CN104736696B - 用于产生棒麦角素型生物碱的基因和方法 - Google Patents

用于产生棒麦角素型生物碱的基因和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于重组生产棒麦角素型生物碱如环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱和裸麦角碱醛的微生物和方法、以及可以在生产棒麦角素型生物碱的方法中使用的多肽、多核苷酸和包含该多核苷酸的载体。

Description

用于产生棒麦角素型生物碱的基因和方法
本申请要求US 61/691848、EP 12181388.5、US 61/786841、EP13159444.2和EP13178008.2号申请的优先权，所述文献均通过引用的方式完整并入。
技术领域
本发明原则上涉及重组产生棒麦角素型生物碱(clavine-type alkaloids)如环棒麦角素(cycloclavine)、狐茅麦角碱(festuclavine)、田麦角碱(agroclavine)、裸麦角碱(chanoclavine)和裸麦角碱醛(chanoclavine aldehyde)的领域。本发明提供用于产生棒麦角素型生物碱的微生物和方法、以及可以在产生棒麦角素型生物碱的方法中使用的多肽、多核苷酸和包含这类多核苷酸的载体。
背景技术
麦角类生物碱(ergot alkaloids)属于具有多样性结构和生物活性的吲哚衍生物复杂家族(Flieger 1997,Folia Microbiol(Praha)42:3–30；Schardl2006,Chem Biol 63:45–86)，由以下科的真菌产生：麦角科(Clavicipitaceae)(例如麦角菌属(Claviceps)和Neotyphodium或香柱菌属(Epichloee))和发菌科(Trichocomaceae)(包括曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium))。重要的天然生产者是麦角菌属、青霉属和曲霉属真菌(Flieger 1997，见上述引文；Schradl，见上述引文)，但是它们还存在于蜜孢霉属(Sphacelia)、瘤座菌属(Balansia)或Periglandula中(outová,S.等人,2008,FungalDiversity,31:95-110和Steiner,U.2011,Mycologia,103(5):1133-1145)。天然麦角类生物碱及其半合成性衍生物广泛应用于现代医学中并且显示出广谱药理学活性，包括子宫收缩活性、调节血压、控制垂体激素分泌、预防偏头痛和多巴胺能活性及神经安定活性(deGroot1998,Drugs 56:523–535；Haarmann 2009,Mol Plant Pathol 10:563–577；Schardl2006，见上述引文)。麦角类生物碱可以根据它们的结构特征分成两类，即，D-麦角酸的酰胺衍生物和棒麦角素型生物碱(Flieger 1997，见上述引文；1998,Alkaloids Chem Biol 50:171–218)。第一组的成员通常由麦角酸和肽结构部分组成。它们又称作麦角肽碱(ergopeptine)。麦角肽碱的重要成员例如是麦角胺(ergotamine)和麦角缬碱(ergovaline)。棒麦角素型生物碱，如环棒麦角素、田麦角碱、烟曲麦角碱(fumigaclavine)和相似物质如野麦角碱(elymoclavine)、焦棒麦角碱(pyroclavine)、肋麦角碱(costaclavine)或epcostaclavine以及其前体裸麦角碱-I和裸麦角碱醛，仅由相同或相似的三环系统或四环系统组成，类似麦角肽碱，但是缺少肽结构部分。但是，棒麦角素型生物碱也可以包含额外的取代基并因此不限于上文提到的棒麦角素型生物碱。这类衍生物的例子是烟曲麦角碱类，如烟曲麦角碱A、B或C、异烟曲麦角碱A或B、或者9-脱乙酰烟曲麦角碱C(Wallwey,C.和Li,S.M.2011,Nat.Prod.Rep.,28:496-510))，其与狐茅麦角碱共有基本结构，但是包含额外的取代基。烟曲麦角碱类例如可以由青霉和曲霉例如烟曲霉产生(A.fumigatus)(Flieger 1997，见上述引文)。而麦角科真菌例如麦角菌(C.purpurea)(Flieger 1997，见上述引文)具有产生麦角肽碱的能力，所述麦角肽碱可以被认为是麦角酸的衍生物，所述衍生物的前体之一是棒麦角素型生物碱田麦角碱。比较ergopeptidens和棒麦角素型生物碱的前体，表明它们的生物合成途径早期阶段非常相似并且可能例如是烟曲霉和麦角菌共有的，而该途径中稍后步骤在这两个真菌物种中不同(Li 2006,Chembiochem 7:158–164；Panaccione 2005,FEMS Microbiol Lett 251:9–17；Schardl2006，见上述引文)。
发酵生产棒麦角素型生物碱和甚至麦角类生物碱通常必须解决麦角类生物碱天然产生者倾向于难以大规模培养的问题。这个问题的一个原因是以深层培养法发酵丝状真菌的技术问题。一些天然麦角类生物碱生产者甚至是植物属如番薯属(Ipomoea)，里韦亚属(Turbina)、银背藤属(Argyreia)和腺叶藤属(Strictocardia)(例如Periglandula物种)的内寄生菌或某些草本植物物种如黑麦草属(Lolium)、高粱属(Sorghum)或羊茅属(Festuca)的内寄生菌(例如Neotyphodium和香柱菌属(Epichloe)物种)。另外，许多天然麦角类生物碱生产者仅在特定条件或在某些发育阶段期间产生这些生物碱，并且甚至那时它们也通常以低生产率生产。许多天然麦角类生物碱生产者产生一组不同的麦角类生物碱，这造成以成本有效方式分离给定生物碱的问题并且甚至进一步降低特定目的生物碱的产量。
全化学合成麦角类生物碱或甚至复杂度较低的棒麦角素型生物碱迄今仍然代表一项巨大挑战：并且通常导致外消旋混合物的合成。
为了克服这些问题，本发明提供重组微生物和重组天然麦角类生物碱生产生物、以及多核苷酸、多肽、载体、和使用这些重组微生物和重组天然麦角类生物碱生产生物、多核苷酸、多肽和载体用于生产棒麦角素型生物碱的方法。
发明概述
本发明提供重组微生物，所述重组微生物包含：
a)至少一种EasH活性，或
b)至少一种EasH和EasD活性，或
c)至少一种EasH和EasA还原酶活性，或
d)至少一种EasH、EasD和EasA活性，或
e)至少一种EasH和EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
f)至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性，或
g)至少一种EasD、EasA和EasG活性，或
h)至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
i)至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA异构酶和EasG活性，或
j)至少一种DmaW、EasF、EasE和EasC活性，
k)a)至j)中至少两者的组合，
其中所述重组微生物不是天然麦角类生物碱生产生物。
本发明还提供重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物具有至少一种上调的选自以下的活性：DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性，其中EasA活性是EasA还原酶、EasA异构酶、或EasA还原酶和EasA异构酶活性。
重组天然麦角类生物碱生产生物包含至少一种上调的活性，所述上调的活性为选自以下的一个或多个组的活性：
a)至少一种EasH活性，或
b)至少一种EasH和EasD，或
c)至少一种EasH和EasA还原酶活性，或
d)至少一种EasH、EasD和EasA活性，或
e)至少一种EasH和EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
f)至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性，或
g)至少一种EasD、EasA和EasG活性，或
h)至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
i)至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA异构酶和EasG活性，或
j)至少一种DmaW、EasF、EasE和EasC活性。
本发明还提供如上所述的重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物具有至少一种下调的选自EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性的活性。本发明的另一个实施方案是如本文中所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物包含增大的DMAPP供应量和/或增大的Me-DMAT供应量，优选地包含至少一种下调的ERG9或ERG20活性，或至少一种上调的HMG-CoA还原酶活性，或包含至少一种下调的ERG9或ERG20活性和至少一种上调的HMG-CoA还原酶活性。
其他本发明的实施方案包含如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物包含至少一个重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码：
a)至少一种EasH活性，或
b)至少一种EasH和EasD活性，或
c)至少一种EasA还原酶或至少一种EasA异构酶活性，或
d)至少一种EasD、EasA异构酶和EasG活性，或
e)至少一种EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
f)至少一种EasH、EasD、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性，或
g)至少一种EasH、EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
h)至少一种EasH、EasD、EasA异构酶和EasG活性，或
i)至少一种DmaW、EasF、EasE和EasC活性，
j)a)至i)中至少两者的组合。
本发明也提供重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码：
a)至少一种EasH活性，或
b)至少一种EasH和EasD活性，或
c)至少一种EasA还原酶或至少一种EasA异构酶活性，或
d)至少一种EasD、EasA异构酶和EasG活性，或
e)至少一种EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
f)至少一种EasH、EasD、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性，或
g)至少一种EasH、EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
h)至少一种EasH、EasD、EasA异构酶和EasG活性，或
i)至少一种DmaW、EasF、EasE和EasC活性，
j)a)至i)中至少两者的组合。
本发明还提供如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物、或如所述的重组多核苷酸，其中DmaW活性归因于
a)包含与SEQ ID NO:145和146具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
b)包含与SEQ ID NO:147或190具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
c)包含与SEQ ID NO:1、19、20、179或180具有至少40％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
d)包含与SEQ ID NO:1、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
e)由与SEQ ID NO:102、122或123具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
f)由与SEQ ID NO:129或137具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
g)可以通过使用两种PCR引物获得的多核苷酸编码的多肽，每种引物各包含选自SEQ ID NO:102、122或123所述序列的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，或
h)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:102、122或123杂交，或
i)根据a)至h)中至少两者、优选地根据至少b)和c)的多肽，或
根据a)至i)中至少之一的多肽，所述多肽可以从天然麦角类生物碱生产生物获得。
其他实施方案包含如本文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物、或如上文所述的重组多核苷酸，其中EasF活性归因于
a)包含与SEQ ID NO:154具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
b)包含与SEQ ID NO:6、75或76具有至少40％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
c)包含与SEQ ID NO:6、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
d)由与SEQ ID NO:107或120具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
e)由与SEQ ID NO:134或142具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
f)由用两种PCR引物可获得的多核苷酸编码的多肽，每种引物各包含下述多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，所述多核苷酸序列选自SEQ ID NO:107或120描述的序列，或
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:107或120杂交，或
h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，或
i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
本发明的其他部分包括如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物、或如上文所述的重组多核苷酸，其中EasE活性归因于
a)包含与SEQ ID NO:153、185或191具有至少90％序列同一性、优选地与SEQ IDNO:191具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
b)包含与SEQ ID NO:5或64具有至少40％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
c)包含与SEQ ID NO:5、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74具有至少90％序列同一性或与SEQ ID NO:5、64、175、66、67、68、69、176、71、177、73或178具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
d)由与SEQ ID NO:106具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
e)由与SEQ ID NO:133或141具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
f)由用两种PCR引物可获得的多核苷酸编码的多肽，每种引物包含下述多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，所述多核苷酸序列选自SEQ ID NO:106、133或141描述的序列，
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:106、133或141杂交，或
h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，或
i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
本发明其他部分包括如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物、或如上文所述的重组多核苷酸，其中EasC活性归因于
a)包含与SEQ ID NO:151或192具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
b)包含与SEQ ID NO:3或41具有至少40％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
c)包含与SEQ ID NO:3、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
d)由与SEQ ID NO:104具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
e)由与SEQ ID NO:131或139具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
f)由用两种PCR引物可获得的多核苷酸编码的多肽，每种引物包含下述多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，所述多核苷酸序列选自SEQ ID NO:104、131或139描述的序列，或
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:104、131或139杂交，或
h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，或
根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
本发明还包括如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物、或如上文所述的重组多核苷酸，其中EasD活性归因于
a)包含与SEQ ID NO:152具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
b)包含与SEQ ID NO:4或53具有至少40％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
c)包含与SEQ ID NO:4、53、54、55、56、57、58、59、60、62或63具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
d)由与SEQ ID NO:105具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
e)由与SEQ ID NO:132或140具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
f)由用两种PCR引物可获得的多核苷酸编码的多肽，每种引物包含下述多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，所述多核苷酸序列选自SEQ ID NO:105、132或140描述的序列，或
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:105、132或140杂交，或
h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，或
根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
本发明的其他部分包括如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物、或如上文所述的重组多核苷酸，其中EasH活性归因于
a)包含与SEQ ID NO:156具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8和/或95具有至少60％序列同一性并且与SEQ ID NO:156具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
c)包含与SEQ ID NO:8和/或95具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
d)由与SEQ ID NO:109,和/或157具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
e)由与SEQ ID NO:109、136、144和/或157具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
f)由用两种PCR引物可获得的多核苷酸编码的多肽，每种引物包含下述多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，所述多核苷酸序列选自通过SEQ ID NO:109、136、144和/或157描述的序列，或
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:109、136、144和/或157杂交，或
h)根据a)至g)中至少两者的多肽，或
i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
其他实施方案包括如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物、或如上文所述的重组多核苷酸，其中EasA还原酶活性归因于
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:148、149和150具有至少90％序列同一性并且在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有酪氨酸，或
b)包含与SEQ ID NO:2或31具有至少40％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
c)包含与SEQ ID NO:2、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
d)由与SEQ ID NO:103具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
e)由与SEQ ID NO:130或138具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
f)由用两种PCR引物可获得的多核苷酸编码的多肽，每种引物包含下述多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，所述多核苷酸序列选自通过SEQ ID NO:103描述的序列，或
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:103杂交，或
h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，或
i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
备选实施方案包括如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物、或如上文所述的重组多核苷酸，其中EasA异构酶活性归因于
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:148、149和150具有至少90％序列同一性并且在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有苯丙氨酸，或
b)包含与SEQ ID NO:2或31具有至少40％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
c)包含与SEQ ID NO:2、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
d)由与SEQ ID NO:103具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
e)由与SEQ ID NO:130或138具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
f)由用两种PCR引物可获得的多核苷酸编码的多肽，每种引物包含下述多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，所述多核苷酸序列选自通过SEQ ID NO:103描述的序列，或
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:103杂交，或
h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，或
i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
其他实施方案包括如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物、或如上文所述的重组多核苷酸，其中EasG活性归因于
a)包含与SEQ ID NO:155或183具有至少90％序列同一性、优选地与SEQ ID NO:183具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
b)包含与SEQ ID NO:7或86具有至少39％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
c)包含与SEQ ID NO:7、86、87、88、89、90、91、92、93或94具有至少70％序列同一性或与SEQ ID NO:7、86、87、88、89、90、181、92、93或94具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
d)由与SEQ ID NO:108具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
e)由与SEQ ID NO:135或143具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或
f)由用两种PCR引物可获得的多核苷酸编码的多肽，每种引物包含下述多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，所述多核苷酸序列选自通过SEQ ID NO:108描述的序列，或
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:108杂交，或
h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，或
i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
本发明还提供如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物，其中ERG9活性归因于包含与SEQ ID NO:9具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或其中ERG20活性归因于包含与SEQ ID NO:10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或其中HMG-CoA还原酶活性归因于包含与SEQ ID NO:11具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或其中ERG9、ERG20和HMG-CoA还原酶活性中至少两种活性归因于包含与SEQID NO:9、10或11具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或其中ERG9、ERG20和HMG-CoA还原酶活性归因于包含与SEQ ID NO:9、10和11具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽。其他实施方案包括重组微生物，所述重组微生物包含选自以下化合物群组的至少一种化合物：
a)环棒麦角素，
b)狐茅麦角碱，
c)田麦角碱，
d)裸麦角碱醛，
e)裸麦角碱I，
其中重组微生物不是天然麦角类生物碱生产生物。
本发明还提供重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物与生长在相同条件下的非重组野生型生物相比以更高的量包含和/或产生至少一种选自以下的化合物：环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I。其他实施方案包括如上文所述的本发明任一个部分和实施方案中描述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物包含选自以下化合物群组的至少一种化合物：
a)环棒麦角素，
b)狐茅麦角碱，
c)田麦角碱，
d)裸麦角碱醛，
e)裸麦角碱I。
本发明的其他部分包括用于表达至少一个编码如本发明任一个部分和实施方案中描述的多肽的多核苷酸的重组表达盒，或包含至少一个这类表达盒的多核苷酸。本发明的其他部分是用于产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者的方法，所述方法包括：
a)在允许重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物中产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者的条件下，培养如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物；和
b)从重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物和/或培养基，获得所述环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I。
本发明的其他方法提供环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者的生产，所述方法包括：
a)在允许重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物中产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛、裸麦角碱I中至少一者的条件下，培养如上所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物；
b)通过培养基向所述重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物提供选自IPP、色氨酸、DMAP、DMAT、Me-DMAT或裸麦角碱I的至少一种化合物，和
c)从重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物和/或培养基，获得所述环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I。
上文所述方法的变体方案包括其中产生并获得环棒麦角素、或其中产生并且获得狐茅麦角碱、或其中产生并且获得田麦角碱、或其中将裸麦角碱I提供给培养基并且产生并获得环棒麦角素、或其中产生并且获得裸麦角碱I、或其中产生并且获得裸麦角碱醛的方法。如上文所述的方法可以利用不同的培养温度。因此，本发明的其他部分包括方法，其中将重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物培养在10℃至40℃之间、优选地在15℃至35℃之间、更优选地在18℃至32℃之间、甚至更优选地在20℃至30℃之间的温度。所述方法可以利用在10℃和32℃之间、在13℃和32℃之间、在15℃和32℃之间、在16℃和32℃之间、在17℃和32℃之间、在18℃和32℃之间、在19℃和32℃之间、在20℃和32℃之间、在15℃和31℃之间、在15℃和30℃之间、在15℃和29℃之间、在15℃和28℃之间、在15℃和27℃之间、在15℃和26℃之间、在15℃和25℃之间温度培养的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物。这些方法的变体方案包括培养温度的改变。因此，本发明提供如上文所述的方法，其中将重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物首先在25℃和40℃之间、优选地25℃和35℃之间的温度培育，随后在10℃和25℃之间、优选地15℃和25℃之间的温度培育，或其中将重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物首先在10℃和25℃之间、优选地15℃和25℃之间的温度培育，随后在25℃和40℃之间、优选地25℃和35℃之间的温度培育。本发明还提供如上文所述的方法，其中通过提取获得产生的环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者。这些方法包括这样的方法，其中通过提取方法获得环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者，所述提取方法包括用选自以下的化合物提取：乙酸乙酯(EA)、叔丁基甲基醚(TBME)、氯仿(CHCl3)和二氯甲烷(DCM)；和这样的方法，其中通过提取方法获得环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者，所述提取方法包括在pH＝10采用乙酸乙酯进行液体/液体提取，优选其中pH用NaOH调节、在pH＝10采用乙酸乙酯进行液体/液体提取。这些方法的其他变体方案包括这样的方法，其中通过提取方法获得环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者，所述提取方法包括用基于二氧化硅的树脂材料采用固相提取法进行提取，所述树脂材料优选选自：在pH＝3的HLB树脂、在pH＝3的Diaion树脂、在pH＝3的Amberlite 1180树脂、在pH＝10的Amberlite 1180树脂、在pH＝3的Amberlite 16N树脂、或在pH＝10的Amberlite 16N树脂。本发明的进一步部分包括如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物的用途或如上文所述的重组多核苷酸的用途，或如上文所述的载体的用途，用于产生选自环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I的至少一种化合物，或用在上文描述的任何方法中。本发明还包括通过上述任一种方法产生的环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I。本发明的其他部分是：在如上文所述的方法中产生的培养基，所述培养基包含环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者，但是不含或以低含量包含其他麦角类生物碱；培养基，其包含环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者，但是不含或以低含量包含其他麦角类生物碱。本发明还提供可以用于上述的本发明任一个部分和实施方案中的多核苷酸。
因此，本发明包括多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的一个或多个核酸序列：
a)核酸序列，其具有如SEQ ID NO:129或130、131、132、133、134、135或136中所显示的核苷酸序列；
b)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有如SEQ ID NO:20、31、41、53、64、75、86或95中所显示的氨基酸序列；
c)与如SEQ ID NO:129或130、131、132、133、134、135或136中所显示的核酸序列至少70％相同的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶或EasG活性的多肽；
d)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶或EasG活性并且具有与如SEQ ID NO:20、31、41、53、64、75、86或95中所显示的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列；和
e)能够在严格条件下与a)至d)的任一个序列杂交的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶或EasG活性的多肽。
本发明的进一步部分包括上文描述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含至少一个核酸序列，所述核酸序列编码如上述的本发明任何部分或实施方案中所述的多肽。本发明的其他实施方案包括包含这些多核苷酸的载体或表达盒、和包含这些表达盒和/或包含本发明中所述任一种多肽的表达盒的载体。本发明还涵盖用于表达本发明任一种多肽的表达载体、和包含这种载体或包含编码至少一种上文所述多肽的多核苷酸的宿主细胞。这些宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、尤其丝状真菌细胞，或酵母细胞。本发明还提供用于产生多肽的方法，所述多肽由如上文所述的多核苷酸编码，所述方法包括
a)在允许产生所述多肽的条件下培养如上文所述的宿主细胞或Paecilomycesdivaricatus细胞；并且
b)从步骤a)的宿主细胞获得多肽。
因此，本发明包括由上述多核苷酸编码的多肽、或可通过用于产生这类多肽的方法获得的多肽。本发明的其他部分包括与上述多肽特异性结合的抗体。本发明的其他实施方案包括用于生产环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I的方法或用于生产其组合的方法，所述方法包括：
a)将如上文所述的宿主细胞或Paecilomyces divaricatus细胞，培养在允许所述宿主细胞中产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者的条件下；并且
b)从所述宿主细胞或Paecilomyces divaricatus细胞或培养基，获得环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者。
本发明还包括如上文所述的多核苷酸，或如上文所述的载体或如上文所述的宿主细胞或Paecilomyces divaricatus细胞的用途，用于产生至少一种选自环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I的化合物。
附图简述
图1为代谢途径的不同步骤的示意图，所述代谢途径导致环棒麦角素，或在该途径的其他分支上导致田麦角碱和/或狐茅麦角碱。该途径的分支点位于裸麦角碱I合成之后，裸麦角碱I随后由EasH、EasD、EasA和EasG活性的组合进一步修饰以产生环棒麦角素，或裸麦角碱I通过EasD活性转化成裸麦角碱醛并且经EasA和EasG活性的组合进一步修饰为田麦角碱和/或狐茅麦角碱——这取决于存在的EasA活性。该EasA活性在田麦角碱的情况下可以是EasA异构酶活性，或在狐茅麦角碱情况下是EasA还原酶活性。
图2为下述代谢途径的不同步骤和参与这些步骤的不同Eas活性的示意图，所述代谢途径通过EasD、EasH、EasA和EasG活性组合从裸麦角碱I产生环棒麦角素；或通过EasD活性从裸麦角碱产生裸麦角碱醛，并且通过“EasA(Tyr176)”介导的EasA还原酶活性和EasG活性的组合从裸麦角碱醛产生狐茅麦角碱，或通过“EasA(Phe176)”介导的EasA异构酶活性和EasG活性的组合从裸麦角碱醛产生田麦角碱。图2还列出了产生棒麦角素型生物碱的一些示例性天然麦角生产生物。这类天然麦角生产生物在环棒麦角素的情况下是日本曲霉(Aspergillus japonicus)(A.japonicus)，在田麦角碱的情况下是麦角菌(C.purpurea)，在狐茅麦角碱的情况下是烟曲霉(A.fumigatus)。
图3a至图3d显示具有DmaW活性的日本曲霉多肽与几种同源多肽的氨基酸序列比对的连续部分。氨基酸根据标准单字母氨基酸代码表述。不同序列的名称包括可以从中获得这些同源物多肽的生物的名称以及这些序列在序列表中的SEQ ID NO。该氨基酸序列比对还描述了这组序列中保守的氨基酸、较不保守的氨基酸和甚至更不保守的氨基酸，其中加黑色阴影的氨基酸位置代表强烈保守，即100％保守，加灰色阴影的氨基酸位置代表较不保守，具有白色背景的氨基酸代表甚至更不保守的氨基酸位置。比对中氨基酸序列内的短划线代表不包含于特定序列中的氨基酸位置。于一组氨基酸位置上方或下方的黑色线描述序列保守性强的区域，代表保守的序列基序。比对还包含这组基因的共有序列(SEQ ID NO:190)，以鉴定在相应氨基酸位置处高度保守的氨基酸。由这个氨基酸序列比对结果给出的关于保守氨基酸和较不保守氨基酸的信息，可以用来确定不包含在该氨基酸序列比对中的氨基酸序列是否将是日本曲霉多肽的真实同源物。潜在同源物的氨基酸序列或天然存在或人工产生的突变体的氨基酸序列将很可能具有DmaW活性，目的氨基酸序列将包含更多的保守氨基酸位置。
图4a至图4c显示具有EasF活性的日本曲霉多肽与几种同源物多肽的氨基酸序列比对的连续部分。序列名称和符号，例如黑色阴影或灰色阴影或共有序列(SEQ ID NO:154)，具有与图3a至图3d中使用的序列名称和符号相同的意思。
图5a至图5e显示具有EasE活性的日本曲霉多肽与几种同源物多肽的氨基酸序列比对的连续部分。序列名称和符号，例如黑色阴影或灰色阴影或包含(SEQ ID NO:191)中所述核心共有序列的共有序列(SEQ ID NO:185)，具有与图3a至图3d中使用的序列名称和符号相同的意思。
图6a至图6d显示具有EasC活性的日本曲霉多肽与几种同源物多肽的氨基酸序列比对的连续部分。序列名称和符号，例如黑色阴影或灰色阴影或共有序列(SEQ ID NO:151)，具有与图3a至图3d中使用的序列名称和符号相同的意思。
图7a至图7b显示具有EasD活性的日本曲霉多肽与几种同源物多肽的氨基酸序列比对的连续部分。序列名称和符号，例如黑色阴影或灰色阴影或共有序列(SEQ ID NO:152)，具有与图3a至图3d中使用的序列名称和符号相同的意思。图7a中的4个黑色箭头和图7b中的2个黑色箭头指向具有EasD活性的蛋白质(Kavanagh 2008,Cell Mol Life Sci 65:3895–3906)的辅因子结合基序TGxxxGxG(SEQ ID NO:188)的保守氨基酸和活性部位基序YxxxK(SEQ ID NO:198)的保守氨基酸。
图8表示具有EasH活性的日本曲霉多肽与同系物多肽的氨基酸序列比对。序列名称和符号，例如黑色阴影或灰色阴影或共有序列(SEQ ID NO:183)，具有与图3a至图3d中使用的序列名称和符号相同的意思。
图9a至图9d表示具有EasA活性的日本曲霉多肽与几种同源物多肽的氨基酸序列比对的连续部分。序列名称和符号，例如黑色阴影或灰色阴影、黑色线或共有序列(SEQ IDNO:184)，具有与图3a至图3d中使用的序列名称和符号相同的意思。图9b包含额外的黑色箭头，所述箭头指向包含Y(代表氨基酸酪氨酸)或F(代表氨基酸苯丙氨酸)的氨基酸位置。在这个位置具有Y的氨基酸序列代表具有EasA还原酶活性的多肽，而在这个位置具有F的氨基酸序列代表具有EasA异构酶活性的多肽。这些活性有时也描述为EasA(Tyr176)和EasA(Phe176)以分别表示EasA还原酶活性和EasA异构酶活性，其中数字176指分别具有EasA还原酶活性或EasA异构酶活性的烟曲霉多肽中具有Y或F的相应氨基酸位置(Cheng等人；2010,J.AM.CHEM.SOC,132:第12835–12837页)。
图10a至图10c表示具有EasG活性的日本曲霉多肽与几种同源物多肽的氨基酸序列比对的连续部分。序列名称和符号，例如黑色阴影或灰色阴影或共有序列(SEQ ID NO:183)，具有与图3a至图3d中使用的序列名称和符号相同的意思。
图11从顶部至底部显示酵母株上清液的色谱图：EYS1849总离子色谱图；EYS1849m/z＝239.1543+/-0.01Da的提取离子色谱图；EYS1849m/z＝241.1699+/-0.01Da的提取离子色谱图；EYS1851总离子色谱图；EYS1851m/z＝239.1543+/-0.01Da的提取离子色谱图；EYS1851m/z＝241.1699+/-0.01Da的提取离子色谱图。
图12显示LC-MS分析菌株CEY2871和CEY3631的上清液的分析结果。从TIC(总离子色谱图)提取裸麦角碱I的质量(m/z＝257.164+/-0.01Da)，显示在CEY3631中保留时间为2.0分钟+/-0.1分钟的峰，所述峰在CEY2871中不存在。将该峰纯化并通过NMR分析。
图13显示LC-MS分析菌株CEY3631和CEY3645的上清液的分析结果。从TIC(总离子色谱图)提取裸麦角碱I的质量(m/z＝257.164+/-0.01Da)，显示在CEY3631和CEY3645中保留时间为2.0+/-0.1分钟的峰。将峰下面积积分(插图)，揭示与EY3631相比CEY3645中裸麦角碱I增加。
图14通过LC-MS分析菌株CEY2557和CEY2625。在两个菌株中均见到保留时间为7.8分钟+/-0.2分钟的一个峰，所述峰具有Me-DMAT的预测质量(m/z＝287.175+/-0.01Da)。通过NMR证实身份。将峰下面积积分，揭示与CEY2557相比CEY2625中Me-DMAT增加两倍。
图15：通过LC-MS分析菌株CEY2557和CEY2625。(参见图6)。将峰下面积积分，揭示与CEY2557相比CEY2625中Me-DMAT增加两倍以上。还显示DMAT的面积。
图16通过LC-MS分析菌株CEY2557、CEY2563和CEY2575。在全部菌株中，均见到保留时间为7.8分钟+/-0.2分钟的峰，所述峰具有Me-DMAT的预测质量(m/z＝287.175+/-0.01Da)。将峰下面积积分，显示全部三个菌株中化合物的水平相似(插图)。通过NMR证实化合物的身份。
图17为显示用于整合至ERG20基因中的PCR产物和酵母基因组中该靶区域的略图。HR1和HR2与该基因组序列同源，允许通过同源重组整合NatR-ScKex2启动子构建体并由此破坏天然ERG20启动子。
图18通过LC-MS分析菌株EYS1538和EYS1926。将峰下面积积分，揭示与EYS1538相比EYS1926中Me-DMAT的两倍以上增加。
