttttt tataacttat ttaataataa aaatcataaa 5640 tcataagaaa ttcgcttatt tagaagtgtc aacaacgtat ctaccaacga tttgaccctt 5700 ttccatcttt tcgtaaattt ctggcaaggt agacaagccg acaaccttga ttggagactt 5760 gaccaaacct ctggcgaaga attgttaatt aagagctcgt ttggctagta ctgggtgatg 5820 acgccaggct ctgatccatc tggggttagt ggtagttttg tctccctaac ggtggttccg 5880 gcggtcttgg tcagcttgga cagctcttgg acggtggctg aaaggccagg gtccacatgg 5940 acagagttga aggatgaggt aacccaatca ccagtttcca aagattgcaa gtagacggac 6000 aagtatggct tgttctttct gtaagagaat gagatgtaag cgtgcaagta gttcaaagtt 6060 tcgtgatcag catgtgggta atgagagcac aattcagctt tgtactgtct agccatttcg 6120 tgccaaccac gacgttcgaa gaaagtagcc aaagcatcag caatttgcat gtcgtttcta 6180 ccgaaagtag taaagtaaac ttgtggttct ggaactggat catcatgatg gatggtgtag 6240 ttggccatca atggcaattg ttcatctgga atagtaccga ttggcaaata tggagctgga 6300 taagattgta aaccagctgg caatctgatc aattcccaca attctctaat catttccaaa 6360 ccagccaaag tagaagcatc agttctttca ccacccatag tccacaaatc ttccaaggct 6420 tccaaagtga ccattctttc caacaagtag attttgattc tggacttggt agggtcaatc 6480 aaatcgcaag acaataatct tggagaggca gtagaagatg gacctctaga ataaacgtat 6540 tgttccaagg tatccaatgg ctttctcaat tctgggtatt gcttagacca tctgaaagca 6600 gaaccaaaaa ccaattcgtg gatacttcta ccagtagcca aagatttcaa ggctgggtag 6660 atgtaagtct taacaacgaa ttcaccatct tgcaagtcca aagccaattt gttttgggtt 6720 ctgatttgtt caccgaccaa gttgttcttg tacaagtatt cggattcttc agcagacaaa 6780 gtcaagtcgt tcttgaagtg tctgaacaaa tccaaatcga taccggattg taaagccatc 6840 aattgttcca atgagtccca aacagcatga gtattgaatg gatctctagc agtaccagta 6900 gcagcgttaa taggttcgta agtgtatcta accaatggac cagaacagtt caaagacaat 6960 tcgaatggag taccatatct ggtcaaaatg gacaaccatc ttggcttatc attagttggg 7020 taaacaccca agaatggaat gacgttcttc ttgtagatca acaagtgctt gtactgagcg 7080 tgtaagttgt agttggtaga ttgcaacatt tgagcaaaca ttggagcagt agaatgccac 7140 cacaattctt catcttgatt ggcgaaatcc aaagcaacag acaaagttct gtagacttcg 7200 caatcagaag cattaccagt cttaatacct tgaccagcag tcattttaag ctttttgtaa 7260 ttaaaactta gattagattg ctatgctttc tttctaatga gcaagaagta aaaaaagttg 7320 taatagaaca agaaaaatga aactgaaact tgagaaattg aagaccgttt attaacttaa 7380 atatcaatgg gaggtcatcg aaagagaaaa aaatcaaaaa aaaaaatttt caagaaaaag 7440 aaacgtgata aaaattttta ttgccttttt cgacgaagaa aaagaaacga ggcggtctct 7500 tttttctttt ccaaaccttt agtacgggta attaacgaca ccctagagga agaaagaggg 7560 gaaatttagt atgctgtgct tgggtgtttt gaagtggtac ggcgatgcgc ggagtccgag 7620 aaaatctgga agagtaaaaa aggagtagaa acattttgaa gctaagatct acgcacagat 7680 attataacat ctgcataata ggcatttgca agaattactc gtgagtaagg aaagagtgag 7740 gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc gcgaatcctt tattttggct 7800 tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt ttccctcctt cttgaattga 7860 tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga aattaccgtc gctcgtgatt 7920 tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc tcgacttcct gtcttcctat 7980 tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag cgacggctca caggttttgt 8040 aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt agtaccacat gctatgatgc 8100 ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg ttactctctc tctttcaaac 8160 agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca cacactcttt tcttctaacc 8220 aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac atttacatat atataaactt 8280 gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt tctaattcgt agtttttcaa 8340 gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc aaggaagtaa ttatctactt 8400 tttacaacaa atataaaaca aagcttaaaa tgacaatttc tgctccacct attattgata 8460 ttagacaagc agggttggaa agttctatac cagaccaagt tgtcgaaggt ctaactaagg 8520 aagtcaagac acttcctgca cttttgtttt actcaacaaa aggcattcag cattggaata 8580 gacattccca cgctgctgat ttctatccta gacatgagga actatgcatc ctcaaagctg 8640 aagctagtaa gatggctgct tcaatcgctc aagatagctt agtaatcgat atgggttctg 8700 ccagtatgga taaggttatc ctcctgttgg aagcgttaga ggaacagaaa aagtccataa 8760 cttactacgc cttggacctg tcctactctg aattagcatc taattttcaa gccattccag 8820 tggacagatt ccactatgtt agattcgcag ccttacatgg cacttttgac gatggacttc 8880 actggttaca aaacgctcct gatattagga acagaccaag atgtatactg ttatttgggt 8940 taaccatcgg taacttctca cgagataatg ctgcatcttt cctcagaaat atcgcccaat 9000 ctgctctgtc tacatcccca actcaatcat ccattatagt gtctctagat tcatgtaaac 9060 ttcctacgaa aatcttaaga gcctacaccg cagatggagt agttccattt gctcttgcct 9120 cactaagcta tgcgaattca ttgtttcatc caaaaggcga cagaaagatt ttcaatgaag 9180 aggattggta ctttcattct gaatggaacc atgcattggg tcgtcacgaa gctagtttga 9240 tcacacaatc aaaagatatc caattaggtg caccactaga gactgttata gtcagacgtg 9300 atgaaaagat cagatttgga tgctcttaca aatacgacaa agctgaaagg gatcagttgt 9360 ttcattcagc gggtttggag gatgccgcag tgtggacagc accagactgt gacgtagcat 9420 tctatcaatt gagactaaga ttgaactaac cgc 9453 <210> 126 <211> 4762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pEVE2049_LoxP-NatR-LoxP-Kex2 promoter <400> 126 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctccct gcaggatcgt 420 caaggttcgt attgttggtt tagccggtgt gcattttaag aaaatttctg ggaacacttg 480 gttgtataaa gagctggctt ctagtatatt aaaagaacta aagttgtaag taacacgttc 540 cctgagaaac cacagcttac atttttgata ttcgaaaaca agaatatccg ttcgatagaa 600 atttatatat atatatagat tctttttatt ctcttttgga aagaagaaat agaatggacc 660 taagcagaca ctcagcagtt aatattttcg tcccttaatt ggtattattt ataaataaat 720 ggcacgtact ttatgtgtaa agcagttcat catcgattga tggaggcggc cgcctaataa 780 cttcgtatag catacattat acgaagttag gtcacccggc cagcgacatg gaggcccaga 840 ataccctcct tgacagtctt gacgtgcgca gctcaggggc atgatgtgac tgtcgcccgt 900 acatttagcc catacatccc catgtataat catttgcatc catacatttt gatggccgca 960 cggcgcgaac gaaaaattac ggctcctcgc tgcagacctg cgagcaggga aacgctcccc 1020 tcacagacgc gttgaattgt ccccacgccg cgcccctgta gagaaatata aaaggttagg 1080 atttgccact gaggttcttc tttcatatac ttccttttaa aatcttgcta ggatacagtt 1140 ctcacatcac atccgaacat aaacaaccat gggtaccact cttgacgaca cggcttaccg 1200 gtaccgcacc agtgtcccgg gggacgccga ggccatcgag gcactggatg ggtccttcac 1260 caccgacacc gtcttccgcg tcaccgccac cggggacggc ttcaccctgc gggaggtgcc 1320 ggtggacccg cccctgacca aggtgttccc cgacgacgaa tcggacgacg aatcggacgc 1380 cggggaggac ggcgacccgg actcccggac gttcgtcgcg tacggggacg acggcgacct 1440 ggcgggcttc gtggtcgtct cgtactccgg ctggaaccgc cggctgaccg tcgaggacat 1500 cgaggtcgcc ccggagcacc gggggcacgg ggtcgggcgc gcgttgatgg ggctcgcgac 1560 ggagttcgcc cgcgagcggg gcgccgggca cctctggctg gaggtcacca acgtcaacgc 1620 accggcgatc cacgcgtacc ggcggatggg gttcaccctc tgcggcctgg acaccgccct 1680 gtacgacggc accgcctcgg acggcgagca ggcgctctac atgagcatgc cctgccccta 1740 atcagtactg acaataaaaa gattcttgtt ttcaagaact tgtcatttgt atagtttttt 1800 tatattgtag ttgttctatt ttaatcaaat gttagcgtga tttatatttt ttttgcctcg 1860 acatcatctg cccagatgcg aagttaagtg cgcagaaagt aatatcatgc gtcaatcgta 1920 tgtgaatgct ggtcgctata ctgctgtcga ttcgatacta acgccgccat ccagtgtcga 1980 aataacttcg tatagcatac attatacgaa gttagcggcc gccctaggcc gcggtcagca 2040 gctctgatgt agatacacgt atctcgacat gttttatttt tactatacat acataaaaga 2100 aataaaaaat gataacgtgt atattattat tcatataatc aatgagggtc attttctgaa 2160 acgcaaaaaa cggtaaatgg aaaaaaaata aagatagaaa aagaaaacaa acaaaggaaa 2220 ggttagcata ttaaataact gagctgatac ttcaacagca tcgctgaaga gaacagtatt 2280 gaaaccgaaa cattttctaa aggcaaacaa ggtactccat atttgctgga cgtgttcttt 2340 ctctcgtttc atatgcataa ttctgtcata agcctgttct ttttcctggc ttaaacatcc 2400 cgttttgtaa aagagaaatc tattccacat atttcattca ttcggctacc atactaagga 2460 taaactaatc ccgttgtttt ttggcctcgt cacataatta taaactacta acccattatc 2520 agaagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 2580 attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 2640 agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 2700 tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 2760 tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 2820 tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 2880 aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 2940 tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 3000 tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 3060 cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 3120 agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 3180 tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 3240 aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 3300 ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 3360 cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 3420 accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 3480 ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 3540 ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 3600 gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 3660 aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 3720 gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 3780 gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 3840 cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 3900 gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 3960 gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 4020 ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 4080 tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 4140 ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 4200 cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 4260 accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 4320 cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 4380 tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 4440 cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 4500 acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 4560 atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 4620 tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 4680 aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 4740 cgtatcacga ggccctttcg tc 4762 <210> 127 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fwd primer for Seq ID 126, w. homology to ERG20 prom and pEVE2049 upstream of loxP <400> 127 cattattctt aaatgttccg atcctcttgt tcgcatatat acagtcgatt gatggaggcg 60 gccgccta 68 <210> 128 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rev primer for Seq ID 126, w homology for Kex2 promoter and 5-end of ERG20 ORF <400> 128 ctactaaccc attatcagaa gacaatggct tcagaaaaag aaattaggag agagagattc 60 ttgaacgttt tcc 73 <210> 129 <211> 1326 <212> DNA <213> Paecilomyces divaricatus <400> 129 atgagttcca gaaagactcg aaatgcgtct agttcagaag tctaccagac tctcagcagt 60 ctcttcgact tccctgacga ggagcagaag ctctggtggc acagtactgc gcccatgttt 120 gccgacatgc tccagacggc caactacgac acccatgccc agtatcgaca tctggggatt 180 tacaagaaat acgtgatccc gttcctaggt gtctacccca ctaatgaccg tgatcgatgg 240 ctgagcattc tgacgcgcta cggtacaccg tttgagttga gtctcaactg ttcggatgac 300 gttgtgcggt acacattcga gcccatcaac gctgcgacgg gcaccatcca ggaccccttc 360 aacactcacg ccatctggga ctgtctgcag aacttcagcc caatgctgaa aggggtggac 420 ctcgaatggt ttagctattt caaagagaaa ctcaccctca atgcggacga atctgccttc 480 cttgtggaga ataacttggc tgatgatccg atcaagaccc agaacaagct ggccctggat 540 cttaagaaca gcggctttgt gctgaagacg tacatctatc cggccctcaa gtccatcgcc 600 acgggccttg cggctccctt gtcggtgata gatgagtatg tccactcccg ggggcctaat 660 ggcacggccg gccctcgcct cttctcctgt gacttggttc atccgagcaa gtctcgcatc 720 aagatctata ttctggagcg gatggtctcg ttagccgcca tggaggatct ctggacgcta 780 ggtggccgac gcaaggatca ctcgactctg gcaggattga atatgatccg tgagctctgg 840 gagctgatcc aactgcctgc cgggctgcgt tcctacccgg agccatacct gcctctgggt 900 accattccga atgagcagct gccgttgatg gccaattaca cgcttcacca ggacgatccc 960 tggcccgagc cccaagtgta cttcacccca tttggcatga acgacatggc gattgccgat 1020 gcattgacga cgttcatgga gcgccggggg tggaacgaca tggctcagtc gtacaaggac 1080 aatttgtgct catattatcc caacgcagac cacgatcatc tgaactacgt gcacgcatat 1140 atatccttct cgtaccggaa tgacaagccg tatttgagcg tgtacctaca ctccttcgag 1200 acgggggatt ggaagatctc gaacttcacc aatcccgaat cgaagtgcaa agaaccacag 1260 cgtgtgtctg tccgatttcc tgtacaagga agaggaagag gtcggatccc tgcaagtgga 1320 tattga 1326 <210> 130 <211> 1140 <212> DNA <213> Paecilomyces divaricatus <400> 130 atgacacaag cttcacctgc atctaagctc ttcacgccgt taagcgtcgg ttcatgcaaa 60 ctataccaca gactcgtcat ggcgccgatg actcgatttc gagcagatga gtctgccatc 120 cagctacctt ttgtcaaaga atactatgga cagcgggcat ctgtccccgg aacattgctg 180 ataagcgagg caaccgacat atctccccaa gctgggggat tcgcgaatgt cccgggtatc 240 tggaatgaag cgcagattca agcatggagg cagattgtag gcgaggtgca ttccaagggc 300 tcctttatct tttgccagct gtgggcgacg ggtcgcgctg ctgaacccag tgtgctcgcc 360 gagaagggat tcacgctagt ttccagcagt gcgaccccaa tatcgcccga cggactgtta 420 ccatgtgcac tgactgaggt cgaaatccac gattatatcg atgacttcgc acaagcagcg 480 cagaacgcaa tactcgccgg atttgatggt