CN113174399A - 重组酿酒酵母菌株及其发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及合成生物学领域，具体涉及重组酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)及其发酵方法。本发明确定了前体底物与甲基供体对整条异源路径的必要性，以及田麦角碱的异源合成路径对内源代谢产生了辅因子不平衡扰乱，为后续继续优化提产田麦角碱提供了有利证据。本发明的重组酿酒酵母菌株相对于现有报道的菌株产量显著提高。

Description

重组酿酒酵母菌株及其发酵方法

技术领域

本发明涉及合成生物学领域，特别涉及重组酿酒酵母菌株及其发酵方法。

背景技术

麦角生物碱主要是曲霉(Aspergillus)，麦角菌属(Claviceps)，以及内生真菌(Neotyphodium)这三类真菌的次生代谢产物，它是一类具有较强药理活性的真菌类吲哚类生物碱天然产物，是治疗偏头痛、子宫出血、帕金森症和其他疾病的治疗药物的原料。生物碱类药物通常从植物提取的起始原料中半合成，这往往限制了它们的可用性和最终价格。近年来合成生物学的进展使得将完整的植物途径引入微生物中来生产植物生物碱成为可能。

微生物生产改性生物碱具有加速生物碱类药物半合成的潜力，它提供了结构上更接近最终药物的高级中间体，可作为新型药物合成的高级中间体。几十年来，人们对麦角生物碱进行了深入的研究，主要是因为它们在受污染的食品和饲料中的有害作用，但也因为它们在医药和农业方面的有益应用。

麦角生物碱合成的源头底物为色氨酸和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)，尽管目前其生物合成路径中的共同前体可以确定为裸麦角碱，但是裸麦角碱的下游合成路径并不是十分清晰，具体的催化机理，反应机制不清楚。而涉及chanoclavine-I形成的一共需要四个酶，分别为dmaw和easF、EasE和EasC，dmaw和easF这两步酶不是限制chanoclavine-I形成的因素，关键是EasE和EasC的研究。2014年，CurtAF Nielsen等研究者成功地在酿酒酵母中以色氨酸和DMAPP合成了裸麦角碱，筛选到来自日本曲霉的EasE和EasC这两个蛋白实现了裸麦角碱的合成，使得EasE和EasC在酵母异源中表达成为可能，关键酶EasE和EasC的研究依赖于真菌的基因互补，但进一步的表征则受到EasE蛋白表达困难的阻碍。最终发现EasE的N端ER靶向信号肽对在酵母中表达活性有影响，研究者对EasE信号肽做了截短验证，并没有将其他酶共同作细胞器定位尝试。2015年，Dorota Jakubczyk等研究者在酿酒酵母中实现了从头合成cycloclavine，裸麦角碱的一步下游产物，通过增加了三个拷贝数的dmaw、四个拷贝数的easC实现了cycloclavine产量为529mg/L，裸麦角碱产量为0.75mg/L，平行副产物羊茅麦角碱89mg/L，发酵优化发现低温22℃对EasE和EasC催化速率有明显提高使得chanoclavine-I产量翻了十几倍。2010年，JohnathanZ.Cheng等研究者发现在麦角生物碱合成路径中EasA是一个重要的分支控制点，序列比对发现easA与黄素酶高度同源，EasA负责两个功能分别为异构化和还原性。2011年，Marco Matuschek等研究者通过在大肠杆菌中表达获得可溶性蛋白EasG，体外通过控制还原性谷胱甘肽(GSH)的量与NADPH，裸麦角碱醛混合孵育，最终获得田麦角碱。在麦角生物碱合成路径中GSH替代了EasA的作用，对此说明EasA的具体催化机理或者说裸麦角碱醛到田麦角碱的催化机制依然是不清楚的。2019年，YongpengYao等研究者又进一步解析了EasC的催化反应机制，EasC主要负责麦角生物碱中心碳环的生物合成，研究者提出自由基理论，解释了EasC的双功能——过氧化氢酶和单加氧酶功能。到目前为止，在异源宿主中进行合成田麦角碱的难度在于EasA酶的功能分配，还原性功能的表达将裸麦角碱醛流向羊茅麦角碱，已实现了89mg/L的滴度。

田麦角碱作为麦角生物碱合成路径上一个重要分支点走向的中间产物，对开发生物合成麦角酸衍生物系列占有举足轻重的地位，而在麦角生物碱中麦角酸衍生物是主要用于医药开发的一类，到目前为止在酿酒酵母中还未实现其全合成，因此田麦角碱的异源表达成功对下游麦角生物碱的研究具有十分重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明通过饲喂色氨酸和SAM优化发酵培养基以及调节内源辅因子平衡，提供一株高产田麦角碱的重组酿酒酵母菌株。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了辅因子调节酶在合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物中的应用；

所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；

所述药物包括麦角酸衍生物；

所述辅因子调节酶包括UTR1，MAE1，POS5或PYC2中的一种或多种的组合酶。

在本发明的一些具体实施方案中，经两种NADH激酶(UTR1，POS5)，苹果酸酶(MAE1)，丙酮酸激酶(PYC2)中的一种或两者以上的组合酶调节内源辅因子平衡。

本发明还提供了表达盒，在功能表达盒WN414中插入UTR1，MAE1，POS5或PYC2中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述插入的位置包括Pgal1-TDH1t之间。

此外，本发明还提供了质粒，转化所述表达盒。

本发明还提供了菌株，转化所述质粒。

在本发明的一些具体实施方案中，所述菌株包括第一表达模块、第二表达模块、第三表达模块和/或内源模块；

所述第一表达模块包括dmaW-easF；所述第一表达模块的整合位点包括XV染色体的Δ22位点；和/或

所述第二表达模块包括easE-easC；所述第二表达模块的整合位点包括XVI染色体的Δ15位点；和/或

所述内源模块包括ero1-fad1；所述内源模块的整合位点包括VIII染色体的Δ14位点；和/或

所述第三表达模块包括：

来源于C.fusiformis、Claviceps purpurea或N.lolii的easA；和/或

来源于Claviceps purpurea、Aspergillus fumigatus或N.lolii的easG；和/或

来源于Claviceps purpurea或Aspergillus fumigatus的easD；

其中，来源于Claviceps purpurea或Aspergillus fumigatus的easD的整合位点包括GAL1/7/10。

作为优选，所述菌株包括第一表达模块、第二表达模块、第三表达模块和/或内源模块；

所述第一表达模块包括dmaW-easF；所述第一表达模块的整合位点包括XV染色体的Δ22位点；和/或

所述第二表达模块包括easE-easC；所述第二表达模块的整合位点包括XVI染色体的Δ15位点；和/或

所述内源模块包括ero1-fad1；所述内源模块的整合位点包括VIII染色体的Δ14位点；和/或

所述第三表达模块包括：

来源于C.fusiformis的easA；和/或

来源于Claviceps purpurea的easG；和/或

来源于Claviceps purpurea的easD；

其中，来源于Claviceps purpurea的easD的整合位点包括GAL1/7/10。

此外，本发明还提供了添加前体底物和/或甲基供体在合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物中的应用；

所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；

所述药物包括麦角酸衍生物；

所述前体底物包括L-色氨酸；和/或

所述甲基供体包括SAM。

在本发明的一些具体实施方案中，所述色氨酸的浓度包括2～10g/L。

在本发明的一些具体实施方案中，所述色氨酸的浓度包括8g/L。

作为优选，所述SAM的浓度包括10～50mg/L。

作为优选，所述SAM的浓度包括20mg/L。

基于上述研究，本发明还提供了培养基，包括前体底物和/或甲基供体；

所述前体底物包括L-色氨酸；和/或

所述甲基供体包括SAM。

此外，本发明还提供了合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物的方法，取所述的菌株，经所述的培养基培养，获得田麦角碱；取所述田麦角碱制备获得麦角生物碱和/或药物；所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；所述药物包括麦角酸衍生物。

本发明提供了优化生产田麦角碱的重组酿酒酵母菌株的方法，包括如下步骤：(1)以实验室一株生产田麦角碱的菌株作为出发菌株进行辅因子平衡调节，鉴于关键分支点田麦角碱与羊矛麦角碱的分配，EasA酶涉及到不同辅因子的结合催化以及整条外源路径的嵌入对宿主代谢的影响，我们选择了两种NADH激酶(UTR1,POS5)和苹果酸酶(MAE1)，丙酮酸激酶(PYC2)进行内源辅因子调节平衡，以此改善田麦角碱的产量；(2)以实验室一株生产田麦角碱的菌株作为出发菌株进行优化提产，首先是对反应底物L-色氨酸进行了外添加优化，其次针对easF催化的反应涉及到甲基供体SAM进行了外添加优化，最后筛选得到一株高产田麦角碱的重组酿酒酵母菌株。