图19来自EYS2098和EYS2099的培养上清液的分析结果，显示这些菌株产生的裸麦角碱I和环棒麦角素的相对量(曲线下面积)。
图20a和图20b显示EYS2055和EYS2056中DMAT和Me-DMAT的产量。二个菌株均表达达成Me-DMAT的两步骤异源途径。此外，EYS2056含有一个额外的组成型表达的Scldi1拷贝。
图21分析EYS1934(对照)和EYS2206(EasC)中环棒麦角素(CCL)和狐茅麦角碱(MW241)的产量，并且显示因基因AjEasC的额外拷贝的表达而导致的EYS2206中产量的增加。
图22：来自EYS2124(来自日本曲霉的EasE)和EYS2125(来自N.lolii的EasE)的培养上清液的分析结果，显示这些菌株产生的环棒麦角素和狐茅麦角碱(MW241)的相对量(曲线下面积)。
图23显示来自具有全长环棒麦角素途径的酵母株的培养上清液的分析结果，每种酵母株各具有DNA密码子使用不同的EasE基因，但是均编码来自日本曲霉的相应酶。不同的密码子使用导致这些菌株产生不同量(如曲线下面积所示)的环棒麦角素和狐茅麦角碱(MW241)。
图24：EYS2006分别在无甘油(对照)或存在2.5％、5％和10％甘油时生长。环棒麦角素和狐茅麦角碱(MW241)的产量随甘油浓度增加而增加。
图25：与EYS2209(左侧)相比EYS1934中以及与EYS2297相比EYS2209中环棒麦角素的产量。
图26：补料分批发酵中CCL和FCL的产量。相对于发酵持续时间，显示化合物的浓度(mg/L)和实测OD600。
图27：遗传背景不同的7个酵母株(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中CCL和FCL的产量(参见表58)。
一般定义
术语“环棒麦角素”意指式(I)化合物。
术语“狐茅麦角碱”意指式(II)化合物
术语“田麦角碱”意指式(III)化合物
术语“裸麦角碱醛”意指(IV)化合物
术语“裸麦角碱I”意指(V)化合物
术语“ME-DMAT”意指式(VI)化合物：
术语“DMAT”意指式(VII)化合物
术语“DMAP”意指式(VIII)化合物
术语“色氨酸”意指氨基酸色氨酸，优选地是L-色氨酸，或其盐之一。
术语“IPP”意指异戊烯焦磷酸，式(IX)化合物或其盐之一。
术语“DmaW活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物能够执行与SEQ ID NO:1的多肽相同或相似的功能，即具有二甲基烯丙基色氨酸合酶活性，催化L-色氨酸在C4位置处异戊烯化，导致形成4-二甲基烯丙基色氨酸((S)-4-(3-甲基-2-丁烯基)-色氨酸或DMAT)。
术语“EasF活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物能够实现与SEQ ID NO:6的多肽相同或相似的功能，即具有N-甲基转移酶活性，催化DMAT甲基化成为Me-DMAT。
术语“EasE活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物能够实现与SEQ ID NO:5的多肽相同或相似的功能，即在EasC活性也存在的情况下催化Me-DMAT转化成裸麦角碱I。
术语“EasC活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物能够实现与SEQ ID NO:3的多肽相同或相似的功能，即在EasE活性也存在的情况下催化Me-DMAT转化成裸麦角碱I。
术语“EasD活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物能够实现与SEQ ID NO:4的多肽相同或相似的功能，即具有氧化还原酶活性，催化裸麦角碱I转化成裸麦角碱醛。
术语“EasE活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物能够实现与SEQ ID NO:8的多肽相同或相似的功能，即在EasD、EasA和EasG活性也存在的情况下，催化裸麦角碱I转化成环棒麦角素。
术语“EasA还原酶活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物能够实现与SEQ IDNO:2的多肽相同或相似的功能，即具有还原酶活性，并且如果EasG活性存在，则催化裸麦角碱醛转化成狐茅麦角碱。
术语“EasA异构酶活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物能够实现与SEQ IDNO:37的多肽(麦角菌EasA)相同或相似的功能，即具有异构酶活性，并且如果EasG活性存在，则催化裸麦角碱醛转化成田麦角碱。
术语“EasA活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物能够实现与SEQ ID NO:2或37的多肽相同或相似的功能，即具有EasA还原酶或EasA异构酶活性或者具有两种活性，正如例如SEQ ID NO:33的Neotyphodium lolii多肽，其在SEQ ID NO:149的第18位置处包含Y至F突变。
术语“EasG活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物能够实现与SEQ ID NO:7的多肽相同或相似的功能，即具有氧化还原酶活性，并且取决于存在的EasA活性，催化裸麦角碱醛转化成田麦角碱和/或狐茅麦角碱，和/或如果EasA、EasD和EasH活性也存在，催化裸麦角碱I转化成环棒麦角素。
术语“ERG9活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物能够在固醇生物合成途径中连接两个法呢基焦磷酸(FPP)部分以形成鲨烯的能力。ERG9活性通常由鲨烯合酶提供。
术语“ERG20活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物催化C15法呢基焦磷酸单位形成用于合成类异戊二烯和固醇生物合成的能力。
术语“HMG-CoA还原酶活性”意指多肽或包含这种多肽的微生物催化HMG-CoA转化成甲羟戊酸的能力。
术语“约”在本文中用来指大约、大致、左右或在……范围内。当术语“约”与一个数字范围联合使用时，它通过将扩展界限值高于和低于所述数值而修饰该范围。通常，术语“约”在本文中用来修饰所述值上下的数值，与所述值相比向上或向下(高于或低于)相差20％、优选15％、更优选10％并且最优选5％。
术语“基因组”或“基因组DNA”指宿主生物的可遗传的遗传信息。所述基因组DNA包括细胞或生物的全部遗传物质，包括细胞核DNA(染色体DNA)、染色体外DNA和细胞器(例如线粒体)DNA。优选地，术语“基因组”或基因组“DNA”指细胞核的染色体DNA。
术语“染色体DNA”或“染色体DNA序列”将理解为独立于细胞周期状态的细胞核基因组DNA。染色体DNA因而可组织为染色体或染色质，它们可以是浓缩的或展开的。可以通过本领域已知的多种方法，如聚合酶链反应(PCR)分析、DNA印迹分析、荧光原位杂交(FISH)、原位PCR和下一代测序法(NGS)，展示并分析向染色体DNA中的插入。
术语“启动子”指指导结构基因转录以产生mRNA的多核苷酸。一般，启动子位于基因的5'区域，临近结构基因的起始密码子。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应于诱导剂而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调节。
术语“增强子”指一种多核苷酸。增强子可以增加特定基因转录成mRNA的效率，其中不受增强子相对于转录起始位点的距离或方向的影响。通常，增强子靠近启动子、5'非翻译序列、或在内含子中。
如果一个多核苷酸序列，相对于一个生物或第二多核苷酸序列而言，源自外来物种，或如果来自相同物种，但相对于其原有形式已经被修饰，则它相对于生物或第二多核苷酸序列为“异源的”。例如，与异源编码序列有效连接的启动子指，编码序列与该启动子来自不同的物种，或，如果来自相同物种，该编码序列与该启动子不天然连接(例如，基因修饰的编码序列或来自不同生态型或品种的等位基因)。
“转基因”、“转基因的”或“重组”指，多核苷酸经人为操作、或多核苷酸的拷贝或互补物经人为操作。例如，包含与第二多核苷酸有效连接的启动子的转基因表达盒可以包含这样的启动子，其中由于对包含该表达盒的分离核酸的人为操作(例如通过Sambrook等,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,New York,(1989)或Current Protocols in Molecular Biology第1-3卷，John Wiley & Sons,Inc.(1994-1998)中描述的方法)，所述启动子相对于所述第二多核苷酸为异源的。在另一个实例中，重组表达盒可以包含以这样方式组合的多核苷酸，所述方式导致所述多核苷酸极不可能在自然界中被找到。例如，经人为操作，限制性位点或质粒载体序列可以分布于启动子侧翼或把启动子与第二多核苷酸隔开。技术人员将认识到可以用多种方式操作多核苷酸，并且不限于上文的例子。
在术语“重组”用来描述生物或细胞(例如微生物)的情况下，它用来表述该生物或细胞包含至少一个“转基因”、“转基因的”或“重组”多核苷酸(稍后描述)。
相对于生物个体为“外源”的多核苷酸是通过有性杂交之外的任何手段引入该生物中的多核苷酸。
术语“有效连接”或“有效连接的”通常理解为指一种排列，其中遗传控制序列例如启动子、增强子或终止子相对于与之有效连接的多核苷酸(例如编码多肽的多核苷酸)能够发挥其功能。在此情形中，功能可以指例如控制核酸序列的表达，例如转录和/或翻译。在此情形下，控制包括例如起始、提高、掌控或抑制表达，即，转录和(根据需要)翻译。控制可以转而例如是组织和/或时间特异的。它也可以是诱导型的，例如由某些化学品、胁迫、病原体等诱导。优选地，有效连接理解为意指例如启动子、待表达的核酸序列和酌情地其它调节元件例如终止子以如下方式依次排列，所述方式导致当核酸序列表达时所述每一种调节元件均可以实现其功能。有效连接不必要求化学意义上的直接连接。遗传控制序列，例如增强子序列，也能够从距离其有效连接的多核苷酸远距离的位置对靶序列发挥其功能。优选的排列是这样的排列，其中待表达的核酸序列被置于充当启动子的序列之后，从而这两个序列彼此共价连接。表达盒中启动子序列与核酸序列之间的距离优选地小于200碱基对、特别地优选小于100碱基对、非常特别优选地小于50碱基对。技术人员熟悉多种方式可以获得这种表达盒。然而，也可以构建表达盒，以便例如通过同源重组或通过随机插入，使待表达的核酸序列处于内源遗传控制元件(例如内源启动子)的控制下。该构建体同样理解为是本发明目的的表达盒。
术语“表达盒”意指这样的构建体，其中待表达的多核苷酸序列与能够使其表达或调节其表达(即转录和/或翻译)的至少一个遗传控制元件有效连接。表达可以例如是稳定的或瞬时的、组成型或诱导型的。
术语“表达”和“表达的”指基因产物(例如，本申请中定义并且描述的途径或反应的基因的生物合成酶)以这样的水平表达，从而编码的该蛋白质的所得酶活性或其所涉及的途径或反应允许在表达该基因/途径的生物中引起通过该途径或反应的代谢通量。可以通过遗传改变用作起始生物的微生物，实现表达。在一些实施方案中，微生物可以被遗传改变(例如，遗传工程化)，从而相对于起始微生物或未经改变的可比较微生物，以增加的水平表达基因产物。遗传改变包括，但是不限于，改变或修饰与特定基因表达相关的调节序列或位点(例如通过添加强启动子、诱导型启动子或多个启动子，或通过移除调节序列使表达成为组成型的)、修饰特定基因的染色体位置、改变与特定基因毗邻的核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子、增加特定基因的拷贝数、修饰参与特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如，调节蛋白、阻抑蛋白、增强子、转录激活物等)，或使用本领域常规方法(包括但不限于使用反义核酸分子，例如，以阻断阻遏蛋白表达)造成特定基因的表达去调节的任何其他常规手段。
在一些实施方案中，可以将微生物在物理或环境上进行改变，以相对于未改变的微生物的基因产物表达水平，表达升高或较低水平的基因产物。例如，可以用已知或疑似可以增加特定基因转录和/或特定基因产物翻译的试剂处理微生物或在该试剂存在下培养微生物，从而增强或增加转录和/或翻译。备选地，可以在经选择可以增加特定基因转录和/或特定基因产物翻译的温度下培养微生物，从而增强或增加转录和/或翻译。
术语“去调节”、“去调节的”和“去调节作用”指，改变或修饰微生物中的至少一个基因，其中相对于不存在该改变或修饰的情况，该改变或修饰导致提高微生物中给定化合物的生产效率。在一些实施方案中，改变或修饰的基因编码生物合成途径中的酶或转运蛋白，从而微生物中该生物合成酶的水平或活性被改变或调整，或该转运的特异性或效率被改变或调整。在一些实施方案中，改变或修饰编码生物合成途径中酶(即在生物合成途径中导致特定活性(例如EasH活性)的多肽)的至少一个基因，从而该酶的水平或活性，相对于未改变的基因或野生型基因存在下的水平，增强或增加。
去调节作用还包括改变一个或多个基因的编码区以产生例如具有反馈抵抗性或具有更高或更低比活性的酶。去调节进一步涵盖编码转录因子(例如，激活物、阻遏蛋白)的基因的遗传变异，所述转录因子调节编码酶或转运蛋白的基因的表达。术语“去调节”、“去调节的”和“去调节作用”可以进一步就存在的去调节作用的类型作出规定。
在特定活性(例如EasH活性)被改变或修饰从而酶水平或活性相对于未改变基因或野生型基因存下的水平增强或增加的情况下，使用术语“上调”。在特定活性(例如ERG9活性)被改变或修饰从而酶水平或活性相对于未改变的基因或野生型基因存下的水平降低或减少的情况下，使用术语“下调”。
术语“过量表达”、“被过量表达”、“过量表达的”和“过量表达”指基因产物的表达，尤其指与起始微生物的遗传变异之前存在的水平相比，以更大的水平增强基因产物的表达。在一些实施方案中，微生物可以通过遗传方式改变(例如，遗传工程化)，从而以比起始微生物产生的水平增加的水平表达基因产物。遗传改变包括，但是不限于，改变或修饰与特定基因表达相关的调节序列或位点(例如通过添加强启动子、诱导型启动子或多个启动子，或通过移除调节序列使表达是组成型的)、修饰特定基因的染色体位置、改变与特定基因毗邻的核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子、增加特定基因的拷贝数、修饰参与特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如，调节蛋白、阻抑蛋白、增强子、转录激活物等)，或使用本领域常规方法去调节特定基因的表达的任何其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子，例如，以阻断阻遏蛋白表达)。过量表达基因产物的另一种方式是增强基因产物的稳定性以增加其寿命。
术语“去调节的”包括：以比操作微生物之前或未经操作的可比较微生物中所表达的水平更高或更低的水平，表达基因产物。在一个实施方案中，可以遗传操作(例如，基因工程化)微生物，从而与操作微生物之前或未经操作的可比较微生物中所表达的水平相比，该微生物以更高或更低的水平表达基因产物。遗传操作可以包括，但是不限于，改变或修饰与特定基因表达相关的调节序列或位点(例如通过移除强启动子、诱导型启动子或多个启动子)、修饰特定基因的染色体位置、改变与特定基因毗邻的核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子、减少特定基因的拷贝数、修饰参与特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如，调节蛋白、阻抑蛋白、增强子、转录激活物等)，或本领域常规的去调节特定基因表达的任何其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子或其他方法以敲除或阻断靶蛋白表达)。
术语“去调节的基因活性”还指，将基因活性引入到之前从未观察到过该相应的基因活性(例如赖氨酸脱羧酶活性)的微生物中，例如通过将重组基因例如异源基因以一个或多个拷贝引入该微生物中，优选地借助基因工程引入。
短语“去调节的途径或反应”指这样的生物合成途径或反应，其中编码生物合成途径或反应中酶的至少一个基因被改变或修饰，从而至少一种生物合成酶的水平或活性被改变或调节。短语“去调节的途径”包括这样的生物合成途径，其中一个以上的基因已经被改变或修饰，从而改变了相应基因产物/酶的水平和/或活性。在一些情况下，能够在微生物中“去调节”一个途径(例如，同时去调节给定生物合成途径中的一个以上基因)的能力源自微生物的一个特定现象，其中一个以上的酶(例如，两个或三个生物合成酶)由存在于称作“簇”或“基因簇”的连续遗传物质片段上的彼此毗邻的基因编码。在其他情况下，为了去调节一个途径，必须以一系列的相继工程化步骤去调节多个基因。
为了表达去调节的本发明基因，编码多肽的DNA序列必须与表达载体中控制转录表达的调节序列有效连接并且随后引入微生物中。除转录调节序列(如启动子和增强子)之外，表达载体还可以包含翻译调节序列和适于选择携带表达载体的细胞的标记基因。
如本文所用，“基本上纯的蛋白质”或化合物意指，所需的纯化蛋白质或化合物基本上不含杂质性细胞组分，如对于蛋白质，通过聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)后单一条带所显示的。术语“基本上纯的”进一步意在描述，按照本领域技术人员使用的一种或多种纯度或均质性特征表征为均质的分子。例如，基本上纯的蛋白质或化合物将显示出在标准实验偏差范围内的恒定和可重复参数特征，所述参数为例如：分子量、色谱迁移行为、氨基酸组成，氨基酸序列、封闭或未封闭的N端、HPLC洗脱图、生物活性和其他这类参数。然而，本术语不意在排除蛋白质的人工变体或合成变体、或两种或更多种选定化合物的人工混合物。特别地，本术语不意在排除从重组宿主分离的融合蛋白，例如蛋白质与亲和纯化用标签的融合物。
术语两个核酸序列之间的“序列同一性”应理解为意指，核酸序列在每种情况下覆盖完整序列长度范围内的同一性百分数，其中所述同一性百分数通过比对、借助设置如下参数的程序算法GAP(Wisconsin Package第10.0版，威斯康辛大学，Genetics ComputerGroup(GCG)，Madison，美国)计算：
空位权重：12 长度权重：4
平均匹配：2,912 平均错配：-2,003
术语两个氨基酸序列之间的“序列同一性”应理解为意指，核酸序列在每种情况下覆盖完整序列长度范围内的同一性百分数，其中所述同一性百分数通过比对、借助程序算法GAP(Wisconsin Package第10.0版，威斯康辛大学，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，美国)、设置如下参数计算：
空位权重：8 长度权重：2
平均匹配：2,912 平均错配：-2,003
术语“结构域”指沿着进化相关蛋白质的序列比对结果在特定位置保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间不同，然而在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，故其可以用作鉴定物以确定任一个所讨论的多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
术语“基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括该结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若该基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,5857-5864；Letunic等人，(2002)Nucleic Acids Res 30,242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifsand its function in automatic sequence interpretation(用于生物分子序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能)(引自)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集(Proceedings 2nd International Conference on IntelligentSystems for Molecular Biology).Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,SearlsD.编著，第53-61页,AAAI Press,Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))，或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1):276-280(2002)及Pfam蛋白质家族数据库：R.D.Finn,J.Mistry,J.Tate,P.Coggill,A.Heger,J.E.Pollington,O.L.Gavin,P.Gunesekaran,G.Ceric,K.Forslund,L.Holm,E.L.Sonnhammer,S.R.Eddy,A.Bateman Nucleic Acids Research(2010)Database Issue 38:211-222)。一组用于芯片上分析蛋白质序列的工具可以在ExPASY蛋白质组服务器上获得(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等人,ExPASy:The proteomics server for in-depth protein knowledgeand analysis(用于深入认识和分析蛋白质的蛋白质组服务器),Nucleic Acids Res.31:3784-3788(2003))。也可以使用常规技术如通过序列比对，鉴定结构域或基序。
用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48:443-453)，以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即，覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人,(1990)J Mol Biol 215:403-10)计算序列同一性百分数并且开展两个序列之间相似性的统计学分析。用于开展BLAST分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(版本1.83)，以默认配对比对参数和百分数评分方法容易地鉴定。也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一，确定总体相似性和同一性百分数(Campanella等，BMCBioinformatics.2003年7月10日；4:29.MatGAT:使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(MatGAT:an application that generates similarity/identitymatrices using protein or DNA sequences))。如对本领域技术人员显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列鉴定同源物的替代，也可以使用特定的结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，可以确定在完整核酸或氨基酸序列范围或所选结构域或保守基序范围内的序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF,Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。
通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列针对任意序列数据库，如针对公开可获得的NCBI数据库进行BLAST。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地对BLAST结果进行过滤。随后，使用过滤的结果或未过滤的结果的全长序列，针对查询序列所来自的生物体中的序列，进行反向BLAST搜索(第二BLAST)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中物与查询序列来自相同的物种，随后的反向BLAST理想地导致查询序列位列最高命中物中，则鉴定到旁系同源物；若在第一BLAST中的高阶位命中物与查询序列来自不同物种，并且优选地在反向BLAST时导致查询序列位列最高命中物中，则鉴定到直向同源物。
高阶位命中物是具有低E-值的那些命中物。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中物的几率越低)。E-值的计算是本领域熟知的。除了E-值外，比较结果也通过同一性百分数评定。同一性百分数指所比较的两个核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助显现相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系同源物。
如本文中所定义的术语“杂交”，是其中基本上同源的互补核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两个互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖凝胶(Sepharose)珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上、或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除单链核酸中的发夹或其它二级结构。
术语“严格性”指杂交发生的条件。杂交的严格性受如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常，将低严格条件选择为在规定的离子强度和pH时低于特定序列的热解链温度(Tm)约30℃。中等严格性条件是温度低于Tm约20℃，高严格性条件是温度低于Tm约10℃。高严格杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而，有时候可能需要中等严格杂交条件以鉴定此类核酸分子。
Tm是在确定的离子强度和pH时使50％的靶序列与完美匹配的探针杂交的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高的温度下特异性杂交。从低于Tm约16℃直至32℃，获得最大杂交速率。杂交溶液中一价阳离子的存在降低两条核酸链之间的静电排斥作用，因而促进杂交分子形成；这种作用对于不超过0.4M的钠浓度是可见的(对于更高浓度，可以忽略这种作用)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针来说，每％碱基错配，Tm下降约1℃。取决于杂交分子的类型，Tm可以使用以下等式计算：
1)DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl,Anal.Biochem.,138:267-284,1984)：
Tm＝81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]–500x[Lc]-1–0.61x％甲酰胺2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子：
Tm＝79.8℃+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)寡DNA杂交分子或寡RNAd杂交分子：
对于<20个核苷酸：Tm＝2(ln)
对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)
a或对于其他一价阳离子，而仅在0.01-0.4M范围内准确。
b仅对30％至75％范围内的％GC准确。
c L＝双链体的长度(以碱基对计)。
d Oligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
可以使用许多已知技术的任何一种控制非特异性结合，例如用含有蛋白质的溶液封闭膜、添加异源性RNA、异源性DNA和SDS至杂交缓冲液，并且用RNA酶处理。对于非同源探针，可以通过变动以下之一进行一系列杂交：
(i)渐进性降低的复性温度(例如从68℃至42℃)或
(ii)渐进性降低的甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。
技术人员了解杂交期间可以加以改变并将维持或改变严格条件的多种参数。除了杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的函数。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般等于杂交严格性或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格条件如上所述。也可以选择更严格或较不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变而将维持或改变严格性条件的多种参数。
例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的典型高严格杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格杂交条件的实例包括在50℃于4×SSC或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交分子的长度是针对杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
出于定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)Molecular Cloning:alaboratory manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,CSH,New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons,N.Y.(1989和年度更新版)。
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于所讨论的未修饰蛋白具有氨基酸置换、缺失和/或插入、并且与其所来源自的未修饰蛋白具有相似的生物活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的导入。插入可以包含单个或多个氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合小，约1-10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的实例包括酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
置换指蛋白质的氨基酸以具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的其他氨基酸替换。氨基酸取代一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽上的功能性约束条件，并且可以为1到10个氨基酸；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸置换优选地是保守性氨基酸置换。保守性置换表是本领域熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman andCompany(编著)和下表1)。
表1：保守性氨基酸置换的例子
残基 保守取代 残基 保守取代
Ala Ser Leu IIe；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；IIe
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val IIe；Leu
IIe Leu，Val
本文中对“内源”基因的提及不仅指生物中以其天然形式(即不存在任何人类干预情况下)存在的所讨论基因，还指以分离形式随后被(再)导入微生物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因微生物可能遭遇转基因表达的明显降低和/或内源基因表达的明显降低。分离的基因可以从生物分离，或可以是人造的，例如通过化学合成法。
术语“直向同源物”和“旁系同源物”涵盖用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因；而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，其也源自共同的祖先基因。
如本文中所用的术语“剪接变体”涵盖其中已经切除、替换、移走或添加所选内含子和/或外显子、或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体是基本上保留蛋白质的生物活性的一类变体；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能片段实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工产生。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域熟知的(见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics.6:25)。
等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然多态性株系中最大一组的序列变体。
优选实施方案的详述
在第一方面，本发明提供包含选自DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性的至少一种活性的重组微生物，其中EasA活性可以是EasA还原酶或EasA异构酶活性，或者可以是EasA还原酶和EasA异构酶活性，并且其中该重组微生物不是天然麦角类生物碱生产生物。
优选地，重组微生物包含至少一种EasH和EasD活性，或包含至少一种EasH和EasA还原酶活性，或包含至少一种EasH、EasA还原酶和EasD活性，或包含至少一种EasH和EasD、EasA和EasG活性、甚至更优选地至少一种EasH、EasD、EasA还原酶和EasG活性。
在另一个实施方案中，重组微生物包含至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性、优选地至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶和EasG活性。
在又一个实施方案中，重组微生物包含至少一种EasD、EasA和EasG活性，或至少一种EasD、EasA还原酶和EasG活性，或至少一种EasD、EasA异构酶和EasG活性，或至少一种EasD、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性。
重组微生物还可以包含至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶和EasG活性，或一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA异构酶和EasG活性，或至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性。
在又一个实施方案中，重组微生物包含至少一种DmaW、EasF、EasE和EasC活性，或至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC和EasD活性。
在一个实施方案中，重组微生物包含选自DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性的至少两种活性，其中EasA活性可以是EasA还原酶或EasA异构酶活性，或者可以是EasA还原酶和EasA异构酶活性，其中这些活性由多肽介导，所述多肽可以从相同或不同的天然麦角类生物碱生产生物获得；例如，在一个实施方案中，重组微生物包含至少EasH和EasD、或至少EasH和EasA、或至少EasH、EasD和EasA活性，其中所述活性可以从一个天然麦角类生物碱生产生物物种或从不同天然麦角类生物碱生产生物获得。在其他示例性实施方案，重组生物包含至少EasF和EasE、或至少EasF和EasC、或至少EasF、EasE和EasC活性，其中所述活性可以从一个天然麦角类生物碱生产生物物种获得。
天然麦角类生物碱生产生物是在自然界中存在并具有产生至少一类麦角类生物碱的能力的生物。天然麦角类生物碱生产生物属于麦角科(Clavicipitaceae)、裸囊菌科(Arthrodermataceae)和发菌科(Trichocomaceae)、尤其是本海姆节皮菌(Arthrodermabenhamiae)、麦角菌属(Claviceps)物种、Neotyphodium物种、香柱菌属(Epichloee)物种、蜜孢霉属(Sphacelia)物种、瘤座菌属(Balansia)物种、或Periglandula物种、曲霉属物种和青霉属物种、Paecylomyces物种、发癣菌属(Trichophyton)物种、Arthoderma物种、绿僵菌属(Metarhizium)物种、肉座菌属(Hypocrea)物种、阿耶罗菌属(Ajellomyces)物种、脉孢菌属(Neurospora)物种、副球孢子菌属(Paracoccidioides)物种，葡萄孢盘菌属(Botryotinia)物种。在本发明的公开内容中描述了各个天然麦角类生物碱生产生物物种的例子。
关于天然麦角类生物碱生产生物以及用于麦角类生物碱生产的基因簇的信息可以例如在Schardl CL,Young CA,Hesse U,Amyotte SG,Andreeva K等人.(2013)Plant-Symbiotic Fungi as Chemical Engineers:Multi-Genome Analysis of theClavicipitaceae Reveals Dynamics of Alkaloid Loci.PLoS Genet 9(2):e1003323.doi:10.1371/journal.pgen.1003323,并且在Schardl Cl等人:“Theepichloae:alkaloid diversity and roles in symbiosis with grasses”,Curr OpinPlant Biol(2013),16:1–9中找到。
优选地，所述重组微生物是并非天然麦角类生物碱生产生物的细菌、酵母、放线菌或丝状真菌。丝状真菌可以是子囊菌、半知菌或担子菌，优选的物种是裂褶菌(Schizophyllum commune)。
待作为本发明宿主细胞使用的优选细菌选自：大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)。
优选的酵母选自：克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)和毕赤酵母属(Pichia)。
更优选的重组微生物选自：乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)和树干毕赤酵母(Pichia stipites)。
甚至更优选地，重组微生物是酿酒酵母。
本发明还涵盖重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物具有至少一种选自以下活性的上调活性：DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性。
在一个实施方案中，重组天然麦角类生物碱生产生物包含至少上调的EasH和EasD、EasA和EasG活性，甚至更优选地上调的EasH、EasD、EasA还原酶和EasG活性。
在另一个实施方案中，重组天然麦角类生物碱生产生物包含至少上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性，优选地至少上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶和EasG活性。
在又一个实施方案中，重组天然麦角类生物碱生产生物包含至少上调的EasD、EasA和EasG活性，或至少上调的EasD、EasA还原酶和EasG活性，或至少上调的EasD、EasA异构酶和EasG活性，或至少上调的EasD、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性。
重组天然麦角类生物碱生产生物还可以包含至少上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶和EasG活性，或上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA异构酶和EasG活性，或上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性。
在又一个实施方案中，重组天然麦角类生物碱生产生物包含至少上调的DmaW、EasF、EasE和EasC活性，或上调的DmaW、EasF、EasE、EasC和EasD活性。
在甚至又一个实施方案中，重组天然麦角类生物碱生产生物包含至少一种下调的选自EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性的活性。
在一个实施方案中，重组天然麦角类生物碱生产生物包含至少一种上调的选自DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性的活性，其中EasA活性可以是EasA还原酶或EasA异构酶活性，或者可以是EasA还原酶和EasA异构酶活性，其中这些活性由多肽介导，所述多肽可以从相同或不同的天然麦角类生物碱生产生物获得；例如，在一个实施方案中，重组微生物包含从一个天然麦角类生物碱生产生物物种或从不同天然麦角类生物碱生产生物可获得的、至少EasH和EasD、或至少EasH和EasA、或至少EasH、EasD和EasA活性。在其他示例性实施方案，重组生物包含从一个天然麦角类生物碱生产生物物种或从不同天然麦角类生物碱生产生物可获得的、至少EasF和EasE、或至少EasF和EasC、或至少EasF、EasE和EasC活性。
优选地，重组天然麦角类生物碱生产生物选自麦角科(Clavicipitaceae)、裸囊菌科(Arthrodermataceae)和发菌科(Trichocomaceae)、尤其是本海姆节皮菌(Arthrodermabenhamiae)、麦角菌属(Claviceps)物种、Neotyphodium物种、香柱菌属(Epichloee)物种、蜜孢霉属(Sphacelia)物种、瘤座菌属(Balansia)物种、或Periglandula物种、曲霉属物种和青霉属物种、Paecylomyces物种、发癣菌属(Trichophyton)物种、Arthoderma物种、绿僵菌属(Metarhizium)物种、肉座菌属(Hypocrea)物种、阿耶罗菌属(Ajellomyces)物种、脉孢菌属(Neurospora)物种、副球孢子菌属(Paracoccidioides)物种，葡萄孢盘菌属(Botryotinia)物种，
或选自：曲霉属，尤其是日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、浅蓝灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergillus carneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、弯头曲霉(Aspergillusdeflectus)、费氏曲霉(Aspergillus fischerianus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、青霉状曲霉(Aspergillus penicilloides)、局限曲霉(Aspergillusrestrictus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、溜曲霉(Aspergillus tamari)、土曲霉(Aspergillus terreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)、杂色曲霉(Aspergillusversicolor)；更优选地、重组天然麦角类生物碱生产生物选自：烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉和米曲霉，或
青霉属(Penicillium)如黄灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)、Penicillium bilaiae、沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)、Penicilliumcandidum、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、棒形青霉(Penicillium claviforme)、普通青霉(Penicillium commune)、桔青霉(Penicillium citrinum)、顶青霉(Penicilliumcorylophinum)、Penicillium comune、瘿青霉(Penicillium fellutanum)、瓦克青霉(Penicillium waksmanii)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、指状青霉(Penicilliumdigitatum)、扩展青霉(Penicillium expansum)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、平滑青霉(Penicillium glabrum)、灰绿青霉(Penicillium glaucum)、意大利青霉(Penicillium italicum)、Penicillium lacussarmientei、马尔尼菲青霉(Penicilliummarneffei)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、娄地青霉(Penicilliumroqueforti)、匍枝青霉(Penicillium stoloniferum)、Penicillium ulaiense、疣孢青霉(Penicillium verrucosum)、鲜绿青霉(Penicillium viridicatum)；或
麦角菌属(Claviceps)，如非洲麦角菌(Claviceps africana)、Clavicepsgigantea、Claviceps grohii、Claviceps cyperi、Claviceps fusiformis、Clavicepshirtella、黑麦角菌(Claviceps nigricans)、雀稗麦角菌(Claviceps paspali)、麦角菌(Claviceps purpurea)、高粱麦角菌(Claviceps sorghi)、Claviceps zizaniae、优选地非洲麦角菌、雀稗麦角菌或麦角菌，或