gttgagattc acggcgcaaa cggctatctt 540 attgaccagt tcacgcaagc ttcatgcaac aagcggattg atcactgggg tggaagtatt 600 gcgaaccgtg cccgattcgc gatcgaagtg actagggccg tcgttgctgc cgttggtgca 660 gatcgagtgg gtgtgaagct atctccatgg agtcagtacc agggcatggg gaatatggac 720 ggtctagtgg cgcaatttga gtatctcatc tcccaactgc agaagatgga tcttgcatac 780 ctgcatctgg ctaattcaac atggctggga gaggagggtc ctcattcaga ccctcaccat 840 gaagtgtttg tgcaggcgtg gggaaagtcc aaacccatct tgttggcagg agggtatgat 900 gccgcgtcgg caaaacaggt tgtggatatg ctttatggcg aacacgacaa tgttgcaatc 960 gcgttcgggc ggtttttcat ttcgaaccct gatcttccct ttcgggtaaa gtcgaatgtc 1020 aagcttcaag actatagtcg ttcttcgatg gataccagcg tgtcgaaaga cggatatttg 1080 gatcatccat tcagtccgga gtttctggct tccaacagat ctgaatttgc cagtacttag 1140 <210> 131 <211> 1560 <212> DNA <213> Paecilomyces divaricatus <400> 131 atgagaacaa aggacgacaa cgctcccaag ccggaccccg atggggtgcc cgcgtacacg 60 acttcaaatg gctgtcccgt catgaggccc gagggactgc cagcagacgg caggaagctc 120 ctcctaaacg actcccacct cattgacatg ttagcccact tcaacagaga gaaaatacct 180 gagcgtgcag tccatgccaa aggcgccgga gcatacggag agttcgaggt caccgaggat 240 atctctgaca tttgcaacat cgacatgttg ctaggagtcg gcaagaagac tccctgtgtc 300 acgcgctttt ccaccaccgg gctggagcgc gggtcgtctg atggcgtccg agacctcaag 360 ggtctggcaa cgaagttcta caccaagcag ggcaactggg attgggtctg cctcaacttt 420 cccttcttct tcatccggga tccgatgaag ttccccagct tgatgcacgc ccagcgccgg 480 gatccccaga ccaacctgct gaacccaaat atgtactggg attgggtgac gagcaaccat 540 gaatctctgc acatggtgct gctgcaattc agtgacttcg gcaccatgtt caactggcgc 600 tcaatgagcg gatacatagg tcacgcatac aaatgggtca 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tacgagacct ggaagctggt gagtccagcg 1440 ctggcggcgc gaatccagaa aggggtggag acgctgctgc agaagagtga ggcgccggcg 1500 gaggagtctt tcatcccggc aagattgtag 1530 <210> 140 <211> 789 <212> DNA <213> Aspergillus japonicus <400> 140 atgaccgtcg tcaactcgcg catctttgca gtcaccggcg gcgcctccgg cattggcgcg 60 gccacctgcc gcctcctcgc cgcgcgcggc gcagcggtca tctgcatcgg ggacatctcg 120 cccaagggct tcgagagcgt caccagcgac atccaggccc tcaacccggc caccaaggtg 180 cactgcaccc ggctggacgt ctcctcgtcc gccgaggttg acgcctggct acagaccatc 240 gtgcagacct tcggggactt gcacgggctg gccaacgtcg cgggcatcgc ccagccggcg 300 ggcgcccgcc aggccccggc cctgctcgag gagacggacg aggaatggca gcgcgtgttc 360 aaggtcaacc tggacggggt cttctactgc acgcgcgcag gtatccgcgc gatgaaggcc 420 cttccggggc ccaaggaccg cgccatcgtc aacatcggta gcatcgccgc gtttattcac 480 ttgccggatg cctacgccta cgggacctcc aagggcgcct gcgcgtactt caccagctgt 540 gcggccatgg atgcctggcc cctggggatt cggatcaaca gtgtctcgcc gggtatcacc 600 gacaccccgg ctctgccgca gttcatgccc caggcgaagt ccatcgatga ggtcaaggaa 660 gcgtacatca 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tctacgcccg cggcgcctcg gagggatgga tcgtagtggg cggggagtgt 720 cccaccgtcg gggcggccgg cggattcctc cagggcggag gagtatcgag ttggctgagc 780 tacgcgcatg gattggcagt ggataatgtg cttgagtatg aagttgtgac ggccaaggga 840 gagattgtca tcgccaacgc ccatcaaaac cccgatctct tctgggcact gcgcggggga 900 ggaggaggca cctttggcgt cgtgacccag gccacgcttc aagtccaccc cgacctcccc 960 gtcagcgtcg ccgacgccgt ggtgacgggc tcccgcgccg acgcgacctt ctggtcccac 1020 ggcgtcgccg ccctcctgcg agcgctacaa ttcctcaaca accacggcac ggcaggccag 1080 ttcatcctcc gcaacaccga cgacgacacg gtgcaagcca gtctgacgat gtacttctcg 1140 aacctgaccg tccccgccgt cgccgacgag cgcatggacc cgctccgccg cgccctcgaa 1200 cacaacggac acccctacca gctcacctcg cggttcctgc cccagatcag cagcaccttc 1260 cggcacaccg cggatcgcta cccggaggac tacggaatcc tgatgggctc ggtcctggtg 1320 tcgctggacc tgttcaattc cgcgacgggc cccgcggcgc tggcgcagca cttcgcgcgg 1380 ctcccgatga cccccgacga tctcctgttc accagcaacc tgggcgggcg agtgtcctcc 1440 ctcaaccgcg acccggccag cacagccatg catcccggct ggcgtgacgc cgcgcagttg 1500 ctcaacttcg tccgcggggt 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ccccggagtt cgtgcacccg 240 atgttcgagt tcatcgacct ggcgcacagc cggggcgtgc ggcggtacgc gctcgtcagc 300 gcgagcaaca ccgaaaaggg ggatccgatg atgggggagg cgcacgcgca cctggactcg 360 aaagaggggg tcaagtatgt ggtgttgcgg ccgacgtggt ttatggaaaa ccacatcgaa 420 gacccccacc tcagctggat caagacggag aacaagatct actcggccac gggcccgggc 480 aagatcccct tcgtctcggc ggatgatatc gcccgcgtcg ccttccacgc cctgacgcag 540 ccgctcaccc agaaggagca gcagtacatg gttctgggcc cggatctgct gtcctatgct 600 gatatggccg agatcctcac cgacctcctg ggccggaaga ttacgcacgt caccctgccc 660 gccgagaagt tcggccagtt cctggtcgac acggccgggt tgcccccgga ctttgcggag 720 atgctggcga cgatggaggc ggcggtggcg acgggggcgg aggagcgggt cagccaagat 780 gtcgagaagg tgaccgggcg gccgccgcgg cggtttgtgg attacgcgag ggagaatcgc 840 gagcattggt tgtga 855 <210> 144 <211> 882 <212> DNA <213> Aspergillus japonicus <400> 144 atgaccatca ccgagacctc caagccgacg ctgcgccgca tcccccggag cgccggcgac 60 gaggccatct tccaagtcct gcaggaagac ggagtcgtcg tgatcgaagg attcatgagc 120 gcggaccagg tccgccgctt caacggggag atcgacccgc acatgaagca gtgggaactg 180 ggccagaagt cgtaccagga gagctacctg gcggggatgc gacagctgag cagcctgccg 240 ctgttcagca agctcttccg ggacgagctg atgaacgacg agctcctgca cgggctgtgc 300 aagcggctgt tcgggcccga gtccggcgac tactggctga cgacctcctc ggtgctggag 360 acagagccgg gctaccacgg gcaggagctg caccgcgagc acgacgggat ccccatctgc 420 accaccctgg gccgccagag ccccgagtcc atgctcaact tcctcaccgc gctgaccgac 480 ttcaccgcgg agaacggcgc cacccgcgtc ctgccgggca gtcacctctg ggaggacttc 540 agcgccccgc cccccaaggc cgacaccgcc atccccgccg tcatgaaccc cggcgatgcc 600 gttctcttca ccggcaagac cctgcacggc gccggcaaga acaacaccac cgacttcctg 660 cgccgcggct tccccctgat catgcagtcg tgccagttca cccctgtcga ggcctcggtg 720 gccctgcccc gtgagctggt cgagaccatg acccccctgg cccagaagat ggtcggctgg 780 cggaccgtct ccgctaaggg ggtggatatc tggacgtatg atctgaagga tctggcgaca 840 ggaattgatc tcaagtcgaa ccaggtggcg aaaaaggcgt ga 882 <210> 145 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DmaW pattern 1_SeqID 145 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any 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<222> (29)..(29) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 145 Ile Xaa Thr Gln Asn Lys Leu Ala Leu Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Phe 1 5 10 15 Xaa Xaa Lys Xaa Tyr Xaa Tyr Pro Xaa Leu Lys Xaa Xaa Thr Gly 20 25 30 <210> 146 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DmaW pattern 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(39) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(42) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(45) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(65) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(70) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(73) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(76) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83)..(83) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (85)..(85) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(90) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 146 Arg Leu Xaa Ser Cys Asp Leu Xaa Xaa Pro Xaa Ser Arg Xaa Lys Ile 1 5 10 15 Tyr Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Val Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Glu Asp Leu Trp 20 25 30 Thr Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Gly Leu Xaa 35 40 45 Xaa Leu Arg Glu Leu Trp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Tyr Pro Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Gly Xaa 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amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (96)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (98)..(98) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (113)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (124)..(124) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (127)..(128) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (130)..(132) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (134)..(134) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (142)..(142) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (146)..(147) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (151)..(153) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (159)..(160) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (163)..(163) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (166)..(167) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (182)..(183) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (197)..(197) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (203)..(203) <223> Xaa can be any 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<221> misc_feature <222> (262)..(262) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (278)..(278) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (291)..(291) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (293)..(293) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (297)..(297) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (307)..(307) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (309)..(310) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (313)..(313) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (316)..(317) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (320)..(320) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (324)..(324) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (327)..(327) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (330)..(330) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (344)..(344) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (347)..(347) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (356)..(356) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (362)..(366) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (378)..(379) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (382)..(383) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (386)..(387) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (389)..(391) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (395)..(395) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (397)..(397) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (399)..(399) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (413)..(413) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (432)..(439) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (441)..(443) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 147 Met Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Tyr Xaa Thr Leu Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa Phe Asp Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Leu Trp Trp His Ser 20 25 30 Thr Ala Pro Met Phe Ala Xaa Met Leu Gln Thr Ala Xaa Tyr Xaa Xaa 35 40 45 His Xaa Gln Tyr Xaa His Leu Gly Ile Tyr Lys Lys Xaa Xaa Ile Pro 50 55 60 Phe Leu Gly Val Tyr Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Trp Leu Ser Ile 65 70 75 80 Leu Thr Arg Tyr Gly Thr Pro Phe 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<222> (13)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (26)..(29) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (31)..(40) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (42)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(54) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (60)..(62) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 148 Tyr Xaa Gln Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Thr Leu Leu Xaa Xaa Xaa Ala 1 5 10 15 Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (38)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 149 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Gly Xaa Glu Xaa His Xaa Xaa Ala Asn 1 5 10 15 Gly Xaa Leu Xaa Asp Gln Phe Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Arg Xaa 20 25 30 Asp Xaa Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Arg Phe 35 40 45 <210> 150 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EasA patern 3 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 150 Gly Arg Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Pro Asp Leu Pro Phe 1 5 10 <210> 151 <211> 496 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<220> <221> misc_feature <222> (77)..(77) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (89)..(89) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (131)..(131) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (144)..(144) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (158)..(158) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (169)..(169) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (179)..(179) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (189)..(189) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (226)..(227) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (229)..