本发明的有益效果包括但不限于：本发明确定了前体底物与甲基供体对整条异源路径的必要性，以及田麦角碱的异源合成路径对内源代谢产生了辅因子不平衡扰乱，为后续继续优化提产田麦角碱提供了有利证据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示利用重组酿酒酵母合成田麦角碱的路径图；

图2示辅因子模块构建的过程图；

图3示内源辅因子调节对田麦角碱影响的结果图；

图4示优化L-色氨酸外添加产生的田麦角碱结果图；

图5示优化甲基供体SAM的外添加产生的田麦角碱结果图。

具体实施方式

本发明公开了重组酿酒酵母菌株及其发酵方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的重组酿酒酵母菌株及其发酵方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1产田麦角碱的重组酿酒酵母的获得

由元英进课题组提供，菌株编号为SyBE_Sc06130032。该重组酿酒酵母所包含的基因改造为：在XV染色体的Δ22位点插入dmaW-easF，将easE-easC插入到XVI染色体的Δ15位点，将ero1-fad1插入到VIII染色体的Δ14位点,将easD插入GAL1/7/10位置，easG-Pgal110-easA连入wn416功能盒中，以质粒的形式存在。

具体步骤为：

高产DMAPP重组酿酒酵母(底盘菌株)的获得

底盘菌株由天津大学元英进课题组提供，菌株编号为yCTH。该重组酿酒酵母所包含的基因改造为：在GAL80处通过强启动子GAL110过表达了IDI1和tHMGR，通过弱启动子HXT1p替换原ERG20启动子下调ERG20的表达。

外源功能基因元件的获得

外源基因为dmaW(来源：Aspergillus japonicus)，easF(来源：Aspergillusfumigatus)，easE(来源：Aspergillus japonicus)，easC(来源：Aspergillus japonicus)，easD(来源：Aspergillus fumigatus、简写为Af；Claviceps purpurea、简写为Cp)，easG(来源：Claviceps purpurea、简写为Cp；Aspergillus fumigatus、简写为Af；N.lolii、简写为NI)，easA(来源：Claviceps purpurea、简写为Cp；C.fusiformis、简写为Cf；N.lolii、简写为NI)，其均经过酿酒酵母密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后，在基因两端额外添加5’端GCGGCCGCGGTCTCCA，3’端TAA AGGAGACCGCGGCCGC通过人工合成得到。dmaW:如SEQID No.1所示

GCGGCCGCGGTCTCCAATGACAGCCGGTCAAGGTATAAAAACAGGTAATGCTTCAGATTGTGAAGTCTACAGAACATTGTCCGTCGCCTTGGACTTTGCCAACCAAGACGAAGAATTGTGGTGGCACTCTACTGCTCCAATGTTTGCTCAAATGTTGCAAAGTACTAATTACAATTTGCACGCTCAATATAAGCATTTGTTGATTTATAAGAAGAACGTCATCCCATTTTTGGGTGTTTATCCTACTAATGATAAGCCAAGATGGTTATCTATTTTGACAAGATATGGTACACCATTCGAATTATCTTTGAACTGTAGTGGTCCTTTGGTCAGATATACTTATGAACCTATTAACGCTGCTACTGGTACTGCAAGAGATCCTTTTAACACCCATGCTGTCTGGGATTCTTTGGAACAATTGATGGCTTTGCAATCAGGTATTGATTTGGATTTGTTTAGACATTTCAAGAACGATTTGACCTTGTCCGCTGAAGAATCTGAATATTTGTATAAAAACAACTTGGTCGGTGAACAAATTAGAACTCAAAATAAATTGGCCTTGGATTTGCAAGATGGTGAATTTGTCGTCAAAACTTATATTTACCCAGCTTTGAAGAGTTTGGCTACCGGTAGATCAATTCATGAATTGGTTTTTGGTTCTGCTTTTAGATGGAGTAAACAATATCCAGAATTGAGAAAGCCATTGGATACTTTGGAACAATACGTTTATAGTAGAGGTCCATCAAGTACAGCTTCTCCAAGATTGTTGTCTTGTGATTTGATTGATCCTACAAAATCTAGAATCAAGATTTATTTGTTGGAAAGAATGGTCACTTTGGAAGCTTTGGAAGATTTGTGGACTATGGGTGGTGAAAGAACTGATGCTTCCACTTTGGCTGGTTTGGAAATGATAAGAGAATTGTGGGAATTGATTAGATTGCCAGCTGGTTTGCAATCTTATCCTGCTCCATATTTGCCAATTGGTACTATACCAGACGAACAATTGCCATTAATGGCTAATTATACTATCCACCATGATGATCCAGTTCCAGAACCTCAAGTTTATTTTACTACTTTTGGTAGAAACGACATGCAAATTGCTGACGCCTTAGCTACTTTTTTTGAAAGAAGAGGTTGGCATGAAATGGCAAGACAATATAAAGCTGAATTGTGTTCTCATTACCCACATGCCGATCATGAAACATTGAACTATTTGCATGCTTATATCTCTTTCTCTTACAGAAAAAATAAACCATATTTGTCTGTTTATTTGCAATCTTTGGAAACTGGTGATTGGGTTACTTCTTCTTTTAATTCTGTTCATGTTGATCCAGGTTTGTCTGCTACTGTTCAAGAATTGTCTAAATTGACTAAAACTGCTGGTACTACTGTTAGAGAAACTAAATTGCCATTGACTCCAGATGGTTCTGAACCAGGTGTTATTACTCAATATTAAAGGAGACCGCGGCCGC

easF:如SEQ ID No.2所示

GCGGCCGCGGTCTCCAATGACAATCTCCGCCCCACCAATTATTGACATTAGACAAGCCGGTTTGGAATCCTCCATTCCAGACCAAGTTGTTGAAGGTTTGACCAAAGAAGTTAAAACCTTGCCAGCATTGTTGTTTTATTCCACTAAAGGTATACAACACTGGAACAGACACTCTCATGCCGCAGATTTTTACCCAAGACACGAAGAATTGTGTATTTTGAAGGCTGAAGCTTCTAAAATGGCTGCTTCTATTGCTCAAGACTCATTAGTTATTGATATGGGTTCCGCTTCTATGGATAAAGTTATTTTGTTATTGGAAGCCTTGGAAGAACAAAAAAAATCTATTACTTATTATGCTTTGGATTTGTCTTATTCTGAATTGGCTTCTAATTTTCAAGCTATTCCAGTTGATAGATTTCATTATGTTAGATTTGCTGCTTTGCATGGTACTTTTGATGATGGTTTGCATTGGTTGCAAAATGCTCCAGATATTAGAAATAGACCAAGATGTATTTTGTTGTTTGGTTTGACTATTGGTAATTTTTCTAGAGATAATGCTGCTTCTTTTTTGAGAAATATTGCTCAATCTGCTTTGTCTACTTCTCCAACTCAATCTTCTATTATTGTTTCTTTGGATTCTTGTAAATTGCCAACTAAAATTTTGAGAGCTTATACTGCTGATGGTGTTGTTCCATTTGCTTTGGCTTCTTTGTCTTATGCTAATTCTTTGTTTCATCCAAAAGGTGATAGAAAAATTTTTAATGAAGAAGATTGGTATTTTCATTCTGAATGGAATCATGCTTTGGGTAGACATGAAGCTTCTTTGATTACTCAATCTAAAGATATTCAATTGGGTGCTCCATTGGAAACTGTTATTGTTAGAAGAGATGAAAAAATTAGATTTGGTTGTTCTTATAAATATGATAAAGCTGAAAGAGATCAATTGTTTCATTCTGCTGGTTTGGAAGATGCTGCTGTTTGGACTGCTCCAGATTGTGATGTTGCTTTTTATCAATTGAGATTGAGATTGAATTAAAGGAGACCGCGGCCGC