拟青霉属(Paecilomyces)，如Paecilomyces divaricatus、皮节菌属(Arthroderma)如本海姆节皮菌(Arthroderma benhamiae)、或发癣菌属(Trichophyton)如疣状发癣菌(Trichophyton verrucosum)、或小孢霉属(Microsporum)如狗小孢霉(Microsporum canis)。
甚至更优选地是，重组天然麦角类生物碱生产生物选自：日本曲霉、黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、烟曲霉、非洲麦角菌、麦角菌、Claviceps fusiformis、雀稗麦角菌、Claviceps zizaniae、产黄青霉、桔青霉、顶青霉、瘿青霉、瓦克青霉、娄地青霉，和Paecilomyces divaricatus，优选地选自日本曲霉、烟曲霉、麦角菌、雀稗麦角菌、非洲麦角菌和Paecilomyces divaricatus。
重组天然麦角类生物碱生产生物可以用来产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者。图1和图2中包含关于应当上调和/或下调哪些活性以提供更多环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I的其他指导。
例如，重组天然麦角类生物碱生产生物是具有上调的EasH活性，优选地具有上调的EasH和EasA还原酶活性和下调的EasA异构酶活性的，雀稗麦角菌、麦角菌或非洲麦角菌细胞。
上文描述的全部重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物优选地包含扩大的细胞内部色氨酸和/或DMAPP供应量和/或扩大的细胞内部Me-DMAT供应量。这种扩大的细胞内部DMAPP和/或Me-DMAT供应量可以通过上调重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或甲羟戊酸途径的基因或多肽的活性来提供。酿酒酵母的甲羟戊酸途径的基因和多肽的例子由SEQ ID NO:12、13、14、15、16、17或18描述。这些基因及其序列变体的同源物是本领域技术人员可容易地获得的。
例如，重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物可以包含选自ERG9和ERG20活性的至少一种下调活性，或可以包含至少一种上调的HMG-CoA还原酶活性，或可以包含选自ERG9和ERG20活性的至少一种下调活性和至少一种上调的HMG-CoA还原酶活性。
因此，本发明优选地涵盖重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物，其中除本发明的多核苷酸之外，所述生物包含合成色氨酸所需要的或促进合成色氨酸的多核苷酸，色氨酸是用于合成如本文提到的棒麦角素型生物碱的原料。更优选地，酶是色氨酸合酶。关于生物合成色氨酸的更多细节可以例如在Radwanski 1995,Plant Cell 7(7):921-934中找到。
在本发明的一个实施方案中，如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物包含至少一个重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码至少一种EasH活性、或编码至少一种EasH和EasD活性、或编码至少一种EasA还原酶或至少一种EasA异构酶活性、或编码至少一种EasD、EasA异构酶和EasG活性、或编码至少一种EasD、EasA还原酶和EasG活性、或编码至少一种EasH、EasD、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性、或编码至少一种EasH、EasD、EasA还原酶和EasG活性、或编码至少一种EasH、EasD、EasA异构酶和EasG活性、或编码至少一种DmaW、EasF、EasE和EasC活性、或编码上述可选项中的至少两者。
因此，本发明又一个实施方案是重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码至少一种EasH活性、或编码至少一种EasH和EasD活性、或编码至少一种EasA还原酶或至少一种EasA异构酶活性、或编码至少一种EasD、EasA异构酶和EasG活性、或编码至少一种EasD、EasA还原酶和EasG活性、或编码至少一种EasH、EasD、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性、或编码至少一种EasH、EasD、EasA还原酶和EasG活性、或编码至少一种EasH、EasD、EasA异构酶和EasG活性、或编码至少一种DmaW、EasF、EasE和EasC活性、或编码上述可选项中的至少两者。
针对本发明描述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸之任一者的DmaW活性，优选地由至少一个多肽或编码至少一个多肽的至少一个多核苷酸的活性导致，所述多肽选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:145和146具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:147和或190具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、19、20、179和/或180具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
d)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、19、20、21、22、23、24、25、26、27和/或28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
e)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:102、122和/或123具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
f)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:129和/或137具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
g)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸可以通过使用两个PCR引物获得，其中每个引物包含选自SEQ ID NO:102、122、123、129和/或137所述序列的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，
h)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:102、122、123、129和/或137杂交，或
i)根据a)至h)中至少两者、优选地根据至少b)和c)的多肽，和
j)根据a)至i)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
编码具有DmaW活性的多肽的多核苷酸原则上可以从本文中提到的任一种天然麦角类生物碱生产者获得。在一个实施方案中，多核苷酸从天然麦角类生物碱生产者获得，所述天然生产者选自：
土曲霉(Aspergillus terreus)、须芒草瘤座菌(Balansia andropogonis)、Balansia cyperi、Balansia obtecta、Balansia pilulaeformis、非洲麦角菌、Clavicepsfusiformis、Claviceps hirtella、Sphacelia eriochloae、Sphacelia texensis、Sphacelia lovelessii、Neotyphodium sp.Lp1、Neotyphodium coenophialum、Neotyphodium lolii、桔青霉(Penicillium citrinum)、普通青霉、顶青霉、皮落青霉、瘿青霉和徘徊青霉(Penicillium palitans)，
或选自：日本曲霉、黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、烟曲霉、麦角菌、Clavicepsfusiformis、雀稗麦角菌、Claviceps zizaniae、产黄青霉、桔青霉、顶青霉、瘿青霉、瓦克青霉、娄地青霉和Paecilomyces divaricatus、
或选自：本海姆节皮菌(Arthroderma benthamiae)、太田节皮菌(Arthrodermaotae)、Epichloe brachyelytri、羊茅香柱菌(Epichloe festucae)、Epichloe glyceriae、柱香菌(Epichloe typhina)、Malbranchea aurantiaca、狗小孢霉(Microsporum canis)、蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)、Metarhizium robertsii、Periglandula ipomoeae、马发癣菌(Trichophyton equinum)和断发癣菌(Trichophyton tonsurans)，
或选自：日本曲霉、烟曲霉、麦角菌和Paecilomyces divaricatus，
或选自这些群组的任何组合。
编码具有DmaW活性的多肽的多核苷酸可以使用PCR引物，借助PCR方法通过扩增基因组片段或cDNA片段，从上文所列的生物获得，其中已经基于本文中公开的编码具有DmaW活性的多肽的多核苷酸的序列信息设计了PCR引物。通常，这些方法中使用的PCR引物组由两条PCR引物组成，每条引物包含本文公开的编码具有DmaW活性的多肽的序列中的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、28个、但少于100、90、80、70、60、50、40或30个连续核苷酸。优选地，PCR引物在无任何核苷酸错配的情况下与待扩增多核苷酸的序列结合。使用本文中就具有相应活性的多肽所提供的序列信息，相同方法也适用于扩增编码具有EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性的多肽的多核苷酸。
优选地，至少一种具有DmaW活性的多肽选自表2中列出的序列、或与这些序列具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
表2：具有DmaW活性的示例性多肽的同一性％表
优选地，具有DmaW活性的多肽包含下文描述的至少一个DmaW标签序列(signaturesequence)，或它们包含DmaW共有序列。优选地，它们包含两个DmaW标签序列，并且甚至更优选地包含两个DmaW标签序列和DmaW共有序列。
DmaW标签序列和共有序列描述了连续氨基酸序列，其中根据本领域使用的单字母氨基酸代码描述每个氨基酸。用“X”描述的氨基酸表示任何氨基酸，优选地，它表示这样的氨基酸，所述氨基酸在表2所述序列及图3a至图3d所示序列的DmaW序列比对中在至少一个氨基酸序列上位于相同位置的氨基酸。
DmaW标签序列1 (SEQ ID NO：124)：
IXTQNKLALDLXXXXFXXKXYXYPXLKXXTG
DmaW标签序列2 (SEQ ID NO：125)：
RLXSCDLXXPXSRXKIYXXEXXVXLXXXEDLWTXGGXXXDXXTXXGLXXLRELWXLXXXXXXXXXYPXXXLXXGXXPXEXLPXMXNXTXXH
DmaW共有序列 (SEQ ID NO：126)：
MXXXNXXXXXVYXTLSXXFDFXXXXQXLWWHSTAPMFAXMLQTAXYXXHXQYXHLGIYKKXXIPFLGVYPTXXXXRWLSILTRYGTPFELSLNCSXSXVRYTYEPINAATGTXKDPFNTXAIWXSLXXLXXXQXGIDLEWFXYFKXXLTLXXXESAYLXXNNXLVXXQIKTQNKLALDLKGXXFVLKTYIYPALKSXATGKSXHELXFGSVXRLSXXXPSIXXPLXXLEXYVXSRGXXXXXXXXXXSTXSPRLLSCDLXDPXKSRVKIYLLERMVSLXAMEDLWTLGGRRXDXSTLXGLEMIRELWXLXXLPXGLXXYPXPYLXLGXIPXEQLPLMANYTLHHXDPX-PEPQVYFTXFGMNDXXXXXALTTFFERRGWXXMAXXYKXXLXXXYPHXDXEXLNYL-HAYISFSYRXNKPYLSVYLHSFETGDWPXXXXXXXXFXXXR
DmaW共有序列2 (SEQ ID NO：190)：
MXTXNXSXXEVYXTLSXXFDFPNXDQXLWWHSTAPMFAXMLQTANYXXHXQYXHLGIYKKHVIPFLGVYPTXXKXRWLSILTRYGTPFELSLNCSXSXVRYTYEPINAATGTXKDPFNTXAIWXSLQXLXXXQXGIDLEWFXYFKXELTLXXXESAYLXXNNXLVXXQIKTQNKLALDLKGXXFVLKTYIYPALKSXATGKSIHELXFGSVXRLSXXXPSIRXPLXXLEXYVXSRNXXXXXXXXXXXXLSPRLLSCDLXDPXKSRVKIYLLERMVSLXAMEDLWTLGGRRXDXSTXXGLXMIRELWXLLXXPXGLXXYPXPYLPLGXIPXEQLPSMANYTLHHXDPX-PEPQVYFTVFGMNDMXVXDALTTFFERRGWXXMAXKYKAXLXXSYPHXDHEXLNYL-HAYISFSYRXNKPYLSVYLHSFETGDW
优选地，就本发明描述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的DmaW活性由至少一种多肽或编码至少一种多肽的至少一种多核苷酸的活性导致，所述多肽选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：19具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：19具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ ID NO:190具有至少85％、优选地至少89％、序列同一性，甚至更优选地具有在如图3中所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:180具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
d)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:180具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ ID NO:190具有至少85％、优选地至少89％、序列同一性，甚至更优选地具有在如图3中所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，和
e)根据a)至d)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
就本发明描述的任何重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasF活性优选地由至少一种多肽或编码至少一种多肽的至少一种多核苷酸的活性导致，所述多肽选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:154具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6、75和/或76具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84和/或85具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
d)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:107和/或120具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
e)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:134和/或142具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
f)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸可以通过使用两个PCR引物获得，其中每个引物包含选自SEQ ID NO:107、120、134和/或142所述序列的多核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸，或
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:107、120、134和/或142杂交，
h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，和
i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
编码具有EasF活性的多肽的多核苷酸原则上可以从本文中提到的任何天然麦角类生物碱生产者获得。在一个实施方案中，多核苷酸从天然麦角类生物碱生产者获得，所述天然生产者选自：
土曲霉(Aspergillus terreus)、须芒草瘤座菌(Balansia andropogonis)、Balansia cyperi、Balansia obtecta、Balansia pilulaeformis、非洲麦角菌、Clavicepsfusiformis、Claviceps hirtella、Sphacelia eriochloae、Sphacelia texensis、Sphacelia lovelessii、Neotyphodium sp.Lp1、Neotyphodium coenophialum、Neotyphodium lolii、桔青霉(Penicillium citrinum)、普通青霉、顶青霉、皮落青霉、瘿青霉和徘徊青霉(Penicillium palitans)，
或选自：日本曲霉、黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、烟曲霉、麦角菌、Clavicepsfusiformis、雀稗麦角菌、Claviceps zizaniae、产黄青霉、桔青霉、顶青霉、瘿青霉、瓦克青霉、娄地青霉和Paecilomyces divaricatus、
或选自：本海姆节皮菌(Arthroderma benthamiae)、太田节皮菌(Arthrodermaotae)、Epichloe brachyelytri、羊茅香柱菌(Epichloe festucae)、Epichloe glyceriae、柱香菌(Epichloe typhina)、Malbranchea aurantiaca、狗小孢霉(Microsporum canis)、蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)、Metarhizium robertsii、Periglandula ipomoeae、马发癣菌(Trichophyton equinum)、断发癣菌(Trichophyton tonsurans)、疣状发癣菌(Trichophyton verrucosum)，
或选自：日本曲霉、烟曲霉、麦角菌和Paecilomyces divaricatus，
或选自这些群组的任何组合。
优选地，至少一种具有EasF活性的多肽选自表3中列出的序列、或与这些序列具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
表3：具有EasF活性的示例性多肽的同一性％表
优选地，具有EasF活性的多肽包含EasF共有序列。EasF共有序列描述了连续氨基酸序列，其中根据本领域使用的单字母氨基酸代码描述每个氨基酸。用“X”描述的氨基酸表示任何氨基酸，优选地，它表示这样的氨基酸，所述氨基酸是在表3及图4a至图4c所述序列的EasF序列比对中在至少一个氨基酸序列中位于相同位置的氨基酸。
EasF共有序列(SEQ ID NO：154)：
MXXPXVIDIRXSXFEDSIPDQVIXGLXSXPKTLPALLFYSNEGLXHWNHHSHQPDFYPRHQEIXILKXKAXEMAASIAXNSVVVDLGSASLDKVIHLLEALEAQXKXVTYYALDLSASQLXSTLXAIPTXQXFRHVRFAGLHGTFDDGLXWLXETPEIRDLPHCVLLFGLTIGNFSRPNAAAFLRNIAXHALXGXSXXQSSILLSLDSCKVPTQVLRAYTAEGVVPFALQSLTYANTLFXXKXXXXXXXXXXXXVFNPDDWYYLSEWNFVLGRHEASLIPRSKDIXLGAPLDXIVVRKDEKVRFGCSYKYDXXERXELFXAAGLKDEXXWSXEGCDVAFYQLKL
优选地，就本发明描述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasF活性由至少一种多肽或编码至少一种多肽的至少一种多核苷酸的活性导致，其中所述多肽选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ ID NO:154具有至少75％、优选地至少79％序列同一性，甚至更优选地具有在图4所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:75具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
d)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ ID NO:154具有至少75％、优选地至少83％序列同一性，甚至更优选地具有在如图4所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，
e)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:76具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
f)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:76具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ ID NO:154具有至少75％、优选地至少78％序列同一性，甚至更优选地具有在如图4所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，和
g)根据a)至f)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
就本发明描述的任一种重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasE活性优选地由至少一种多肽或至少一种多核苷酸的活性导致，其选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:153、185和/或191具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，优选地与SEQ ID NO:191具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5和/或64具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73和/或74具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或与SEQ ID NO:5、64、175、66、67、68、69、176、71、177、73和/或178具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
d)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:106具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
e)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:133和/或141具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
f)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸可以通过使用两个PCR引物获得，其中每个引物包含选自SEQ ID NO:106、133和/或141所述序列的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:106、133和/或141杂交，
h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，和
i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
优选地，编码的多肽具有可以作为去向内质网的分选信号发挥作用的N末端序列。
编码具有EasE活性的多肽的多核苷酸原则上可以从本文中提到的任何天然麦角类生物碱生产者获得。在一个实施方案中，多核苷酸从天然麦角类生物碱生产者获得，所述天然生产者选自：
土曲霉(Aspergillus terreus)、须芒草瘤座菌(Balansia andropogonis)、Balansia cyperi、Balansia obtecta、Balansia pilulaeformis、非洲麦角菌、Clavicepsfusiformis、Claviceps hirtella、Sphacelia eriochloae、Sphacelia texensis、Sphacelia lovelessii、Neotyphodium sp.Lp1、Neotyphodium coenophialum、Neotyphodium lolii、桔青霉(Penicillium citrinum)、普通青霉、顶青霉、皮落青霉、瘿青霉和徘徊青霉(Penicillium palitans)，
或选自：日本曲霉、黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、烟曲霉、麦角菌、Clavicepsfusiformis、雀稗麦角菌、Claviceps zizaniae、产黄青霉、桔青霉、顶青霉、瘿青霉、瓦克青霉、娄地青霉和Paecilomyces divaricatus、
或选自：本海姆节皮菌(Arthroderma benthamiae)、石膏样节皮菌(Arthrodermagypseum)、太田节皮菌(Arthroderma otae)、Epichloe brachyelytri、羊茅香柱菌(Epichloe festucae)、Epichloe glyceriae、柱香菌(Epichloe typhina)、Malbrancheaaurantiaca、狗小孢霉(Microsporum canis)、蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)、Metarhizium robertsii、Periglandula ipomoeae、马发癣菌(Trichophyton equinum)、红色发癣菌(Trichophyton rubrum)、断发癣菌(Trichophyton tonsurans)、疣状发癣菌(Trichophyton verrucosum)，
或选自：日本曲霉、烟曲霉、麦角菌和Paecilomyces divaricatus，
或选自这些群组的任何组合。
优选地，至少一种具有EasE活性的多肽选自表4中列出的序列、或与这些序列具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
表4：具有EasE活性的示例性多肽的同一性％表
优选地，具有EasE活性的多肽包含EasE共有序列。EasF共有序列描述连续氨基酸序列，其中根据本领域使用的单字母氨基酸代码描述每个氨基酸。用“X”描述的氨基酸表示任何氨基酸，优选地，它表示这样的氨基酸，所述氨基酸是在表4及图5a至图5e所述序列的EasE序列比对中在至少一个氨基酸序列中位于相同位置的氨基酸。
EasE共有序列(SEQ ID NO：153)：
MXXLVXXXXXXXLXXXLXXXXXXXXXCRCRPWEXCWPSXXXWXSXNXSIDGXLXXLRPI-AXVCHXPXFDXSACXXLLXLSRDSGWRASNPGXLQDWVWEAGXTANESCPVGSXRXXSXXXSCHQGRIPLYSAAVESTXQVQXAVRFARRHNLRLVIRNTGHDXAGRSSAPDSFQIHTHRLQEIXFHXNFRLXGSXXXXTSLGXPAVTVGAGVMMGELYAXGARXGYMVLGGECPTVGVVGGFLQGGGVSSFLSFXXGLAVDNVLEYEVVTAXGELVVANAHQNQDLFWALRGGGGGTFGVVTRATMRVFPDVPVVVSEILLXAXXAXSS-FWTXGLSXLLTALQSLNQDNVGGQLVIXXXXKDAVQASIXLFFLNMTEXAXIDXRMKPXLTXLSXXNIXYTXSSKXLPXXSSXLRXXPDIHPDNXYGILXSSVLISQXLFXSSE-GPXKVAXXIAXLPMSPXDLLFTSNLGGRVIANGXXELAETSMHPAWRSAAQLINYVRTVXEPSIEGKAXALEXLTNXQMPILYAIDPXFKLSYRNLGDPNEKDFQQVYWGXNX-YGRLSXIKKKWDPDDLFFSKLGVGSEXWDSEGMCRKXXXXQXXLXQXLXXLXS
EasE共有序列2(SEQ ID NO：153)：
LLTXGLVALLSWXIYTXXTXXXSCRCRPWESCWPSEEXWXSLNTSIDGXLVRLRPIAHVCHGPXFDXSACDNLLXLSRDSGWRASNPGXLQDWVWEAGXTANESCPVGSXRXXSXXXSCHQGRIPLYSAAVESTXQVQXAVRFARRHNLRLVIRNTGHDXAGRSSAPDSFQIHTHRLQEIXFHXNFRLXGSXXXXTSLGXPAVTVGAGVMMGELYAXGARXGYMVLGGECPTVGVVGGFLQGGGVSSFLSFXXGLAVDNVLEYEVVTAXGELVVANAHQNQDLFWALRGGGGGTFGVVTRATMRVFPDVPVVVSEILLXAXXAXSSFWTXGLSXLLTALQSLNQDNVGGQLVIXXXXKDAVQASIXLFFLNMTEXAXIDXRMKPXLTXLSXXNIXYTXSSKXLPXXSSXLRXXPDIHPDNXYGILXSSVLISQXLFXSSEGPXKVAXXLAXLPMSPXDLLFTSNLGGRVIANGXXE-LAETSMHPAWRSAAQLINYVRTVXEPSIEGKAXALEXLTNXQMPILYAIDPXFKLSYRNLGDPNEKDFQQVYWGXNXYGRLSXIKKKWDPDDLFFSKLGVGSEXWDSEGMCRKXXXXQXXLXQXLXXLXS
EasE核心共有序列(SEQ ID NO：191)：
CRCRPWESCWPSEEXWXSLNTSIDGXLVRLRPIAHVCHGPXFDXSACDNLLXLSRDSGWRASNPGXLQDWVWEAGXTANESCPVGSXRXXXXXXSCHQGRIPLYSAAVESTXQVQXAVRFARRHNLRLVIRNTGHDXAGRSSAPDSFQIHTHRLQEIXFHXNFRLXGSXXXXTSLGXPAVTVGAGVMMGELYAXGARXGYMVLGGECPTVGVVGGFLQGGGVSSFLSFXXGLAVDNVLEYEVVTAXGELVVANAHQNQDLFWALRGGGGGTFGVVTRATMRVFPDVPVVVSEILLXAXXAXSSFWTXGLSXLLTALQSLNQDNVGGQLVIXXXXKDAVQASIXLFFLNMTEXAXIDXRMKPXLTXLSXXNIXYTXSSKXLPXXSSXLRXXPDIHPDNXYGILXSSVLISQXLFXSSEGPXKVAXXLAXLPMSPXDLLFTSNLGGRVIANGXXELAETSMHPAWRSAAQLINYVRTVXEPSIEGKAXALEXLTNXQMPILYAIDPXFKLSYRNLGDPNEKDFQQVYWGXNXYGRLSXIKKKWDPDDLFFSKLGVGSEXWDSEGMCRK
优选地，就本发明描述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasE活性由至少一种多肽或编码至少一种多肽的至少一种多核苷酸的活性导致，所述多肽选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：5具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：5具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ ID NO：191具有至少70％、优选地至少73％序列同一性，甚至更优选地具有在如图5所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：64具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
d)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:64具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ ID NO:191具有至少75％、优选地至少79％序列同一性，甚至更优选地具有在如图5所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，和
e)根据a)至d)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
就本发明描述的任一种重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasC活性优选地由至少一种多肽或至少一种多核苷酸的活性导致，其选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:151和/或192具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3和/或41具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3或41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和/或52具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
d)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:104具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
e)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:131或139具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
f)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸可以通过使用两个PCR引物获得，其中每个引物包含选自SEQ ID NO:104、131和/或139所示序列的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，或
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:104、131和/或139杂交，或
h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，和
i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
编码具有EasC活性的多肽的多核苷酸原则上可以从本文中提到的任何天然麦角类生物碱生产者获得。在一个实施方案中，多核苷酸从天然麦角类生物碱生产者获得，所述天然生产者选自：
土曲霉(Aspergillus terreus)、须芒草瘤座菌(Balansia andropogonis)、Balansia cyperi、Balansia obtecta、Balansia pilulaeformis、非洲麦角菌、Clavicepsfusiformis、Claviceps hirtella、Sphacelia eriochloae、Sphacelia texensis、Sphacelia lovelessii、Neotyphodium sp.Lp1、Neotyphodium coenophialum、Neotyphodium lolii、桔青霉(Penicillium citrinum)、普通青霉(Penicilliumcommune)、顶青霉(Penicillium corylophinum)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、瘿青霉(Penicillium fellutanum)和徘徊青霉(Penicillium palitans)，
或选自：日本曲霉、黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、烟曲霉、麦角菌、Clavicepsfusiformis、雀稗麦角菌、Claviceps zizaniae、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、桔青霉、顶青霉、瘿青霉、瓦克青霉(Penicillium waksmanii)、娄地青霉(Penicilliumroqueforti)和Paecilomyces divaricatus、
或选自：本海姆节皮菌(Arthroderma benthamiae)、石膏样节皮菌(Arthrodermagypseum)、太田节皮菌(Arthroderma otae)、Epichloe brachyelytri、羊茅香柱菌(Epichloe festucae)、Epichloe glyceriae、柱香菌(Epichloe typhina)、蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)、Metarhizium robertsii、Periglandula ipomoeae、马发癣菌(Trichophyton equinum)、红色发癣菌(Trichophyton rubrum)和疣状发癣菌(Trichophyton verrucosum)，
或选自：日本曲霉、烟曲霉、麦角菌和Paecilomyces divaricatus，
或选自这些群组的任何组合。
优选地，至少一种具有EasC活性的多肽选自表5中列出的序列、或与这些序列具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
表5：具有EasC活性的示例性多肽的同一性％表
优选地，具有EasC活性的多肽包含EasC共有序列。EasC共有序列描述连续氨基酸序列，其中根据本领域使用的单字母氨基酸代码描述每个氨基酸。用“X”描述的氨基酸表示任何氨基酸，优选地，它表示这样的氨基酸，所述氨基酸是在表5及图6a至图6d所述序列的EasC序列比对中在至少一个氨基酸序列中位于相同位置的氨基酸。
EasC共有序列(SEQ ID NO：151)：
AXXXSXXYTTSNGCPVXXPEGXXXXGXXXXLXLXDXHLIDXLAHFNREKIPERAVHAKGAGAYGEFEVTXDISDICXIDMLLGVGKKTXCVTRFSTTGLERGSADSVRDLKGMAV-KFYTXEGNWDWVXLNXPMFFIRDPSKFPXLIHAQRRDPQTNLXNPSMFWDFVTXN-HEALHMVMXQFSDFGTMFXYRSMSGYVGHAYKWVMPDGSFKYVHIFLSSDQGPNFXXGXXAXXIAXXDPDXATRDLYEAIERGEYPSWTANVQVVDPEDAXKLGFNILDVTKHWNLGXYPXDLXXIPSRXFGKLTLNKNPXNYFAEIEQLAFSPSHLVPGVEPSEDPILQARLFAY-PDAQRYRLGXNHXXIPVNXXKXXFXPXXRDGXXXXXGNYGAXPXYXSXXXXMXFAXXKSXXXPEHXXWLSXVXSXSWXXXXEXDYK-FAREFWXXLPXXRXQEFQDXMVXNMAXSVAQXXXELRKKVYXTFXLVAXDLAXRVKXG-TEXLVA
EasC共有核心序列(SEQ ID NO：192)：
LAHFNREKIPERAVHAKGAGAYGEFEVTXDISDICXIDMLLGVGKKTXCVTRFSTTGLERGSADSVRDLKGMAVKFYTXEGNWDWVXLNXPMFFIRDPSKFPXLIHAQRRDPQTNLXNPSMFWDFVTXNHEALHMVMXQFSDFGTMFXYRSMSGYVGHAYKWVMPDGS-FKYVHIFLSSDQGPNFXXXXXXXXXXXXDPDXATRDLYEAIERGEYPSWTANVQVVDPEDAXKLGFNILDVTKHWNLGXYPXDLXXIPSRXFGKLTLNKNPXNYFAEIEQLAFSPSHLVPGVEPSEDPILQARLFAYPDAQRYRLG
优选地，就本发明描述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasC活性由至少一种多肽或编码至少一种多肽的至少一种多核苷酸的活性导致，所述多肽选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ ID NO:192具有至少85％、优选地至少87％序列同一性，甚至更优选地具有在如图6所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:41具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
d)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:41具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ ID NO:192具有至少85％、优选地至少90％序列同一性，甚至更优选地具有在如图6所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，和
e)根据a)至d)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
就本发明描述的任一种重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasD活性优选地由至少一种多肽或至少一种多核苷酸的活性导致，其选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:152具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4和/或53具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4、53、54、55、56、57、58、59、60、62和/或63具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
d)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:105具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
e)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:132和/或140具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
f)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸可以通过使用两个PCR引物获得，其中每个引物包含选自SEQ ID NO:105、132和/或140所示序列的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:105、132和/或140杂交，或
h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，和
i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
编码具有EasD活性的多肽的多核苷酸原则上可以从本文中提到的任何天然麦角类生物碱生产者获得。在一个实施方案中，多核苷酸从天然麦角类生物碱生产者获得，所述天然生产者选自：
土曲霉(Aspergillus terreus)、须芒草瘤座菌(Balansia andropogonis)、Balansia cyperi、Balansia obtecta、Balansia pilulaeformis、非洲麦角菌、Clavicepsfusiformis、Claviceps hirtella、Sphacelia eriochloae、Sphacelia texensis、Sphacelia lovelessii、Neotyphodium sp.Lp1、Neotyphodium coenophialum、Neotyphodium lolii、桔青霉(Penicillium citrinum)、普通青霉(Penicilliumcommune)、顶青霉(Penicillium corylophinum)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、瘿青霉(Penicillium fellutanum)和徘徊青霉(Penicillium palitans)，
或选自：日本曲霉、黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、烟曲霉、麦角菌、Clavicepsfusiformis、雀稗麦角菌、Claviceps zizaniae、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、桔青霉、顶青霉、瘿青霉、瓦克青霉(Penicillium waksmanii)、娄地青霉(Penicilliumroqueforti)和Paecilomyces divaricatus、