(230) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (232)..(233) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (236)..(237) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (241)..(241) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (271)..(271) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (288)..(288) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (291)..(291) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (294)..(295) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (300)..(300) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (311)..(311) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (356)..(356) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (359)..(360) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (365)..(366) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (368)..(369) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (371)..(371) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (373)..(374) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (378)..(382) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (388)..(388) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (390)..(390) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (392)..(392) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (394)..(397) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (399)..(399) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (402)..(403) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (406)..(408) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (412)..(413) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (417)..(417) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (419)..(419) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (421)..(421) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (424)..(427) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (429)..(429) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (439)..(440) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (443)..(444) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (446)..(446) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (452)..(452) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (455)..(455) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (459)..(459) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (464)..(466) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (474)..(474) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (477)..(477) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (481)..(481) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (485)..(485) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (489)..(489) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (493)..(493) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 151 Ala Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Tyr Thr Thr Ser Asn Gly Cys Pro Val 1 5 10 15 Xaa Xaa Pro Glu Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 20 25 30 Leu Xaa Asp Xaa His Leu Ile Asp Xaa Leu Ala His Phe Asn Arg Glu 35 40 45 Lys Ile Pro Glu Arg Ala Val His Ala Lys Gly Ala Gly Ala Tyr Gly 50 55 60 Glu Phe Glu Val Thr Xaa Asp Ile Ser Asp Ile Cys Xaa Ile Asp Met 65 70 75 80 Leu Leu Gly Val Gly Lys Lys Thr Xaa Cys Val Thr Arg Phe Ser Thr 85 90 95 Thr Gly Leu Glu Arg Gly Ser Ala Asp Ser Val Arg Asp Leu Lys Gly 100 105 110 Met Ala Val Lys Phe Tyr Thr Xaa Glu Gly Asn Trp Asp Trp Val Xaa 115 120 125 Leu Asn Xaa Pro Met Phe Phe Ile Arg Asp Pro Ser Lys Phe Pro Xaa 130 135 140 Leu Ile His Ala Gln Arg Arg Asp Pro Gln Thr Asn Leu Xaa Asn Pro 145 150 155 160 Ser Met Phe Trp Asp Phe Val Thr Xaa Asn His Glu Ala 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occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (112)..(112) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (114)..(114) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (117)..(117) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (121)..(121) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (143)..(145) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (147)..(147) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (182)..(182) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (191)..(191) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (197)..(197) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (202)..(202) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (213)..(213) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (215)..(215) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (223)..(223) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (225)..(225) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 152 Met Ala Ser Val Ser Ser Lys Ile Phe Ala Ile Thr Gly Gly Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ile Gly Ala Ala Thr Cys Arg Leu Leu Ala Xaa Arg Gly Ala Ala 20 25 30 Val Ile Cys Val Gly Asp Val Ser Ser Xaa Asn Phe Xaa Ser Leu Xaa 35 40 45 Lys Ser Ile Lys Glu Ile Asn Pro Ser Thr Lys Val His Cys Thr Val 50 55 60 Leu Asp Val Ser Ser Ser Ser Glu Val Asp Xaa Trp Leu Xaa Asp Ile 65 70 75 80 Ile Ser Thr Phe Gly Asp Leu His Gly Ala Ala Asn Val Ala 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amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (39)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (54)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (74)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (92)..(92) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (102)..(102) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (113)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (115)..(116) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (118)..(120) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (138)..(138) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (142)..(142) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (163)..(163) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (184)..(184) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (187)..(187) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (192)..(192) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (195)..(198) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (203)..(203) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (220)..(220) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (224)..(224) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (255)..(256) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (272)..(272) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (322)..(322) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (324)..(325) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (327)..(327) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (333)..(333) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (337)..(337) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (357)..(360) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (369)..(369) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (378)..(378) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (380)..(380) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (383)..(383) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (388)..(388) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (391)..(391) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (394)..(395) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (398)..(398) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (401)..(401) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (405)..(405) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (408)..(409) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (412)..(412) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (415)..(416) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (424)..(424) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (429)..(429) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (437)..(437) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (440)..(440) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (446)..(446) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (450)..(451) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (454)..(454) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (460)..(460) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (477)..(478) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (503)..(503) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (512)..(512) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (516)..(516) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (520)..(520) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (531)..(531) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (554)..(554) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (556)..(556) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (562)..(562) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (583)..(583) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (593)..(596) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (598)..(599) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (601)..(601) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (603)..(603) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (605)..(606) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (608)..(608) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 153 Met Xaa Xaa Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Arg Cys Arg Pro Trp 20 25 30 Glu Xaa Cys Trp Pro Ser Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Ser Xaa Asn Xaa Ser 35 40 45 Ile Asp Gly Xaa Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Ile Ala Xaa Val Cys His 50 55 60 Xaa Pro Xaa Phe Asp Xaa Ser Ala Cys Xaa Xaa Leu Leu Xaa Leu Ser 65 70 75 80 Arg Asp Ser Gly Trp Arg Ala Ser Asn Pro Gly Xaa Leu Gln Asp Trp 85 90 95 Val Trp Glu Ala Gly Xaa Thr Ala Asn Glu Ser Cys Pro Val Gly Ser 100 105 110 Xaa Arg Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Cys His Gln Gly Arg Ile Pro 115 120 125 Leu Tyr Ser Ala Ala Val Glu Ser Thr Xaa Gln Val Gln Xaa Ala Val 130 135 140 Arg Phe Ala Arg Arg His Asn Leu Arg Leu Val Ile Arg Asn Thr Gly 145 150 155 160 His Asp Xaa Ala Gly Arg Ser Ser Ala Pro Asp Ser Phe Gln Ile His 165 170 175 Thr His Arg Leu Gln Glu Ile Xaa Phe His Xaa Asn Phe Arg Leu Xaa 180 185 190 Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Ser Leu Gly Xaa Pro Ala Val Thr Val 195 200 205 Gly Ala Gly Val Met Met Gly Glu Leu Tyr Ala Xaa Gly Ala Arg Xaa 210 215 220 Gly Tyr Met Val Leu Gly Gly Glu Cys Pro Thr Val Gly Val Val Gly 225 230 235 240 Gly Phe Leu Gln Gly Gly Gly Val Ser Ser Phe Leu Ser Phe Xaa Xaa 245 250 255 Gly Leu Ala Val Asp Asn Val Leu Glu Tyr Glu Val Val Thr Ala Xaa 260 265 270 Gly Glu Leu Val Val Ala Asn Ala His Gln Asn Gln Asp Leu Phe Trp 275 280 285 Ala Leu Arg Gly Gly Gly Gly Gly Thr Phe Gly Val Val Thr Arg Ala 290 295 300 Thr Met Arg Val Phe Pro Asp Val Pro Val Val Val Ser Glu Ile Leu 305 310 315 320 Leu Xaa Ala Xaa Xaa Ala Xaa Ser Ser Phe Trp Thr Xaa Gly Leu Ser 325 330 335 Xaa Leu Leu Thr Ala Leu Gln Ser Leu Asn Gln Asp Asn Val Gly Gly 340 345 350 Gln Leu Val Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Lys 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naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (79)..(79) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (105)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (121)..(121) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (125)..(125) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (130)..(130) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (132)..(132) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (150)..(150) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (153)..(153) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (189)..(189) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (193)..(193) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (195)..(195) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (197)..(198) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (240)..(241) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (243)..(254) <223> the stretch of X between amino acid position 243 and 254 can be between 4 X and 12 X <220> <221> misc_feature <222> (286)..(286) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (293)..(293) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (312)..(313) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (316)..