easE:如SEQ ID No.3所示

GCGGCCGCGGTCTCCAATGGGTCAATCTAGAGGTATATTAGGTGGTGTTAGACAATTAATTTTGGTCATTTTGGTCGGTGCTTATTTATCTAGATTATCTGCTGTTGATGACGACAGACACGACTGTAGATGTAGACCAGGTGAACCATGTTGGCCAACTGTTTCTCATTGGTCTACTTTGAATGAATCTATTGGTGGTGCTTTGGCTCATGTTAAACCTATTGCTCATGTTTGTCATCAATCTGGTCAAGATTCTTCTGCTTGTGAACAAGTTTTGCAAGAATCTTTGGACTCCAAATGGAGAGCTTCTCATACTGGTGCTTTGCAAGATTGGGTTTGGGAAGGTGGTGCTGAATCTAATCAAACATGTTATTATTTGAGATCCGGTCCAGCTGGTAGTTGTCATCAAGGTAGAATTCCATTGTATTCTGCTGCTGTTAAATCTGCTTCTGATGTTCAAAAAGTTGTTGATTTTACCAGACAACATAACTTGAGATTGGTTATTAGAAACACTGGTCATGATGGTAGTGGTAGATCCTCTGGTCCTGATTCTGTTGAAATTCATACTCATCATTTGAACTCTGTCCAATATCACCCAAATTTCAGACCAGCAGGTTCTTCTGAAAGACAAAGTGCCCCAGGTCAACCAGCTGTTACTGTTGGTGCTGGTATTTTATTGGGTGACTTATACGCTAGAGGTGCTTCTGAAGGTTGGATAGTTGTTGGTGGTGAATGTCCAACTGTAGGTGCTGCTGGTGGTTTTTTGCAAGGTGGTGGTGTTTCTTCTTGGTTGTCTTATGCTCATGGTTTGGCTGTTGATAATGTTTTGGAATATGAAGTTGTCACTGCTAAGGGTGAAATTGTTATTGCTAATGCTCATCAAAACCCTGATTTGTTTTGGGCTTTGAGAGGTGGTGGTGGTGGTACTTTTGGTGTTGTTACTCAAGCTACTTTGCAAGTTCATCCAGATTTGCCAGTTTCTGTTGCTGATGCTGTTGTTACTGGTTCTAGAGCTGATGCTACTTTTTGGTCACATGGTGTTGCTGCTTTGTTGAGAGCATTGCAATTTTTGAATAACCATGGTACTGCTGGTCAATTTATTTTGAGAAATACTGATGACGACACCGTTCAAGCTTCTTTGACTATGTATTTTTCTAACTTGACCGTTCCTGCTGTTGCTGATGAAAGAATGGACCCATTGAGAAGAGCTTTAGAACACAATGGTCACCCATATCAATTGACATCTAGATTTTTGCCTCAAATTTCTTCTACTTTCAGACATACTGCTGATAGATATCCAGAAGATTACGGTATTTTGATGGGTTCTGTTTTGGTTTCTTTGGATTTATTTAACTCCGCTACTGGTCCTGCTGCTTTAGCTCAACACTTTGCTAGATTGCCAATGACTCCAGATGATTTGTTGTTTACTAGTAATTTGGGTGGTAGAGTTTCTTCTTTGAATAGAGATCCAGCTTCTACTGCTATGCATCCAGGTTGGAGAGATGCTGCTCAATTGTTAAATTTTGTTAGAGGTGTTGGTGCTCCTTCTTTGGCTGCTAAGGCTACTGCTTTGCATGAATTGCAAACTGTTCAAATGGCTAGATTGTATGAAATTGAACCAGCTTTTCAAATCAGTTATAGAAATTTGGGTGACCCATCTGAAAGAAGATCAAGAGAAGTTTACTGGGGTTCTAATTATGCTAGATTGGTTGAAGTTAAGAGAAGATGGGACCCAGAAGGTTTGTTTTTTTCCAAGTTGGGTATTGATGGTGATGCTTGGGATGCAGAAGGTATGTGTAGACAAACTAGACAAGGTGCTTGGAATGTTGCTGTTAAATGGGTTCAATCTTTTTTGGGTTCTTTGTCTGCTAGTGTTGTTTAAAGGAGACCGCGGCCGC

easC:如SEQ ID No.4所示

GCGGCCGCGGTCTCCAATGGCACCAGACTCCAAACCAACATATACCACAGCCAACGGTTGCCCATTTCACAAGCCAGAAGGTCCACCAGCAGACGGTAGAACTTTGGCCTTGTCCGATCATCACTTGGTCGACACCTTGGCACATTTTAACAGAGAAAAAATTCCAGAAAGAGTTGTTCATGCTAAAGGTGCTGGTGCTTATGGTGAATTTGAAGTTACTGCTGATATTTCTGATATTTGTGATATTGATATGTTGGTTGGTGTTGGTAAAAAAACTCCATGTGTTACTAGATTTTCTACTACTGGTTTGGAAAGAGGTTCTAATGAAGGTATGAGAGATTTGAAAGGTATGGCTTGTAAATTTTATACTACTGAAGGTAATTGGGATTGGGTTATGTTGAATTTTCCATTTTTTTTTATTAGAGATCCAGTTAAATTTCCATCTTTGATGCATGCTCAAAGAAGAGATCCACAAACTAATTTGTTGAATCCAAATATGTATTGGGATTGGGTTACTAATAATCATGAATCTTTGCATATGGTTTTGTTGCAATTTTCTGATTTTGGTACTATGTTTAATTGGAGATCAATGTCTGGTTATATGGCTCATGCTTATAAATGGGTTAAACCAGATGGTTCTTTTAAATATGTTCATATTTTTTTGTCTTCTGATAGAGGTCCAAATTTTACTGATGGTCAACAAGCTAAAGGTACTAATGATTTGGACCCTGATCATGCTACTAGAGATTTGTATGAAGCTATTGAAAGAGGTGAATATCCAACTTGGACTGCTTCTGTTCAAGTTGTTGATCCAAAAGATGCTCCAAATTTGGGTTATAATATTTTGGATGTTACTAAACATTGGAATTTGGGTACTTATCCAAAAGATGTTACTTTGATTCCACCAAAAGTTTTTGGTAAATTGACTTTGAAAAGAAATCCAGCTAATTATTTTGCTGAAATTGAACAATTGGCTTATTCTCCATCTAATATGGTTCCAGGTGTTGCTCCATCTGAAGATCCAATTTTGCAAGCTAGAATTTTTGCTTATCCAGATGCTCAAAGATATAGATTGGGTGCTAATCATCAACAAATTCCAGTTAATAGATCAGCTCATACTTTTAATCCAATTGCTAGAGATGGTCAAGGTACTTTTGATGCTAATTATGGTGCTCATCCAGGTTTTTTGACTCAACAACAACCAGTTAGATTTGCTGAACCAAGAGAACCAGATCCAAAATATAATGAATGGTTGAAAGAAATTCAATCTAAATCTTGGTTGCAAACTACTGAACATGATTATAAATTTGCTAGAGATTTTTATGAAGTTTTGCCAGATTTTAGAGGTCAAGAATTTCAAGATACTATGGTTCAAAATATGGTTGAATCTGTTGCTCAAACTAGAGCTGAAATTCAAAAACAAGTTTATGAAACTTGGAAATTGGTTTCTCCAGCTTTGGCTGCTAGAATTCAAAAAGGTGTTGAAACTTTGTTGCAAAAATCTGAAGCTCCAGCTGAAGAATCTTTTATTCCAGCTAGATTGTAAAGGAGACCGCGGCCGC

easD_Cp:如SEQ ID No.5所示

GCGGCCGCGGTCTCCAATGCCATCCATGACCTCTAAAGTTTTTGCTATTACTGGTGGTGCTTCTGGTATTGGTGCTGCTACATGTAGATTGTTGGCTGAAAGAGATGCTGCTGTTATTTGTTTGGCTGATGTTTCTTCTACTAATTTTACTTCTTTGCAAGAATCCATTGCTAAATCTAATCCATCTACTTTGGTTCATTGTACTGAATTGGATGTTAGATCAGCTGATAAGGTTGATCAATGGTTGCAATCTATTGTTTCTACTCATGGTGATTTACATGGTGCTGCTAATGTTGCTGGTATTGCTCAAGGTGCTGGTTTGAGAGCTACTCCAACTATTTTGGAAGAAAATGATGCTGAATGGTCTAGAATTTTGGATGTTAATTTGAACGGTGTTTTCTATTCTACTAGAGCTCAAGTTAGAGTTATGAAAGATTTGCCACCAGGTCATAGATCAATTGTTAATGTTGCTTCTATTGCTGCTTTTTCTCATGTTCCAGATGTTTATGCTTATGGTACTTCTAAATCCGCTTGTGCTTACTTGACTACCTGTATTGCTGCTGATGTTTTTTGGTCTGGTATTAGAGTTAATTGTGTTTCTCCTGGTATTACTAACACTCCAATGTTGCCACAATTTGAACCTAAAGCTAAATCTTTGGATGCTATTAAAGATATGTACAGAGATCAAGGTTACCCAACTGGTGAAGCTGATGGTGTTGCTAGAACAATTGTTTGGTTATTGAGTGAAGATTCTATTCCAGTTTACGGTGCTAATATTAATGTTGGTGCTTGTCCACCATAAAGGAGACCGCGGCCGC