或选自：本海姆节皮菌(Arthroderma benthamiae)、石膏样节皮菌(Arthrodermagypseum)、太田节皮菌(Arthroderma otae)、Epichloe brachyelytri、羊茅香柱菌(Epichloe festucae)、Epichloe glyceriae、柱香菌(Epichloe typhina)、狗小孢霉(Microsporum canis)、蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)、Metarhizium robertsii、Periglandula ipomoeae、马发癣菌(Trichophyton equinum)、红色发癣菌(Trichophytonrubrum)、断发癣菌(Trichophyton tonsurans)、疣状发癣菌(Trichophyton verrucosum)和Trichoderma virens，
或选自：日本曲霉、烟曲霉、麦角菌和Paecilomyces divaricatus，
或选自这些群组的任何组合。
优选地，至少一种具有EasD活性的多肽选自表6中列出的序列、或与这些序列具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
表6：具有EasD活性的示例性多肽的同一性％表
优选地，具有EasD活性的多肽包含EasD共有序列。EasD共有序列描述连续氨基酸序列，其中根据本领域使用的单字母氨基酸代码描述每个氨基酸。用“X”描述的氨基酸表示任何氨基酸，优选地，它表示这样的氨基酸，所述氨基酸是在表6及图7a至图7b所述序列的EasD序列比对中在至少一个氨基酸序列中位于相同位置的氨基酸。
EasD共有序列(SEQ ID NO：152)：
MASVSSKIFAITGGASGIGAATCRLLAXRGAA-VICVGDVSSXNFXSLXKSIKEINPSTKVHCTVLDVSSSSEVDXWLXDIISTFGDLHGAAN-VAGIAQGAGLRQTPTILEEXDXEWXRIFXVNLDGVFYSTRAQVRAMKDLPXXXGXDR-SIVNVASIAAFSHMPDVYAYGTSKAACAYFTTXCVAADVFPXGIRVNXVSPGXITNTPLL-PQFXPXAKSLDEVXEXYKKEGFSVIEADDVARTIVWLLSEDSRPVYGANINVGACMP
优选地，就本发明描述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasD活性由至少一种多肽或编码至少一种多肽的至少一种多核苷酸的活性导致，所述多肽选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ ID NO:152具有至少80％、优选地至少81％序列同一性，甚至更优选地具有在如图7所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:53具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
d)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:53具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ ID NO:152具有至少85％、优选地至少86％序列同一性，甚至更优选地具有在如图7所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，和
e)根据a)至d)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
就本发明描述的任一种重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasH活性优选地由至少一种多肽或至少一种多核苷酸的活性导致，其选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:156具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与EQ ID NO:8和/或95具有至少60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQID NO:156具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8和/或95具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
d)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:109和/或157具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
e)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:109,136或144和/或157具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
f)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸可以通过使用两个PCR引物获得，其中每个引物包含选自SEQ ID NO:109、136、144和/或157所述序列的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，或
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO：109、136、144和/或157杂交，或
h)根据a)至g)中至少两者的多肽，和
i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
编码具有EasH活性的多肽的多核苷酸原则上可以从本文中提到的任何天然麦角类生物碱生产者获得。在一个实施方案中，多核苷酸从天然麦角类生物碱生产者获得，所述天然生产者选自：日本曲霉和Paecilomyces divaricatus。
再一具有EasH活性的多肽包含于Ipomoea hildebrandtii Vatke种子所含的内寄生菌中，如Stauffacher D.等人，(1969)Tetrahedron第25卷：第5879-5887页中公开。
优选地，具有EasH活性的多肽包含EasH共有序列。EasH共有序列描述连续氨基酸序列，其中根据本领域使用的单字母氨基酸代码描述每个氨基酸。用“X”描述的氨基酸表示任何氨基酸，优选地，它表示这样的氨基酸，所述氨基酸是在SEQ ID NO：8和95及图8所述序列的EasH序列比对中在至少一个氨基酸序列中位于相同位置的氨基酸。
EasH共有序列(SEQ ID NO：156)：
MTXTXTSKPXLRRXPXSAGXXAIFQVLQEDGVXXIEGFXXXXQVXXFNXEXDPHXKXWELGQXSXQEXYLAXMXQLSSLPLFSKXFRDXLMNXXLLHGXCKXXFGPXSGDYWLTTSSVLETXPGYXGQXLHREHDGIPICTTLGRXSPEXMLNFLTALTDFTXENGATRVLPGSHLWEDXSXXXXXXDXAIPAXMNPGDAVLFXGKTLHGAGKNXXXDFLRRGFPLIMQSCQFTPVEASVAXPRXLVETMTPLAQKMVGWRXVSAKGVXIWTYDLKDLAXGXXLK
优选地，就本发明描述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasH活性优选地由至少一种多肽或编码至少一种多肽的至少一种多核苷酸的活性导致，所述多肽选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：8具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：8具有至少60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ IDNO:156具有至少90％、优选地至少95％序列同一性，甚至更优选地具有在如图8所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:95具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
d)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:95具有至少60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ IDNO:156具有至少90％、优选地至少95％序列同一性，甚至更优选地具有在如图8所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，
e)根据a)至d)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
就本发明描述的任一种重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasA还原酶活性优选地由至少一种多肽或至少一种多核苷酸的活性导致，其选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:148、149和150具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有酪氨酸，或
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:193、194和195具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且在SEQ ID NO:194的氨基酸位置18处具有酪氨酸，或
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2和/或31具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
d)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、31、32、33、34、35、36、37、38、39和/或40具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
e)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:103具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
f)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:130和/或138具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
g)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸可以通过使用两个PCR引物获得，其中每个引物包含选自SEQ ID NO:103、130和/或138所示序列或(序列表中的同源物)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，
h)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:103、130和/或138杂交，或
i)根据a)至h)中至少两者、优选地根据至少b)和c)的多肽，和
j)根据a)至i)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
编码具有EasA活性的多肽的多核苷酸原则上可以从本文中提到的任何天然麦角类生物碱生产者获得。在一个实施方案中，多核苷酸从天然麦角类生物碱生产者获得，所述天然生产者选自：
土曲霉、须芒草瘤座菌、Balansia cyperi、Balansia obtecta、Balansiapilulaeformis、非洲麦角菌、Claviceps fusiformis、Claviceps hirtella、Sphaceliaeriochloae、Sphacelia texensis、Sphacelia lovelessii、Neotyphodium sp.Lp1、Neotyphodium coenophialum、Neotyphodium lolii、桔青霉、普通青霉、顶青霉、皮落青霉、瘿青霉和徘徊青霉，
或选自：日本曲霉、黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、烟曲霉、麦角菌、Clavicepsfusiformis、雀稗麦角菌、Claviceps zizaniae、产黄青霉、桔青霉、顶青霉、瘿青霉、瓦克青霉、娄地青霉和Paecilomyces divaricatus，
或选自：日本曲霉、烟曲霉、麦角菌和Paecilomyces divaricatus，
或选自这些群组的任何组合。
优选地，至少一种具有EasA活性的多肽选自表7中列出的序列、或与这些序列具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
表7：具有EasA活性的示例性多肽的同一性％表
优选地，具有EasA活性的多肽包含下文描述的至少一个EasA标签序列。优选地它们包含至少两个EasA标签序列，并且甚至更优选地，它们包含全部三个EasA标签序列。
EasA标签序列和共有序列描述连续氨基酸序列，其中根据本领域使用的单字母氨基酸代码描述每个氨基酸。用“X”描述的氨基酸表示任何氨基酸，优选地，它表示这样的氨基酸，所述氨基酸是在表7及图9a至图9d所述序列的EasA序列比对中在至少一个氨基酸序列中位于相同位置的氨基酸。甚至更优选地，具有EasA活性的多肽包含在图9a、图9b和图9c中用黑色线标记的全部氨基酸序列，并且在图9b中用黑色箭头标记的氨基酸位置处包含苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)。
EasA标签序列1.1(SEQ ID NO：148)：
YXQRXXXXGTLLXXXAXXIXXXXXGXXXXPXXXXXXXXXXWXXXXXXVHXXXXXIXXQLXXXGR
EasA标签序列2.1(SEQ ID NO：149)：
AXXXXFDGXEXHXXANGXLXDQFXQXXXNXRXDXXGGXXXXRXRF
EasA标签序列3.1(SEQ ID NO：150)：
GRXXXSXPDLPF
EasA标签序列1.2(SEQ ID NO：193)：
YAQRASVPGTLLITEATXISPRAGGFPNVPGIWXEAQIAAWKXVVDAVHAKGS-FIFLQLWATGR
EasA标签序列2.2(SEQ ID NO：194)：
AVXAGXFDGVEIHGANGYLIDQFTQXSCNXRTDXWGGSIENRARF
EasA标签序列3.2(SEQ ID NO：195)：
GRHFISNPDLPF
优选地，就本发明描述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasA活性由至少一种多肽或编码至少一种多肽的至少一种多核苷酸的活性导致，所述多肽选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有酪氨酸，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并与SEQ ID NO:148、149和150具有至少95％、优选地具有100％序列同一性，并且在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有酪氨酸，
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:31具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有酪氨酸，
d)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:31具有至少60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并与SEQ ID NO:148、149和150具有至少95％、优选地具有100％序列同一性，并且在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有酪氨酸，和
e)根据a)至d)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
编码具有EasA还原酶活性的多肽的多核苷酸优选地从选自以下的天然麦角类生物碱生产生物获得：日本曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、Claviceps hirtella，非洲麦角菌、产黄青霉和Paecilomyces divaricatus。
就本发明描述的任一种重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasA异构酶活性优选地由至少一种多肽或至少一种多核苷酸的活性导致，其选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:148、149和150具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有苯丙氨酸，或
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:193、194和195具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且在SEQ ID NO:194的氨基酸位置18处具有苯丙氨酸，或
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2和/或31具有至少40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
d)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、31、32、33、34、35、36、37、38、39和/或40具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
e)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:103具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
f)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:130和/或138具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或
g)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸可以通过使用两个PCR引物获得，其中每个引物包含选自SEQ ID NO:103、130和/或138所示序列的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，或
h)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:103、130和/或138杂交，或
h)根据a)至h)中至少两者的多肽，和
j)根据a)至i)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
优选地，就本发明描述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasA活性由至少一种多肽或编码至少一种多肽的至少一种多核苷酸的活性导致，所述多肽选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有苯丙氨酸，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并与SEQ ID NO:148、149和150具有至少95％、优选地具有100％序列同一性，并且在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有苯丙氨酸，
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:31具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有苯丙氨酸，
d)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:31具有至少60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并与SEQ ID NO:148、149和150具有至少95％、优选地具有100％序列同一性，并且在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有苯丙氨酸，并且
e)根据a)至d)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
编码具有EasA异构酶活性的多肽的多核苷酸优选地从天然麦角类生物碱生产生物获得，所述天然生产生物选自：土曲霉、须芒草瘤座菌、Balansia cyperi、Balansiaobtecta、Balansia pilulaeformis、麦角菌、Claviceps hirtella、Clavicepsfusiformis、雀稗麦角菌、Claviceps zizaniae、Sphacelia eriochloae、Sphaceliatexensis、Sphacelia lovelessii、Neotyphodium sp.Lp1、Neotyphodium coenophialum、Neotyphodium lolii、桔青霉、顶青霉、瘿青霉和Periglandula ipomoeae，或选自：麦角菌、Claviceps fusiformis、Neotyphodium lolii和Periglandula ipomoeae。
就本发明描述的任一种重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasG活性优选地由至少一种多肽或至少一种多核苷酸的活性导致，其选自：
a)包含与SEQ ID NO:155和/或183具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性、优选地与SEQ ID NO:183具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7和/或86具有至少39％、40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7、86、87、88、89、90、91、92、93和/或94具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
d)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:108具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
e)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:135和/或143具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
f)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸可以通过使用两个PCR引物获得，其中每个引物包含选自SEQ ID NO:108、135和/或143所示序列的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，
g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:108、135和/或143杂交，
h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，和
i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
编码具有EasG活性的多肽的多核苷酸原则上可以从本文中提到的任何天然麦角类生物碱生产生物获得。在一个实施方案中，多核苷酸从天然麦角类生物碱生产者获得，所述天然生产者选自：
土曲霉、须芒草瘤座菌、Balansia cyperi、Balansia obtecta、Balansiapilulaeformis、非洲麦角菌、Claviceps fusiformis、Claviceps hirtella、Sphaceliaeriochloae、Sphacelia texensis、Sphacelia lovelessii、Neotyphodium sp.Lp1、Neotyphodium coenophialum、Neotyphodium lolii、桔青霉、普通青霉、顶青霉、皮落青霉、瘿青霉和徘徊青霉，
或选自：日本曲霉、黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、烟曲霉、麦角菌、Clavicepsfusiformis、雀稗麦角菌、Claviceps zizaniae、产黄青霉、桔青霉、顶青霉、瘿青霉、瓦克青霉、娄地青霉和Paecilomyces divaricatus，
或选自：羊茅香柱菌、Epichloe glyceriae，蝗绿僵菌、Metarhizium robertsii和疣状发癣菌，
或选自：日本曲霉、烟曲霉、麦角菌和Paecilomyces divaricatus，
或选自这些群组的任何组合。
优选地，至少一种具有EasG活性的多肽选自表8中列出的序列、或与这些序列具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
表8：具有EasG活性的示例性多肽的同一性％表
优选地，具有EasG活性的多肽包含EasG共有序列。EasG共有序列描述了连续氨基酸序列，其中根据本领域使用的单字母氨基酸代码描述每个氨基酸。用“X”描述的氨基酸表示任何氨基酸，优选地，它表示这样的氨基酸，所述氨基酸是在表8及图10a至图10b所述序列的EasG序列比对中在至少一个氨基酸序列中位于相同位置的氨基酸。
EasG共有序列(SEQ ID NO：155)：
XMTILLTGGRGKTASHIASLLXXAXXXVPFIVASRSSSXXXXSPYRXXXFDWLDEXTYG-NXLSXXDXXXXXGMXPISAVWLVXPPIXDLAPPMIKFIDFARSKGVKRFVLL-SASTIEKGGPAMGXIHAHLDSLXEGIXYXVLRPTWFMENFSXXXELQWIXIRXEN-KIYSATGDGKIPFISVXDIAR-VAFRALTDEXSXNTXDYVLLGPELLTYDDVXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAEILSTVLGR-KITHVKLTEAELAXKLXXEXGMPXDDAXMLASMDTXVKXGAEERLNXXXVKXVTGXXPRT-FLDFASXEKXXWL
优选地，就本发明描述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物或重组多核苷酸的EasG活性由至少一种多肽或编码至少一种多肽的至少一种多核苷酸的活性导致，所述多肽选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：7具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
b)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：7具有至少60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与SEQ IDNO：183具有至少90％、优选地至少95％序列同一性，甚至更优选地具有在如图10所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，
c)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：86具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，
d)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：86具有至少60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且与EQ ID NO：183具有至少90％、优选地至少95％序列同一性，甚至更优选地具有在如图10所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸，和
e)根据a)至d)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获得。
如上文所述，本文描述的全部重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物优选地包含扩大的细胞内部色氨酸和/或DMAPP供应量和/或扩大的细胞内部Me-DMAT供应量。为了提供扩大的细胞内部供应量，在大多数情况下需要对相应的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物的内源基因进行去调节。
在重组微生物选自酵母、优选地酵母属物种、甚至更优选地酿酒酵母的情况下，本发明的一个优选实施方案是，通过下调该重组微生物的内源多肽，下调ERG9活性(EC2.5.1.21)，其中所述内源多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
备选地或额外地，酵母、优选地酵母属物种、甚至更优选地酿酒酵母细胞的内部DMAPP供应量可以通过下调具有ERG20活性(EC2.5.1.1/2.5.1.10)的多肽而扩大，其中所述多肽尤其是包含与SEQ ID NO:10具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
另外，酵母、优选地酵母属物种、甚至更优选地酿酒酵母细胞的内部DMAPP供应量也可以通过上调该生物的甲羟戊酸途径的基因而扩大，例如通过调节HMG-CoA还原酶活性而扩大，其中所述HMG-CoA还原酶活性由包含与SEQ ID NO:11具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽引起。
扩大细胞中棒麦角素型生物碱前体的内部供应量的另一个方案是，限制Me-DMAT输出至培养基中。这可以通过上调细胞的甲羟戊酸途径内源多肽的活性实现。在重组微生物是酵母、优选地酵母属物种、甚至更优选地酿酒酵母细胞的情况下，这可以通过下调一种或多种包含下述氨基酸序列的多肽的活性实现，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:12,13,14,15或16具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
通过用本发明的多核苷酸，表达盒和/或载体转化没有能力产生麦角类生物碱的生物，本发明使得可以产生新的麦角类生物碱生产生物、尤其是能够产生棒麦角素型生物碱的新麦角类生物碱生产生物。
在许多情况下，还有利的是，通过基因的过量表达，支持重组表达的多肽的正确表达、折叠和稳定性，其中所述基因在相应的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物中支持这些功能。
可以支持这些功能的基因例如是Scldi1(SEQ ID No:158)、ScPdi1(SEQ ID No:166)和ScFad1(SEQ ID No:167)。
因此，又一个实施方案是重组微生物或或重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物表达如本文所述的用于产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I的多肽，除此之外，还包含至少一种含有与SEQ ID NO:158、166或167具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的上调活性；优选地具有至少一种包含与SEQ ID NO:166和167具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的上调活性。
在一个实施方案中，重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物是酵母，优选地酿酒酵母，具有上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性，如本文所述的用于生产环棒麦角素，和/或具有上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA和EasG活性，如本文所述的，用于生产狐茅麦角碱或田麦角碱的至少之一。优选地，该重组微生物或或重组天然麦角类生物碱生产生物还具有扩大的内部DMAPP供应量，如上文所述。
本发明的又一个实施方案是重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母具有上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性，如本文所述用于产生环棒麦角素，和/或具有上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA和EasG活性，如本文所述用于产生狐茅麦角碱或田麦角碱的至少之一，并且具有至少一种包含与SEQ ID NO:158、166和/或167具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的上调活性，优选地具有至少一种包含与SEQ ID NO:166和167具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的上调活性。
优选地，如本文所述用于产生环棒麦角素、狐茅麦角碱和/或田麦角碱的具有至少上调的EasE活性的酿酒酵母还具有至少一种多肽的上调活性，所述多肽包含与SEQ ID NO:187具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；优选地，包含与SEQ ID NO:187具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的所述多肽由具有下述核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:186具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
优选地，如上文所述，该重组酿酒酵母还具有扩大的内部DMAPP供应量，优选地通过以下方式扩大该内部供应量：下调包含与SEQ ID NO:9或10具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的内源多肽，或下调包含与SEQ ID NO:9具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的内源多肽、并且下调包含与SEQ ID NO:10具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的内源多肽。
因此，本发明的其他实施方案是重组微生物，所述重组微生物包含选自以下化合物群组的至少一种化合物
a)环棒麦角素，
b)狐茅麦角碱，
c)田麦角碱，
d)裸麦角碱醛，和
e)裸麦角碱I，
其中该重组微生物不是天然麦角类生物碱生产生物。
优选地，所述重组微生物是细菌、酵母、放线菌或丝状真菌，但不是天然麦角类生物碱生产生物。这类丝状真菌可以是子囊菌、半知菌或担子菌。
待作为本发明宿主细胞使用的优选细菌选自：大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)。
优选的重组微生物选自：
优选的酵母选自：克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)和毕赤酵母属(Pichia)。
更优选地是重组微生物选自：乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)和树干毕赤酵母(Pichia stipites)。
甚至更优选地，重组微生物是酿酒酵母。
这些生物的不同菌株是本领域技术人员可容易获得的，例如，在公共菌株保藏中心保藏。合适的酿酒酵母株例如是，但不限于，BY4742、cGY1585、Ethanol Red、CEN.PK111-61A、FY1679-06C、BMA64(W303)、SEY6210。
在重组微生物是细菌、尤其大肠杆菌的情况下，可能有利的是，过量表达甲羟戊酸途径基因。包含上调的甲羟戊酸途径基因的大肠杆菌是本领域已知的，并且例如在US7172886、US7192751、US7667017、US7622282、US7736882、US7622283、US791502和US8288147中描述。
包含环棒麦角素的重组微生物优选地包含提供DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性之每一种、更优选地提供DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含狐茅麦角碱的重组微生物优选地包含提供以下每种活性的至少一种多肽：DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶和EasG活性。
包含田麦角碱的重组微生物优选地包含提供以下每种活性的至少一种多肽：DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA异构酶和EasG活性。
包含裸麦角碱醛的重组微生物优选地包含提供以下每种活性的至少一种多肽：DmaW、EasF、EasE、EasC和EasD活性。
包含裸麦角碱I的重组微生物优选地包含提供以下每种活性的至少一种多肽：DmaW、EasF、EasE和EasC活性。
包含Me-DMAT的重组微生物优选地包含提供以下每种活性的至少一种多肽：DmaW和EasF活性。
包含Me-DMAT的重组微生物优选地包含提供DmaW活性的至少一种多肽。
还可以产生这样的重组微生物，所述重组微生物包含环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I或这些化合物中至少两者的组合，但是与从细胞内部色氨酸池和DMAPP池产生相应化合物或多种化合物所需的活性相比，具有较小的活性。该缺失的活性可以通过其他手段向重组微生物提供必需前体，例如通过向生长培养基提供前体而弥补。
因此，本发明的一个实施方案是包含环棒麦角素的重组微生物，其中所述重组微生物被供给DMAT并且所述重组微生物包含提供以下每种活性：EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性、更优选地提供以下每种活性：EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶和EasG活性，的至少一种多肽。
又一个实施方案是包含环棒麦角素的重组微生物，其中所述重组微生物被供给Me-DMAT并且所述重组微生物包含提供以下每种活性：EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性、更优选地提供以下每种活性：EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶和EasG活性，的至少一种多肽。
再一个实施方案是包含环棒麦角素的重组微生物，其中所述重组微生物被供给裸麦角碱I并且所述重组微生物包含提供以下每种活性：EasD、EasH、EasA和EasG活性、更优选地提供以下每种活性：EasD、EasH、EasA还原酶和EasG活性，的至少一种多肽。
其他实施方案是：
包含狐茅麦角碱的重组微生物，其中所述重组微生物被供给DMAT，并且所述重组微生物包含提供EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含狐茅麦角碱的重组微生物，其中所述重组微生物被供给Me-DMAT，并且所述重组微生物包含提供EasE、EasC、EasD、EasA还原酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含狐茅麦角碱的重组微生物，其中所述重组微生物被供给裸麦角碱I，并且所述重组微生物包含提供EasD、EasA还原酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含狐茅麦角碱的重组微生物，其中所述重组微生物被供给裸麦角碱醛，并且所述重组微生物包含提供EasA还原酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含田麦角碱的重组微生物，其中所述重组微生物被供给DMAT，并且所述重组微生物包含提供EasF、EasE、EasC、EasD、EasA异构酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含田麦角碱的重组微生物，其中所述重组微生物被供给Me-DMAT，并且所述重组微生物包含提供EasE、EasC、EasD、EasA异构酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含田麦角碱的重组微生物，其中所述重组微生物被供给裸麦角碱I，并且所述重组微生物包含提供EasD、EasA异构酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含田麦角碱的重组微生物，其中所述重组微生物被供给裸麦角碱醛，并且所述重组微生物包含提供EasA异构酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含裸麦角碱醛的重组微生物，其中所述重组微生物被供给DMAT，并且所述重组微生物包含提供EasF、EasE、EasC和EasD活性之每一种的至少一种多肽。
包含裸麦角碱醛的重组微生物，其中所述重组微生物被供给Me-DMAT，并且所述重组微生物包含提供EasE、EasC和EasD活性之每一种的至少一种多肽。
包含裸麦角碱醛的重组微生物，其中所述重组微生物被供给裸麦角碱I，并且所述重组微生物包含提供EasD活性的至少一种多肽。
包含裸麦角碱I的重组微生物，其中所述重组微生物被供给DMAT，并且所述重组微生物包含提供EasF、EasE和EasC活性之每一种的至少一种多肽。
包含裸麦角碱I的重组微生物，其中所述重组微生物被供给Me-DMAT，并且所述重组微生物包含提供EasE和EasC活性的至少一种多肽。
取决于细胞所包含的其他活性，环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I或这些化合物中至少两者的组合的含量可以低或高。
例如，包含田麦角碱、但也包含利用田麦角碱作为离析物以产生产物(例如野麦角碱或毛麦角碱)的活性、或包含促进田麦角碱输出到周围培养基的活性的重组微生物可能包含低含量的田麦角碱。
类似地，包含狐茅麦角碱、但也包含利用狐茅麦角碱作为离析物以产生产物(例如Fumiclavine B、A或C)或产生二氢麦角类生物碱的活性、或包含促进狐茅麦角碱输出到周围培养基的活性的重组微生物可能包含低含量的狐茅麦角碱。
包含裸麦角碱醛、但也包含利用裸麦角碱醛作为离析物以产生产物(例如狐茅麦角碱或田麦角碱)的活性、或包含促进裸麦角碱醛输出到周围培养基的活性的重组微生物可能包含低含量的裸麦角碱醛。
包含裸麦角碱I、但也包含利用裸麦角碱I作为离析物以产生产物(例如环棒麦角素、裸麦角碱醛或6,7-secolyergine)的活性、或包含促进裸麦角碱I输出到周围培养基的活性的重组微生物可能包含低含量的裸麦角碱I。
但是，在利用相应化合物作为离析物的活性或促进该化合物输出到周围培养基的活性被下调的情况下，重组微生物中该化合物的含量可以是高的。
本发明也使得可以产生重组天然麦角类生物碱生产生物，所述重组生物与其非重组形式相比具有增强的一种或多种麦角类生物碱生产。通过下调用于麦角类生物碱生产的内源基因，或通过引入本文公开的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性中的一种或多种，也可以改变天然麦角类生物碱生产者通常产生的麦角类生物碱的类型，尤其是改变天然麦角类生物碱生产者产生的棒麦角素型生物碱的产量。
优选地，与对照生物相比，所述增强的一种或多种麦角类生物碱生产是统计学显著的，其中所述对照生物缺乏本发明多核苷酸的表达，并且优选地是已用来构建该重组天然麦角类生物碱生产生物的相同物种且优选地相同株系的野生型生物，即非重组生物，当其用作对照生物时与该重组天然麦角类生物碱生产生物生长在相同的条件下。
可以通过本领域熟知的统计检验法(包括例如Student t-检验)，确定增加是否具有显著性。更优选地，增加是与所述对照生物相比相应麦角类生物碱的量增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％或至少30％。用于测量麦角类生物碱量的合适测定法在后续实施例中描述并且是本领域已知的。
因此，本发明的其他实施方案是包含选自环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I的至少一种化合物的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中该重组天然麦角类生物碱生产生物与自然界中不产生这种化合物的天然麦角类生物碱生产生物是相同物种。
除此之外，通过产生具有至少一种上调活性或至少一种下调活性或至少一种上调活性及至少一种下调活性的重组天然麦角类生物碱生产生物，本发明的多肽和多核苷酸也可以用来增强天然麦角类生物碱生产生物的环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I的生产，其中所述活性选自DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性。
因此，本发明的其他实施方案是重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物包含和/或产生至少一种选自以下的化合物：环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I，与相同条件下生长的非重组野生型生物相比，所述化合物的量更高或达到更高的量。
用于比较的相应野生型生物优选为已经用来产生该相应的重组天然麦角类生物碱生产生物的相同物种，并优选为相同株系。
包含环棒麦角素或产生环棒麦角素的重组天然麦角类生物碱生产生物，将包含至少一种上调的EasH活性，优选地包含至少一种上调的EasH活性和至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA和/或EasG活性，更优选地包含至少一种上调的EasH活性和至少一种DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶和/或EasG活性，并且甚至更优选地包含至少一种上调的EasH活性和至少一种上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶和/或EasG活性以及至少一种下调的EasA异构酶活性。.