(316) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (320)..(320) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (328)..(329) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (332)..(332) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 154 Met Xaa Xaa Pro Xaa Val Ile Asp Ile Arg Xaa Ser Xaa Phe Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ile Pro Asp Gln Val Ile Xaa Gly Leu Xaa Ser Xaa Pro Lys Thr 20 25 30 Leu Pro Ala Leu Leu Phe Tyr Ser Asn Glu Gly Leu Xaa His Trp Asn 35 40 45 His His Ser His Gln Pro Asp Phe Tyr Pro Arg His Gln Glu Ile Xaa 50 55 60 Ile Leu Lys Xaa Lys Ala Xaa Glu Met Ala Ala Ser Ile Ala Xaa Asn 65 70 75 80 Ser Val Val Val Asp Leu Gly Ser Ala Ser Leu Asp Lys Val Ile His 85 90 95 Leu Leu Glu Ala Leu Glu Ala Gln Xaa Lys Xaa Val Thr Tyr Tyr Ala 100 105 110 Leu Asp Leu Ser Ala Ser Gln Leu Xaa Ser Thr Leu Xaa Ala Ile Pro 115 120 125 Thr Xaa Gln Xaa Phe Arg His Val Arg Phe Ala Gly Leu His Gly Thr 130 135 140 Phe Asp Asp Gly Leu Xaa Trp Leu Xaa Glu Thr Pro Glu Ile Arg Asp 145 150 155 160 Leu Pro His Cys Val Leu Leu Phe Gly Leu Thr Ile Gly Asn Phe Ser 165 170 175 Arg Pro Asn Ala Ala Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ala Xaa His Ala Leu 180 185 190 Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Gln Ser Ser Ile Leu Leu Ser Leu Asp Ser 195 200 205 Cys Lys Val Pro Thr Gln Val Leu Arg Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Val 210 215 220 Val Pro Phe Ala Leu Gln Ser Leu Thr Tyr Ala Asn Thr Leu Phe Xaa 225 230 235 240 Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Phe 245 250 255 Asn Pro Asp Asp Trp Tyr Tyr Leu Ser Glu Trp Asn Phe Val Leu Gly 260 265 270 Arg His Glu Ala Ser Leu Ile Pro Arg Ser Lys Asp Ile Xaa Leu Gly 275 280 285 Ala Pro Leu Asp Xaa Ile Val Val Arg Lys Asp Glu Lys Val Arg Phe 290 295 300 Gly Cys Ser Tyr Lys Tyr Asp Xaa Xaa Glu Arg Xaa Glu Leu Phe Xaa 305 310 315 320 Ala Ala Gly Leu Lys Asp Glu Xaa Xaa Trp Ser Xaa Glu Gly Cys Asp 325 330 335 Val Ala Phe Tyr Gln Leu Lys Leu 340 <210> 155 <211> 318 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EasG consensus <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (24)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (38)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (46)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (63)..(64) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (66)..(70) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (86)..(86) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (124)..(124) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (133)..(133) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (137)..(137) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (139)..(139) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (152)..(154) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (160)..(160) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (163)..(163) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (182)..(182) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (196)..(196) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (198)..(198) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (217)..(235) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (259)..(259) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (262)..(263) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (265)..(265) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (269)..(269) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (273)..(273) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (281)..(281) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (284)..(284) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (292)..(294) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (297)..(297) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (301)..(302) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (312)..(312) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (315)..(316) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 155 Met Thr Ile Leu Leu Thr Gly Gly Arg Gly Lys Thr Ala Ser His Ile 1 5 10 15 Ala Ser Leu Leu Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Val Pro Phe Ile Val Ala 20 25 30 Ser Arg Ser Ser Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Pro Tyr Arg Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Phe Asp Trp Leu Asp Glu Xaa Thr Tyr Gly Asn Xaa Leu Ser Xaa Xaa 50 55 60 Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Met Xaa Pro Ile Ser Ala Val Trp Leu 65 70 75 80 Val Xaa Pro Pro Ile Xaa Asp Leu Ala Pro Pro Met Ile Lys Phe Ile 85 90 95 Asp Phe Ala Arg 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Ala Ser Xaa Glu Lys Xaa Xaa Trp Leu 305 310 315 <210> 156 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EasH consensus <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (33)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (39)..(42) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (45)..(46) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (85)..(85) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (89)..(89) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (93)..(94) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(99) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (102)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (122)..(122) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (126)..(126) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (129)..(129) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (146)..(146) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (150)..(150) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (163)..(163) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (180)..(180) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (182)..(187) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (189)..(189) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (194)..(194) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (204)..(204) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (215)..(217) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (242)..(242) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (245)..(245) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (262)..(262) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (269)..(269) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (280)..(280) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (282)..(283) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 156 Met Thr Xaa Thr Xaa Thr Ser Lys Pro Xaa Leu Arg Arg Xaa Pro Xaa 1 5 10 15 Ser Ala Gly Xaa Xaa Ala Ile Phe Gln Val Leu Gln Glu Asp Gly Val 20 25 30 Xaa Xaa Ile Glu Gly Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Val Xaa Xaa Phe Asn 35 40 45 Xaa Glu Xaa Asp Pro His Xaa Lys Xaa Trp Glu Leu Gly Gln Xaa Ser 50 55 60 Xaa Gln Glu Xaa Tyr Leu Ala Xaa Met Xaa Gln Leu Ser Ser Leu Pro 65 70 75 80 Leu Phe Ser Lys Xaa Phe Arg Asp Xaa Leu Met Asn Xaa Xaa Leu Leu 85 90 95 His Gly Xaa Cys Lys Xaa Xaa Phe Gly Pro Xaa Ser Gly Asp Tyr Trp 100 105 110 Leu Thr Thr Ser Ser Val Leu Glu Thr Xaa Pro Gly Tyr Xaa Gly Gln 115 120 125 Xaa Leu His Arg Glu His Asp Gly Ile Pro Ile Cys Thr Thr Leu Gly 130 135 140 Arg Xaa Ser Pro Glu Xaa Met Leu Asn Phe Leu Thr Ala Leu Thr Asp 145 150 155 160 Phe Thr Xaa Glu Asn Gly Ala Thr Arg Val Leu Pro Gly Ser His Leu 165 170 175 Trp Glu Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Ala Ile Pro 180 185 190 Ala Xaa Met Asn Pro Gly Asp Ala Val Leu Phe Xaa Gly Lys Thr Leu 195 200 205 His Gly Ala Gly Lys Asn Xaa Xaa Xaa Asp Phe Leu Arg Arg Gly Phe 210 215 220 Pro Leu Ile Met Gln Ser Cys Gln Phe Thr Pro Val Glu Ala Ser Val 225 230 235 240 Ala Xaa Pro Arg Xaa Leu Val Glu Thr Met Thr Pro Leu Ala Gln Lys 245 250 255 Met Val Gly Trp Arg Xaa Val Ser Ala Lys Gly Val Xaa Ile Trp Thr 260 265 270 Tyr Asp Leu Lys Asp Leu Ala Xaa Gly Xaa Xaa Leu Lys 275 280 285 <210> 157 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EasH of Paecilomyces divaricatus codon optimized for S. cerrevisiae <400> 157 atgaccgtga ccaaaacttc caagcccgtc cttcggcgct tgccgatctc cgccggagcc 60 gatgccattt tccaggttct ccaggaggac ggcgtcctca tcatcgaggg cttcctgacg 120 cccgagcagg tgaagaagtt taacgcggag gtcgaccccc acctcaagaa gtgggagttg 180 ggtcagggtt ccatgcaaga gggctacctc gccaacatga agcagctgtc cagcttgcct 240 ctcttcagca agaccttccg cgacgacctt atgaaccatg acctcctcca cggcatctgc 300 aagaaggcct tcggtccgga ttctggtgac tactggctga ctacgtcctc cgtcctggag 360 accgaccctg gctatcccgg ccaagacttg catcgggaac acgatggcat ccccatctgc 420 accaccctgg gccgtgactc ccctgaggcc atgctgaact tcctgaccgc tctgaccgac 480 tttaccgaag agaacggtgc cactcgcgtc ctgcccggtt cccacctgtg ggaggattac 540 tctaagagcg ttagtcccga ccaggcaatt cctgccgaga tgaatccggg tgacgccgtc 600 ttgttcagcg gcaagaccct ccacggtgcc ggcaagaacc agtccaagga cttcctccgc 660 cgtggcttcc ccctcattat gcagtcgtgt cagttcactc ccgtcgaggc cagcgtggct 720 atccctcgct ccctggtcga gaccatgacc cccctggctc agaagatggt cggctggcgt 780 tctgtctcgg ccaaaggagt ggaaatctgg acatacgacc tcaaggatct ggctaaggga 840 cttaagctga aggcgatcgc tgctgagtag 870 <210> 158 <211> 867 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 158 atgactgccg acaacaatag tatgccccat ggtgcagtat ctagttacgc caaattagtg 60 caaaaccaaa cacctgaaga cattttggaa gagtttcctg aaattattcc attacaacaa 120 agacctaata cccgatctag tgagacgtca aatgacgaaa gcggagaaac atgtttttct 180 ggtcatgatg aggagcaaat taagttaatg aatgaaaatt gtattgtttt ggattgggac 240 gataatgcta ttggtgccgg taccaagaaa gtttgtcatt taatggaaaa tattgaaaag 300 ggtttactac atcgtgcatt ctccgtcttt attttcaatg aacaaggtga attactttta 360 caacaaagag ccactgaaaa aataactttc cctgatcttt ggactaacac atgctgctct 420 catccactat gtattgatga cgaattaggt ttgaagggta agctagacga taagattaag 480 ggcgctatta ctgcggcggt gagaaaacta gatcatgaat taggtattcc agaagatgaa 540 actaagacaa ggggtaagtt tcacttttta aacagaatcc attacatggc accaagcaat 600 gaaccatggg gtgaacatga aattgattac atcctatttt ataagatcaa cgctaaagaa 660 aacttgactg tcaacccaaa cgtcaatgaa gttagagact tcaaatgggt ttcaccaaat 720 gatttgaaaa ctatgtttgc tgacccaagt tacaagttta cgccttggtt taagattatt 780 tgcgagaatt acttattcaa ctggtgggag caattagatg acctttctga agtggaaaat 840 gacaggcaaa ttcatagaat gctataa 867 <210> 159 <211> 1658 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T/P cassette including both Asc I sites <400> 159 ggcgcgccat gcagggatat cagatctggg ccgtatactt acatatagta gatgtcaagc 60 gtaggcgctt cccctgccgg ctgtgagggc gccataacca aggtatctat 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tggaatcaaa gctaacttca aaattcgcca caacattgaa gatggatccg ttcaactagc 1020 agaccattat caacaaaata ctccaattgg cgatggccct gtccttttac cagacaacca 1080 ttacctgtcg acacaatctg ccctttcgaa agatcccaac gaaaagcgtg accacatggt 1140 ccttcttgag tttgtaactg ctgctgggat tacacatggc atggatgagc tctacaaata 1200 atgaattcgt cgaggccgtt caggcctcga ggccgttcag gctcgacccg gggatccgcg 1260 gacaaatcgc tcttaaatat atacctaaag aacattaaag ctatattata agcaaagata 1320 cgtaaatttt gcttatatta ttatacacat atcatatttc tatattttta agatttggtt 1380 atataatgta cgtaatgcaa aggaaataaa ttttatacat tattgaacag cgtccaagta 1440 actacattat gtgcactaat agtttagcgt cgtgaagact ttattgtgtc gcgaaaagta 1500 aaaattttaa aaattagagc accttgaact tgcgaaaaag gttctcatca actgtttaaa 1560 aggaggatat caggtcctat ttctgacaaa caatatacaa atttagtttc aaagcatgcc 1620 catgggttaa ctgatcaatg catcctgcat ggcgcgcc 1658 <210> 160 <211> 7599 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pEVE2656 (YERC?8-KanMX-G/C+Aj_EasC) <400> 160 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctccct gcaggcccag 420 ttgtttgtag ctggttcata tttagcggca attctctgtt gcgtaaatga aaatattaat 480 gtaaacaaaa aaagaccaaa acattttagc agtgtaagaa ggtgtactga tacaaaatgt 540 gtttagagtc tactgatatg ttactgaccg ttcgttggga aaaaaatact gtatcattta 600 ttaatcaaaa gcgacttttg gtggaatatt atgatatgtg ttgttaaaat atgacgtaat 660 tttagaattg tctgattcgt attcaaattt ggtgaaggaa taacgcagag ttgacaattt 720 aatagaatgg attaatcgta attttcagaa acgtagaaaa agaaaaacaa ttaaaacatt 780 atattaagat tattgatttg ccttttaagg gtccagcggc cgccagctga agcttcgtac 840 gctgcaggtc gacaaccctt aatataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattag 900 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gcctcgacat catctgccca gatgcgaagt taagtgcgca 1860 gaaagtaata tcatgcgtca atcgtatgtg aatgctggtc gctatactgc tgtcgattcg 1920 atactaacgc cgccatccag tgtcgaaaac gagcatgccc atgggttaac tgatcaatgc 1980 atcctgcatg gcgcgcc 1997 <210> 169 <211> 9612 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Integration vector pEVE2658 <400> 169 