easD_Af:如SEQ ID No.6所示

GCGGCCGCGGTCTCCAATGGCATCCGTTGAAAGTAGAATTATTGCTATTACTGGTGGTGCTTCCGGTATTGGTGCTGCTACATGTAGATTGTTGGCTGAAAGAGGTGCTGCTGTTTTGTGTGTTTGTGATATTTCTCCTAAAAACTTCGATGATTTGAAGATTTCTATTAAGAAGATTAACCCATCCACTAAAGTTCATTGTGCTACTGTTGATGTTACATCTTCTGTTGAAGTTAGACAATGGATTGAAGGTATTATTTCTGATTTCGGTGATTTGCATGGTGCTGTTAATGCTGCTGGTATTGCTCAAGGTGCTGGTATGAGAAATACTCCTACAATTGCTGAAGAAGTTGATGAAGAATGGACTAGAATTATGAATACTAACTTGAACGGTGTTTTCTATTGTACTAGAGAAGAAGTTAGAGCTATGAAAGGTTTGCCAGCTACTGATAGATCCATTGTTAATGTTGGTAGTATTGCTTCTGTTTCCCATATGCCAGATGTTTACGCTTATGGTACCTCTAAAGGTGCTTGTGCTTATTTTACCACTTGTGTTGCTGCTGATGCTTTTCCTTTGGGTATTAGAATTAATAACGTTTCTCCTGGTGTTACTAATACTCCAATGTTGCCACAATTTGCTCCTATGGCTAAGACTTTTGAAGAAATTGAAGAATCTTACAAGAAGGAAGGTTTGTCTTTGATTGAAGCAGAAGATGTTGCTAGAACTATTGTTTGGTTGTTGTCTGAAGATAGTAGACCTGTTTTTGGTGCAAATATTAATGTTGGTGCTTGTATGCCATAAAGGAGACCGCGGCCGC

easG_NI:如SEQ ID No.7所示

GCGGCCGCGGTCTCCAATGGTTCAAATTTACTTGCCAAGATTGTCTATGAGATTAGGTTATCATGATAAGAACAACAAGATGACTATTTTGTTGACTGGTGGTAGAGGTAAAACTGCTTCTCATATTGCTTCCTTGTTGCAAGCTGCTAAAGTTCCATTTATTGTTGCAAGTAGATCCTCTGATCCATCATCTTCTTCCCCATATTATCAAAACTGTTTTGATTGGTTGGATGAAAAAACTTATGGTGATGTTTTGACTTCTAAAGATTCTATGCAACCAATTTCTACTATTTGGTTGGTTCCACCACCAATTTTTGATTTGGCTCCATTGATGATTAAATTTGTTGATTTTGCTTCTAGAAAAGGTGTTAAAAGATTTGTTTTGTTGTCTGCTTCTACTATTAAAAAAGGTGGTCCAGCTATGGGTCAAGTTCATGAATATTTGGCTTCTTTGGGTGGTATTGAATATGCTGTTTTGAGGCCTACTTGGTTTATGGAAAATTTTTCTTATCCACAAGAATTGCAAAGATTGGCTATTAAAAATGAAAATAAAATTTATTCTGCTGCTGGTGATGGTAAATTGCCATTTGTTTCTGTTGCTGATATTGCTAGAGTTGCTTTTAGAACTTTGACTGATGAAAAATCTCATAATACTGATTATGTTTTGTTGGGTCCAGAATTGATTACTTATGATCAAGTTGCTGAAACTTTGTCTACTGTTTTGGGTAGAACTATTACTCATATTAAATTGACTGAAGAAGAATTGGTTAAAAGATTGGAAAATTCTGGTATGCCAGCTGAAGATGCTAAAATGTTGGCTGGTATGGATACTTCTATTTCTGATGGTGCTGAAGATAGATTGAATAATGTTGTTAAACATGTTACTGGTGCTGATCCAAGAACTTTTTTGGATTTTGCTACTCATCAAAAAGCTACTTGGGGTTAAAGGAGACCGCGGCCGC

easG_Cp:如SEQ ID No.8所示

GCGGCCGCGGTCTCCAATGACAGTTTTGTTGACCGGTGGTACCGGTAGAACCGCTAAACATATTGCTGGTATTTTTAGACAAACCAACGTTCCATTTTTGGTTGCTTCTAGATCCTCTTCCGCTGGTACCGCTGAAAATCATAGAAAATTTGATTGGTTGGATGAAGAAACTTTCCCAAACGCTTTGTCAGTTGATCAAGGTATGAAGCCTATTTCTGTTGTTTGGTTGTGTCCTCCACCATTGTATGATTTGGCTACTCCAGTTATTAAATTCATTGATTTCGCTGTTTCCCAAAATGTTAAGAAGTTTGTTTTGTTGTCCGCTTCCGTTATTCAAAAGGGTGGTCCTGCTATGGGTAAGATTCATGGTCATTTGGATAGTATTAAGGATGTTACTTACACTGTTTTGAGGCCTACTTGGTTTATGGAAAATTTTTCTACTAAGGGTGAAATTCAATGTGAAGCTATTAGAAGAGATTCTACTGTTTATTCTGCTACAGAAAATGGTAAAATTCCTTTCATTTCCGTTGTTGATATTGCTAGAGTTGCTGCTTGTGCTTTGACTGCTGAAACTTTGAAAAATTCTGATCATATTTTGCAAGGTCCAGATTTGTTGACTTATGATGAAGTTGCTCAAGCTTTGACTGGTGTTTTGGGTAGAAAAATTACTCATACTAAGATGACTGAAGGTGAATTGGCTGAAAAATTAATGGAAGAAGGTGTTACTCCTGAAGAAGCTTATATGCATGCTGCTATGGATTCTATGATTAAGTCTGGTTCAGAAGAAAGAGTTGTTTCTGATGAAGTTAAAGAATGGACTGGTGTTAAACCAAGAGGTTTTATTAATTTCGCTTTGTCTGAAAAGGCTGCTTGGAGAGCTAGAAAGTAAAGGAGACCGCGGCCGC

easG_Af:如SEQ ID No.9所示

GCGGCCGCGGTCTCCAATGACAATTTTGGTTTTGGGTGGTAGAGGTAAGACTGCTTCTAGATTGTCCTTGTTGTTGGATAATGCTGGTGTTCCATTTTTGGTTGGTTCTTCTTCTACTTCTTATGTTGGTCCATATAAGATGACTCATTTTGATTGGTTGAACGAAGATACTTGGACTAATGTTTTTTTGAGAGCTTCTTTGGATGGTATTGATCCTATTTCTGCTGTTTATTTGGTTGGTGGTCATGCTCCTGAATTGGTTGATCCTGGTATTAGATTTATTAACGTTGCTAGAGCTCAAGGTGTTAATAGATTTGTTTTGTTGTCTGCTTCTAACATTGCTAAGGGTACTCATTCTATGGGTATTTTGCATGCTCATTTGGATTCTTTGGAAGATGTTCAATATGTTGTTTTGAGGCCTACTTGGTTTATGGAAAATTTGTTGGAAGATCCACATGTTTCTTGGATTAAAAAGGAAGATAAGATTTACTCCGCTACTGGTGATGGTAAAATTCCATTCATTAGTGCTGATGATATTGCAAGAGTTGCTTTTTCAGTTTTGACAGAATGGAAAAGTCAAAGAGCTCAAGAATATTTTGTTTTGGGTCCAGAATTGTTGTCTTATGATCAAGTTGCTGATATTTTGACTACTGTTTTAGGTAGAAAGATTACTCATGTTTCATTGGCTGAAGCTGATTTGGCTAGATTGTTGAGAGATGATGTTGGTTTGCCTCCTGATTTTGCTGCTATGTTGGCTTCTATGGAAACCGATGTTAAGCATGGTACTGAAGTTAGAAATTCTCATGATGTTAAGAAGGTTACAGGTAGTTTGCCATGTTCTTTTTTGGATTTTGCTGAACAAGAAAAGGCTAGATGGATGAGACATTAAAGGAGACCGCGGCCGC