包含狐茅麦角碱或产生狐茅麦角碱的重组天然麦角类生物碱生产生物，将包含至少一种上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶或EasG活性，优选地至少一种上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶或EasG活性和至少一种下调的EasA异构酶和/或EasH活性。
包含田麦角碱或产生田麦角碱的重组天然麦角类生物碱生产生物，将包含至少一种上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA异构酶和/或EasG活性，优选地至少一种上调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA异构酶和/或EasG活性和至少一种下调的EasA还原酶和/或EasH活性。
包含裸麦角碱醛或产生裸麦角碱醛的重组天然麦角类生物碱生产生物，将包含至少一种上调的DmaW、EasF、EasE、EasC和/或EasD活性或至少一种下调的EasA、EasG和/或EasH活性，优选地将包含至少一种上调的DmaW、EasF、EasE、EasC和/或EasD活性和至少一种下调的EasA、EasG和/或EasH活性。
包含裸麦角碱I或产生裸麦角碱I的重组天然麦角类生物碱生产生物，将包含至少一种上调的DmaW、EasF、EasE和/或EasC活性，或至少一种下调的EasD、EasA、EasG和/或EasH活性，或将包含至少一种上调的DmaW、EasF、EasE和/或EasC活性和至少一种下调的EasD、EasA、EasG和/或EasH活性。
也可以产生这样的重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物包含和/或产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I或这些化合物中至少两者的组合，但是与从细胞内部色氨酸池和DMAPP池产生相应化合物或多种化合物所需的活性相比，具有较小的活性。该缺失的活性可以通过借助其他手段向重组天然麦角类生物碱生产生物提供必需前体，例如通过向生长培养基提供前体，而弥补。
因此，本发明的一个实施方案是包含环棒麦角素的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给DMAT，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性之每一种、更优选地提供EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
又一个实施方案是包含环棒麦角素的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给Me-DMAT，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性之每一种、更优选地提供EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
再一个实施方案是包含环棒麦角素的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给裸麦角碱I，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasD、EasH、EasA和EasG活性之每一种、更优选地提供EasD、EasH、EasA还原酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
其他实施方案是：
包含狐茅麦角碱的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给DMAT，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasF、EasE、EasC、EasD、EasA还原酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含狐茅麦角碱的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给Me-DMAT，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasE、EasC、EasD、EasA还原酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含狐茅麦角碱的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给裸麦角碱I，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasD、EasA还原酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含狐茅麦角碱的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给裸麦角碱醛，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasA还原酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含田麦角碱的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给DMAT，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasF、EasE、EasC、EasD、EasA异构酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含田麦角碱的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给Me-DMAT，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasE、EasC、EasD、EasA异构酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含田麦角碱的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给裸麦角碱I，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasD、EasA异构酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含田麦角碱的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给裸麦角碱醛，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasA异构酶和EasG活性之每一种的至少一种多肽。
包含裸麦角碱醛的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给DMAT，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasF、EasE、EasC和EasD活性之每一种的至少一种多肽。
包含裸麦角碱醛的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给Me-DMAT，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasE、EasC和EasD活性之每一种的至少一种多肽。
包含裸麦角碱醛的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给裸麦角碱I，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasD活性的至少一种多肽。
包含裸麦角碱I的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给DMAT，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasF、EasE和EasC活性之每一种的至少一种多肽。
包含裸麦角碱I的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述重组天然麦角类生物碱生产生物被供给Me-DMAT，并且所述重组天然麦角类生物碱生产生物包含提供EasE和EasC活性的至少一种多肽。
优选地，重组天然麦角类生物碱生产生物选自：曲霉属，如日本曲霉、黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、烟曲霉、棘孢曲霉、浅蓝灰曲霉、亮白曲霉、肉色曲霉、棒曲霉、弯头曲霉、费氏曲霉、黄曲霉、灰绿曲霉、构巢曲霉、赭曲霉、寄生曲霉、青霉状曲霉、局限曲霉、酱油曲霉、溜曲霉、土曲霉、焦曲霉、杂色曲霉；
青霉属，如黄灰青霉、Penicillium bilaiae、沙门柏干酪青霉、Penicilliumcandidum、产黄青霉、棒形青霉、普通青霉、皮落青霉、指状青霉、扩展青霉、绳状青霉、平滑青霉、灰绿青霉、意大利青霉、Penicillium lacussarmientei、马尔尼菲青霉、产紫青霉、娄地青霉、匍枝青霉、Penicillium ulaiense、疣孢青霉、鲜绿青霉；
麦角菌属，如非洲麦角菌、Claviceps fusiformis、Claviceps hirtella，雀稗麦角菌、麦角菌、高粱麦角菌、Claviceps zizaniae；
拟青霉属，如Paecilomyces divaricatus。
甚至更优选地是重组天然麦角类生物碱生产生物选自：日本曲霉、黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、烟曲霉、产黄青霉、Paecilomyces divaricatus、娄地青霉。
本发明的又一个实施方案是包含和/或产生环棒麦角素的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中重组天然麦角类生物碱生产生物不属于物种日本曲霉或Paecilomycesdivaricatus，或属于物种烟曲霉或麦角菌。
本发明的又一个实施方案是包含和/或产生茅麦角碱的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中重组天然麦角类生物碱生产生物不属于物种日本曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、Claviceps hirtella，非洲麦角菌、产黄青霉和Paecilomyces divaricatus，
或属于物种：土曲霉、须芒草瘤座菌、Balansia cyperi、Balansia obtecta、Balansia pilulaeformis、麦角菌、Claviceps hirtella、Claviceps fusiformis、雀稗麦角菌、Claviceps zizaniae、Sphacelia eriochloae、Sphacelia texensis、Sphacelialovelessii、Neotyphodium sp.Lp1、Neotyphodium coenophialum、Neotyphodium lolii、桔青霉、顶青霉、瘿青霉或Periglandula ipomoeae，或属于物种：麦角菌、Clavicepsfusiformis、Neotyphodium lolii或Periglandula ipomoeae。
本发明的又一个实施方案是包含和/或产生田麦角碱的重组天然麦角类生物碱生产生物，其中该重组天然麦角类生物碱生产生物不属于物种：土曲霉、须芒草瘤座菌、Balansia cyperi、Balansia obtecta、Balansia pilulaeformis、麦角菌、Clavicepshirtella、Claviceps fusiformis、雀稗麦角菌、Claviceps zizaniae、Sphaceliaeriochloae、Sphacelia texensis、Sphacelia lovelessii、Neotyphodium sp.Lp1、Neotyphodium coenophialum、Neotyphodium lolii、桔青霉、顶青霉、瘿青霉和Periglandula ipomoeae，或：麦角菌、Claviceps fusiformis、Neotyphodium lolii和Periglandula ipomoeae，
或属于物种：日本曲霉、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、Claviceps hirtella，非洲麦角菌、产黄青霉和Paecilomyces divaricatus。
优选地，上文描述的任一种重组天然麦角类生物碱生产生物的上调或下调的DmaW、EasF、EasE、EasC、EasH、EasD、EasA或EasG活性中至少之一由至少一种多肽或编码至少一种多肽的至少一种多核苷酸提供，所述多肽选自：
a)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、20、31、41、53、64、75、86和/或95具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；
d)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:102、122或123、129、130、131、132、133、134、135和/或136具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或
e)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸可以通过使用两个PCR引物获得，其中每个引物包含选自SEQ ID NO:102、122、123、129、130、131、132、133、134、135和/或136所示序列的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸；或
f)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:102、122或123、123、129、130、131、132、133、134、135和/或136杂交，或
g)根据a)至f)中至少之一的多肽，所述多肽可从日本曲霉或Paecilomycesdivaricatus获得。
表9至表14列出了重组多核苷酸的组合的示例非限制性例子，所述重组多核苷酸编码具有所列DmaW、EasF、EasE、EasC、EasA、EasG、EasD或EasH活性的多肽，所述多肽与表中所述来源生物所包含的具备相应DmaW、EasF、EasE、EasC、EasA、EasG、EasD或EasH活性的多肽序列具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。表中，每个X表示重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物包含的重组多核苷酸的一个拷贝。
本领域技术人员能够设计与表9至14中列出的实施方案相似的其他实施方案。
尤其优选的实施方案是酵母，优选酿酒酵母、以及它们作为重组微生物用于生产环棒麦角素的用途，其中所述酵母，优选地酿酒酵母，包含
a)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasH活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:8和/或95具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:8和/或95具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:156具有至少90％、优选地至少95％序列同一性的氨基酸序列，甚至更优选地包含与SEQ ID NO:8和/或95具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图8所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列；
b)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasA还原酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:2、31、32、33、34、35、36、37、38、39和/或40具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:2、31、32、33、34、35、36、37、38、39和/或40具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性、并与SEQ ID NO:148、149和150具有至少95％、优选地具有100％序列同一性、并在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有酪氨酸的氨基酸序列；
c)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasG活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:7、86、87、88、89、90、181、92、93和/或94具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:7、86、87、88、89、90、181、92、93和/或94具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性、并且与SEQ ID NO:183具有至少90％、优选地至少95％序列同一性的氨基酸序列，更优选地包含与SEQ ID NO:7、86、87、88、89、90、181、92、93和/或94具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图10所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列；
d)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasD活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:4、53、54、55、56、57、58、59、60、62和/或63具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:4、53、54、55、56、57、58、59、60、62和/或63具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:152具有至少80％、优选地至少81％序列同一性的氨基酸序列，更优选地与SEQID NO:4、53、54、55、56、57、58、59、60、62和/或63具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图7所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列，
e)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasC活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:3或41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和/或52具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:3或41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和/或52具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:192具有至少85％、优选地至少87％序列同一性的氨基酸序列，更优选地包含与SEQ ID NO:3或41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和/或52具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图6所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列；
f)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasE活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:5、64、175、66、67、68、69、176、71、177、73和/或178具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:5、64、175、66、67、68、69、176、71、177、73和/或178具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:191具有至少70％、优选地至少73％序列同一性的氨基酸序列，更优选地包含与SEQ ID NO:5、64、175、66、67、68、69、176、71、177、73和/或178具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图5所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列；
g)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasF活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:6、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84和/或85具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:6、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84和/或85具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:154具有至少75％、优选地至少79％序列同一性的氨基酸序列，更优选地包含与SEQ ID NO:6、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84和/或85具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图4所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列；
h)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有DmaW活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1、19、20、21、22、23、24、25、26、27和/或28具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:1、19、20、21、22、23、24、25、26、27和/或28具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:190具有至少85％、优选地至少89％序列同一性的氨基酸序列，更优选地包含与SEQ ID NO:1、19、20、21、22、23、24、25、26、27和/或28具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图3所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列。
优选地，提供EasE活性的多肽具有可以在酵母中作为去往内质网的分选信号发挥作用的N末端序列。在重组微生物是酿酒酵母的情况下，提供EasE活性的多肽优选包含可以在酿酒酵母中作为去往内质网的分选信号发挥作用的N末端序列。
优选地，编码提供DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶和/或EasG活性的多肽的多核苷酸具有可以从天然麦角类生物碱生产生物获得的多核苷酸序列。
这些酵母的优选变体是表12中描述的实施方案。
这些酵母的其他变体可以用来产生田麦角碱、狐茅麦角碱。这些酵母将优选地不包含这样的表达盒，所述表达盒包含编码具有EasH活性的多肽的多核苷酸。
这些酵母的优选变体是表13和表14中描述的实施方案。
这些酵母的其他变体可以用来产生裸麦角碱I，但是将不包含这样的表达盒，所述表达盒包含编码具有EasH、EasA、EasG或EasD活性的多肽的多核苷酸。
这些酵母的其他变体将包含这样的表达盒，所述表达盒包含编码具有EasH、EasA、EasG和EasD活性的多肽的多核苷酸；但将不包含这样的表达盒，所述表达盒包含编码具有DmaW、EasF、EasE或EasC活性的多肽的多核苷酸。对这些酵母提供裸麦角碱I时，这些酵母可以用来生产环棒麦角素。
这些酵母的其他变体将包含这样的表达盒，所述表达盒包含编码具有EasA、EasG和EasD活性的多肽的多核苷酸；但将不包含这样的表达盒，所述表达盒包含编码具有DmaW、EasF、EasE、EasC或EasH活性的多肽的多核苷酸。对这些酵母提供裸麦角碱I时，这些酵母可以用来产生狐茅麦角碱或田麦角碱。
尤其优选的实施方案是酵母，优选地酿酒酵母、以及它们作为重组微生物用于产生环棒麦角素的用途，其中所述酵母、优选地酿酒酵母，包含
a)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasH活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:8和/或95具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:8和/或95具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:156具有至少90％、优选地至少95％序列同一性的氨基酸序列，甚至更优选地包含与SEQ ID NO:8和/或95具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图8所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列；
b)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasA还原酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:2、31、32、33、34、35、36、37、38、39和/或40具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:2、31、32、33、34、35、36、37、38、39和/或40具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性、并与SEQ ID NO:148、149和150具有至少95％、优选地具有100％序列同一性、并在SEQ ID NO:149的氨基酸位置18处具有酪氨酸的氨基酸序列；
c)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasG活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:7、86、87、88、89、90、181、92、93和/或94具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:7、86、87、88、89、90、181、92、93和/或94具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性、并且与SEQ ID NO:183具有至少90％、优选地至少95％序列同一性的氨基酸序列，更优选地包含与SEQ ID NO:7、86、87、88、89、90、181、92、93和/或94具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图10所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列；
d)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasD活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:4、53、54、55、56、57、58、59、60、62和/或63具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:4、53、54、55、56、57、58、59、60、62和/或63具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:152具有至少80％、优选地至少81％序列同一性的氨基酸序列，更优选地与SEQID NO:4、53、54、55、56、57、58、59、60、62和/或63具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图7所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列，
e)至少两个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasC活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:3或41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和/或52具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:3或41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和/或52具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:192具有至少85％、优选地至少87％序列同一性的氨基酸序列，更优选地包含与SEQ ID NO:3或41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和/或52具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图6所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列；
f)至少两个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasE活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:5、64、175、66、67、68、69、176、71、177、73和/或178具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:5、64、175、66、67、68、69、176、71、177、73和/或178具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:191具有至少70％、优选地至少73％序列同一性的氨基酸序列，更优选地包含与SEQ ID NO:5、64、175、66、67、68、69、176、71、177、73和/或178具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图5所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列；
g)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasF活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:6、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84和/或85具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:6、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84和/或85具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:154具有至少75％、优选地至少79％序列同一性的氨基酸序列，更优选地包含与SEQ ID NO:6、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84和/或85具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图4所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列；
h)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有DmaW活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1、19、20、21、22、23、24、25、26、27和/或28具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:1、19、20、21、22、23、24、25、26、27和/或28具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:190具有至少85％、优选地至少89％序列同一性的氨基酸序列，更优选地包含与SEQ ID NO:1、19、20、21、22、23、24、25、26、27和/或28具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图3所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列。
优选地，这些酵母包含
a)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有DmaW活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:28具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:28具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:190具有至少85％、优选地至少89％序列同一性的氨基酸序列，更优选地包含与SEQ ID NO:28具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图3所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列，和/或
b)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasF活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:76具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO:76具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且与SEQ ID NO:154具有至少75％、优选地至少79％序列同一性的氨基酸序列，更优选地包含与SEQ ID NO:76具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且具有在如图4所示的比对结果中100％保守的全部氨基酸的氨基酸序列。
这些酵母的其他变体可以用来产生田麦角碱、狐茅麦角碱。这些酵母将优选地不包含这样的表达盒，所述表达盒包含编码具有EasH活性的多肽的多核苷酸。
这些酵母的其他变体可以用来产生裸麦角碱I，但是将不包含这样的表达盒，所述表达盒包含编码具有EasH、EasA、EasG或EasD活性的多肽的多核苷酸。
可以通过本领域使用的标准转化和/或突变方案，产生本文中公开的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物。用于每种相应物种的最有效方法可以容易地从文献中获得，例如，Turgeon(2010)Molecular and cell biology methods for fungi,第3-9页；Koushki,MM等人,(2011),AFRICAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY第10卷(41):第7939-7948页；Coyle等人(2010)Appl Environ Microbiol 76:3898–3903；Current Protocols inMolecular Biology,第13章.Ausubel F.M.等人编著,Wiley & Sons,U.K.；和GenomeAnalysis:A Laboratory Manual,Cloning Systems.第3卷.编者Birren B,Green ED,Klapholz S,Myers RM,Riethman H,Roskams J.New York:Cold Spring HarborLaboratory Press；1999:297-565。
这些方法涉及编码多肽的重组多核苷酸，其中所述多肽包含DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA或EasG活性中的至少之一。这些多核苷酸可以靶向整合于目的微生物的已经存在的表达盒中，或可以包含于能够在相应微生物中转录和翻译所述多核苷酸的重组表达盒中。表达盒包含与多核苷酸有效连接的启动子和终止子，其中所述多核苷酸编码提供DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA和EasG活性的多肽中的至少之一。编码至少一种所述多肽的多核苷酸优选适应于相应微生物的密码子选择。启动子，终止子和关于合适用于特定微生物的密码子选择的信息是本领域技术人员已知的。
除实施例中列出的启动子之外，用于酵母的合适组成型启动子，尤其对酿酒酵母而言，例如是trpC、gpdA、tub2和Tef1启动子。
用于酵母、尤其用于酿酒酵母的合适诱导型启动子例如是Gal1、Gal10、Cup1、Pho5和Met25启动子。
其他启动子和终止子、以及克隆策略例如在Shao等人,(2009)Nucleic AcidsResearch,第37卷,第2期e16(10页)中描述。
上文描述的表达盒可以包含在或可以不包含在较大的多核苷酸中，所述较大多核苷酸可以用于转化，或可以通过在一个基因组座位中或其附近定向整合几个构建体而产生。这些较大的多核苷酸可以包含提供相同活性的一个或多个多肽的表达盒，或可以包含提供不同活性的一个或多个多肽的表达盒，或可以包含提供相同活性的一个或多个多肽的表达盒并且包含提供不同活性的一个或多个多肽的表达盒。备选地，或除上文描述的方法和多核苷酸之外额外地，可以转化重组微生物几次，或可以用几种不同的多核苷酸同时转化重组微生物，由此所述重组微生物在其基因组的两个或更多个基因座处包含所述表达盒。
因此，本发明的其他实施方案是编码如上文任一个实施方案中所述的多肽的重组多核苷酸、和用于表达编码如上文任一个实施方案中所述的多肽的多核苷酸的表达盒、和包含至少一个所述多核苷酸或表达盒的载体，包括表达载体和转化载体。
如上文任一个实施方案中所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物可以用于生产环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛、裸麦角碱I和裸麦角碱中至少一者，这也涵盖在本发明中。因此，其他实施方案包括用于生产环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者的方法，所述方法包括：
a)培养如上文任一个实施方案中所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述培养在允许该重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物中产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I中至少一者的条件下进行；和
b)从所述重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物和/或培养基，获得环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I中至少一者。
本发明的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物可以按表面培养、深层培养、固态培养、腐生营养培养、摇瓶培养、或符合预期目的的任何其他方式培养。优选地，重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物以深层培养法培养。
重组微生物和重组天然麦角类生物碱生产生物的生长条件和生长培养基是本领域技术人员已知的，例如可以使用用来培养非重组微生物和天然麦角类生物碱生产生物的条件。这类方案和方法例如在以下文献中公开：Bacon CW(1985)Mycologia第77卷:418–423；Schulz B等人,(1993)Mycol Res 97:1447–1450；Banks等人,(1974)Journal ofGeneral Microbiology第82卷:p345-361；Flieger,M.等人,(1997)Folia Microbiologica第42卷:第3-30页；outová,S.等人,(1981)Journal of Natural Products第44卷:第225-235页。
诱导或增强天然麦角类生物碱生产生物产生麦角类生物碱的培养方法和方法已经例如在以下文献中公开：