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctccct gcaggctgca 420 acttgtcagc ctttgcgacg atttgtaatg aatccttttg catcgctaga aggagaagat 480 aatatttctt ctgttttttt tttacatatg caacaatttg aaagtcaggt caaagacaga 540 ttccggttcc ccatattcag ataggagaaa aaaacttttg gcaactcatg ttaccaagtc 600 gagaccttaa agttaagtgt cggcctggaa acgcaaaatc ttgtaatctt ttaacgctgc 660 ttttcaaatc acgaacgcaa tcagtacttg tacctaattt tggttttctc gtattgaata 720 gtgaaccata ggtcgaaaat ttaaggccac ataaatccag agcccgcaac ttggataggt 780 atttacttga tttttagttt gctttcaata gtgtcgtgaa attataaagt acgccgcata 840 catatcttga ttagttaaaa atagcagtgt tcaatgatga tttgataggg ttcataactg 900 gtaccagcgt agtacaatta cgattatcca tgaacataaa agtggcttaa atactatata 960 tcagtgaagc ttcaaagtaa gcaaacgaga taccaagatc ttgtaggacc acgatatata 1020 agaagcctag ttccgttgta gcatcacata gaagagagcg acgatgcctc agaaagtcta 1080 cagcaacaga aagctcagtg agcggccgcc agctgaagct tcgtacgctg caggtcgaca 1140 acccttaata taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tattaggtct agagatctgt 1200 ttagcttgcc tcgtccccgc cgggtcaccc ggccagcgac atggaggccc agaataccct 1260 ccttgacagt cttgacgtgc gcagctcagg ggcatgatgt gactgtcgcc cgtacattta 1320 gcccatacat ccccatgtat aatcatttgc atccatacat tttgatggcc gcacggcgcg 1380 aagcaaaaat tacggctcct cgctgcagac ctgcgagcag ggaaacgctc 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tcagttttgt tctttttgca aacaaatcac gagcgacggt aatttctttc tcgataagag 8580 gccacgtgct ttatgagggt aacatcaatt caagaaggag ggaaacactt cctttttctg 8640 gccctgataa tagtatgagg gtgaagccaa aataaaggat tcgcgcccaa atcggcatct 8700 ttaaatgcag gtatgcgata gttcctcact ctttccttac tcacgagtaa ttcttgcaaa 8760 tgcctattat gcagatgtta taatatctgt gcgtggcgcg tccggctgtc tgccatgctg 8820 cccggtgtac cgacataacc gccggtggca tagccgcgca tacgcgccat ttccttccat 8880 cttgtgattc atgctatcca tcttttttga gtatccaatt aacgaagacg ttaccagctg 8940 attgaaggtt ctcaaagtga ctgtactcca tgttttctta tcatccatgt agttattttt 9000 caaactgcaa attcaagaaa aagccacgcg tgtgcacctt ttttttcccc ttccagtgca 9060 ttatgcaata gacagcacga gtctttgaaa aagtaactta taaaactgta tcaattttta 9120 aacctaaata gattcataaa ctattcgtta atataaagtg ttctaaacta tgatgaaaaa 9180 ataagcagaa aagactaata attcttagtt aaaagcactc cgcggttagg ccttcttagc 9240 aacttgatta gacttcaagt caataccggt agccaaatcc ttcaaatcgt aggtccaaat 9300 atcaacaccc ttagcagaaa cagttctcca accaaccatt ttttgggcca atggagtcat 9360 agtttcaacc aattctcttg gcaaagcaac actagcttca actggagtga attgacaaga 9420 ttgcatgatc aatgggaaac ctcttctcaa aaaatcagta gtgttgttct taccggcacc 9480 atgtaaagtt ttaccagtaa acaaaacagc atcacctgga ttcataacag ctggaatagc 9540 agtatcagct tttggtggtg gagcagaaaa atcttcccac aaatgagaac ctggcaaaac 9600 tctagtagca ccattttcag cagtgaaatc agtcaaagca gtcaagaagt tcaacataga 9660 ttctggagat tgtctaccca aggtagtaca gattggaata ccatcatgtt ctctatgcaa 9720 ttcttgacca tggtaacctg gttcagtttc caaaacagaa gaagtagtca accagtaatc 9780 accagattct ggaccgaata atctcttgca caaaccgtgc aataattcgt cgttcatcaa 9840 ttcatctctg aacaacttgg agaacaaagg caaagatgac aattgtctca taccagccaa 9900 gtaagattct tggtaggatt tttgacccaa ttcccattgc ttcatgtgtg gatcaatttc 9960 accgttgaat cttctaactt ggtcagcaga catgaaacct tcgataacaa caacgccatc 10020 ttcttgcaag acttggaaaa tagcttcatc accagctgat cttggaattc ttctcaaggt 10080 tggcttagaa gtttcggtaa tggtcataag ctttttgtaa ttaaaactta gattagattg 10140 ctatgctttc tttctaatga gcaagaagta aaaaaagttg taatagaaca agaaaaatga 10200 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gacatggatc tccaattgaa 11880 catagtaccg aaatcagaaa attgcaacaa gaccatgtgc aaggattcat gattgttggt 11940 aacccaatcc cagtacatgt ttgggttcaa caaattagtt tgtggatctc ttctttgagc 12000 gtgcatcaaa gatgggaact tgactggatc acgaatgaag aagaatggga aattcaacat 12060 gacccaatcc caattacctt cagtagtgta gaacttacaa gccatacctt tcaaatctct 12120 cataccttcg ttagaacctc tttccaaacc agtggtagag aatctagtaa cacatggagt 12180 ctttttaccg acaccaacca acatatcgat atcgcaaata tcggagatat cggcagtaac 12240 ttcaaattca ccataagcac cagcaccttt agcgtgaaca actctttctg gaatcttttc 12300 tctgttgaaa tgggccaagg tatcaaccaa atgatgatca gacaaagcca aagttctacc 12360 atcagctggt ggaccttcag gcttatgaaa tggacaacca ttagcagtag tgtaagttgg 12420 cttagaatct ggagccataa gctttttgat agatttgact gtgttatttt gcgtgaggtt 12480 atgagtagaa aataataatt gagaaaggaa tatgacaaga aatatgaaaa taaagggaac 12540 aaacccaaat ctgattgcaa ggagagtgaa agagccttgt ttatatattt ttttttccta 12600 tgttcaacga ggacagctag gtttatgcaa aaatgtgcca tcaccataag ctgattcaaa 12660 tgagctaaaa aaaaaatagt tagaaaataa 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Pro Val 435 440 445 Gln Gly Arg Gly Arg Gly Arg Ile Pro Ala Ser Gly Tyr 450 455 460 <210> 181 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Neotyphodium lolii sequence with improved N-terminus <400> 181 Met Thr Ile Leu Leu Thr Gly Gly Arg Gly Lys Thr Ala Ser His Ile 1 5 10 15 Ala Ser Leu Leu Gln Ala Ala Lys Val Pro Phe Ile Val Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ser Asp Pro Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Tyr Gln Asn Cys Phe Asp 35 40 45 Trp Leu Asp Glu Lys Thr Tyr Gly Asp Val Leu Thr Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Met Gln Pro Ile Ser Thr Ile Trp Leu Val Pro Pro Pro Ile Phe Asp 65 70 75 80 Leu Ala Pro Leu Met Ile Lys Phe Val Asp Phe Ala Ser Arg Lys Gly 85 90 95 Val Lys Arg Phe Val Leu Leu Ser Ala Ser Thr Ile Lys Lys Gly Gly 100 105 110 Pro Ala Met Gly Gln Val His Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Gly Gly Ile 115 120 125 Glu Tyr Ala Val Leu Arg Pro Thr Trp Phe Met Glu Asn Phe Ser Tyr 130 135 140 Pro Gln Glu Leu Gln Arg Leu Ala Ile Lys Asn Glu Asn Lys Ile Tyr 145 150 155 160 Ser Ala Ala Gly Asp Gly Lys Leu Pro Phe Val Ser Val Ala Asp Ile 165 170 175 Ala Arg Val Ala Phe Arg Thr Leu Thr Asp Glu Lys Ser His Asn Thr 180 185 190 Asp Tyr Val Leu Leu Gly Pro Glu Leu Ile Thr Tyr Asp Gln Val Ala 195 200 205 Glu Thr Leu Ser Thr Val Leu Gly Arg Thr Ile Thr His Ile Lys Leu 210 215 220 Thr Glu Glu Glu Leu Val Lys Arg Leu Glu Asn Ser Gly Met Pro Ala 225 230 235 240 Glu Asp Ala Lys Met Leu Ala Gly Met Asp Thr Ser Ile Ser Asp Gly 245 250 255 Ala Glu Asp Arg Leu Asn Asn Val Val Lys His Val Thr Gly Ala Asp 260 265 270 Pro Arg Thr Phe Leu Asp Phe Ala Thr His Gln Lys Ala Thr Trp Gly 275 280 285 <210> 182 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DmaW consensus sequence 2 <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (47)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(73) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (96)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (98)..(98) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (113)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (124)..(124) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (130)..(132) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (134)..(134) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (142)..(142) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (146)..(146) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (151)..(153) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (159)..(160) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (163)..(163) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (166)..(167) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (182)..(183) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (197)..(197) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (207)..(207) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (212)..(212) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (216)..(218) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (223)..(223) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (226)..(227) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (230)..(230) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (233)..(233) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (237)..(248) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (259)..(259) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (262)..(262) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (278)..(278) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (291)..(291) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (293)..(293) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (296)..(297) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (300)..(300) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (307)..(307) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (310)..(311) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (313)..(313) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (316)..(317) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (320)..(320) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (327)..(327) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (330)..(330) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (344)..(344) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (347)..(347) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (363)..(363) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (365)..(365) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (378)..(379) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (382)..(382) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (387)..(387) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (389)..(390) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (395)..(395) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (399)..(399) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (413)..(413) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (432)..(439) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (442)..(443) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (446)..(450) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 182 Met Xaa Thr Xaa Asn Xaa Ser Xaa Xaa Glu Val Tyr Xaa Thr Leu Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa Phe Asp Phe Pro Asn Xaa Asp Gln Xaa Leu Trp Trp His Ser 20 25 30 Thr Ala Pro Met Phe Ala Xaa Met Leu Gln Thr Ala Asn Tyr Xaa Xaa 35 40 45 His Xaa Gln Tyr Xaa His Leu Gly Ile Tyr Lys Lys His Val Ile Pro 50 55 60 Phe Leu Gly Val Tyr Pro Thr Xaa Xaa Lys Xaa Arg Trp Leu Ser Ile 65 70 75 80 Leu Thr Arg Tyr Gly Thr Pro Phe Glu Leu Ser Leu Asn Cys Ser Xaa 85 90 95 Ser Xaa Val Arg Tyr Thr Tyr Glu Pro Ile Asn Ala Ala Thr Gly Thr 100 105 110 Xaa Lys Asp Pro Phe Asn Thr Xaa Ala Ile Trp Xaa Ser Leu Gln Xaa 115 120 125 Leu Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Gly Ile Asp Leu Glu Trp Phe Xaa Tyr Phe 130 135 140 Lys Xaa Glu Leu Thr Leu Xaa Xaa Xaa Glu Ser Ala Tyr Leu Xaa Xaa 145 150 155 160 Asn Asn Xaa Leu Val Xaa Xaa Gln Ile Lys Thr Gln Asn Lys Leu Ala 165 170 175 Leu Asp Leu Lys Gly Xaa Xaa Phe Val Leu Lys Thr Tyr Ile Tyr Pro 180 185 190 Ala Leu Lys Ser Xaa Ala Thr Gly Lys Ser Ile His Glu Leu Xaa Phe 195 200 205 Gly Ser Val Xaa Arg Leu Ser Xaa Xaa Xaa Pro Ser Ile Arg Xaa Pro 210 215 220 Leu Xaa Xaa Leu Glu Xaa Tyr Val Xaa Ser Arg Asn Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ser Pro Arg Leu Leu Ser Cys 245 250 255 Asp Leu Xaa Asp Pro Xaa Lys Ser Arg Val Lys Ile Tyr Leu Leu Glu 260 265 270 Arg Met Val Ser Leu Xaa Ala Met Glu Asp Leu Trp Thr Leu Gly Gly 275 280 285 Arg Arg Xaa Asp Xaa Ser Thr Xaa Xaa Gly Leu Xaa Met Ile Arg Glu 290 295 300 Leu Trp Xaa Leu Leu Xaa Xaa Pro Xaa Gly Leu Xaa Xaa Tyr Pro Xaa 305 310 315 320 Pro Tyr Leu Pro Leu Gly Xaa Ile Pro Xaa Glu Gln Leu Pro Ser Met 325 330 335 Ala Asn Tyr Thr Leu His His Xaa Asp Pro Xaa Pro Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Phe Thr Val Phe Gly Met Asn Asp Met Xaa Val Xaa Asp Ala Leu 355 360 365 Thr Thr Phe Phe Glu Arg Arg Gly Trp Xaa Xaa Met Ala Xaa Lys Tyr 370 375 380 Lys Ala Xaa Leu Xaa Xaa Ser Tyr Pro His Xaa Asp His Glu Xaa Leu 385 390 395 400 Asn Tyr Leu His Ala Tyr Ile Ser Phe Ser Tyr Arg Xaa Asn Lys Pro 405 410 415 Tyr Leu Ser Val Tyr 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<221> misc_feature <222> (63)..(70) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (77)..(77) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (86)..(86) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (100)..(100) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (124)..(124) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (133)..(134) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (137)..(137) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (139)..(139) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (152)..(154) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (157)..(157) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (160)..