easA_NI:如SEQ ID No.10所示

GCGGCCGCGGTCTCCAATGTCAACCTCTAACTTGTTTACCCCATTGCAATTTGGTAAATGTTTGTTGCAACATAAGTTGGTTTTGTCCCCAATGACCAGATTTAGAGCTGATAACGAAGGTGTTCCATTGCCATATGTTAAAACTTACTATTGTCAAAGAGCTTCTTTGCCAGGTACTTTGTTGTTGACCGAAGCAACTGCTATTTCCAGAAGAGCTAGAGGTTTTCCAAATGTTCCAGGTATTTGGTCACAAGAACAAATTGCTGGTTGGAAAGAAGTTGTTGATGCTGTTCATGCTAAGGGTTCTTATATTTGGTTGCAATTGTGGGCTACTGGTAGAGCTGCTGAAGTTGGTGTTTTGAAAGCTAATGGTTTTGATTTGGTTTCTTCTTCTGCTGTTCCTGTTTCTCCTGGTGAACCAACTCCAAGAGCTTTGTCTGATGATGAAATTAATTCCTATATTGGTGATTTCGTTCAAGCTGCTAAAAATGCTGTTTTGGAAGCTGGTTTTGATGGTGTTGAATTGCATGGTGCTAACGGTTTTTTGATTGATCAATTTTTGCAATCCCCTTGTAATCAAAGAACTGATCAATGGGGTGGTTGTATTGAAAATAGATCAAGATTTGGTTTGGAAATTACCAGAAGAGTTATTGATGCTGTTGGTAAAGATCATGTTGGTATGAAATTGTCTACTTGGAGTACTTTTCAAGGTATGGGTACTATGGATGATTTGATTCCTCAATTTGAACATTTCATTATGAGATTGAGAGAAATTGGTATTGCATATTTGCATTTGGCTAATTCTAGATGGGTTGAAGAAGAAGATCCAACAATTAGAACTCATCCAGATATTCATAACGAAACTTTTGTTAGAATGTGGGGTAAAGAAAAGCCAGTTTTATTGGCTGGTGGTTATGGTCCAGAATCTGCTAAATTGGTTGTTGATGAAACTTATTCCGATCATAAAAACATTGGTGTTGTTTTTGGTAGACATTATATTTCAAACCCTGATTTGCCTTTTAGATTGAAGATGGGTTTACCATTGCAAAAATATAACAGAGAAACCTTTTACATTCCATTCTCTGATGAAGGTTATTTGGATTATCCATACTCCGAAGAATATATTACTGAAAATAAGAAGCAAGCTGTTTTGGCATAAAGGAGACCGCGGCCGC

easA_Cf:如SEQ ID No.11所示

GCGGCCGCGGTCTCCAATGTCATCCTCTAACTTGTTTAAGCCAATTCCATTGGGTAGAAAAGTTTTGCAACATAAAGTTGTTTTGTCCCCAATGACCAGATTCAGAGCTGATAACGATGGTGTTCCATTGTCCTACGTTAAATCTTATTATGGTCAAAGAGCTTCCATTAGAGGTACTTTGTTGATTACAGAAGCTGTTGCTATTTGTCCAAGAGCAAAGGGTTTTTCTAATTGTCCAGGTATTTGGCATCAAGATCAAATTGCTGCATGGAAAGAAGTTGTTGATGAAGTTCATTCTAAGGGTTCAGTTATTTGGTTGCAATTGTGGGCTACTGGTAGAGCTTCTGATGCTGATACTTTAAAAGAATCAGGTTTTCATTTGGAATCCTCTAGTGATGTTCCAGTTGCTCCTGGTGAACCAGTTCCAAGACCTTTGTCAGAAGATGAAATTGAATCATATATTAGAGATTACGTTACCGGTGCTATTAATGCTGTTCAAGGTGCTGGTTTCGATGGTATTGAAATTCATGGTGCTAATGGTTTTTTGGTTGATCAATTTTTGCAAGCTTCTTGTAATACTAGAGCTGATCAATGGGGTGGTTCTATTGAAAATAGAAGTAGATTTGGTTTGGAAATTACCAGAAGAGTTGTTGATGCTGTTGGTAAAGATAGAGTTGGTGTTAAATTGTCTCCTTGGTCAACTTTTCAAGGTATGGGTACTATGGATGATTTGGTTGCTCAATTTGAACATTTTATTTCCAGATTGAGAGAAATGGATATTGCTTATATTCATTTGGTTAACACCAGATGGTTGGAAGAAGAAGAACCAGGTATTAAAACTCATCCAGATGTTGATAACCAAACTTTCGTTAGAATGTGGGGTAATAAGACCCCAATTTTATTGGCAGGTGGTTATGATGCAGATAGTGCTAGAAGATTGGTTGATGAAACATATTCCGATCAAAATAACATTATGGTTGTTTTCGGTAGACATTATATTTCTAACCCAGATTTGCCTTTTAGATTGAGATTGGGTATTCCATTGCAAAAATATAACAGAGATACCTTTTACATTCCATTCTCTGATGAAGGTTATTTGGATTATCCATTTTGTCAAGAATTCTTGGATCAACAAGATGTTGATCAAGTTGTTGTTGCTGCTTAAAGGAGACCGCGGCCGC

easA_Cp:如SEQ ID No.12所示

GCGGCCGCGGTCTCCAATGTCAACCTCTAACTTGTTTTCCACCGTTCCATTTGGTAAAAATGTTTTGAACCATAAGATTGTTTTGTCCCCAATGACCAGATTTAGAGCTGATGATAACGGTGTTCCATTGTCTTATATGAAAACTTTTTACGCTCAAAGAGCTTCTGTTAGAGGTACTTTGTTGGTTACTGATGCTGTTGCTATTTGTCCAAGAACAAAAGGTTTTCCAAATGTTCCAGGTATTTGGCATAAAGATCAAATTGCTGCTTGGAAAGAAGTTGTTGATGAAGTTCATTCAAAGGGTTCTTTTATTTGGTTGCAATTGTGGGCTACTGGTAGAGCTGCTGATTTGGAAGCTTTGACTTCTCAAGGTTTGAAATTGGAATCTTCTTCTGAAGTTCCTGTTGCTCCAGGTGAACCAACTCCTAGAGCTTTGGATGAAGATGAAATTCAACAATATATTTTGGATTACGTTCAAGGTGCTAAAAATGCTGTTCATGGTGCTGGTTTTGATGGTGTTGAAATTCATGGTGCTAACGGTTTTTTGATTGATCAATTTTTGCAATCCTCCTGTAATAGAAGAACTGATCAATGGGGTGGTTCCATTGAAAATAGAAGTAGATTTGGTTTGGAAATTACCAGAGGTGTTGTTGATGCTGTTGGTCATGATAGAGTTGGTATGAAATTGTCTCCATGGTCAACTTTTCAAGGTATGGGTACTATGGATGATTTGGTTCCTCAATTTGAACATTTTATTACCTGTTTGAGAGAAATGGATATTGCTTATTTGCATTTGGCTAATTCTAGATGGGTTGAAGAAGAAGATCCATCTATTAGAACTCATCCAGATTTTCATAACCAAACTTTTGTTCAAATGTGGGGTAAAAAGAGGCCTATTTTGTTGGCTGGTGGTTATGATCCAGATTCTGCTAGAAGATTGGTTGATCAAACATATTCTGATAGAAACAACGTTTTGGTTGTTTTTGGTAGACATTATATTTCCAACCCAGATTTGCCTTTTAGATTGAGAATGGGTATTGCTTGTAGATCCACAATTGAAACTCATTCTATTTTCCCAGCAAGAGAAAGAGCTATGTGGACTATTCCATCCGTTAAGAATATTTAAAGGAGACCGCGGCCGC