Keller,U.和Tudzynski,P.(2002)，Osiewacz,H.D.(编著),The Mycota,第X卷，“Industrial Applications”.Springer,Berlin,第157–181页；Haarmann,T.等人,(2005),Phytochemistry第66卷,第1312–1320页；或者Furuta,T等人(1982)Agricultural andBiological Chemistry,第46卷(7):第1921-1922页；Tudzynski P.等人,(2001)AppliedMicrobiology and Biotechnology,第57卷(5-6)第593-605页；Kantorova,M.等人,(2002)Journal of Natural Products,第65卷(7):第1039-1040页；Kozlovsky,A.G.(2010)Applied Biochemistry and Microbiology,第46卷(5):第525-529页；Kozlovsky,A.G.(1999)Applied Biochemistry and Microbiology第35卷(5):第477-485页；Narayan V.和Rao K.K.,(1982)Biotechnology Letters第4卷(3):第193-196页；Rehacek,Z.等人,(1970)Folia Microbiologica第15卷(3):第210-213页；Narayan V.和Rao K.K.,(1982)Biotechnology Letters第4卷(3):第193-196页；Rehacek,Z.等人,(1971)FoliaMicrobiologica第15卷(3):第35-40页；Janardhanan K.和Husain A.(1990)IndianJournal of Experimental Biology,第28卷(11):第1054-1057页；Hernandesz M.等人,(1992)Letters in Applied Microbiology第15卷(4):第156-159页；Hernandesz M.等人,(1993)Process Biochemistry第28卷(1):第23-27页；Sarkisova M.等人(1991)Antibiotiki I Khimioperapiya第36卷(12):第8-10页；Samdani G等人,(1998)AsianJournal of Chemistry第10卷(2):第373-374页。
例如，可以通过向生长培养基添加色氨酸作为前体和诱导物，改善麦角菌的麦角类生物碱生产，其中所述生长培养基优选具有高渗透值和低磷酸盐水平。
另外，可以通过添加麦角类生物碱前体，改善在感染的黑麦雌穗上培养的麦角菌、Claviceps fusiformis或雀稗麦角菌的麦角类生物碱生产。
可以在HulvováH等人,"Parasitic fungus Claviceps as a source forbiotechnological production of ergot alkaloids"Biotechnology Advances 31(2013)79–89中找到关于如何使用麦角菌产生麦角类生物碱的其他指导。
可以例如利用葡萄糖、蔗糖、蜜、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、动物或植物油等作为培养基碳源，培养重组微生物和重组天然麦角类生物碱生产生物。另外，大豆粉、小麦胚、玉米浆、棉籽废弃物、肉浸汁、聚胨、麦芽提取物、酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠、尿素等可以用作氮源。添加可以产生钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸(磷酸氢二钾等)、硫酸(硫酸镁等)和所需的其他离子的无机盐也是有效的。另外，按需要，也可以添加各种维生素，如硫胺素(盐酸硫胺素等)、氨基酸如谷氨酰胺(谷氨酸钠等)、天冬酰胺(DL-天冬酰胺等)、痕量养分如核苷酸等、和选择用药物如抗生素等。另外，有机物质和无机物质可以适当地添以辅助生物的生长和促进麦角类生物碱产生，尤其是环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I的产生。培养基的pH为例如大约pH 5.5至pH 8。可以用方法如有氧条件下固态培养法、震荡培养法、通气搅拌培养法或深层有氧培养法实施培养，但是深层有氧培养法最合适。培养的适宜温度是10℃至40℃，但是在许多情况下生长在22℃至30℃范围内发生。环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I的产量根据培养基和培养条件、或所用宿主而不同，但是采用任何培养方法，环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I产量的积累通常在2日至10日内达到最大，但是可能持续显著更长的时间，例如15、20、25、30、40、50日或甚至更长时间。当培养物中环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I的生产量达到其最高水平时停止培养，将目标材料从培养物分离并且提炼以从培养材料分离产生的环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I。用于分离环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I产物的目标材料可以是任何有用材料，例如生物本身——其可以是完整生物或仅是该生物产生的孢子或该生物的任何其他部分、或用来培养该生物的培养基。可以适应性调整培养条件，以提高环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I的产量，例如向重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物提供环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I的一种或多种前体，该前体优选地选自IPP、色氨酸、DMAPP、DMAT、Me-DMAT和裸麦角碱I。
因此，本发明的又一个实施方案是用于产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I中至少一者的方法，所述方法包括：
a)培养如上文任一个实施方案中所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物，所述培养在允许该重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物中产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I中至少一者的条件下进行；
b)通过培养基，向所述重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物提供选自IPP、色氨酸、DMAP、DMAT、Me-DMAT或裸麦角碱I的至少一种化合物，和
c)从所述重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物和/或培养基，获得环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I中至少一者。
上文描述的方法优选地用来获得至少一种选自环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I的化合物。优选地，这些方法用来获得环棒麦角素。
但是，也可以省略获得狐茅麦角碱，田麦角碱，裸麦角碱醛，裸麦角碱I的方法步骤，尤其是在重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物包含其他基因时，其中所述其他基因利用狐茅麦角碱，田麦角碱，裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者作为离析物以产生其他麦角类生物碱(如焦棒麦角碱、fumiclavine A或C或麦角胺)。此时，从生物或培养基获得这些化合物可能是有利的。例如，在重组天然麦角类生物碱生产生物是烟曲霉的情况下，可以产生和获得麦角类生物碱如烟曲麦角碱B、烟曲麦角碱A或烟曲麦角碱。而且，在重组天然麦角类生物碱生产生物是麦角菌属物种，优选地麦角菌、雀稗麦角菌或非洲麦角菌的情况下，可以产生和获得选自野麦角碱、雀稗草酸(paspalic acid)、麦角酸、ergopeptam和麦角肽碱的一种或多种化合物。相同原则适用于其他重组天然麦角类生物碱生产生物，其中所述生物产生一种或多种麦角类生物碱并利用狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I至少一者作为产生这些生物碱的前体。优选地，所述天然麦角类生物碱生产者，与用来产生该相应天然麦角类生物碱生产生物的相同物种和株系相比，将以更高数量、以更高速率产生这些其他麦角类生物碱中的至少一者。更高速率或更高数量意指，与用来产生该相应天然麦角类生物碱生产生物的相同物种和菌株相比，当都培养在相同条件下时，多或快至少5％、10％、15％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或至少100％。
培养条件可以根据所用的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物变动。实施例中提供用于酵母、尤其酿酒酵母的合适生长条件。但是，可以进一步适应性修改这些生长条件。例如，可以针对生物的慢速或快速生长，适应性修改生长温度。因此，本发明包括用于产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I中至少一者的方法，其中将重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物在10℃至40℃之间、优选地在15℃至35℃之间，更优选地在18℃至32℃之间，甚至更优选地在20℃至30℃之间的温度培养，或其将重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物在10℃和32℃之间、在13℃和32℃之间、在15℃和32℃之间、在16℃和32℃之间、在17℃和32℃之间、在18℃和32℃之间、在19℃和32℃在之间，在20℃和32℃之间、在15℃和31℃之间、在15℃和30℃之间、在15℃和29℃之间、在15℃和28℃之间、在15℃和27℃之间、在15℃和26℃之间、在15℃和25℃之间的温度培养，或其中将重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物首先在25℃和40之间、优选地在25℃和35℃的温度培养，随后在10℃和25℃之间、优选地在15℃和25℃之间的温度培养，或其中将重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物首先在10℃和25℃之间、优选地在15℃和25℃之间的温度培养，随后在25℃和40℃之间、优选地在25℃和35℃之间的温度培养。
通常，生长条件根据相应重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物的偏好选择，然而偏离该偏好也可能是有利的。例如，可能有利的是，在15℃和25℃之间的温度、优选地在20℃培养酿酒酵母以产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I。
在一些实施方案中，选择相应的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物，例如酿酒酵母，的生长条件以减缓生长。这可以例如通过向生长培养基添加甘油、三甲胺N-氧化物(TMAO)或脯氨酸，例如，浓度2.5％、5％或10％的甘油、浓度250mM或500mM的TMAO、或浓度200mM的脯氨酸实现。
又一个优选的实施方案使用可以用来产生高细胞密度和/或延长发酵的补料分批培养条件。
通过如本文所述的方法产生的环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I优选地通过提取获得，但是原则上还可以通过其他方法获得。
在一个实施方案中，通过用选自以下的化合物提取实施提取：乙酸乙酯(EA)、叔丁基甲基醚(TBME)、氯仿(CHCl3)和二氯甲烷(DCM)。
优选地，提取方法包括在pH＝10采用乙酸乙酯的液体/液体提取法，和更优选地用NaOH调节pH的、在pH＝10采用乙酸乙酯的液体/液体提取法。
然而，还可以通过下述提取方法获得环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I，所述提取方法包括用基于二氧化硅的树脂材料采用固相提取法提取，所述树脂材料优选地选自：HLB树脂，优选地在pH＝3、Diaion树脂在pH＝3、Amberlite1180树脂，优选地在pH＝3、Amberlite 1180树脂，优选地在pH＝10、Amberlite 16N树脂，优选地在pH＝3、或Amberlite 16N树脂，优选地在pH＝10。
合适获得环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I或其他棒麦角素型生物碱或其他麦角类生物碱的方法是本领域技术人员已知的。例如，一种获得环棒麦角素的方法在Furuta等人,(1982),Agricultural and Biological Chemistry第46卷(7):第1921-1922页或在Stauffacher D.等人(1969)Tetrahedron第25卷:第5879-5887页中公开。
分析麦角类生物碱的方法例如在Flieger,M.等人,(1997)Folia Microbiolgica,第42卷(1)第3-29页及在Halada,P.等人,(1998)Chemicke Listy第92卷(7)第538-547页中描述。
本发明包括如上文任一个实施方案中所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物、重组多核苷酸、载体的用途，用于产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I中至少一者或用于上文描述的任一种方法中。
本发明的其他实施方案包括：通过上文描述的任一种方法产生的环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I，以及包含至少一种选自环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I的化合物并且通过培养本发明的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物而产生的培养基。
优选地，培养基包含环棒麦角素，但是不含或以相对低含量包含狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I中至少一者。同等优选地，培养基包含狐茅麦角碱，但是不含或以相对低含量包含环棒麦角素、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I中至少一者。同等优选地，培养基包含田麦角碱，但是不含或以相对低含量包含环棒麦角素、狐茅麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I中至少一者。还同等优选地，培养基包含裸麦角碱醛，但是不含或以相对低含量包含环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱和裸麦角碱I中至少一者。还同等优选地，培养基包含裸麦角碱I，但是不含或以相对低含量包含环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱和裸麦角碱醛中至少一者。
相对低含量意指，与通过培养所讨论的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物的相应对照生物而已经产生的培养基中的含量相比，相应化合物的含量低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或100％。
本发明还包括可以用来产生如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物的、从Paecilomyces divaricatus分离的多核苷酸及其序列变体。
因此，本发明的一个实施方案是多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的一个或多个核酸序列：
a)核酸序列，其具有如SEQ ID NO:129、130、131、132、133、134、135或136中所显示的核苷酸序列；
b)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有如SEQ ID NO:20、31、41、53、64、75、86、95或180中所显示的氨基酸序列；
c)与如SEQ ID NO:129、130、131、132、133、134、135或136中所显示的核酸序列至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶或EasG活性的多肽；
d)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶或EasG活性，并且具有与如SEQ ID NOs:20、31、41、53、64、75、86、95或180中所显示的氨基酸序列至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
e)能够在严格条件下与a)至d)的任一个序列杂交的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶或EasG活性的多肽。
本发明的其他实施方案包括可以用来产生如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物的多肽及其序列变体。
因此，本发明的一个实施方案是多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的一个或多个核酸序列：
a)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有如SEQ ID NO:175、176、177或178中所显示的氨基酸序列；
b)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有EasE活性并且具有与如SEQ ID NO:175、176、177或178中所显示的氨基酸序列至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
c)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有如SEQ ID NO:181中所显示的氨基酸序列；
d)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有DmaW活性并且具有与如SEQ ID NO:181中所显示的氨基酸序列至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
从Paecilomyces divaricatus分离的这些多核苷酸及其序列变体、以及编码具有EasE或DmaW活性并且具有与如SEQ ID NO:175、176、177、178或181中所显示的氨基酸序列至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的氨基酸序列的多肽的核酸序列，可以与在本文所述的任一个实施方案中描述的任一个多核苷酸组合、优选地与编码具有DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶或EasG活性的多肽的多核苷酸组合。
多核苷酸还可以与启动子和终止子序列有效连接，以产生用于转录和翻译所编码多肽的表达盒。另外，可以将这些多核苷酸和表达盒引入转化载体和或表达载体中，并例如用来产生本发明的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物，或用来产生具有DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶或EasG活性的编码多肽以进一步纯化，例如目的在于产生识别这些多肽的抗体或产生该多肽的蛋白质晶体，或将这些多肽用于体外试验和生产方法。因此，本发明涵盖包含此类多核苷酸的原核和真核宿主细胞。优选地，宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞或酵母细胞。
本发明的又一个实施方案是一种用于产生多肽的方法，所述方法包括：a)培养包含用于编码多肽的核酸序列的表达盒的宿主细胞，其中所述多肽具有DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶或EasG活性并且具有与如SEQ ID NO:20、31、41、53、64、75、86或95中所显示的氨基酸序列至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，或培养Paecilomyces divaricatus细胞，其中所述培养在允许所述多肽产生的条件下进行；和b)从步骤a)的宿主细胞或Paecilomyces divaricatus细胞获得多肽。
本发明还涵盖用于产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I或这些化合物的组合的方法，所述方法包括：a)在允许产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I的条件下培养Paecilomyces divaricatus细胞；和b)从Paecilomyces divaricatus细胞和/或培养基获得环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者。
本发明的其他部分包括多核苷酸的用途，所述多核苷酸包含选自以下的一个或多个核酸序列：
a)核酸序列，其具有如SEQ ID NO:129、130、131、132、133、134、135或136中所显示的核苷酸序列；
b)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有如SEQ ID NO:20、31、41、53、64、75、86或95中所显示的氨基酸序列；
c)与如SEQ ID NO:129、130、131、132、133、134、135或136中所显示的核酸序列至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶或EasG活性的多肽；
d)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶或EasG活性并且具有与如SEQ ID NOs:20、31、41、53、64、75、86或95中所显示的氨基酸序列至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
e)能够在严格条件下与a)至d)的任一个序列杂交的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶或EasG活性的多肽，
或包含这些多核苷酸的载体或宿主细胞或Paecilomyces divaricatus细胞的用途，用于产生至少一种选自环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I的化合物，或用于生产以至少一种选自环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I的化合物作为前体产生的至少一种麦角类生物碱。
本发明的其他部分包括多核苷酸的用途，所述多核苷酸包含选自以下的一个或多个核酸序列：
a)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有如SEQ ID NO:175、176、177或178中所显示的氨基酸序列；
b)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有EasE活性并且具有与如SEQ ID NO:175、176、177或178中所显示的氨基酸序列至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
c)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有如SEQ ID NO:181中所显示的氨基酸序列；
d)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有DmaW活性并且具有与如SEQ ID NO:181中所显示的氨基酸序列至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
或包含这些多核苷酸的载体、或重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物，优选地日本曲霉、烟曲霉、Paecilomyces divaricatus、麦角菌、雀稗麦角菌、非洲麦角菌或酵母细胞的用途，用于产生至少一种选自环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I的化合物，或用于生产以至少一种选自环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和裸麦角碱I的化合物作为前体产生的至少一种麦角类生物碱。
本发明的又一个实施方案涉及表达选自以下的至少一种多肽的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物：
a)具有如SEQ ID NO:175、176、177或178中所显示的氨基酸序列的多肽；
b)具有EasE活性并且具有与如SEQ ID NO:175、176、177或178中所显示的氨基酸序列至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽；
c)具有如SEQ ID NO:181中所显示的氨基酸序列的多肽，和
d)具有DmaW活性并且具有与如SEQ ID NO:181中所显示的氨基酸序列至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
优选地，表达所述多肽的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物是日本曲霉、烟曲霉、Paecilomyces divaricatus、麦角菌、雀稗麦角菌、非洲麦角菌或酵母细胞。
实施例：
实施例1：在面包酵母(酿酒酵母)中产生环棒麦角素
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK 111-61A(MATαMAL2-8C SUC2his3Δ1leu2-3_112ura3-52)
表15中列出实施例1中使用的基因：
表15：本实验中使用的基因清单
基因名 Seq.ID 序列来源
Aj_DmaW_altC 102 日本曲霉
Af_EasF 107 烟曲霉
Aj_EasE 106 日本曲霉
Aj_EasC 104 日本曲霉
Aj_EasD 105 日本曲霉
Aj_EasH 109 日本曲霉
Aj_EasA 103 日本曲霉
Aj_EasG 108 日本曲霉
基因的克隆：
产生经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(SEQ ID NO:102-108)外加翻译终止密码子。在合成期间全部基因在5′端配有包含HindIII限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将基因克隆至酵母表达盒(SEQ ID NO:110和111)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母启动子和终止子。全部盒在侧翼具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(SEQ ID NO:110和111)被包含在基于pUC18的质粒载体(SEQ ID NO:112)上，其中所述质粒载体中已经插入了接头(SEQID NO:113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。
基因表达盒用于将一个或两个表达盒亚克隆至指定的整合载体(SEQ ID NO:114-118)中，所述整合载体还含有酵母选择标记基因。在两个表达盒的情况下，克隆方向是头对头，意指启动子将允许以相反方向转录。标记和表达盒的旁侧为与宿主基因组DNA具有同源性的序列(SEQ ID NO：114-118)。通过用Not I和Sbf I限制性酶消化整合载体，从基于pUC18的主链，释放旁侧有同源序列的包含表达盒和选择标记的完整整合构建体，并且用于转化酵母。使用标准乙酸锂转化方案(Current Protocols；第13章)。通过PCR验证正确整合，并且在用表达Cre重组酶的质粒转化细胞后，以lox方式剔除(切除)选择标记，如通过Sauer，1987所描述。用于整合的靶位点由Flagfeldt，2009描述。表16a和表16mmb中列出整合载体及其整合构建体的SEQ ID NO。
表16a：具有整合构建体和基因组靶位点的整合载体
表16b：具有整合构建体和基因组靶位点的整合载体
构建体名 SEQ ID NO：
标记 目标区
pEVE2294 114 KanMX YORWΔ17
pEVE2312 115 HygR YPRCΔ15
pEVE2342 116 BIeR YORWΔ22
pEVE2343 117 BIeR YORWΔ22
pEVE2344 118 NatR YPRCT3
途径组装：
通过将完整环棒麦角素途径或缺少基因EasH的途径整合至EYS1456中，制备两个酵母株。通过整合来自pEVE2294、pEVE2312、pEVE2343和pEVE2344的构建体(表16a和16b)制备EYS1849，而通过整合来自pEVE2294、pEVE2312、pEVE2342和pEVE2344的构建体(表16a和16b)制备EYS1851。所得到的菌株因此含有以下基因的表达盒：
EYS1849：AjDmaW_altC、AfEasF、AjEasE、AjEasC、AjEasD、AjEasA、AjEasG和AjEasHEYS1851：AjDmaW_altC、AfEasF、AjEasE、AjEasC、AjEasD、AjEasA和AjEasG
生长条件：
工程化酵母株EYS1849和EYS1851在含2％葡萄糖的标准SC培养液(ForMedium,Hunstanton,U.K.)中培养。将培养物在20℃于含有25mL培养基的250mL摇瓶中培养72小时，伴随恒定振摇。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC,Waters,Milford,Mass.,美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是AcquityBridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表17
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿电压(End Plate Offset)：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
制备程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。将上清液用10M NaOH调节至pH＝10并且通过液体/液体提取法用等体积的乙酸乙酯提取。将粗提物在真空下干燥并用二甲基亚砜(DMSO)重构以获得浓度100mg/ml。随后将它在制备性HPLC系统(Waters,Milford,Mass,美国)上纯化。固定相：柱是XBridgeTM制备性C18.5μm，19x250mm柱。
液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％三氟乙酸。流动相B：乙腈+0.1％三氟乙酸。运行条件：
表18：
ESI参数：源电压：毛细管电压(Capillary)：3.00kV；锥孔电压(Cone)：30V。萃取锥孔电压(Extractor)：3V。RF透镜电压(RF Lens)：0.1V。
源温度：150℃。去溶剂化温度：350℃
结果：
将EYS1849、EYS1851和EYS1456在20℃如上文所述培养。通过LC-MS分析上清液，EYS1849的环棒麦角素预期质量(m/z＝239.1543+/-0.01Da)的提取离子色谱图显示一个保留时间为5.5分钟(+/-0.2)的峰，在菌株EYS1851中未见该峰(在EYS1456中也未见此峰，数据未显示)。另一个明显峰存在于EYS1849和EYS1851中，质量为m/z＝241.1699+/-0.01Da，保留时间5.91分钟(参见图11)。
将5.49分钟保留时间处的峰如上文所述纯化，并通过LC-MS和NMR光谱法分析，并且阐明结构，证实化合物的身份是环棒麦角素。
EYS1849的上清液中在5.49分钟洗脱的纯化化合物的NMR数据：1H NMR(600MHz，CHLOROFORM-d)·ppm 0.70(d，J＝6.02Hz，1H)1.72(s，3H)1.81(d，J＝5.83Hz，1H)2.83(br.s.，3H)3.02(d，J＝10.40Hz，1H)3.09-3.17(m，1H)3.27(d，J＝13.69Hz，1H)3.63(d，J＝11.67Hz，1H)3.99(t，J＝9.60Hz，1H)6.76(d，J＝7.20Hz，1H)6.88(br.s.，1H)7.05(t，J＝7.65Hz，1H)7.19(d，J＝8.71Hz，1H)11.79-12.55(m，1H).
实施例2：面包酵母(酿酒酵母)中利用烟曲霉EasF和日本曲霉DmaW_altC、EasE和EasC产生裸麦角碱I
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK 111-61A(MATα MAL2-8C SUG2his3Δ1leu2-3_112ura3-52)
基因序列：
表19中列出实施例2中使用的基因：
表19：实施例2中使用的基因
基因名 SEQ ID NO： 序列来源
AjDmaW_altC 102 日本曲霉
AfEasF 107 烟曲霉
AjEasE 106 日本曲霉
AjEasC 104 日本曲霉
基因的克隆：
产生经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(SEQ ID NO：102、107、106和104)外加翻译终止密码子。在合成期间，全部基因在5′端配有包含Hind III限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将基因克隆至酵母表达盒(SEQ ID NO：110和111)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母启动子和终止子。全部盒均在侧翼具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(SEQ ID NO：110和111)包含在基于pUC18的质粒载体(SEQ ID NO：112)上，其中所述质粒载体已经插入了接头(SEQ ID NO：113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。
将含有AjDmaW_altC(SEQ ID NO:102)和AfEasF(SEQ ID NO:107)的基因表达盒用于亚克隆至整合载体pEVE2294(Seq ID No:114)中，所述整合载体还含有酵母选择标记基因(参见表16a和16b)。这两个表达盒具有头对头取向，意味着启动子将允许以相反方向转录。标记和表达盒的旁侧具有与宿主基因组DNA具有同源性的序列。通过用Not I和Sbf I限制性酶消化，从基于pUC18的主链，释放旁侧有基因组同源序列的包含表达盒和选择标记的完整整合构建体，并且用于转化酵母。使用标准乙酸锂转化方案(Current Protocols；第13章)。通过PCR验证正确整合，并且在用表达Cre重组酶的质粒转化细胞后，以lox方式剔除(切除)选择标记，如通过Sauer，1987所描述。用于整合的靶位点由Flagfeldt，2009描述。表16a和16b中列出整合构建体和Seq ID(参见实施例1)。
将基因AjEasE(SEQ ID NO:106)和AjEasC(SEQ ID NO:104)克隆至PA表达盒和GC表达盒(分别是SEQ ID NO:110和111)并且随后分别插入酵母载体pRS315和pRS313的主链中，以产生载体pCCL254和pCCL256。pRS载体pRS315和pRS313之前已经通过在这些原始载体的Pvu II位点之间插入多克隆位点接头(SEQ ID NO:113)而被修饰，因此允许所述表达盒克隆至该接头的Asc I位点中。pRS载体由Sikorski，1989描述。
途径组装：
通过将裸麦角碱I生物合成途径引入EYS1456，制备了酵母株。首先，通过将源自pEVE2294(SEQ ID NO:114)的构建体整合至EYS1456，制备中间菌株(参见实施例1中表16和16b)。所产生的菌株进一步用空载体pRS315和pRS313转化以产生CEY2871，或用载体pCCL254和pCCL256转化以产生CEY3631。所得到的两个菌株因此含有以下基因的表达盒：
CEY2871：AjDmaW_altC和AfEasF
CEY3631：AjDmaW_altC、AfEasF、AjEasE和AjEasC
生长条件：
工程化酵母株CEY2871和CEY3631在含2％葡萄糖、不含Leu(亮氨酸)和His(组氨酸)的标准SC培养液(ForMedium，Hunstanton，U.K.)中培养。将培养物在30℃于含有25mL培养基的250mL摇瓶中培养72小时，伴随恒定振摇。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC，Waters，Milford，Mass.，美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH，Bremen，德国)偶联。固定相：柱是AcquityBridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表20：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
5.00 0.400 0.0 100.0
6.00 0.400 0.0 100.0
6.10 0.400 99.0 1.0
7.50 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
制备流程：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。将上清液用10M NaOH调节至pH＝10，并且通过液体/液体提取法用等体积的乙酸乙酯提取。将粗提物在真空下干燥并用二甲基亚砜(DMSO)重构以获得浓度100mg/ml。随后将它在制备性HPLC系统(Waters，Milford，Mass，美国)上纯化：固定相：柱是XBridgeTM制备性C18.5μm，19x250mm柱。
液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％三氟乙酸。流动相B：乙腈+0.1％三氟乙酸。运行条件：
表21：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 14.00 99.0 1.0
21.00 14.00 70.0 50.0
27.00 14.00 0.0 100.0
31.00 14.00 0.0 100.0
31.10 14.00 99.0 1.0
41.00 14.00 99.0 1.0
ESI参数：源电压：毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：30V；萃取锥孔电压：3V。RF透镜电压：0.1V。
源温度：150℃。去溶剂化温度：350℃
结果：
通过LC-MS分析CEY2871和CEY3631的上清液。裸麦角碱I预期质量(m/z＝257.164+/-0.01Da)的提取离子色谱图显示菌株CEY3631中保留时间为4.4分钟(+/-0.2)的一个峰，在菌株CEY2871中未见该峰(参见图12)。
将4.4分钟保留时间处的峰如上文所述纯化，并通过LC-MS和NMR光谱法分析。阐明相应化合物的结构，证实化合物的身份是裸麦角碱。来自CEY3631在4.4分钟+/-0.2分钟洗脱的纯化化合物的NMR数据：1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δppm 1.82(s，3H)2.67(t，J＝5.22Hz，3H)3.11(dd，J＝15.65，7.79Hz，1H)3.32(dd，J＝15.58，4.00Hz，1H)3.54(m，J＝7.20，3.60，3.60Hz，1H)3.95(s，2H)4.25(dd，J＝9.39，7.60Hz，1H)5.36(dd，J＝9.74，0.89Hz，1H)6.71(d，J＝7.11Hz，1H)7.08(t，J＝7.60Hz，1H)7.16(s，1H)7.25(d，J＝8.09Hz，1H)8.48(br.s.，1H)8.73(br.s.，1H)11.01(s，1H)
实施例3：利用烟曲霉的EasF、日本曲霉的DmaW_altC和EasC、和日本曲霉的EasE或SUMO-EasE产生裸麦角碱I
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK111-61A(MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112ura3-52)
基因序列：
表22中列出实施例3中使用的基因。
表22：实施例3中使用的基因
基因名 Seq.ID 序列来源
AjDmaW_altC 102 日本曲霉
AfEasF 107 烟曲霉
AjEasE 106 日本曲霉
AjEasE_SUMO 119 日本曲霉
AjEasC 104 日本曲霉
基因的克隆：
产生经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(SEQ ID NO:102、107、106、119和104)外加翻译终止密码子。在合成期间全部基因在5′端配有包含Hind III限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将基因克隆至酵母表达盒(SEQ IDNO:110和111)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母启动子和终止子。全部盒均侧翼具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(SEQ ID NO:110和111)包含在基于pUC18的质粒载体(SEQ ID NO:112)上，其中所述质粒载体已经插入了接头(SEQ ID NO:113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。
将含有AjDmaW_altC(SEQ ID NO:102)和AfEasF(SEQ ID NO:107)的基因表达盒用于亚克隆至整合载体pEVE2294(SEQ ID NO:114)中，所述整合载体还含有酵母选择标记基因(参见实施例1中的表16a和16b)。这两个表达盒具有头对头取向，意味着启动子将允许以相反方向转录。标记和表达盒的旁侧有与宿主基因组DNA具有同源性的序列。通过用Not I和Sbf I限制性酶消化，从基于pUC18的主链，释放旁侧有基因组同源序列的包含表达盒和选择标记的完整整合构建体，并且用于转化酵母。使用标准乙酸锂转化方案(CurrentProtocols；第13章)。通过PCR验证正确整合，在用表达Cre重组酶的质粒转化细胞后，以lox方式剔除(切除)选择标记，如通过Sauer，1987所描述。用于整合的靶部位由Flagfeldt，2009描述。表16a和16b中列出整合构建体和Seq ID(参见实施例1)。