(160) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (162)..(163) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (181)..(182) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (196)..(196) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (198)..(198) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (236)..(236) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (240)..(240) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (243)..(244) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (246)..(246) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (250)..(250) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (252)..(252) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (254)..(254) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (262)..(262) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (265)..(265) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (273)..(275) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (278)..(278) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (282)..(283) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (292)..(294) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (296)..(297) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 183 Met Thr Ile Leu Leu Thr Gly Gly Arg Gly Lys Thr Ala Ser Xaa Ile 1 5 10 15 Ala Ser Leu Leu Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Val Pro Phe Ile Val Ala 20 25 30 Ser Arg Ser Ser Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Ser Pro Tyr Arg Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Phe Asp Trp Leu Asp Glu Xaa Thr Phe Gly Asn Xaa Leu Ser Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Met Xaa Pro Ile Ser Xaa Val Trp Leu 65 70 75 80 Val Xaa Pro Pro Ile Xaa Asp Leu Ala Pro Pro Met Ile Lys Phe Ile 85 90 95 Asp Phe Ala Xaa Ser Arg Gly Val Lys Arg Phe Val Leu Leu Ser Ala 100 105 110 Ser Thr Ile Glu Lys Gly Gly Pro Ala Met Gly Xaa Val His Ala His 115 120 125 Leu Asp Ser Leu Xaa Xaa Gly Val Xaa Tyr Xaa Val Leu Arg Pro Thr 130 135 140 Trp Phe Met Glu Asn Phe Ser Xaa Xaa Xaa Glu Leu Xaa Trp Ile Xaa 145 150 155 160 Ile Xaa Xaa Glu Asn Lys Ile Tyr Ser Ala Thr Gly Asp Gly Lys Ile 165 170 175 Pro Phe Ile Ser Xaa Xaa Asp Ile Ala Arg Val Ala Phe Arg Ala Leu 180 185 190 Thr Asp Glu Xaa Ser Xaa 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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (79)..(79) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (88)..(88) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (117)..(119) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (121)..(121) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (135)..(135) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (148)..(149) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (163)..(163) <223> Xaa can be any naturally occurring amino 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(297)..(307) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (309)..(310) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (319)..(319) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (325)..(325) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (329)..(330) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (333)..(333) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (335)..(336) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (341)..(341) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (358)..(358) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (361)..(361) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (374)..(374) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (376)..(376) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (386)..(386) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 184 Ser Ser Ser Lys Leu Phe Xaa Pro Leu Xaa Val Gly Xaa Arg Xaa Xaa 1 5 10 15 Leu Gln His Arg Ile Val Met Ala Pro Met Thr Arg Phe Arg Ala Asp 20 25 30 Asp Xaa Gly Val Pro Xaa Leu Pro Tyr Val Lys Xaa Tyr Tyr Ala Gln 35 40 45 Arg Ala Ser Val Pro Gly Thr Leu Leu Ile Thr Glu Ala Thr Xaa Ile 50 55 60 Ser Pro Arg Ala Gly Gly Phe Pro Asn Val Pro Gly Ile Trp Xaa Glu 65 70 75 80 Ala Gln Ile Ala Ala Trp Lys Xaa Val Val Asp Ala Val His Ala Lys 85 90 95 Gly Ser Phe Ile Phe Leu Gln Leu Trp Ala Thr Gly Arg Ala Ala Asp 100 105 110 Pro Asp Val Leu Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Phe Asp Leu Val Ser Ser Ser 115 120 125 Ala Val Pro Val Ala Pro Xaa Gly Pro Val Pro Arg Ala Leu Thr Glu 130 135 140 Asp Glu Ile Xaa Xaa Tyr Ile Ala Asp Tyr Ala Gln Ala Ala Lys Asn 145 150 155 160 Ala Val Xaa Ala 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Xaa Ser Xaa Glu Gly Tyr Leu Asp Tyr Pro Phe 370 375 380 Ser Xaa Glu Phe Leu 385 <210> 185 <211> 606 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EasE consensus sequence 2 <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (89)..(89) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(99) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (110)..(110) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (112)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (115)..(117) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (135)..(135) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (139)..(139) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (160)..(160) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (181)..(181) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (184)..(184) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (189)..(189) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (192)..(195) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (200)..(200) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (217)..(217) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (221)..(221) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (252)..(253) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (269)..(269) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (319)..(319) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (321)..(322) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (324)..(324) <223> Xaa can be any 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<221> misc_feature <222> (395)..(395) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (398)..(398) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (402)..(402) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (405)..(406) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (409)..(409) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (412)..(413) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (421)..(421) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (426)..(426) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (434)..(434) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (437)..(437) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (443)..(443) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (447)..(448) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (451)..(451) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (457)..(457) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (474)..(475) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (500)..(500) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (509)..(509) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (513)..(513) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (517)..(517) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (528)..(528) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (551)..(551) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (553)..(553) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (559)..(559) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (580)..(580) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (590)..(593) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (595)..(596) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (598)..(598) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (600)..(600) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (602)..(603) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (605)..(605) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 185 Leu Leu Thr Xaa Gly Leu Val Ala Leu Leu Ser Trp Xaa Ile Tyr Thr 1 5 10 15 Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Ser Cys Arg Cys 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cctaagtttg actttgaagg acgaattcag atctcgcttc 1020 aagaatgtca cgaagattat ggattgtgtg caatgtgata gatgtagatt gtggggcaaa 1080 attcaaacta ccggttacgc aactgccttg aaaattttgt ttgaaatcaa cgacgctgat 1140 gaattcacca aacaacatat tgttggtaag ttaaccaaat atgagttgat tgcactatta 1200 cagactttcg gtagattatc tgaatctatt gaatctgtta acatgttcga aaaaatgtac 1260 gggaaaaggt taaacggttc tgaaaacagg ttaagctcat tcttccaaaa taacttcttc 1320 aacattttga aggaggcagg caaatcgatt cgttacacca tagagaacat caattccact 1380 aaagaaggaa agaaaaagac taacaattct caatcacatg tatttgatga tttaaaaatg 1440 cccaaagcag aaatagttcc aaggccctct aacggtacag taaataaatg gaagaaagct 1500 tggaatactg aagttaacaa cgttttagaa gcattcagat ttatttatag aagctatttg 1560 gatttaccca ggaacatctg ggaattatct ttgatgaagg tatacaaatt ttggaataaa 1620 ttcatcggtg ttgctgatta cgttagtgag gagacacgag agcctatttc ctataagcta 1680 gatatacaat aa 1692 <210> 187 <211> 563 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 187 Met Arg Leu Arg Thr Ala Ile Ala Thr Leu Cys Leu Thr Ala Phe Thr 1 5 10 15 Ser 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misc_feature <222> (39)..(39) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (47)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(73) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (96)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (98)..(98) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (113)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (124)..(124) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (130)..(132) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (134)..(134) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (142)..(142) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (146)..(146) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (151)..(153) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (159)..(160) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (163)..(163) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (166)..(167) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (182)..(183) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (197)..(197) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (207)..(207) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (212)..(212) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (216)..(218) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (223)..(223) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (226)..(227) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (230)..(230) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (233)..(233) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (237)..(258) <223> the stretch of X between amino acid position 237 and 258 can be between 4 X and 12 X <220> <221> misc_feature <222> (259)..(259) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (262)..(262) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (278)..(278) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (291)..(291) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (293)..(293) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (296)..(297) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (300)..(300) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (307)..(307) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (310)..(311) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (313)..(313) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (316)..(317) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (320)..(320) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (327)..(327) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (330)..(330) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (344)..(344) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (347)..(347) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (363)..(363) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (365)..(365) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (378)..(379) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (382)..(382) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (387)..(387) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (389)..