模块化整合质粒的构建

考虑到遗传稳定表达的因素，作者设计将模块一和模块二分两步整合到基因组上，模块三涉及到不同来源的组合，其中easD包括两个来源，easG和easA分别包含三个来源，将获得18种结果，对此作者选择将两个来源的easD利用CRISPR系统整合到基因组上，easG-easA以单拷贝质粒的形式进行筛选高产田麦角碱的菌株。

模块一的构建：dmaW-easF选择将其插入到XV染色体的Δ22位点，采用多片段DNA酵母快速组装方法将片段Δ22上游同源臂，leu2 ORF，dmaW ORF，easF ORF，Δ22下游同源臂，与以氨苄为抗性选择性标记的载体利用同源重组的原理进行连接，各片段之间同源臂长度为20-50bp，在Δ22上下游同源臂两侧保留NotI位点。采用醋酸锂法将以上片段转化到空白酵母中，转化后采用SD-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，挑选得到的转化子进行菌落PCR验证，将验证正确的单菌落接种到5mlSD-LEU液体(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L)培养基中过夜培养，提取质粒回转到大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行单、双酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。

模块二的构建：easE-easC选择将其插入到XVI染色体的Δ15位点，同样采用多片段DNA酵母快速组装方法将片段Δ15上游同源臂，G418 ORF，easE ORF，easC ORF，Δ15下游同源臂，与以氨苄为抗性选择性标记的载体利用同源重组的原理进行连接，各片段之间同源臂长度为20-50bp，在Δ15上下游同源臂两侧保留NotI位点。采用醋酸锂法将以上片段转化到空白酵母中，转化后采用YPD-G418固体板(20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，2％的琼脂粉，200mg/L的G418)进行筛选，挑选得到的转化子进行菌落PCR验证，将验证正确的单菌落接种到5ml YPD-G418液体(20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，200mg/L的G418)培养基中过夜培养，提取质粒回转到大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行单、双酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。

内源模块ero1-fad1的构建：同模块一和模块二的构建方法相同，选择将ero1和fad1通过潮霉素的抗性标记插入到VIII染色体的Δ14位点。

模块三的构建：

选择将两个来源的easD插入GAL1/7/10位置，采用overlap-PCR将GAL1/7/10上游同源臂，easD ORF，GAL1/7/10上游同源臂三个片段连接在一起，胶收DNA产物进行测序，保证碱基序列未发生突变，工具切割质粒CRISPR-Cas9由实验室模块库提供。关于easG-easA模块的构建，选择采用无缝克隆方法将3个来源的easG和3个来源的easA 6个基因片段进行交叉组合连入实验室模块库表达盒。

WN416-URA3-FBA1t-(easG)-P_Gal110-(easA)-TDH2t中，得到9个表达盒，分别为：WN416-URA3-FBA1t-easG_Cp-P_Gal110-easA_Cf-TDH2t；

WN416-URA3-FBA1t-easG_Cp-P_Gal110-easA_Cp-TDH2t；

WN416-URA3-FBA1t-easG_Cp-P_Gal110-easA_NI-TDH2t；

WN416-URA3-FBA1t-easG_Af-P_Gal110-easA_Cf-TDH2t；

WN416-URA3-FBA1t-easG_Af-P_Gal110-easA_Cp-TDH2t；

WN416-URA3-FBA1t-easG_Af-P_Gal110-easA_NI-TDH2t；

WN416-URA3-FBA1t-easG_NI-P_Gal110-easA_Cf-TDH2t；

WN416-URA3-FBA1t-easG_NI-P_Gal110-easA_Cp-TDH2t；

WN416-URA3-FBA1t-easG_NI-P_Gal110-easA_NI-TDH2t。

模块化整合构建生产田麦角碱的重组酿酒酵母菌株

将构建好的表达模块一质粒和表达模块二质粒以及内源ero1-fad1表达质粒用not1酶切位点切割，获得整合片段Δ22上游同源臂-leu2-CYC1t-dmaW-P_Gal110-easF-ADH1t-Δ22下游同源臂、Δ15上游同源臂-KanR-CYC1t-easE-P_Gal110-easC-ADH1t-Δ15下游同源臂和Δ14上游同源臂-hphMX6-CYC1t-ero1-P_Gal110-fad1-ADH1t-Δ14下游同源臂，采用醋酸锂法先将整合片段Δ22上游同源臂-leu2-CYC1t-dmaW-P_Gal110-easF-ADH1t-Δ22下游同源臂导入底盘菌株yCTH中，转化后采用SD-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并命名为SyBE_Sc06130001。采用同样的方法将Δ15上游同源臂-KanR-CYC1t-easE-P_Gal110-easC-ADH1t-Δ15下游同源臂导入菌株SyBE_Sc06130001中，获得正确的重组菌株并保存甘油菌命名为SyBE_Sc06130002。再采用同样的方法将Δ14上游同源臂-hphMX6-CYC1t-ero1-P_Gal110-fad1-ADH1t-Δ14下游同源臂导入菌株SyBE_Sc06130002中，获得正确的重组菌株并保存甘油菌命名为SyBE_Sc06130008。然后将overlap程序获得的两个片段GAL1/7/10上游同源臂-P_Gal7-easD_Af-GPM1t-GAL1/7/10上游同源臂和GAL1/7/10上游同源臂-P_Gal7-easD_Cp-GPM1t-GAL1/7/10上游同源臂通过醋酸锂法分别与CRISPR-Cas9质粒一起导入菌株SyBE_Sc06130008中，获得正确的重组菌株并保存甘油菌分别命名为SyBE_Sc06130018和SyBE_Sc06130019。最终将easG-easA的9个表达盒分别导入SyBE_Sc06130018和SyBE_Sc06130019，共获得18株产田麦角碱的菌种，依次命名为SyBE_Sc06130020--SyBE_Sc06130037。

表1

实施例2辅因子调节模块化整合质粒的构建

考虑到底盘菌株中存在包含尿嘧啶营养标签的EasG-EasA质粒模块，作者设计将辅因子调节酶UTR1，MAE1，POS5，PYC2插入到功能表达盒WN414中，用BsaI酶消化功能表达盒WN414，在Pgal1-TDH1t中间获得切口以此获得线性化的载体，通过上下引物将载体两个切口处各20bp的同源臂分别加在UTR1,MAE1,POS5,PYC2的两端借助PCR仪获得，在体外用无缝克隆的方法进行连接，将连接体系一起导入DH5α，挑选转化子进行放大培养提质粒进行测序，测序无误的质粒采用醋酸锂法转化到SyBE_Sc06130032中，转化后采用SD-URA-TRP固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，挑选得到的转化子进行20mmNaOH溶液煮菌PCR验证，验证正确的单菌落进行分离纯化待发酵检测。

对照菌株(只包含功能表达盒WN414)编号为SyBE_Sc06130102，实验菌依次编号为SyBE_Sc06130103(POS5)，SyBE_Sc06130104(UTR1)，SyBE_Sc06130105(MAE1)，SyBE_Sc06130106(PYC2)。

引物序列如表2所示。

表2引物

POS5-1	如SEQ ID No.13所示	CGGTTTTAGCATTTGCTCTGGGCAC
			POS5-2	如SEQ ID No.14所示	GACATTCTAGCCGTGTTCTATGCAAAC
UTR1-1	如SEQ ID No.15所示	TTTACGGTTGAGGTTGGAGTGCAC
			UTR1-2	如SEQ ID No.16所示	TGTGGTGTGTGCTTAGTTTTTCCACC
MAE1-1	如SEQ ID No.17所示	ACGGCGTTGACAAGGAAGAAGCG
			MAE1-2	如SEQ ID No.18所示	CGGGAGTGGAGTTAGCCTCGTAAG
MAE1-3	如SEQ ID No.19所示	AGATCGCAACTAACCAGATCCTTG
			PYC2-1	如SEQ ID No.20所示	GCTCAATTCATGGTTTCTAACAAACTG
PYC2-2	如SEQ ID No.21所示	CCGTATGGTTGACCAATTAAACCTTC
			PYC2-3	如SEQ ID No.22所示	ATCAACGTTACAAAGTCTGCACCAC
PYC2-4	如SEQ ID No.23所示	CCATCAGTAGAGTACCATTGAACTGTC
			PYC2-5	如SEQ ID No.24所示	AGCTAACGTTCCTACCGTTCCCGG
PYC2-6	如SEQ ID No.25所示	ACCAAAGGCGGCCTTAATGATCACC
			PYC2-7	如SEQ ID No.26所示	TGGTCAATAGCATTGTCAGGTAATGAAG