将基因AjEasE(SEQ ID NO:106)和AjEasC(SEQ ID NO:104)克隆至PA表达盒和GC表达盒(分别是SEQ ID NO:110和111)，随后分别插入酵母载体pRS315和pRS313的主链中，以产生载体pCCL254和pCCL256。通过以下方式产生载体pCCL255：将含有SUMO标签的合成性DNA序列插入载体pCCL254的单一Hind III位点，因此产生N末端SUMO化形式的EasE酶(SEQID NO:119)。SUMO-标签的用途由例如Peroutka，2008描述。
pRS载体pRS315和pRS313之前已经通过在这些原始载体的Pvu II位点之间插入多克隆位点接头(SEQ ID NO:113)而被修饰，因此允许该表达盒克隆至该接头的Asc I位点中。pRS载体由Sikorski，1989描述。
途径组装：
通过将裸麦角碱I的生物合成途径引入EYS1456中，制备了酵母株。通过将源自pEVE2294(SEQ ID NO:114)的构建体整合至EYS1456，制备中间菌株。所产生的菌株进一步用载体pCCL254和pCCL256转化以产生CEY3631，或用载体pCCL254和pCCL255转化以产生CEY3645。所得到的两个菌株因此含有以下基因的表达盒：
CEY3631：AjDmaW_altC、AfEasF、AjEasE和AjEasC
CEY3645：AjDmaW_altC、AfEasF、SUMO-AjEasE和AjEasC
生长条件：
工程化酵母株CEY3631和CEY3645在含2％葡萄糖、不含Leu和His的标准SC培养液(ForMedium，Hunstanton，U.K.)中培养。将培养物在30℃于含有25mL培养基的250mL摇瓶中培养72小时，伴随恒定振摇。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC，Waters，Milford，Mass.，美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH，Bremen，德国)偶联。固定相：柱是Acquity Bridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表23
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
5.00 0.400 0.0 100.0
6.00 0.400 0.0 100.0
6.10 0.400 99.0 1.0
7.50 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
结果：
通过LC-MS分析CEY3631和CEY3645的上清液。从TIC(总离子色谱图)提取了裸麦角碱I的质量(m/z＝257.164+/-0.01Da)。检测到保留时间2.0分钟(+/-0.1)的一个峰，其对应于先前(参见实施例2)阐明的裸麦角碱I(参见图13)。
对与裸麦角碱I相对应的峰下面积积分，显示与具有非SUMO化形式EasE的菌株(CEY3631)相比，在具有SUMO化形式EasE的菌株(CEY3645)中面积增加大约27％，参见图13，插图。
实施例4：利用与源自烟曲霉或日本曲霉的EasF组合的AjDmaW_altC产生Me-DMAT
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK 111-61A(MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52)
表24中列出实施例4中使用的基因：
表24：实施例4中使用的基因
基因名 Seq.ID 序列来源
AjDmaW_altC 102 日本曲霉
AfEasF 107 烟曲霉
AjEasF 120 日本曲霉
基因的克隆：
经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(SEQID NO:102,107和120)外加翻译终止密码子。在合成期间全部基因在5′端配有包含HindIII限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将基因克隆至酵母CA表达盒(SEQ ID NO:121)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母Cup1启动子和Adh1终止子。全部盒均旁侧具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(SEQ ID NO:121)包含在基于pUC18的质粒载体(SEQ ID NO:112)上，其中所述质粒载体已经插入了接头(SEQID NO:113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。
将基因AjDmaW_altC(Seq ID No:102)克隆至CA表达盒(SEQ ID NO:121)中并且随后插入酵母载体pRS316的主链以产生载体pCCL100。将基因AfEasF(Seq ID No:107)和AjEasF(Seq ID No:120)克隆至CA表达盒(SEQ ID NO:121)中并且随后分别插入酵母载体pRS315的主链以分别产生载体pCCL98和pCCL91。pRS载体pRS316和pRS315之前已经通过在这些原始载体的Pvu II位点之间插入多克隆位点接头(SEQ ID NO:113)而被修饰，因此允许该表达盒克隆至该接头的Asc I位点中。pRS载体由Sikorski，1989描述。
途径组装：
通过将Me-DMAT的生物合成途径引入EYS1456中，准备了酵母株。EYS1456用载体pCCL100和pCCL98转化以产生CEY2557，或用载体pCCL100和pCCL91转化以产生CEY2625。所得到的两个菌株因此含有以下基因的表达盒：
CEY2557：AjDmaW_altC和AjEasF
CEY2625：AjDmaW_altC和AfEasF
生长条件：
工程化酵母株CEY2557和CEY2625在含2％葡萄糖、不含Leu(亮氨酸)和Ura(尿嘧啶)的标准SC培养液(ForMedium,Hunstanton,U.K.)中培养。添加硫酸铜至终浓度200μM。将培养物在30℃于含有25mL培养基的250mL摇瓶中培养72小时，伴随恒定振摇。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC,Waters,Milford,Mass.,美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是AcquityBridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表25：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
12.00 0.400 50.0 50.0
15.00 0.400 0.0 100.0
17.00 0.400 0.0 100.0
17.10 0.400 99.0 1.0
19.00 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
制备程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。将上清液用10M NaOH调节至pH＝10并且通过液体/液体提取法用等体积的乙酸乙酯提取。将粗提物在真空下干燥并用二甲基亚砜(DMSO)重构以获得浓度100mg/ml。随后将它在制备性HPLC系统(Waters,Milford,Mass,美国)上纯化：固定相：柱是XBridgeTM制备性C18.5μm，19x250mm柱。
液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％三氟乙酸。流动相B：乙腈+0.1％三氟乙酸。运行条件：
表26：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 14.00 99.0 1.0
21.00 14.00 70.0 50.0
27.00 14.00 0.0 100.0
31.00 14.00 0.0 100.0
31.10 14.00 99.0 1.0
41.00 14.00 99.0 1.0
ESI参数：
源电压：毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：30V。萃取锥孔电压：3V。RF透镜电压：0.1V。
源温度：150℃。去溶剂化温度：350℃
结果：
通过LC-MS分析CEY2557和CEY2625的上清液。Me-DMAT预期质量(m/z＝287.175+/-0.01Da)的提取离子色谱图显示一个在保留时间7.8+/-0.2分钟处的峰(参见图14)。将这个峰如上文所述纯化并通过LC-MS和NMR光谱法分析，并且阐明结构，证实化合物的身份是Me-DMAT。
对与Me-DMAT相对应的峰下面积积分，显示与具有日本曲霉形式EasF的菌株(CEY2557)相比，具有烟曲霉形式EasF的菌株(CEY2625)中面积增加2倍以上，参见图15。
Me-DMAT：CEY2557上清液中5.49分钟洗脱的纯化化合物的NMR数据：
1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δppm 1.61(s，3H)1.63(s，3H)2.45(s，3H)3.19(dd，J＝16.28，8.33Hz，1H)3.42(dd，J＝16.00，4.94Hz，1H)3.57-3.63(m，3H)5.13-5.21(m，1H)6.74(d，J＝7.15Hz，1H)6.98(t，J＝7.50Hz，1H)7.14(s，1H)7.16-7.21(m，1H)
实施例5：利用烟曲霉EasF连同CpDmaW、AjDmaW_altC或AjDmaW_trcC产生Me-DMAT
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK 111-61A(MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52)
表27中列出实施例5中使用的基因：
表27：实施例5中使用的基因
基因名 Seq.ID 序列来源
AjDmaW_altC 102 日本曲霉
AjDmaW_trcC 122 日本曲霉
CpDmaW 123 麦角菌
AfEasF 107 烟曲霉
基因的克隆：
经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(SEQID NO:102至107和SEQ ID NO:122至123)外加翻译终止密码子。在合成期间全部基因在5′端配有包含Hind III限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将基因克隆至酵母CA表达盒(SEQID NO:121)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母Cup1启动子和Adh1终止子。全部盒均旁侧有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(SEQ IDNO:121)包含在基于pUC18的质粒载体(SEQ ID NO:112)上，其中所述质粒载体之前已经插入了接头(SEQ ID NO:113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。
将基因AjDmaW_altC(SEQ ID NO:102)、AjDmaW_trcC(SEQ ID NO:122)和CpDmaW(SEQ ID NO:123)克隆至CA表达盒(SEQ ID NO:121)中并且随后分别插入酵母载体pRS316的主链以产生载体pCCL100、pCCL99和pCCL95。将基因AfEasF克隆至CA表达盒(SEQ ID NO:121)中并且随后插入酵母载体pRS315的主链以产生载体pCCL98。pRS载体pRS316和pRS315之前已经通过在这些原始载体的Pvu II位点之间插入多克隆位点接头(SEQ ID NO:113)而被修饰，因此允许该表达盒克隆至该接头的Asc I位点中。pRS载体由Sikorski，1989描述。
途径组装：
通过将Me-DMAT的生物合成途径引入EYS1456中，准备了酵母株。EYS1456用载体pCCL100和pCCL98转化以产生CEY2557，或用载体pCCL99和pCCL98转化以产生CEY2563，或用载体pCCL95和pCCL98转化以产生CEY2575。所得到的三个菌株因此含有以下基因的表达盒：
CEY2557：AjDmaW_altC和AfEasF
CEY2563：AjDmaW_trcC和AfEasF
CEY2575：CpDmaW和AfEasF
生长条件：
工程化酵母株CEY2557、CEY2563和CEY2575在含2％葡萄糖、不含Leu(亮氨酸)和Ura(尿嘧啶)的标准SC培养液(ForMedium,Hunstanton,U.K.)中培养。添加硫酸铜至终浓度200μM。将培养物在30℃于含有25mL培养基的250mL摇瓶中培养72小时，伴随恒定振摇。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC,Waters,Milford,Mass.,美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是AcquityBridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表28：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
12.00 0.400 50.0 50.0
15.00 0.400 0.0 100.0
17.00 0.400 0.0 100.0
17.10 0.400 99.0 1.0
19.00 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
制备程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。将上清液用10M NaOH调节至pH＝10，并且通过液体/液体提取法用等体积的乙酸乙酯提取。将粗提物在真空下干燥并用二甲基亚砜(DMSO)重构以获得浓度100mg/ml。随后将它在制备性HPLC系统(Waters,Milford,Mass,美国)上纯化：固定相：柱是XBridgeTM制备性C18.5μm，19x250mm柱。
液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％三氟乙酸。流动相B：乙腈+0.1％三氟乙酸。运行条件：
表29：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 14.00 99.0 1.0
21.00 14.00 70.0 50.0
27.00 14.00 0.0 100.0
31.00 14.00 0.0 100.0
31.10 14.00 99.0 1.0
41.00 14.00 99.0 1.0
ESI参数：
源电压：毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：30V；萃取锥孔电压：3V。RF透镜电压：0.1V。
源温度：150℃。去溶剂化温度：350℃
结果：
通过LC-MS分析CEY2557、CEY2563和CEY2575的上清液。峰的提取离子色谱图显示一种具有Me-DMAT预期质量的化合物(m/z＝257.164+/-0.01Da)(参见图16)。将7.8分钟保留时间处的这个峰如上文所述纯化并通过LC-MS和NMR光谱法分析，并且阐明结构，证实化合物的身份是Me-DMAT。对与Me-DMAT相对应的峰下面积积分(图16，插图)，显示全部三个菌株具有相似水平的Me-DMAT产生。
实施例6：在法呢基焦磷酸合酶活性降低的宿主菌株中利用日本曲霉的DmaW_altC和烟曲霉的EasF产生Me-DMAT
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK 111-61A(MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52)
表30中列出实施例6中使用的基因：
表30.实施例6中使用的基因
基因名 Seq.ID 序列来源
AjDmaW_altC 102 日本曲霉
AfEasF 107 烟曲霉
基因的克隆：
由德国雷根斯堡GeneArt AG生产经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(SEQ ID NO:102和107)外加翻译终止密码子。在合成期间全部基因在5′端配有包含Hind III限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将AjDmaW(SEQ ID NO:102)克隆至酵母PA表达盒(SEQ ID NO:110)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和SacII的多克隆位点分隔的天然酵母Pgk1启动子和Adh2终止子。使用Hind III和Sac II，将AfEasF克隆至酵母TE表达盒(SEQ ID NO:124)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母Tef1启动子和Eno2终止子。两个盒均旁侧具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(SEQ ID NO:110和124)包含在基于pUC18的质粒载体(SEQ IDNO:112)上，其中所述质粒载体之前已经插入了接头(SEQ ID NO:113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。
随后将基因AjDmaW和AfEasF克隆至基于载体pESC-Ura(Agilent Technologies(Schweiz)AG，巴赛尔，瑞士)的单个2μM载体中：将PA表达盒中包含Pgk1启动子和AfEasF编码序列的Bgl II/Sac II片段插入Bgl II和Sac II消化的pESC-Ura中。这使Adh2终止子更换为pESC-Ura的Cyc1终止子。所得到的载体用Bgl II和Sac I消化，并且将载体主链连接至类似消化的PCR产物，所述PCR产物包含来自TE表达盒的Tef1启动子。该PCR产物之前用PCR引物制备，其中所述PCR引物在5'末端并入Bgl II位点和在3'末端并入三个位点Aar I、PmeI和Sac。最后，所得到的载体用Aar I和Pme I消化。Aar I之前已经设计成留下与Bgl II消化序列相容的突出端，而Pme I留下平末端。具有AjDmaW_altC的TE表达盒随后用Sac II消化，使用T4DNA聚合酶使其平端化，随后用Bgl II消化。包含Tef1启动子和AjDmaW_altC编码序列的这个片段随后与用Aar I和Pme I如刚才所述那样消化的主链连接。这使Eno2终止子更换为pESC-Ura的Adh1终止子。最终载体，命名为pEVE2075(SEQ ID NO:125)，在Tef1启动子和Adh1终止子之间含有AjDmaW，并且在Pgk1启动子和Cyc1终止子之间含有AfEasF。
制备ERG20活性降低的酵母宿主：
通过以下方式修饰酵母株EYS1456：缺失部分的ERG20调节区并将其替换为相对弱的ScKex2基因的组成型天然启动子。首先，制备载体pEVE2049(SEQ ID NO:126)，其包含后接ScKex2启动子的诺尔丝菌素抗性选择标记基因NatR。随后使用两个引物SEQ ID NO:127和128，通过PCR扩增NatR-ScKex2片段。SEQ ID NO:127的5′-端与酵母宿主中位置-768至-724(相对于ERG20翻译起始位点而言)的基因组序列相同(图17中的HR1)，并且3’-端与pEVE2049中NatR选择标记上游的序列相同。SEQ ID NO:128的5′-端与ERG20编码序列的反向互补序列相同(图17中的HR2)，并且3’-端与ScKex2启动子3`-端的反向互补序列相同。将PCR产物用来转化EYS1456，导致ERG20启动子区替换为ScKEX2启动子。通过利用NatR选择标记，选择成功整合的克隆。图17显示整合构建体和基因组靶区域的概略图。这个克隆，和EYS1456，用质粒pEVE2075进一步转化以产生菌株EYS1538(具有天然ERG20启动子区的对照菌株)和EYS1926(其中天然ERG20启动子替换为ScKex2启动子)。
途径组装：
如上文所述制备携带质粒pEVE2075的两个酵母株，EYS1538和EYS1926，在两者中均产生Me-DMAT的生物合成途径。所得到的菌株因此均含有以下基因的表达盒：
EYS1538和EYS1926：AjDmaW_altC和AfEasF
生长条件：
工程化酵母株EYS1538和EYS1926在含2％葡萄糖、不含Ura(尿嘧啶)的标准SC培养液(ForMedium,Hunstanton,U.K.)中培养。将培养物在30℃于含有25mL培养基的250mL摇瓶中培养72小时，伴随恒定振摇。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000x g离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC,Waters,Milford,Mass.,美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是AcquityBridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表31：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
12.00 0.400 50.0 50.0
15.00 0.400 0.0 100.0
17.00 0.400 0.0 100.0
17.10 0.400 99.0 1.0
19.00 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
结果：
通过LC-MS分析EYS1538和EYS1926的上清液。提取离子色谱图指示一个在保留时间7.8分钟与Me-DMAT预期质量(m/z＝257.164+/-0.01Da)相对应的峰。通过参比先前纯化的该化合物(参见实施例4)，确定该峰为Me-DMAT。对与Me-DMAT相对应的峰下面积积分，显示与EYS1538相比，EYS1926中Me-DMAT增加两倍以上(参见图18)。这种增加归因于EYS1926中启动子的替换，这导致ERG20下调并且因此导致可用于Me-DMAT合成的DMAPP增加。
实施例7：面包酵母(酿酒酵母)中通过表达一个八步骤异源途径(包括P.divaricatus的EasH)产生环棒麦角素
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK 111-61A(MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52)
表32中列出实施例7中使用的基因：
表32：实施例7中使用的基因清单
基因名 Seq.ID 序列来源
Aj_DmaW_altC 102 日本曲霉
Af_EasF 107 烟曲霉
Aj_EasE 106 日本曲霉
Aj_EasC 104 日本曲霉
Aj_EasD 105 日本曲霉
Aj_EasH 109 日本曲霉
Pd_EasH 157 P.divaricatus
Aj_EasA 103 日本曲霉
Aj_EasG 108 日本曲霉
基因的克隆：
由美国加利福尼亚州Menlo Park的DNA2.0公司或德国雷根斯堡GeneArt AG制备了经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(Seq ID No:102至109和157)外加翻译终止密码子。在合成期间全部基因在5′端配有包含Hind III限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将基因克隆至酵母表达盒((Seq ID No:110和111)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母启动子和终止子。全部盒均旁侧具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(Seq ID No:110和111)包含在基于pUC18的质粒载体(Seq ID No:112)上，其中所述质粒载体之前已经插入了接头(Seq IDNo:113)以提供Asc I位点用于进一步克隆表达盒。
基因表达盒用于将一个或两个表达盒亚克隆至指定的整合载体(Seq ID No:114至118)中，其中所述整合载体还含有酵母选择标记基因。在两个表达盒的情况下，克隆方向是头对头，意味着启动子将允许以相反方向转录。标记和表达盒的旁侧有与宿主基因组DNA具有同源性的序列(Seq ID No:114至118)。通过用Sbf I限制性酶消化整合载体，从基于pUC18的主链释放旁侧有同源序列的包含表达盒和选择标记的完整整合构建体，并且用于转化酵母。使用标准乙酸锂转化方案(Current Protocols；第13章)。通过PCR验证正确整合，在用表达Cre重组酶的质粒转化细胞后，以lox方式剔除(切除)选择标记，如通过Sauer，1987所描述。用于整合的靶位点由Flagfeldt，2009描述。表33中列出整合载体的SEQ ID No及其整合构建体。
表33：实施例7中使用的整合载体及其整合构建体
此外，构建了两个质粒，所述质粒含有来自日本曲霉的AjEasH基因(Seq ID No:109)或来自Paecilomyces divaricatus的PdEasH基因(Seq ID028)，克隆至配备表达盒(Seq ID No:111)的pRS315载体中，其中所述表达盒使用GPD1启动子和CYC1终止子。克隆如实施例2中所述进行。
途径组装：
通过将源自pEVE2294、pEVE2312、pEVE2342和pEVE2344的构建体整合至EYS1456中，制备酵母株EYS1851(表33)。通过用分别含有PdEasH或AjEasH的pRS载体(见上文)转化EYS1851，制备了两个菌株EYS2098和EYS2099。所得到的菌株因此含有以下基因的表达盒：
EYS2098：AjDmaW_altC、AfEasF、AjEasE、AjEasC、AjEasD、AjEasA、AjEasG、PdEasH
EYS2099：AjDmaW_altC、AfEasF、AjEasE、AjEasC、AjEasD、AjEasA、AjEasG、AjEasH
生长条件：
工程化酵母株EYS2098和EYS2099在含2％葡萄糖、不含亮氨酸的标准SC培养液(ForMedium,Hunstanton,U.K.)中培养。将培养物在20℃于含有25mL培养基的250mL摇瓶中培养72小时，伴随恒定振摇。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC,Waters,Milford,Mass.,美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是AcquityBridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表34：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
12.00 0.400 50.0 50.0
15.00 0.400 0.0 100.0
17.00 0.400 0.0 100.0
17.10 0.400 99.0 1.0
19.00 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
结果：
通过LC-MS分析来自EYS2098和EYS2099的上清液，并且通过与纯化合物对比，验证了裸麦角碱I(痕量)和环棒麦角素的产生(化合物鉴定参见实施例1和2)。由于亲本株EYS1851不产生环棒麦角素(参见实施例1)，故上述两个菌株中环棒麦角素的产生(参见图19)显示了来自P.divaricatus或日本曲霉的EasH基因能够引起这种化合物产生的能力。
实施例8：在异戊烯基二磷酸:二甲基烯丙基二磷酸异构酶活性(Idi1)增加的宿主菌株中，利用日本曲霉DmaW_altC和烟曲霉EasF，增加Me-DMAT的产生
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK 111-61A(MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52)
表35中列出实施例8中使用的基因：
表35：实施例8中使用的基因
基因名 Seq.ID No: 序列来源
AjDmaW_altC 102 日本曲霉
AfEasF 107 烟曲霉
Scldi1 158 酿酒酵母
基因的克隆：
经密码子优化以便在酵母中表达的两个合成基因由德国雷根斯堡GeneArt AG制造，编码AjDmaW_altC(Seq ID No:102)和AfEasF(Seq ID No:107)的氨基酸序列，包括翻译终止密码子。使用酿酒酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增编码Scldi1(异戊烯基二磷酸:二甲基烯丙基二磷酸异构酶)的基因(Seq ID No:158)。在合成(AjDmaW_altC和AfEasF)或PCR扩增(Scldi1)期间，全部基因在5′端配有包含Hind III限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。
使用Hind III和Sac II，将基因克隆至酵母表达盒(Seq ID No:110、124和159)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母启动子(分别是Gpd1、Tef1和Tef2)和终止子(分别是Cyc1,Eno2和Pgi1)。全部盒均旁侧具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒包含在基于pUC18的质粒载体(Seq ID No:112)上，其中所述质粒载体之前已经插入了接头(Seq ID No:113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。最后，将含有所述基因的表达盒作为Asc I片段分别克隆至酵母载体pRS316、pRS315和pRS313的主链中。pRS载体pRS316、pRS315和pRS313之前已经通过在这些原始载体的Pvu II位点之间插入多克隆位点接头(Seq ID No:113)而被修饰，因此允许所述表达盒克隆至该接头的AscI位点中。pRS载体由Sikorski，1989描述。
途径组装：
使用上文描述的包含基因AjDmaW_altC和AfEasF的pRS载体，通过将Me-DMAT生物合成途径引入EYS1456中，制备酵母株EYS2055。这个菌株进一步用包含Scldi1基因的第三pRS载体转化以产生菌株EYS2056。所得到的两个菌株因此含有以下基因的表达盒：
EYS2055:AjDmaW_altC和AfEasF
EYS2056:AjDmaW_altC、AfEasF和Scldi1
生长条件：
工程化酵母株EYS2055和EYS2056在含有2％葡萄糖、不含His(组氨酸)、Leu(亮氨酸)和Ura(尿嘧啶)的标准SC培养液中培养(ForMedium,Hunstanton,U.K.)。将培养物在20℃或30℃于含有25mL培养基的250mL摇瓶中培养72小时，伴随恒定振摇。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC,Waters,Milford,Mass.,美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是AcquityBridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表36：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
12.00 0.400 50.0 50.0
15.00 0.400 0.0 100.0
17.00 0.400 0.0 100.0
17.10 0.400 99.0 1.0
19.00 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
结果：
通过LC-MS分析EYS2055和EYS2056的上清液。提取DMAT(m/z＝273.159+/-0.01Da)和Me-DMAT(m/z＝287.175+/-0.01Da)的预期质量的离子色谱图，并对峰下面积积分。结果(参见图20a和20b)显示，在两种温度，与EYS2055相比菌株EYS2056中Me-DMAT产量增加。该增加对应于与EYS2055的正常野生型表达水平相比Scldi1的过量表达。
实施例9：通过表达全长异源途径的基因的额外拷贝增加环棒麦角素的产生
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK 111-61A(MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52)
表37中列出实施例9中使用的基因：
表37：实施例9中使用的基因清单
基因名 Seq.ID No: 序列来源
Aj_DmaW_altC 102 日本曲霉
Af_EasF 107 烟曲霉
Aj_EasE 106 日本曲霉
Aj_EasC 104 日本曲霉
Aj_EasD 105 日本曲霉
Aj_EasH 109 日本曲霉
Aj_EasA 103 日本曲霉
Aj_EasG 108 日本曲霉
基因的克隆：
由美国加利福尼亚州Menlo Park的DNA2.0公司或德国雷根斯堡GeneArt AG产生经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(Seq ID No:102至109)外加翻译终止密码子。在合成期间全部基因在5′端配有包含Hind III限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将基因克隆至酵母表达盒(Seq ID No:110和111)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母启动子和终止子。全部盒均旁侧具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(Seq ID No:110和111)包含在基于pUC18的质粒载体(Seq ID No:112)上，其中所述质粒载体之前已经插入了接头(Seq ID No:113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。
基因表达盒用于将一个或两个表达盒亚克隆至指定的整合载体(Seq ID No:114、115、117、118和160)中，所述整合载体还含有酵母选择标记基因。克隆方向是头对头，意味着启动子将允许以相反方向转录。标记和表达盒的旁侧具有与宿主基因组DNA具有同源性的序列。通过用Sbf I限制性酶消化整合载体，从基于pUC18的主链释放旁侧有同源序列的包含表达盒和选择标记的最终整合构建体(Seq ID No:114、115、117、118和160)，并且用于转化酵母。使用标准乙酸锂转化方案(Current Protocols；第13章)。通过PCR验证正确整合，并且用表达Cre重组酶的质粒转化细胞后，以lox方式剔除(切除)选择标记，如通过Sauer，1987所描述。用于整合的靶位点由Flagfeldt，2009描述。表38中列出整合载体及其整合构建体的SEQ ID No。
表38：实施例9中使用的整合载体及其整合构建体
途径组装：
通过将完整环棒麦角素途径的单拷贝(EYS1934)或完整途径外加基因AjEasC的额外拷贝(EYS2206)整合至EYS1456中，制备了两个酵母株。通过整合来自pEVE2294、pEVE2312、pEVE2343和pEVE2344的构建体(表38)制备EYS1934，而通过整合来自pEVE2294、pEVE2312、pEVE2343、pEVE2344和pEVE2656的构建体(表38)制备EYS2206。所得到的菌株因此含有以下基因的表达盒：
EYS1934：AjDmaW_altC、AfEasF、AjEasE、AjEasC、AjEasD、AjEasA、AjEasG和AjEasH
EYS2206：AjDmaW_altC、AfEasF、AjEasE、2x AjEasC、AjEasD、AjEasA、AjEasG和AjEasH
生长条件：
工程化酵母株EYS1934和EYS2206在含有2％葡萄糖的标准SC培养液(ForMedium,Hunstanton,U.K.)中培养。将培养物在30℃于含有25mL培养基的250mL摇瓶中培养72小时，伴随恒定振摇。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC,Waters,Milford,Mass.,美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是AcquityBridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表39：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
12.00 0.400 50.0 50.0
15.00 0.400 0.0 100.0
17.00 0.400 0.0 100.0
17.10 0.400 99.0 1.0
19.00 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
结果：
将EYS1934和EY2206在30℃如上文所述培养。通过LC-MS分析上清液，并且提取环棒麦角素预期质量(m/z＝239.1543+/-0.01Da)的离子色谱图。也提取了该途径的第二产物(按照大约241的m/z命名为MW241)(m/z＝241.1699+/-0.01Da)的色谱图。对峰下面积积分，并且结果的比较显示与EYS1934相比，EYS2206中环棒麦角素(CCL)和狐茅麦角碱(MW241)的产生均增加。参见图21，认为该增加是，与EYS1934相比，EYS2206中表达AjEasC额外拷贝的效果。
实施例10：面包酵母(酿酒酵母)中通过表达一个八步骤异源途径(包括N.lolii的EasE)产生环棒麦角素
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK 111-61A(MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52)
表40中列出实施例10中使用的基因：
表40：实施例10中使用的基因清单
基因名 Seq.ID No: 序列来源
Aj_DmaW_altC 102 日本曲霉
Af_EasF 107 烟曲霉
Aj_EasE 106 日本曲霉
Nl_EasE 161 N.lolii
Aj_EasC 104 日本曲霉
Aj_EasD 105 日本曲霉
Aj_EasH 109 日本曲霉
Aj_EasA 103 日本曲霉
Aj_EasG 108 日本曲霉
基因的克隆：
经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(SeqID No:102至109和161)外加翻译终止密码子。在合成期间全部基因在5′端配有包含HindIII限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将基因(Seq ID No:102、107、105、109、103和108)克隆至酵母表达盒(Seq ID No:110和111)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和SacII的多克隆位点分隔的天然酵母启动子和终止子。全部盒均旁侧具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(Seq ID No:110和111)包含在基于pUC18的质粒载体(Seq ID No:112)上，其中所述质粒载体之前已经插入了接头(Seq ID No:113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。
基因表达盒用于将表达盒成对亚克隆至指定的整合载体(Seq ID No:114、117和118)中，所述整合载体还含有酵母选择标记基因。克隆方向是头对头，意味着启动子将允许以相反方向转录。标记和表达盒的旁侧有与宿主基因组DNA具有同源性的序列。通过用SbfI限制性酶消化整合载体，从基于pUC18的主链释放旁侧有同源序列的包含表达盒和选择标记的完整整合构建体(Seq ID No:114、117和118)，并且用于转化酵母。使用标准乙酸锂转化方案(Current Protocols；第13章)。通过PCR验证正确整合，并且用表达Cre重组酶的质粒转化细胞后，以lox方式剔除(切除)选择标记，如通过Sauer，1987所描述。用于整合的靶位点由Flagfeldt，2009描述。
表41中列出整合载体及其整合构建体的SEQ ID。
表41：实施例10中使用的整合载体及其整合构建体
此外，构建了三个质粒：一个质粒含有克隆至pRS313中的AjEasC基因(Seq ID No:104)。pRS313之前已经配备包含天然酵母Cup1启动子和Adh1终止子的C/A表达盒(Seq IDNo:121)。含有来自日本曲霉的AjEasE基因(Seq ID No:106)或来自Neotyphodium lolii的NlEasE基因(Seq ID No:161)的另两个质粒，通过将各基因分别克隆至也配备了C/A表达盒(Seq ID No:121)的pRS315载体中制备。克隆如实施例2中所述进行。
途径装配：
通过将源自pEVE2294、pEVE2343和pEVE2344的构建体整合至EYS1456中制备酵母株EYS1937(表41)。随后通过用含有AjEasC连同AjEasE或NlEasE的pRS载体(见上文)转化EYS1937，制备两个菌株EYS2124和EYS2125。所得到的菌株因此含有以下基因的表达盒：
EYS2124:AjDmaW_altC,AfEasF,AjEasE,AjEasC,AjEasD,AjEasA,AjEasG,AjEasH
EYS2125:AjDmaW_altC,AfEasF,NlEasE,AjEasC,AjEasD,AjEasA,AjEasG,AjEasH
生长条件：
工程化酵母株EYS2124和EYS2125在含有2％葡萄糖、不含亮氨酸和组氨酸的标准SC培养液(ForMedium,Hunstanton,U.K.)中培养。添加硫酸铜至终浓度200μM。将培养物在20℃于含有25mL培养基的250mL摇瓶中培养72小时，伴随恒定振摇。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC,Waters,Milford,Mass.,美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是AcquityBridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表42：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