(390) <223> Xaa can be any naturally occurring 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Leu Xaa Xaa Xaa Glu Ser Ala Tyr Leu Xaa Xaa 145 150 155 160 Asn Asn Xaa Leu Val Xaa Xaa Gln Ile Lys Thr Gln Asn Lys Leu Ala 165 170 175 Leu Asp Leu Lys Gly Xaa Xaa Phe Val Leu Lys Thr Tyr Ile Tyr Pro 180 185 190 Ala Leu Lys Ser Xaa Ala Thr Gly Lys Ser Ile His Glu Leu Xaa Phe 195 200 205 Gly Ser Val Xaa Arg Leu Ser Xaa Xaa Xaa Pro Ser Ile Arg Xaa Pro 210 215 220 Leu Xaa Xaa Leu Glu Xaa Tyr Val Xaa Ser Arg Asn Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ser Pro Arg Leu Leu Ser Cys 245 250 255 Asp Leu Xaa Asp Pro Xaa Lys Ser Arg Val Lys Ile Tyr Leu Leu Glu 260 265 270 Arg Met Val Ser Leu Xaa Ala Met Glu Asp Leu Trp Thr Leu Gly Gly 275 280 285 Arg Arg Xaa Asp Xaa Ser Thr Xaa Xaa Gly Leu Xaa Met Ile Arg Glu 290 295 300 Leu Trp Xaa Leu Leu Xaa Xaa Pro Xaa Gly Leu Xaa Xaa Tyr Pro Xaa 305 310 315 320 Pro Tyr Leu Pro Leu Gly Xaa Ile Pro Xaa Glu Gln Leu Pro Ser Met 325 330 335 Ala Asn Tyr Thr Leu His His Xaa Asp Pro Xaa Pro Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Phe Thr Val Phe 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occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (87)..(87) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(94) <223> the stretch of X between amino acid position 88 and 94 can be between 2 X and 6 X <220> <221> misc_feature <222> (112)..(112) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (116)..(116) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (137)..(137) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (158)..(158) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (161)..(161) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (166)..(166) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (169)..(172) <223> the stretch of X between amino acid position 169 and 172 can be between 1 X and 4 X <220> <221> misc_feature <222> (177)..(177) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (194)..(194) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (198)..(198) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (229)..(230) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (246)..(246) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (296)..(296) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (298)..(299) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (301)..(301) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (307)..(307) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (311)..(311) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (331)..(334) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (343)..(343) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (352)..(352) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (354)..(354) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (357)..(357) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (362)..(362) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (365)..(365) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (368)..(369) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (372)..(372) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (375)..(375) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (379)..(379) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (382)..(383) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (386)..(386) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (389)..(390) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (398)..(398) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (403)..(403) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (411)..(411) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (414)..(414) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (420)..(420) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (424)..(425) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (428)..(428) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (434)..(434) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (451)..(452) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (477)..(477) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (486)..(486) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (490)..(490) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (494)..(494) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (505)..(505) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (528)..(528) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (530)..(530) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (536)..(536) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (557)..(557) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 191 Cys Arg Cys Arg Pro Trp Glu Ser Cys Trp Pro Ser Glu Glu Xaa Trp 1 5 10 15 Xaa Ser Leu Asn Thr Ser Ile Asp Gly Xaa Leu Val Arg Leu Arg Pro 20 25 30 Ile Ala His Val Cys His Gly Pro Xaa Phe Asp Xaa Ser Ala Cys Asp 35 40 45 Asn Leu Leu Xaa Leu Ser Arg Asp Ser Gly Trp Arg Ala Ser Asn Pro 50 55 60 Gly Xaa Leu Gln Asp Trp Val Trp Glu Ala Gly Xaa Thr Ala Asn Glu 65 70 75 80 Ser Cys Pro Val Gly Ser Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Cys 85 90 95 His Gln Gly Arg Ile Pro Leu Tyr Ser Ala Ala Val Glu Ser Thr Xaa 100 105 110 Gln Val Gln Xaa Ala Val Arg Phe Ala Arg Arg His Asn Leu Arg Leu 115 120 125 Val Ile Arg Asn Thr Gly His Asp Xaa Ala Gly Arg Ser Ser Ala Pro 130 135 140 Asp Ser Phe Gln Ile His Thr His Arg Leu Gln Glu Ile Xaa Phe His 145 150 155 160 Xaa Asn Phe Arg Leu Xaa Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Ser Leu Gly 165 170 175 Xaa Pro Ala Val Thr Val Gly Ala Gly Val Met Met Gly Glu Leu Tyr 180 185 190 Ala Xaa Gly Ala Arg Xaa Gly Tyr Met Val Leu Gly Gly Glu Cys Pro 195 200 205 Thr Val Gly Val Val Gly Gly Phe Leu Gln Gly Gly Gly Val Ser Ser 210 215 220 Phe Leu Ser Phe Xaa Xaa Gly Leu Ala Val Asp Asn Val Leu Glu Tyr 225 230 235 240 Glu Val Val Thr Ala Xaa Gly Glu Leu Val Val Ala Asn Ala His Gln 245 250 255 Asn Gln Asp Leu Phe Trp Ala Leu Arg Gly Gly Gly Gly Gly Thr Phe 260 265 270 Gly Val Val Thr Arg Ala Thr Met Arg Val Phe Pro Asp Val Pro Val 275 280 285 Val Val Ser Glu Ile Leu Leu Xaa Ala Xaa Xaa Ala Xaa Ser Ser Phe 290 295 300 Trp Thr Xaa Gly Leu Ser Xaa Leu Leu Thr Ala Leu Gln Ser Leu Asn 305 310 315 320 Gln Asp Asn Val Gly Gly Gln Leu Val Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Asp 325 330 335 Ala Val Gln Ala Ser Ile Xaa Leu Phe Phe Leu Asn Met Thr Glu Xaa 340 345 350 Ala Xaa Ile Asp Xaa Arg Met Lys Pro Xaa Leu Thr Xaa Leu Ser Xaa 355 360 365 Xaa Asn Ile Xaa Tyr Thr Xaa Ser Ser Lys Xaa Leu Pro Xaa Xaa Ser 370 375 380 Ser Xaa Leu Arg Xaa Xaa Pro Asp Ile His Pro Asp Asn Xaa Tyr Gly 385 390 395 400 Ile Leu Xaa Ser Ser Val Leu Ile Ser Gln Xaa Leu Phe Xaa Ser Ser 405 410 415 Glu Gly Pro Xaa Lys Val Ala Xaa Xaa Leu Ala Xaa Leu Pro Met Ser 420 425 430 Pro Xaa Asp Leu Leu Phe Thr Ser Asn Leu Gly Gly Arg Val Ile Ala 435 440 445 Asn Gly Xaa Xaa Glu Leu Ala Glu Thr Ser Met His Pro Ala Trp Arg 450 455 460 Ser Ala Ala Gln Leu Ile Asn Tyr Val Arg Thr Val Xaa Glu Pro Ser 465 470 475 480 Ile Glu Gly Lys Ala Xaa Ala Leu Glu Xaa Leu Thr Asn Xaa Gln Met 485 490 495 Pro Ile Leu Tyr Ala Ile Asp Pro Xaa Phe Lys Leu Ser Tyr Arg Asn 500 505 510 Leu Gly Asp Pro Asn Glu Lys Asp Phe Gln Gln Val Tyr Trp Gly Xaa 515 520 525 Asn Xaa Tyr Gly Arg Leu Ser Xaa Ile Lys Lys Lys Trp Asp Pro Asp 530 535 540 Asp Leu Phe Phe Ser Lys Leu Gly Val Gly Ser Glu Xaa Trp Asp Ser 545 550 555 560 Glu Gly Met Cys Arg Lys 565 <210> 192 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EasC core consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (79)..(79) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (87)..(87) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (90)..(90) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (103)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (117)..(117) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (138)..(138) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (148)..(148) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (185)..(196) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (200)..(200) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (230)..(230) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (247)..(247) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (250)..(250) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (253)..(254) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (259)..(259) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (270)..(270) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 192 Leu Ala His Phe Asn Arg Glu Lys Ile Pro Glu Arg Ala Val His Ala 1 5 10 15 Lys Gly Ala Gly Ala Tyr Gly Glu Phe Glu Val Thr Xaa Asp Ile Ser 20 25 30 Asp Ile Cys Xaa Ile Asp Met Leu Leu Gly Val Gly Lys Lys Thr Xaa 35 40 45 Cys Val Thr Arg Phe Ser Thr Thr Gly Leu Glu Arg Gly Ser Ala Asp 50 55 60 Ser Val Arg Asp Leu Lys Gly Met Ala Val Lys Phe Tyr Thr Xaa Glu 65 70 75 80 Gly Asn Trp Asp Trp Val Xaa Leu Asn Xaa Pro Met Phe Phe Ile Arg 85 90 95 Asp Pro Ser Lys Phe Pro Xaa Leu Ile His Ala Gln Arg Arg Asp Pro 100 105 110 Gln Thr Asn Leu Xaa Asn Pro Ser Met Phe Trp Asp Phe Val Thr Xaa 115 120 125 Asn His Glu Ala Leu His Met Val Met Xaa Gln Phe Ser Asp Phe Gly 130 135 140 Thr Met Phe Xaa Tyr Arg Ser Met Ser Gly Tyr Val Gly His Ala Tyr 145 150 155 160 Lys Trp Val Met Pro Asp Gly Ser Phe Lys Tyr Val His Ile Phe Leu 165 170 175 Ser Ser Asp Gln Gly Pro Asn Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Pro Asp Xaa Ala Thr Arg Asp Leu Tyr Glu Ala 195 200 205 Ile Glu Arg Gly Glu Tyr Pro Ser Trp Thr Ala Asn Val Gln Val Val 210 215 220 Asp Pro Glu Asp Ala Xaa Lys Leu Gly Phe Asn Ile Leu Asp Val Thr 225 230 235 240 Lys His Trp Asn Leu Gly Xaa Tyr Pro Xaa Asp Leu Xaa Xaa Ile Pro 245 250 255 Ser Arg Xaa Phe Gly Lys Leu Thr Leu Asn Lys Asn Pro Xaa Asn Tyr 260 265 270 Phe Ala Glu Ile Glu Gln Leu Ala Phe Ser Pro Ser His Leu Val Pro 275 280 285 Gly Val Glu Pro Ser Glu Asp Pro Ile Leu Gln Ala Arg Leu Phe Ala 290 295 300 Tyr Pro Asp Ala Gln Arg Tyr Arg Leu Gly 305 310

Claims (59)

  1. a) 적어도 하나의 EasH 활성, 또는
    b) 적어도 하나의 EasH 및 EasD 활성, 또는
    c) 적어도 하나의 EasH 및 EasA 리덕타제 활성, 또는
    d) 적어도 하나의 EasH, EasD 및 EasA 활성, 또는
    e) 적어도 하나의 EasH 및 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
    f) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 또는
    g) 적어도 하나의 EasD, EasA 및 EasG 활성, 또는
    h) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
    i) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
    j) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성, 또는
    k) a) 내지 j) 중 적어도 2개의 조합
    을 포함하고, 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 아닌 재조합 미생물.
  2. DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성으로 이루어지는 활성의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 상향조절된 활성을 갖고, 여기서 EasA 활성은 EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasA 리덕타제 및 EasA 이소머라제 활성인 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 상향조절된 활성이
    a) 적어도 하나의 EasH 활성, 또는
    b) 적어도 하나의 EasH 및 EasD, 또는
    c) 적어도 하나의 EasH 및 EasA 리덕타제 활성, 또는
    d) 적어도 하나의 EasH, EasD 및 EasA 활성, 또는
    e) 적어도 하나의 EasH 및 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
    f) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 및 EasG 활성, 또는
    g) 적어도 하나의 EasD, EasA 및 EasG 활성, 또는
    h) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
    i) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
    j) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성
    의 군 중의 하나 이상의 활성으로부터 선택되는 것인 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 하향조절된 활성을 갖는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, DMAPP의 확대된 공급 및/또는 Me-DMAT의 확대된 공급을 포함하는, 바람직하게는 적어도 하나의 하향조절된 ERG9 또는 ERG20 활성, 또는 적어도 하나의 상향조절된 HMG-CoA 리덕타제 활성을 포함하는, 또는 적어도 하나의 하향조절된 ERG9 또는 ERG20 활성 및 적어도 하나의 상향조절된 HMG-CoA 리덕타제 활성을 포함하는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 적어도 하나의 EasH 활성, 또는
    b) 적어도 하나의 EasH 및 EasD 활성, 또는
    c) 적어도 하나의 EasA 리덕타제 또는 적어도 하나의 EasA 이소머라제 활성, 또는
    d) 적어도 하나의 EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
    e) 적어도 하나의 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
    f) 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
    g) 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
    h) 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
    i) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성, 또는
    j) a) 내지 i) 중 적어도 2개의 조합
    을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체.