实施例3辅因子调节的实验菌发酵检测

试验材料：菌株SyBE_Sc06130102-SyBE_Sc06130106

试验方法：

种子培养基：SD-URA液体培养基(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，色氨酸、亮氨酸、组氨酸以100*母液形式回补)；

发酵培养基：SD-URA液体培养基(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖40g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，色氨酸、亮氨酸、组氨酸以100*母液形式回补)。

将上述菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2分别接种于50mL发酵培养基中，于22℃、220rpm条件下培养120h，监测发酵终期的菌体密度(OD600)及田麦角碱的产量。

田麦角碱的定量检测方法：取发酵终期的发酵液1ml，5000r离心分离菌体，收集上层清液，准备进行LC-MS检测所需的样品，用乙腈配制标品田麦角碱的母液得测标曲。通过QExactive HF orbitrap质谱仪与Ultimate3000 RSLC nano(Thermo Fisher Scientific,USA)在正离子模式下进行LC-MS/MS分析。采用BEH酰胺柱(2.1mm x 100mm,Waters,USA)进行LC分离。流动相A为100％乙腈+0.1％甲酸；流动相B为水+0.1％甲酸。梯度洗脱，5％(A)至95％(A)，流速0.3mL/min,20min。前体的质量分辨为120000。离子源其他详细参数如下：喷雾电压，正极为3.5kV；毛细管温度：320℃；鞘气流量(arb)，40；aux气体流量(arb)，10；探头加热器温度：350℃；质量范围(m/z)，100-500。

试验结果如图3、表3所示：在5株菌株中，经过对每株菌田麦角碱产量的统计发现，其中编号为SyBE_Sc06130106的产量最高，丙酮酸羧化酶PYC2可以改善了内源辅因子平衡情况，提高了田麦角碱的产量。

表3图3数据

实施例4优化L-色氨酸的外添加提高田麦角碱的产量

试验材料：菌株SyBE_Sc06130032

试验方法：

种子培养基：SD-URA液体培养基(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，色氨酸、亮氨酸、组氨酸以100*母液形式回补)；

发酵培养基：空白对照：SD-URA液体培养基(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖+40g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，色氨酸、亮氨酸、组氨酸以100*母液形式回补)；实验组：在空白培养基的基础上将色氨酸设置5个梯度浓度，依次为：2g/L,4g/L,6g/L,8g/L,10g/L。

将上述菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2分别接种于50mL发酵培养基中，于22℃、220rpm条件下培养120h，监测发酵终期的菌体密度(OD600)及田麦角碱的产量。

田麦角碱的定量检测方法：同上。

试验结果如图4、表4所示：在色氨酸浓度为8g/L的培养基中田麦角碱产量最高，达到12.42mg/L(2.22mg/g)。

表4图4数据

实施例5优化SAM(S-腺苷-蛋氨酸)的外添加提高田麦角碱的产量

试验材料：菌株SyBE_Sc06130032

试验方法：

种子培养基：SD-URA液体培养基(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，色氨酸、亮氨酸、组氨酸以100*母液形式回补)；

发酵培养基：空白对照：SD-URA液体培养基(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖40g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，亮氨酸、组氨酸以100*母液形式回补，色氨酸浓度为8g/L)；实验组：在空白培养基的基础上将SAM(S-腺苷-蛋氨酸)设置5个梯度浓度，依次为：10mg/L,20mg/L,30mg/L,40mg/L,50mg/L。

将上述菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2分别接种于50mL发酵培养基中，于22℃、220rpm条件下培养120h，监测发酵终期的菌体密度(OD600)及田麦角碱的产量。

田麦角碱的定量检测方法：同上。

试验结果如图5、表5所示：在色氨酸回补到8g/L的基础上，又将SAM进行了一系列优化发现，在SAM回补到20mg/L时，使田麦角碱的产量提高到15.59mg/L(2.61mg/g)的滴度，相比之前提高了1.25倍，说明底物和甲基供体的供给在该底盘中供不应求，外添加的方式可以有效缓解该情况，该产量也是目前田麦角碱已知的最高产量。

表5图5数据

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学，中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 重组酿酒酵母菌株及其发酵方法

<130> MP21007775

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1472

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcggccgcgg tctccaatga cagccggtca aggtataaaa acaggtaatg cttcagattg 60

tgaagtctac agaacattgt ccgtcgcctt ggactttgcc aaccaagacg aagaattgtg 120

gtggcactct actgctccaa tgtttgctca aatgttgcaa agtactaatt acaatttgca 180

cgctcaatat aagcatttgt tgatttataa gaagaacgtc atcccatttt tgggtgttta 240

tcctactaat gataagccaa gatggttatc tattttgaca agatatggta caccattcga 300

attatctttg aactgtagtg gtcctttggt cagatatact tatgaaccta ttaacgctgc 360

tactggtact gcaagagatc cttttaacac ccatgctgtc tgggattctt tggaacaatt 420

gatggctttg caatcaggta ttgatttgga tttgtttaga catttcaaga acgatttgac 480

cttgtccgct gaagaatctg aatatttgta taaaaacaac ttggtcggtg aacaaattag 540

aactcaaaat aaattggcct tggatttgca agatggtgaa tttgtcgtca aaacttatat 600

ttacccagct ttgaagagtt tggctaccgg tagatcaatt catgaattgg tttttggttc 660

tgcttttaga tggagtaaac aatatccaga attgagaaag ccattggata ctttggaaca 720

atacgtttat agtagaggtc catcaagtac agcttctcca agattgttgt cttgtgattt 780

gattgatcct acaaaatcta gaatcaagat ttatttgttg gaaagaatgg tcactttgga 840

agctttggaa gatttgtgga ctatgggtgg tgaaagaact gatgcttcca ctttggctgg 900

tttggaaatg ataagagaat tgtgggaatt gattagattg ccagctggtt tgcaatctta 960

tcctgctcca tatttgccaa ttggtactat accagacgaa caattgccat taatggctaa 1020

ttatactatc caccatgatg atccagttcc agaacctcaa gtttatttta ctacttttgg 1080

tagaaacgac atgcaaattg ctgacgcctt agctactttt tttgaaagaa gaggttggca 1140

tgaaatggca agacaatata aagctgaatt gtgttctcat tacccacatg ccgatcatga 1200

aacattgaac tatttgcatg cttatatctc tttctcttac agaaaaaata aaccatattt 1260

gtctgtttat ttgcaatctt tggaaactgg tgattgggtt acttcttctt ttaattctgt 1320

tcatgttgat ccaggtttgt ctgctactgt tcaagaattg tctaaattga ctaaaactgc 1380

tggtactact gttagagaaa ctaaattgcc attgactcca gatggttctg aaccaggtgt 1440

tattactcaa tattaaagga gaccgcggcc gc 1472

<210> 2

<211> 1052

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcggccgcgg tctccaatga caatctccgc cccaccaatt attgacatta gacaagccgg 60

tttggaatcc tccattccag accaagttgt tgaaggtttg accaaagaag ttaaaacctt 120

gccagcattg ttgttttatt ccactaaagg tatacaacac tggaacagac actctcatgc 180

cgcagatttt tacccaagac acgaagaatt gtgtattttg aaggctgaag cttctaaaat 240

ggctgcttct attgctcaag actcattagt tattgatatg ggttccgctt ctatggataa 300

agttattttg ttattggaag ccttggaaga acaaaaaaaa tctattactt attatgcttt 360

ggatttgtct tattctgaat tggcttctaa ttttcaagct attccagttg atagatttca 420

ttatgttaga tttgctgctt tgcatggtac ttttgatgat ggtttgcatt ggttgcaaaa 480

tgctccagat attagaaata gaccaagatg tattttgttg tttggtttga ctattggtaa 540

tttttctaga gataatgctg cttctttttt gagaaatatt gctcaatctg ctttgtctac 600

ttctccaact caatcttcta ttattgtttc tttggattct tgtaaattgc caactaaaat 660

tttgagagct tatactgctg atggtgttgt tccatttgct ttggcttctt tgtcttatgc 720

taattctttg tttcatccaa aaggtgatag aaaaattttt aatgaagaag attggtattt 780

tcattctgaa tggaatcatg ctttgggtag acatgaagct tctttgatta ctcaatctaa 840

agatattcaa ttgggtgctc cattggaaac tgttattgtt agaagagatg aaaaaattag 900

atttggttgt tcttataaat atgataaagc tgaaagagat caattgtttc attctgctgg 960

tttggaagat gctgctgttt ggactgctcc agattgtgat gttgcttttt atcaattgag 1020

attgagattg aattaaagga gaccgcggcc gc 1052

<210> 3

<211> 1898

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggccgcgg tctccaatgg gtcaatctag aggtatatta ggtggtgtta gacaattaat 60