12.00 0.400 50.0 50.0
15.00 0.400 0.0 100.0
17.00 0.400 0.0 100.0
17.10 0.400 99.0 1.0
19.00 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
结果：
通过LC-MS分析来自EYS2124和EYS2125的上清液，并且提取环棒麦角素预期质量(m/z＝239.1543+/-0.01Da)的离子色谱图。另外，提取该途径的第二产物(根据大约241的m/z命名为MW241)，即狐茅麦角碱(m/z＝241.1699+/-0.01Da)的色谱图。对峰下面积积分，并且结果的比较显示两个菌株中环棒麦角素(CCL)和狐茅麦角碱的产生，与EYS2125相比，EYS2124中生产水平更高(参见图22)。这显示，在所用的条件下，来自日本曲霉的EasE基因比来自N.lolii的EasE更高效，但是这两种EasE同源物均有功能并且导致CCL和MW241产生。
实施例11：面包酵母(酿酒酵母)中通过表达一个八步骤异源途径(包括具有不同密码子选择的合成性EasE基因)产生环棒麦角素
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK 111-61A(MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52_
表43中列出实施例11中使用的基因：
表43：实施例11中使用的基因清单
基因名 Seq.ID No: 序列来源
Aj_DmaW_altC 102 日本曲霉
Af_EasF 107 烟曲霉
Aj_EasE 106 日本曲霉
Aj_EasE 162 日本曲霉
Aj_EasE 163 日本曲霉
Aj_EasE 164 日本曲霉
Aj_EasE 165 日本曲霉
Aj_EasC 104 日本曲霉
Aj_EasD 105 日本曲霉
Aj_EasH 109 日本曲霉
Aj_EasA 103 日本曲霉
Aj_EasG 108 日本曲霉
基因的克隆：
经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(SeqID No:102至109和162至165)外加翻译终止密码子。在合成期间全部基因在5′端配有包含Hind III限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将基因(Seq ID No:102、107、105、109、103和108)克隆至酵母表达盒(Seq ID No:110和111)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母启动子和终止子。全部盒均旁侧具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(Seq ID No:110和111)包含在基于pUC18的质粒载体(Seq ID No:112)上，其中所述质粒载体之前已经插入了接头(Seq ID No:113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。
基因表达盒用于将表达盒成对亚克隆至还含有酵母选择标记基因的指定整合载体(Seq ID No:114、117和118)中。克隆方向是头对头，意指启动子将允许相反方向的转录。标记和表达盒的旁侧有与宿主基因组DNA具有同源性的序列。通过用Sbf I限制性酶消化整合载体，从基于pUC18的主链释放旁侧有同源序列的包含表达盒和选择标记的完整整合构建体(Seq ID No:114、117和118)，并且用于转化酵母。使用标准乙酸锂转化方案(CurrentProtocols；第13章)。通过PCR验证正确整合，并且用表达Cre重组酶的质粒转化细胞后，以lox方式剔除(切除)选择标记，如通过Sauer，1987所描述。用于整合的靶位点由Flagfeldt，2009描述。表44中列出整合载体及其整合构建体的SEQ ID。
表44：实施例11中使用的整合载体及其整合构建体
此外，构建了六个质粒：一个质粒含有克隆至pRS313中的AjEasC基因(Seq ID No：104)。pRS313之前已经配备包含天然酵母Cup1启动子和Adh1终止子的C/A表达盒(Seq IDNo：121)。通过克隆至也配备了C/A表达盒(Seq ID No：121)的pRS315载体中，制备了其他五个质粒，所述质粒含有采用5种可变密码子选择合成的日本曲霉AjEasE基因变体(Seq IDNo：112和162至165)。克隆如实施例2中所述进行。
途径装配：
通过将源自pEVE2294、pEVE2343和pEVE2344的构建体整合至EYS1456中制备酵母株EYS1937(表44)。随后通过用含有AjEasC连同所述AjEasE基因形式之一的pRS载体(见上文)分别转化EYS1937，制备了5个菌株EYS2124、EYS2127、EYS2147、EYS2148和EYS2149。所得到的菌株因此含有以下基因的表达盒：
EYS2124：AjDmaW_altC，AfEasF，AjEasE(Seq ID No：106)，AjEasC，AjEasD，AjEasA，AjEasG，AjEasH
EYS2127：AjDmaW_altC，AfEasF，AjEasE(Seq ID No：162)，AjEasC，AjEasD，AjEasA，AjEasG，AjEasH
EYS2147：AjDmaW_altC，AfEasF，AjEasE(Seq ID No：163)，AjEasC，AjEasD，AjEasA，AjEasG，AjEasH
EYS2148：AjDmaW_altC，AfEasF，AjEasE(Seq ID No：164)，AjEasC，AjEasD，AjEasA，AjEasG，AjEasH
EYS2149：AjDmaW_altC，AfEasF，AjEasE(Seq ID No：165)，AjEasC，AjEasD，AjEasA，AjEasG，AjEasH
生长条件：
工程化酵母株EYS2124、EYS2127、EYS2147、EYS2148和EYS2149在含有2％葡萄糖、不含亮氨酸和组氨酸的标准SC培养液(ForMedium，Hunstanton，U.K.)中培养。添加硫酸铜至终浓度200μM。将培养物在30℃于含有25mL培养基的250mL摇瓶中培养72小时，伴随恒定振摇。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000x g离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC，Waters，Milford，Mass.，美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是AcquityBridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表45：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
12.00 0.400 50.0 50.0
15.00 0.400 0.0 100.0
17.00 0.400 0.0 100.0
17.10 0.400 99.0 1.0
19.00 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
结果：
通过LC-MS分析来自EYS2124、EYS2127、EYS2147、EYS2148和EYS2149的上清液，并且提取环棒麦角素预期质量(m/z＝239.1543+/-0.01Da)的离子色谱图。另外，提取该途径的第二产物——因大约241的m/z而命名为MW241(m/z＝241.1699+/-0.01Da)——的色谱图。对峰下面积积分，并且结果显示全部5个菌株中环棒麦角素(CCL)和狐茅麦角碱(MW241)以不同水平产生(参见图23)。测试的各个版本EasE基因均编码相同的氨基酸序列，化合物生产水平的差异因此反映了这些合成性EasE基因中所用的不同DNA密码子选择。
实施例12：通过在面包酵母(酿酒酵母)中表达一个八步骤异源途径并且在渗压剂存在下培养该酵母而增加环棒麦角素产生
已经证实渗压剂的存在在一些情况下可以改善蛋白质的正确折叠(Bandyopadhyay 2012，Burkewitz 2012)。这里，我们证实在添加至生长培养基时渗压剂甘油可以改善酵母中基于异源表达途径的环棒麦角素产生。
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK 111-61A(MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52)
表46中列出实施例12中使用的基因：
表46：实施例12中使用的基因清单
基因名 Seq.ID No: 序列来源
Aj_DmaW_altC 102 日本曲霉
Af_EasF 107 烟曲霉
Aj_EasE 106 日本曲霉
Aj_EasC 104 日本曲霉
Aj_EasD 105 日本曲霉
Aj_EasH 109 日本曲霉
Aj_EasA 103 日本曲霉
Aj_EasG 108 日本曲霉
基因的克隆：
由美国加利福尼亚州Menlo Park的DNA2.0公司或德国雷根斯堡GeneArt AG产生经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(Seq ID No:102至109)外加翻译终止密码子。在合成期间全部基因在5′端配有包含Hind III限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将基因克隆至酵母表达盒(Seq ID No:110和111)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母启动子和终止子。全部盒均旁侧具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(Seq ID No:110和111)包含在基于pUC18的质粒载体(Seq ID No:112)上，其中所述质粒载体之前已经插入了接头(Seq ID No:113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。
基因表达盒用于将两个表达盒分别亚克隆至还含有酵母选择标记基因的指定整合载体(Seq ID No:114、115、117和118)中。克隆方向是头对头，意味着启动子将允许以相反方向转录。标记和表达盒的旁侧具有与宿主基因组DNA具有同源性的序列。通过用Sbf I限制性酶消化整合载体，从基于pUC18的主链释放旁侧有同源序列的包含表达盒和选择标记的最终整合构建体(Seq ID No:114、115、117和118)，并且用于转化酵母。使用标准乙酸锂转化方案(Current Protocols；第13章)。通过PCR验证正确整合，并且用表达Cre重组酶的质粒转化细胞后，以lox方式剔除(切除)选择标记，如通过Sauer，1987所描述。用于整合的靶位点由Flagfeldt，2009描述。
表47中列出整合载体及其整合构建体的SEQ ID。
表47：实施例12中使用的整合载体及其整合构建体
途径组装：
使用来自pEVE2294、pEVE2312、pEVE2343和pEVE2344的构建体(表47)，并且额外地引入3个空质粒pRS313、pRS315和pRS316(上文描述)，将完整的环棒麦角素途径的单个拷贝整合至EYS1456中，制备了酵母株(EYS2006)。所得到的菌株因此含有以下基因的表达盒：
EYS2006：AjDmaW_altC、AfEasF、AjEasE、AjEasC、AjEasD、AjEasA、AjEasG和AjEasH
生长条件：
工程化酵母株EYS2006在含有2％葡萄糖、不含亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的标准SC培养液(ForMedium,Hunstanton,U.K.)中培养。EYS2006的培养物在无甘油或存在2.5％、5％和10％甘油的情况下培养。将0.8mL培养物在30℃于BioLector发酵罐(M2P-labs，Baesweiler，德国)中培养72小时。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC,Waters,Milford,Mass.,美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是AcquityBridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表48：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
12.00 0.400 50.0 50.0
15.00 0.400 0.0 100.0
17.00 0.400 0.0 100.0
17.10 0.400 99.0 1.0
19.00 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
结果：
如上文所述在30℃培养EYS2006。通过LC-MS分析上清液，并且提取环棒麦角素预期质量(m/z＝239.1543+/-0.01Da)的离子色谱图。另外，提取该途径的第二产物狐茅麦角碱(MW241，原因是大约241的m/z)(m/z＝241.1699+/-0.01Da)的色谱图。对峰下面积积分并比较(参见图24)。与对照相比(无甘油情况下培养的EYS2006)，在甘油存在情况下培养的培养物产生更多的环棒麦角素和狐茅麦角碱。在测试的条件下，化合物生产水平随甘油浓度增加而增加，在10％甘油获得最高生产水平。
实施例13：通过表达多拷贝来自异源CCL途径的基因并过量表达宿主Pdi1和Fad1，增加环棒麦角素产生
材料与方法：
这些实验中使用的基础酵母株EYS1456具有以下基因型：
CEN.PK 111-61A(MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52)
表49中列出实施例13中使用的基因：
表49：实施例13中使用的基因清单
基因名 Seq.ID No: 序列来源
Aj_DmaW_altC 102 日本曲霉
Af_EasF 107 烟曲霉
Aj_EasE 106 日本曲霉
Aj_EasC 104 日本曲霉
Aj_EasD 105 日本曲霉
Aj_EasH 109 日本曲霉
Aj_EasA 103 日本曲霉
Aj_EasG 108 日本曲霉
Sc_Pdi1 166 酿酒酵母
Sc_Fad1 167 酿酒酵母
基因的克隆：
经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(SeqID No:102至109)外加翻译终止密码子。从基因组DNA扩增天然酵母(酿酒酵母)基因Pdi1(Seq ID No:166)和Fad1(Seq ID No:167)。在合成期间全部基因在5′端配有包含Hind III限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将基因克隆至酵母表达盒(Seq ID No:110、111、159和168)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母启动子和终止子。全部盒均旁侧具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(Seq ID No:110、111、159和168)包含在基于pUC18的质粒载体(Seq ID No:112)上，其中所述质粒载体之前已经插入了接头(Seq ID No:113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。
基因表达盒用于将一个、两个或三个表达盒亚克隆至还含有酵母选择标记基因的指定整合载体(Seq ID No:114、115、117、118、160、169、170和171)中。标记和表达盒的旁侧有与宿主基因组DNA具有同源性的序列。通过用Sbf I限制性酶消化整合载体，从基于pUC18的主链释放旁侧有同源序列的包含表达盒和选择标记的最终整合构建体(Seq ID No:114、115、117、118、160、169、170和171)，并且用于转化酵母。使用标准乙酸锂转化方案(CurrentProtocols；第13章)。通过PCR验证正确的整合。用于整合的靶位点由Flagfeldt，2009描述。表50a和表50b中列出整合载体及其整合构建体的SEQ ID。
表50a：整合载体及其整合构建体第1部分
表50b：整合载体及其整合构建体第2部分
途径组装：
通过将完整环棒麦角素途径单拷贝(EYS1934)或完整途径外加CCL途径基因和宿主基因的额外拷贝整合至EYS1456中，制备三个酵母株。因此，通过整合来自pEVE2294、pEVE2312、pEVE2343和pEVE2344的构建体，制备EYS1934(表50)；通过整合来自pEVE2294、pEVE2312、pEVE2343、pEVE2344、pEVE2656和pEVE2658的构建体，制备EYS2209(表50a和50b)，并且通过整合来自pEVE2294、pEVE2312、pEVE2343、pEVE2344、pEVE2656、pEVE2658、pEVE2682和pEVE2723的构建体，制备EYS2297(表50a和50b)。EYS1934已经通过表达Cre重组酶以lox方式剔除(切除)选择标记(Sauer，1987描述)并且充当制备EYS2209和EYS2297的中间体。所得到的菌株因此含有以下基因的表达盒：
EYS1934：AjDmaW_altC、AfEasF、AjEasE、AjEasC、AjEasD、AjEasA、AjEasG和AjEasH
EYS2209：AjDmaW_altC、AfEasF、AjEasE、2x AjEasC、AjEasD、AjEasA、AjEasG、AjEasH、ScPdi1和ScFad1
EYS2325：2x AjDmaW_altC、AfEasF、2x AjEasE、3x AjEasC、AjEasD、AjEasA、AjEasG、3x AjEasH、ScPdi1和ScFad1
生长条件：
工程化酵母株EYS1934和EYS2209在BioLector(M2P labs，Baesweiler，德国)中于含有2％葡萄糖的标准SC+all培养液(ForMedium,Hunstanton,U.K.)中培养。为了延长生长期，将10％甘油添加至生长培养基。将培养物在30℃培养72小时，伴随恒定振摇。随后，以相同条件培养EYS2209和EYS2297。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000xg离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC,Waters,Milford,Mass.,美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是AcquityBridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表51：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
12.00 0.400 50.0 50.0
15.00 0.400 0.0 100.0
17.00 0.400 0.0 100.0
17.10 0.400 99.0 1.0
19.00 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
结果：
通过LC-MS分析EYS1934和EYS2209的培养上清液，并且提取环棒麦角素预期质量(m/z＝239.1543+/-0.01Da)的离子色谱图。对峰下面积积分，并且结果的比较显示EYS2209中的环棒麦角素的产生与EYS1934相比增加(图25，左侧)并且在这些条件下达到几乎12mg/L的滴度。与EYS1934相比，认为这种增加是EYS2209中表达Aj_EasC、Sc_Pdi1和Sc_Fad1额外拷贝的效果。
使用相同的生长条件以及提取方法和分析方法，比较EYS2209和EYS2297，并且这种比较显示与EYS2209相比，EYS2297中的CCL滴度进一步增加，直至22mg/L(图25，右侧)。与EYS2209相比，认为这种增加是EYS2297中表达Aj_DmaW_altC、Aj_EasC、Aj_EasE和Aj_EasH(x2)额外拷贝的效果。
实施例14：通过连续补料葡萄糖，增加环棒麦角素产生。
材料与方法：
这些实验中使用的酵母株EYS2325具有以下基因型：
MATα MAL2-8C SUC2 his3Δ1 leu2-3_112 ura3-52 YERCΔ8：：AjEasC/KanMXYHRCΔ14：：ScPdi1/ScFad1/BleR YMRWΔ15：：AjEasH/AjDmaW/HygR YN-RCΔ9：：AjEasH/AjEasC/AjEasE/Nat YORWΔ17：：AjDmaW/AfEasFYORWΔ22：：AjEasH/AjEasDYPRCt3：：AjEasG/AjEasA YPRCΔ15：：AjEasE/AjEasC[ARS/CEN/URA3][ARS/CEN/HIS3][ARS/CEN/LEU2]
通过用3个空质粒pRS313、pRS315和pRS316(Sikorski，1989)转化菌株EYS2297(实施例13中描述)以使该菌株成为原养型，制备酵母株EYS2325。
将菌株EYS2325的CCL生产与生物量生产(内部观察结果)偶联，因此我们建立旨在产生高生物量的补料分批发酵过程。选择常规补料方案，并且通气方案和搅拌方案旨在避免发酵型代谢以及使葡萄糖积累和乙醇和/或乙酸盐形成最小化。
使用合成性完全培养基(SC)，以分批方式开始该过程；之后开始补料，所述补料含有葡萄糖、盐、维生素、痕量金属和氨基酸。用于所述发酵过程的平台是来自瑞士博特明根Infors AG的Multifors 2，其使用最大工作容积1L的容器。起始体积是0.32L，并且在补料期间，使用预定指数补料方案，添加总计435.6mL补料，导致终体积大约755mL的发酵液。
种子培养物
在发酵罐接种之前选择两阶段种子培养(seed train)。从新鲜培养的平板开始，通过接种4挡板(锯齿形)式500mL摇瓶中的100mL培养基，制备第一种子培养物。培养基由含20g/L葡萄糖的SC-His-Leu-Ura-培养基(ForMedium，Hunstanton，U.K.)组成。将摇瓶30℃置于振摇台上160转/分钟。将细胞培养至指数期直至OD600是大约0.5——这在葡萄糖耗尽之前。使用第一种子培养物，随后在4挡板(锯齿形)式500mL摇瓶中用足以达到初始OD6000.025的接种物制备第二100mL SC-His-Leu-Ura-培养基种子培养物。将细胞培养至指数期直至OD600达到3.2——这在葡萄糖耗尽之前。
分批发酵阶段
发酵在最大工作容积1L的Multifors 2发酵罐(瑞士博特明根Infors AG)中进行。该发酵罐配备两套Rushton六叶片和4块挡板。空气用于发酵罐通气。培养期间自始至终控制温度、pH、搅拌和通气速率。温度维持在20℃。通过自动添加5M NH4OH或0.5M HCl，将pH维持在5.85。搅拌器速度设定为800转/分钟并且通气速率维持在1vvm[L气体/(L液体x分钟)]。发酵以38小时的分批发酵开始，起始体积为0.32L SC-His-Leu-Ura，20g/L葡萄糖和0.01％消泡液(AF204，Sigma)。在接种之前，取出发酵罐中的10mL培养基。接下来，10mL等分试样的第二阶段种子培养物(见上文)用于接种发酵罐至终体积0.32L。因此，接种比例是3％(v/v)，产生初始0.1的OD600。
补料组成和一般条件
在38小时分批发酵时间后，补料始于葡萄糖，维生素，痕量金属和盐的混合物，进一步用氨基酸富化(参见表52、表53和表54)。
表52：补料分批培养中所用补料混合物的组成，其中以NH4OH作为氮源
成分 浓度(g/l)
总碳源 600
葡萄糖*H20 660
YNB无氨基酸和铵 10.2
SC撤除成分混合物(-His-Leu-Met-Trp-Ura) 3.9735
L-甲硫氨酸 0.2568
L-色氨酸 0.2568
KH2PO4 10.8
MgSO4*7H2O 6.12
K2SO4 4.2
Na2SO4 0.336
痕量金属原液(见表53) 15(ml)
维生素原液(见表54) 15(ml)
表53：痕量金属原液
化合物 浓度(g/l)
Na2EDTA+2H2O 15
ZnSo4*7H2O 4.5
FeSO4*7H2O 3
CaCl2*2H2O 3
MnCl2*4H2O 1
CoCl2*6H2O 0.32
CuSO4*5H2O 0.3
Na2MoO4*H2O 0.4
H3BO3 1
Kl 0.1
表54：维生素原液
化合物 浓度(g/l)
D-生物素 0,1
Ca-泛酸盐 2
硫胺素-HCl 2
吡哆醇-HCl 2
烟酸 2
对氨基苯甲酸 2
m-肌醇 0.05
在所述补料阶段期间，使用氢氧化铵(5M NH4OH)作为氮源和控制pH的碱。用来控制pH的酸是0.5M HCl。空气用于生物反应器通气。培养期间自始至终控制温度、pH、搅拌和通气速率。温度维持在20℃。通过自动添加5M NH4OH或0.5M HCl，将pH维持在5.85。搅拌器速度起初设定为800转/分钟并且通气速率起初设定为1.0vvm。根据时间方案(见下文)，逐步手工增加搅拌器速度，达到最大值1200转/分钟。逐步手工增加通气以维持体积及生物量增加期间的足够通气速率(见下文)。通气和搅拌的管理旨在防止溶解氧(DO)降到10–20％以下。补料分批阶段期间的一般运行条件是：液体体积：0.32-0.755L，温度20℃，pH 5.85，搅拌速度800-1200转/分钟和空气流速1-2vvm。
根据下文给出的补料方案，预计的补料总添加量是72小时内435.6mL。气体的滞留量并未过多，但是仍然预计增进实际体积多达10％。通过向补料分批培养的初始分批阶段中所用的“SC-His-Leu-Ura”培养基添加消泡剂，控制泡沫的形成和气体滞留。一日2次抽取样品并分析CCL产生。生物量增加主要通过OD600增加来跟踪。
补料方案
对于补料阶段，使用预定的指数补料方案，所述方案不受任何类型的调定点如溶解氧或其他任何因素控制。表55中显示指数补料概况，并且表56中给出搅拌速率和通气速率。
表55：补料分批培养的补料阶段期间的补料概况
时间 F(t) F(t) 时间 F(t) F(t) 时间 F(t) F(t)
t(h) mL/h mL/min t(h) mL/h mL/min t(h) mL/h mL/min
38 0.6 0.01 62 2.1 0.035 86 6.9 0.115
39 0.7 0.011 63 2.2 0.037 87 7.3 0.121
40 0.7 0.012 64 2.3 0.038 88 7.6 0.127
41 0.7 0.012 65 2.4 0.04 89 8 0.134
42 0.8 0.013 66 2.5 0.042 90 8.4 0.141
43 0.8 0.013 67 2.7 0.045 91 8.9 0.148
44 0.8 0.014 68 2.8 0.047 92 9.3 0.156
45 0.9 0.015 69 3 0.049 93 9.8 0.164
46 0.9 0.016 70 3.1 0.052 94 10.3 0.172
47 1 0.016 71 3.3 0.054 95 10.8 0.181
48 1 0.017 72 3.4 0.057 96 11.4 0.19
49 1.1 0.018 73 3.6 0.06 97 12 0.2
50 1.1 0.019 74 3.8 0.063 98 12.6 0.21
51 1.2 0.02 75 4 0.067 99 13.2 0.221
52 1.3 0.021 76 4.2 0.07 100 13.9 0.232
53 1.3 0.022 77 4.4 0.074 101 14.6 0.244
54 1.4 0.023 78 4.6 0.077 102 15.4 0.257
55 1.5 0.024 79 4.9 0.081 103 16.2 0.27
56 1.5 0.026 80 5.1 0.085 104 17 0.284
57 1.6 0.027 81 5.4 0.09 105 17.9 0.298
58 1.7 0.028 82 5.7 0.094 106 18.8 0.313
59 1.8 0.03 83 6 0.099 107 19.8 0.329
60 1.9 0.031 84 6.3 0.104 108 20.8 0.346
61 2 0.033 85 6.6 0.11 109 21.8 0.364
表56：补料分批培养的补料阶段的运行条件
孵育(h) 补料 搅拌器速度和通气的改变
37.99 起始
68.56 搅拌器从800rpm增加至1000rpm
68.57 流速从0.32NL/min增加至0.5NL/min
69.06 搅拌器从1000rpm增加至1100rpm
92.89 流速从0.5NL/min增加至1NL/min
92.9 搅拌器从1100rpm增加至1200rpm
97.89 流速从1NL/min增加至1.5NL/min
109.99 终止
116.31 发酵结束
分析程序：
样品制备：将发酵期间取得的酵母样品以1000x g离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTMUltra Performance LC,Waters,Milford,Mass.,美国)，后者与micrOTOF-Q II(BrukerDaltonik GmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是Acquity Bridged EthylHybrid(BEH)C181.7μm 2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表57：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
12.00 0.400 50.0 50.0
15.00 0.400 0.0 100.0
17.00 0.400 0.0 100.0
17.10 0.400 99.0 1.0
19.00 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
结果
测量CCL和狐茅麦角碱(FCL)的产生，并且将化合物滴度/小时相对于细胞密度(OD600)作图(参见图26)。证实两种化合物的增加均与细胞质量的增加相关。在Ultrospec10细胞密度计(Amersham Biosciences)中，通过乘以系数0.49，将OD600换算成细胞干重(CDW)，估计了生物量的增加。
采用该发酵过程获得的CCL的浓度，在澄清培养液中(即在移除细胞后)测量，是大约789mg/L(参见图26)。尽管还在胞内检出部分的CCL，但是我们仍然能够从澄清的培养液分离大部分CCL。此外，产生了大约114mg/L FCL。
总之，结果显示，在受控补料分批发酵过程期间增长EYS2325的细胞质量可以增加CCL和FCL的产生。
实施例15：在遗传背景不同的酵母株中产生环棒麦角素
材料与方法：
表58中列出本实验中使用的酵母株：
表58：本实验中分析了用两种质粒HRT1和HRT5转化的7个不同遗传背景的菌株
表59中列出实施例15中使用的基因：
表59：实施例15中使用的基因清单
基因名 Seq.ID No: 序列来源
Cp_DmaW 123 麦角菌
Af_EasF 102 烟曲霉
Aj_EasE 106 日本曲霉
Aj_EasC 104 日本曲霉
Aj_EasD 105 日本曲霉
Aj_EasH 109 日本曲霉
Aj_EasA 103 日本曲霉
Aj_EasG 108 日本曲霉
基因的克隆：
经密码子优化以便在酵母中表达的合成性基因。所述基因编码氨基酸序列(SeqID No:123和102至109)外加翻译终止密码子。在合成期间全部基因在5′端配有包含HindIII限制性识别位点的DNA序列AAGCTTAAA，并且在3′端配有包含Sac II限制性识别位点的DNA序列CCGCGG。使用Hind III和Sac II，将基因克隆至酵母表达盒(Seq ID No:110、111、124和172)中，所述酵母表达盒含有由包含Hind III和Sac II的多克隆位点分隔的天然酵母启动子和终止子。全部盒均旁侧具有Asc I限制性位点。所述基因表达盒(Seq ID No:110、111、124和172)包含在基于pUC18的质粒载体(Seq ID No:112)上，其中所述质粒载体之前已经插入了接头(Seq ID No:113)以提供Asc I位点用于克隆表达盒。
将基因表达盒亚克隆至基于pUC18的重组载体中，每个重组载体都于中心具有旁侧带有Asc I位点和Mlu I位点的120bp同源重组标签(HRT)序列。这些HRT被设计成第一标签的后半部分与第二标签的前半部分相同，以此类推。
三个辅助片段用来装配两个质粒，所述质粒一起构成完整CCL途径：一个辅助片段包含酵母营养缺陷型标记和细菌pMB1复制起点。第二辅助片段包含用于酵母中复制的ARS4/CEN6序列和细菌氯霉素耐药标记。两个片段均具有侧翼HRT。第三片段设计成仅具有被600bp短间隔序列分隔的HRT。全部辅助片段之前均已经克隆在基于pUC18的主链中以便在大肠杆菌中扩增。全部片段均克隆在Asc I位点中，从该位点可以将它们切出。
为了制备两个质粒CCL-HRT1和CCL-HRT5(Seq ID No:173和174)，来自三个辅助质粒的质粒DNA与包含CpDmaW、AfEasF、AjEasE和AjEasC的质粒DNA(对于CCL-HRT1)、或与包含AjEasD、AjEasG、AjEasH和AjEasA的质粒DNA(对于CCL-HRT5)混合。用Asc I消化质粒DNA的混合物。这从质粒主链释放全部片段，并且产生在末端具有HRT的片段，这些片段依次与下一个片段的HRT重叠。酵母株EYS1456用消化的混合物分别转化，通过同源重组在体内装配质粒CCL-HRT1和CCL-HRT5，如Shao2009所描述。将这两个质粒从酵母转化体分离并且复转化至允许容易扩增和纯化质粒DNA的大肠杆菌中。将两个质粒CCL-HRT1和CCL-HRT5共转化至一组酵母株中(表58)。
生长条件：
包含两个载体CCL-HRT1和CCL-HRT5的工程化酵母株在不含亮氨酸和尿嘧啶、含有2％葡萄糖的3mL标准SC培养液(ForMedium,Hunstanton,U.K.)中培养。将培养物在20℃培养96小时，伴随恒定振摇。
分析程序：
样品制备：将酵母培养物以1000x g离心10分钟。将沉淀物和上清液分开。在不作进一步纯化的情况下，将5μL上清液上样于UPLC-TOF中(Waters AcquityTM UltraPerformance LC,Waters,Milford,Mass.,美国)，后者与micrOTOF-Q II(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,德国)偶联。固定相：柱是Acquity Bridged Ethyl Hybrid(BEH)C181.7μm2.1x100mm。液相色谱法：流动相A：H2O+0.1％甲酸。流动相B：乙腈+0.1％甲酸。运行条件：
表60：
时间(min) 流速(mL/min) ％流动相A ％流动相B
T＝0 0.400 99.0 1.0
12.00 0.400 50.0 50.0
15.00 0.400 0.0 100.0
17.00 0.400 0.0 100.0
17.10 0.400 99.0 1.0
19.00 0.400 99.0 1.0
PDA参数：λ范围：210nm至500nm。分辨率：1.2nm。采样速率：5个点/秒。ELSD参数：增益：50，气压：40psi，雾化器模式：加热，功率水平：80％，漂移管：80℃。TOF参数：来源：终板补偿：-500V。毛细管电压：-4500V。雾化器：1.6巴。干燥气：8.0L/分钟。干燥温度：180℃。扫描模式：MS扫描质量范围：80至1000m/z。
结果：
通过LC-MS分析全部菌株的上清液，提取环棒麦角素预期质量(m/z＝239.1543+/-0.01Da)和狐茅麦角碱预期质量(m/z＝241.1699+/-0.01Da)的离子色谱图。将峰下面积积分，基于内标物计算CCL和FCL的产生。比较CCL和FCL的量(图27)，显示全部菌株中均产生两种化合物，但是以不同的量产生。这些结果显示CCL和FCL产生不依赖于特定酿酒酵母株或基因型。
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Claims (21)

1.一种酵母，其包含
a)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasH活性的多肽的多核苷酸，所述多肽由与SEQ ID NO:8和/或95具有至少99％或100％序列同一性且来源于日本曲霉菌株或Paecilomyces divaricatus菌株的氨基酸序列组成；以及
b)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasA还原酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽由与SEQ ID NO:2具有至少99％或100％序列同一性且来源于日本曲霉菌株的氨基酸序列组成，以及
c)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasG活性的多肽的多核苷酸，所述多肽由与SEQ ID NO:7具有至少99％或100％序列同一性且来源于日本曲霉菌株的氨基酸序列组成；以及
d)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasD活性的多肽的多核苷酸，所述多肽由与SEQ ID NO:4具有至少99％或100％序列同一性且来源于日本曲霉菌株的氨基酸序列组成，以及
e)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasC活性的多肽的多核苷酸，所述多肽由与SEQ ID NO:3具有至少99％或100％序列同一性且来源于日本曲霉菌株的氨基酸序列组成；以及
f)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasE活性的多肽的多核苷酸，所述多肽由与SEQ ID NO:5和/或69具有至少99％或100％序列同一性且来源于日本曲霉菌株或Neotyphodium lolii菌株的氨基酸序列组成；以及
g)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有EasF活性的多肽的多核苷酸，所述多肽由与SEQ ID NO:6和/或76具有至少99％或100％序列同一性且来源于日本曲霉菌株或烟曲霉菌株的氨基酸序列组成；以及
h)至少一个表达盒，所述表达盒包含编码具有DmaW活性的多肽的多核苷酸，所述多肽由与SEQ ID NO:19和/或28具有至少99％或100％序列同一性且来源于日本曲霉菌株或麦角菌(Claviceps purpurea)菌株的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的酵母，其包含选自如下化合物组的至少一种化合物：
a)环棒麦角素，
b)狐茅麦角碱，
c)田麦角碱，
d)裸麦角碱醛和
e)裸麦角碱I。
3.重组多核苷酸，其包含权利要求1中描述的(a)的至少一个表达盒、(b)的至少一个表达盒、(c)的至少一个表达盒、(d)的至少一个表达盒、(e)的至少一个表达盒、(f)的至少一个表达盒、(g)的至少一个表达盒和(h)的至少一个表达盒。
4.权利要求3的重组多核苷酸，其中所述重组多核苷酸是载体。
5.用于产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者的方法，包括：
a)培养根据权利要求1或2所述的酵母，其中所述培养在允许该酵母中产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者的条件下进行；和
b)从该酵母和/或培养基获得所述环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛和/或裸麦角碱I。
6.用于产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者的方法，包括：
a)培养根据权利要求1或2所述的酵母，其中所述培养在允许该酵母中产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者的条件下进行；
b)通过培养基向所述酵母提供选自IPP、色氨酸、DMAPP、DMAT、Me-DMAT或裸麦角碱I的至少一种化合物，和
c)从该酵母和/或培养基，获得所述环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中产生并获得环棒麦角素。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其中将裸麦角碱醛提供给培养基并且产生和获得环棒麦角素。
9.根据权利要求5或6所述的方法，其中将裸麦角碱I提供给培养基并且产生和获得环棒麦角素。
10.根据权利要求5或6所述的方法，其中将Me-DMAT提供给培养基并且产生和获得环棒麦角素。
11.根据权利要求5或6所述的方法，其中将DMAT提供给培养基并且产生和获得环棒麦角素。
12.根据权利要求5或6所述的方法，其中在10℃至40℃之间的温度培养该酵母。
13.根据权利要求5或6所述的方法，其中在10℃和32℃之间的温度培养该酵母。
14.根据权利要求5或6所述的方法，其中将所述酵母首先在25℃和40℃之间的温度培养，随后在10℃和25℃之间的温度培养，或其中将所述酵母首先在10℃和25℃之间的温度培养，随后在25℃和40℃之间的温度培养。
15.根据权利要求5或6所述的方法，其中将所述酵母首先在25℃和35℃之间的温度培养，随后在15℃和25℃之间的温度培养，或其中将所述酵母首先在15℃和25℃之间的温度培养，随后在25℃和35℃之间的温度培养。
16.根据权利要求5或6所述的方法，其中通过提取，获得产生的环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者。
17.根据权利要求5或6所述的方法，其中通过提取方法获得环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者，所述提取方法包括用选自以下的化合物提取：乙酸乙酯(EA)、叔丁基甲基醚(TBME)、氯仿(CHCl3)和二氯甲烷(DCM)。
18.根据权利要求5或6所述的方法，其中通过提取方法获得环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者，所述提取方法包括在pH＝10采用乙酸乙酯的液体/液体提取法。
19.根据权利要求5或6所述的方法，其中通过提取方法获得环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者，所述提取方法包括用基于二氧化硅的树脂材料采用固相提取法的提取。
20.根据权利要求1或2所述的酵母或根据权利要求3或4所述的重组多核苷酸用于产生环棒麦角素、狐茅麦角碱、田麦角碱、裸麦角碱醛或裸麦角碱I中至少一者的用途。
21.根据权利要求1或2所述的酵母或根据权利要求3或4所述的重组多核苷酸用于根据权利要求5至19中任一项所述的方法中的用途。
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