  7. a) 적어도 하나의 EasH 활성, 또는
    b) 적어도 하나의 EasH 및 EasD 활성, 또는
    c) 적어도 하나의 EasA 리덕타제 또는 적어도 하나의 EasA 이소머라제 활성, 또는
    d) 적어도 하나의 EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
    e) 적어도 하나의 EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
    f) 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
    g) 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 리덕타제 및 EasG 활성, 또는
    h) 적어도 하나의 EasH, EasD, EasA 이소머라제 및 EasG 활성, 또는
    i) 적어도 하나의 DmaW, EasF, EasE 및 EasC 활성, 또는
    j) a) 내지 i) 중 적어도 2개의 조합
    을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, DmaW 활성이
    a) 서열 145 및 146에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    b) 서열 147 및/또는 190에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    c) 서열 1, 19, 20, 179, 및/또는 180에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    d) 서열 1, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 및/또는 28에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    e) 서열 102, 122, 123에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    f) 서열 129 및/또는 137에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
    g) 서열 102, 122, 123, 129 및/또는 137에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    h) 엄격한 조건 하에 서열 102, 122, 123, 129 및/또는 137에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    i) a) 내지 h) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 b) 및 c)에 따른 폴리펩티드, 또는
    j) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 i) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드
    에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, EasF 활성이
    a) 서열 154에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    b) 서열 6, 75 및/또는 76에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    c) 서열 6, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 및/또는 85에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    d) 서열 107 및/또는 120에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    e) 서열 134 및/또는 142에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
    f) 서열 107, 120, 134 및/또는 142에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    g) 엄격한 조건 하에 서열 107, 120, 134 및/또는 142에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드 또는
    i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드
    에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, EasE 활성이
    a) 서열 153, 185 및/또는 191에 적어도 90% 서열 동일성, 바람직하게는 서열 191에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는,
    b) 서열 5 및/또는 64에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    c) 서열 5, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 및/또는 74에 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열 5, 64, 175, 66, 67, 68, 69, 176, 71, 177, 73 및/또는 178에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    d) 서열 106에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    e) 서열 133 및/또는 141에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
    f) 서열 106, 133 또는 141에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    g) 엄격한 조건 하에 서열 106, 133 또는 141에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드 또는
    i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드
    에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, EasC 활성이
    a) 서열 151 및/또는 192에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는,
    b) 서열 3 및/또는 41에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    c) 서열 3, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및/또는 52에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    d) 서열 104에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    e) 서열 131 및/또는 139에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
    f) 서열 104, 131 및/또는 139에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    g) 엄격한 조건 하에 서열 104, 131 및/또는 139에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드, 또는
    i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드
    에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, EasD 활성이
    a) 서열 152에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는,
    b) 서열 4 및/또는 53에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    c) 서열 4, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 및/또는 63에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    d) 서열 105에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    e) 서열 132 및/또는 140에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    f) 서열 105, 132 및/또는 140에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는
    g) 엄격한 조건 하에 서열 105, 132 및/또는 140에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는
    h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드 또는
    i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드
    에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, EasH 활성이
    a) 서열 156에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    b) 서열 8 및/또는 95에 적어도 60% 서열 동일성을 갖고 서열 156에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    c) 서열 8 및/또는 95에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    d) 서열 109 및/또는 157에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    e) 서열 109, 136 또는 144 및/또는 157에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
    f) 서열 109, 136, 144 및/또는 157에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    g) 엄격한 조건 하에 서열 109, 136, 144 및/또는 157에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드 또는
    i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드
    에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, EasA 리덕타제 활성이
    a) 서열 148, 149 및 150에 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 티로신을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    b) 서열 193, 194 및 195에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 194의 아미노산 위치 18에 티로신을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    c) 서열 2 및/또는 31에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    d) 서열 2, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및/또는 40에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    e) 서열 103에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    f) 서열 130 및/또는 138에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
    g) 서열 103, 130 및/또는 138에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    h) 엄격한 조건 하에 서열 103, 130 및/또는 138에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    i) a) 내지 h) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 b) 및 c)에 따른 폴리펩티드, 또는
    j) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 i) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드
    에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, EasA 이소머라제 활성이
    a) 서열 148, 149 및 150에 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 페닐알라닌을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    b) 서열 193, 194 및 195에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 194의 아미노산 위치 18에 페닐알라닌을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    c) 서열 2 및/또는 31에 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    d) 서열 2, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및/또는 40에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    e) 서열 103에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    f) 서열 130 및/또는 138에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는,
    g) 서열 103, 130 및/또는 138에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    h) 엄격한 조건 하에 서열 103, 130 및/또는 138에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    i) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드, 또는
    j) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드
    에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, EasG 활성이
    a) 서열 155 및/또는 183에 적어도 90% 서열 동일성, 바람직하게는 서열 183에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    b) 서열 7 및/또는 86에 적어도 39% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    c) 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 181, 92, 93 및/또는 94에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    d) 서열 108에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    e) 서열 135 및/또는 143에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    f) 서열 108, 135 및/또는 143에 의해 설명되는 서열의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 각각 포함하는 2개의 PCR-프라이머를 사용하여 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    g) 엄격한 조건 하에 서열 108, 135 및/또는 143에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는
    h) a) 내지 g) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 a) 및 b)에 따른 폴리펩티드, 또는
    i) 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체로부터 얻을 수 있는, a) 내지 h) 중 적어도 하나에 따른 폴리펩티드
    에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  17. 제1항 내지 제6항, 및 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 효모이고,
    a. 서열 8 및/또는 95에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 8 및/또는 95에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 156에 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 더 바람직하게는 서열 8 및/또는 95에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 8에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
    b. 서열 2, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및/또는 40에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 2, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및/또는 40에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 148, 149 및 150에 적어도 95%, 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 149의 아미노산 위치 18에 티로신을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasA 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
    c. 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 181, 92, 93 및/또는 94에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 181, 92, 93 및/또는 94에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 183에 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 7, 86, 87, 88, 89, 90, 181, 92, 93 및/또는 94에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 10a 내지 10c에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
    d. 서열 4, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 및/또는 63에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 4, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 및/또는 63에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 152에 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 4, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 및/또는 63에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 7a 내지 7b에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasD 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
    e. 서열 3 또는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및/또는 52에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 3 또는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및/또는 52에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 192에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 3 또는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및/또는 52에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 6a 내지 6d에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasC 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
    f. 서열 5, 64, 175, 66, 67, 68, 69, 176, 71, 177, 73 및/또는 178에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 5, 64, 175, 66, 67, 68, 69, 176, 71, 177, 73 및/또는 178에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 191에 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 73% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 5, 64, 175, 66, 67, 68, 69, 176, 71, 177, 73 및/또는 178에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 5a 내지 5e에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasE 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
    g. 서열 6, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 및/또는 85에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 6, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 및/또는 85에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 154에 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 79% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 6, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 및/또는 85에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 4a 내지 4c에 제시된 정렬에 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EasF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트,
    h. 서열 1, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및/또는 28에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열 1, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및/또는 28에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 서열 190에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열 1, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및/또는 28에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고 도 3a 내지 3d에 제시된 정렬에서 100% 보존된 모든 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, DmaW 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트
    를 포함하는 재조합 미생물.
  18. 제5항, 제6항, 및 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, ERG9 활성이 서열 9에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체.
  19. 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, ERG20 활성이 서열 10에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  20. 제5항, 제6항, 및 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, HMG-CoA 리덕타제 활성이 서열 11에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체.
  21. 제20항에 있어서, ERG9, ERG20 및 HMG-CoA 리덕타제 활성 중 적어도 2개가 서열 9, 10 또는 11에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체.
  22. 제21항에 있어서, ERG9, ERG20 및 HMG-CoA 리덕타제 활성이 서열 9, 10 및 11에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의한 것인 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체.
  23. a. 시클로클라빈,
    b. 페스투클라빈,
    c. 아그로클라빈
    d. 카노클라빈 알데히드, 및
    e. 카노클라빈 I
    로 이루어지는 화합물의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하고, 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 아닌 재조합 미생물.
  24. 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I의 군으로부터 선택되는 화합물 중 적어도 하나를 동일한 조건 하에 성장할 때 비-재조합 야생형 유기체에 비해 보다 많은 양으로 포함하고/하거나 생산하는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체.
  25. 제1항 내지 제6항, 및 제8항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 시클로클라빈,
    b. 페스투클라빈,
    c. 아그로클라빈,
    d. 카노클라빈 알데히드, 및
    e. 카노클라빈 I
    로 이루어지는 화합물의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체.
  26. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에서 설명된 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 벡터.
  27. a) 제1항 내지 제6항, 및 제8항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에서 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산을 허용하는 조건 하에 상기 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 배양하는 단계; 및
    b) 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 및/또는 배양 배지로부터 상기 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I을 얻는 단계
    를 포함하는, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산 방법.
  28. a) 제1항 내지 제6항, 및 제8항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에서 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산을 허용하는 조건 하에 상기 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체를 배양하는 단계;
    b) 상기 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체에게 IPP, 트립토판, DMAPP, DMAT, Me-DMAT 또는 카노클라빈 I의 군으로부터 선택되는 화합물 중 적어도 하나를 배양 배지를 통해 제공하는 단계; 및
    c) 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체 및/또는 배양 배지로부터 상기 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및/또는 카노클라빈 I을 얻는 단계
    를 포함하는, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 시클로클라빈이 생산되고 얻어지는 것인 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 카노클라빈 알데히드가 배지에 공급되고, 시클로클라빈이 생산되고 얻어지는 것인 방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 카노클라빈 I이 배지에 공급되고, 시클로클라빈이 생산되고 얻어지는 것인 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, Me-DMAT가 배지에 공급되고, 시클로클라빈이 생산되고 얻어지는 것인 방법.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, DMAT가 배지에 공급되고, 시클로클라빈이 생산되고 얻어지는 것인 방법.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 10℃ 내지 40℃의 온도에서 배양되는 것인 방법.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 10℃ 내지 32℃의 온도에서 배양되는 것인 방법.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 먼저 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 25℃ 내지 35℃의 온도에서, 이어서 10℃ 내지 25℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃의 온도에서 배양되거나, 또는 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체가 먼저 10℃ 내지 25℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃의 온도에서, 이어서 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 25℃ 내지 35℃의 온도에서 배양되는 것인 방법.
  37. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 생산된 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나가 추출을 통해 얻어지는 것인 방법.
  38. 제27항, 제28항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나가, 에틸 아세테이트 (EA), tert-부틸 메틸에테르 (TBME), 클로로포름 (CHCl3) 및 디클로로메탄 (DCM)의 군으로부터 선택된 화합물을 사용한 추출을 포함하는 추출 방법을 통해 얻어지는 것인 방법.
  39. 제27항, 제28항, 제37항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나가 pH=10에서 에틸 아세테이트를 사용한 액체/액체 추출, 바람직하게는 pH가 NaOH로 조정되는, pH=10에서 에틸 아세테이트를 사용한 액체/액체 추출을 포함하는 추출 방법을 통해 얻어지는 것인 방법.
  40. 제27항, 제28항, 및 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나가 바람직하게는 pH=3의 HLB 수지, pH=3의 디아이온(Diaion) 수지, pH=3의 앰벌라이트(Amberlite) 1180 수지, pH=10의 앰벌라이트 1180 수지, pH=3의 앰벌라이트 16N 수지 또는 pH=10의 앰벌라이트 16N 수지의 군으로부터 선택되는 실리카계 수지 물질을 사용하는 고상 추출을 이용한 추출을 포함하는 추출 방법을 통해 얻어지는 것인 방법.
  41. 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산을 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항, 또는 제8항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 또는 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드, 또는 제26항에 따른 벡터의 용도.
  42. 제27항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항, 또는 제8항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물 또는 재조합 천연 맥각 알칼로이드 생산자 유기체, 또는 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드, 또는 제26항에 따른 벡터의 용도.
  43. 제27항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I.
  44. 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나를 포함하지만, 다른 맥각 알칼로이드는 존재하지 않거나 낮은 함량으로 존재하는, 제27항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 생산된 배양 배지.
  45. 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나를 포함하지만, 다른 맥각 알칼로이드는 존재하지 않거나 낮은 함량으로 존재하는 배양 배지.
  46. a) 서열 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 또는 136에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 서열;
    b) 서열 20, 31, 41, 53, 64, 75, 86, 95 또는 180에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
    c) 서열 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 또는 136에 제시된 핵산 서열에 적어도 70% 동일하고 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
    d) DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖고 서열 20, 31, 41, 53, 64, 75, 86 또는 180에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열; 및
    e) 엄격한 조건 하에 a) 내지 d) 중 임의의 하나에 혼성화할 수 있고 DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  47. a) 서열 175, 176, 177 또는 178에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
    b) EasE 활성을 갖고 서열 175, 176, 177 또는 178에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
    c) 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및
    d) DmaW 활성을 갖고 서열 181에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열
    로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 규정된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  49. 제46항 또는 제47항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 또는 제48항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 벡터 또는 발현 카세트.
  50. 제49항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
  51. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제49항 또는 제50항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  52. 제51항에 있어서, 박테리아 세포, 진균 세포, 또는 효모 세포인 숙주 세포.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 박테리아 세포, 진균 세포, 또는 효모 세포, 바람직하게는 아스페르길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 클라비셉스 푸르푸레아(Claviceps purpurea), 클라비셉스 파스팔리(Claviceps paspali), 클라비셉스 아프리카누스(Claviceps africanus) 또는 효모 세포인 숙주 세포.
  54. DmaW, EasF, EasE, EasC, EasD, EasH, EasA 리덕타제, EasA 이소머라제 또는 EasG 활성을 갖고 서열 20, 31, 41, 53, 64, 75, 86, 또는 180에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 과다발현하고/하거나
    EasE 활성을 갖고 서열 175, 176, 177 또는 178에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및/또는 DmaW 활성을 갖고 서열 181에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 과다발현하는 파에실로미세스 디바리카투스(Paecilomyces divaricatus).
  55. a) 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 또는 파에실로미세스 디바리카투스 세포를 제46항 또는 제47항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 생산을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
    b) 단계 a)의 숙주 세포 또는 파에실로미세스 디바리카투스로부터 폴리펩티드를 얻는 단계
    를 포함하는, 제46항 또는 제47항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 적어도 하나의 폴리펩티드의 제조 방법.
  56. 제46항 또는 제47항의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되거나 또는 제55항의 방법에 의해 얻을 수 있는 폴리펩티드.
  57. 제56항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
  58. a) 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 또는 파에실로미세스 디바리카투스 또는 제54항에 따른 파에실로미세스 디바리카투스를, 상기 숙주 세포에서 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나의 생산을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
    b) 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I 중 적어도 하나를 상기 숙주 세포 또는 파에실로미세스 디바리카투스 세포 또는 배양 배지로부터 얻는 딘계
    를 포함하는, 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 또는 카노클라빈 I, 또는 이들의 조합물의 제조 방법.
  59. 시클로클라빈, 페스투클라빈, 아그로클라빈, 카노클라빈 알데히드 및 카노클라빈 I의 군으로부터 선택되는 화합물 중 적어도 하나의 제조를 위한, 제46항 또는 제47항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제49항 또는 제50항에 따른 벡터 또는 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 또는 파에실로미세스 디바리카투스의 용도.
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