tttggtcatt ttggtcggtg cttatttatc tagattatct gctgttgatg acgacagaca 120

cgactgtaga tgtagaccag gtgaaccatg ttggccaact gtttctcatt ggtctacttt 180

gaatgaatct attggtggtg ctttggctca tgttaaacct attgctcatg tttgtcatca 240

atctggtcaa gattcttctg cttgtgaaca agttttgcaa gaatctttgg actccaaatg 300

gagagcttct catactggtg ctttgcaaga ttgggtttgg gaaggtggtg ctgaatctaa 360

tcaaacatgt tattatttga gatccggtcc agctggtagt tgtcatcaag gtagaattcc 420

attgtattct gctgctgtta aatctgcttc tgatgttcaa aaagttgttg attttaccag 480

acaacataac ttgagattgg ttattagaaa cactggtcat gatggtagtg gtagatcctc 540

tggtcctgat tctgttgaaa ttcatactca tcatttgaac tctgtccaat atcacccaaa 600

tttcagacca gcaggttctt ctgaaagaca aagtgcccca ggtcaaccag ctgttactgt 660

tggtgctggt attttattgg gtgacttata cgctagaggt gcttctgaag gttggatagt 720

tgttggtggt gaatgtccaa ctgtaggtgc tgctggtggt tttttgcaag gtggtggtgt 780

ttcttcttgg ttgtcttatg ctcatggttt ggctgttgat aatgttttgg aatatgaagt 840

tgtcactgct aagggtgaaa ttgttattgc taatgctcat caaaaccctg atttgttttg 900

ggctttgaga ggtggtggtg gtggtacttt tggtgttgtt actcaagcta ctttgcaagt 960

tcatccagat ttgccagttt ctgttgctga tgctgttgtt actggttcta gagctgatgc 1020

tactttttgg tcacatggtg ttgctgcttt gttgagagca ttgcaatttt tgaataacca 1080

tggtactgct ggtcaattta ttttgagaaa tactgatgac gacaccgttc aagcttcttt 1140

gactatgtat ttttctaact tgaccgttcc tgctgttgct gatgaaagaa tggacccatt 1200

gagaagagct ttagaacaca atggtcaccc atatcaattg acatctagat ttttgcctca 1260

aatttcttct actttcagac atactgctga tagatatcca gaagattacg gtattttgat 1320

gggttctgtt ttggtttctt tggatttatt taactccgct actggtcctg ctgctttagc 1380

tcaacacttt gctagattgc caatgactcc agatgatttg ttgtttacta gtaatttggg 1440

tggtagagtt tcttctttga atagagatcc agcttctact gctatgcatc caggttggag 1500

agatgctgct caattgttaa attttgttag aggtgttggt gctccttctt tggctgctaa 1560

ggctactgct ttgcatgaat tgcaaactgt tcaaatggct agattgtatg aaattgaacc 1620

agcttttcaa atcagttata gaaatttggg tgacccatct gaaagaagat caagagaagt 1680

ttactggggt tctaattatg ctagattggt tgaagttaag agaagatggg acccagaagg 1740

tttgtttttt tccaagttgg gtattgatgg tgatgcttgg gatgcagaag gtatgtgtag 1800

acaaactaga caaggtgctt ggaatgttgc tgttaaatgg gttcaatctt ttttgggttc 1860

tttgtctgct agtgttgttt aaaggagacc gcggccgc 1898

<210> 4

<211> 1562

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcggccgcgg tctccaatgg caccagactc caaaccaaca tataccacag ccaacggttg 60

cccatttcac aagccagaag gtccaccagc agacggtaga actttggcct tgtccgatca 120

tcacttggtc gacaccttgg cacattttaa cagagaaaaa attccagaaa gagttgttca 180

tgctaaaggt gctggtgctt atggtgaatt tgaagttact gctgatattt ctgatatttg 240

tgatattgat atgttggttg gtgttggtaa aaaaactcca tgtgttacta gattttctac 300

tactggtttg gaaagaggtt ctaatgaagg tatgagagat ttgaaaggta tggcttgtaa 360

attttatact actgaaggta attgggattg ggttatgttg aattttccat ttttttttat 420

tagagatcca gttaaatttc catctttgat gcatgctcaa agaagagatc cacaaactaa 480

tttgttgaat ccaaatatgt attgggattg ggttactaat aatcatgaat ctttgcatat 540

ggttttgttg caattttctg attttggtac tatgtttaat tggagatcaa tgtctggtta 600

tatggctcat gcttataaat gggttaaacc agatggttct tttaaatatg ttcatatttt 660

tttgtcttct gatagaggtc caaattttac tgatggtcaa caagctaaag gtactaatga 720

tttggaccct gatcatgcta ctagagattt gtatgaagct attgaaagag gtgaatatcc 780

aacttggact gcttctgttc aagttgttga tccaaaagat gctccaaatt tgggttataa 840

tattttggat gttactaaac attggaattt gggtacttat ccaaaagatg ttactttgat 900

tccaccaaaa gtttttggta aattgacttt gaaaagaaat ccagctaatt attttgctga 960

aattgaacaa ttggcttatt ctccatctaa tatggttcca ggtgttgctc catctgaaga 1020

tccaattttg caagctagaa tttttgctta tccagatgct caaagatata gattgggtgc 1080

taatcatcaa caaattccag ttaatagatc agctcatact tttaatccaa ttgctagaga 1140

tggtcaaggt acttttgatg ctaattatgg tgctcatcca ggttttttga ctcaacaaca 1200

accagttaga tttgctgaac caagagaacc agatccaaaa tataatgaat ggttgaaaga 1260

aattcaatct aaatcttggt tgcaaactac tgaacatgat tataaatttg ctagagattt 1320

ttatgaagtt ttgccagatt ttagaggtca agaatttcaa gatactatgg ttcaaaatat 1380

ggttgaatct gttgctcaaa ctagagctga aattcaaaaa caagtttatg aaacttggaa 1440

attggtttct ccagctttgg ctgctagaat tcaaaaaggt gttgaaactt tgttgcaaaa 1500

atctgaagct ccagctgaag aatcttttat tccagctaga ttgtaaagga gaccgcggcc 1560

gc 1562

<210> 5

<211> 818

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcggccgcgg tctccaatgc catccatgac ctctaaagtt tttgctatta ctggtggtgc 60

ttctggtatt ggtgctgcta catgtagatt gttggctgaa agagatgctg ctgttatttg 120

tttggctgat gtttcttcta ctaattttac ttctttgcaa gaatccattg ctaaatctaa 180

tccatctact ttggttcatt gtactgaatt ggatgttaga tcagctgata aggttgatca 240

atggttgcaa tctattgttt ctactcatgg tgatttacat ggtgctgcta atgttgctgg 300

tattgctcaa ggtgctggtt tgagagctac tccaactatt ttggaagaaa atgatgctga 360

atggtctaga attttggatg ttaatttgaa cggtgttttc tattctacta gagctcaagt 420

tagagttatg aaagatttgc caccaggtca tagatcaatt gttaatgttg cttctattgc 480

tgctttttct catgttccag atgtttatgc ttatggtact tctaaatccg cttgtgctta 540

cttgactacc tgtattgctg ctgatgtttt ttggtctggt attagagtta attgtgtttc 600

tcctggtatt actaacactc caatgttgcc acaatttgaa cctaaagcta aatctttgga 660

tgctattaaa gatatgtaca gagatcaagg ttacccaact ggtgaagctg atggtgttgc 720

tagaacaatt gtttggttat tgagtgaaga ttctattcca gtttacggtg ctaatattaa 780

tgttggtgct tgtccaccat aaaggagacc gcggccgc 818

<210> 6

<211> 818

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcggccgcgg tctccaatgg catccgttga aagtagaatt attgctatta ctggtggtgc 60

ttccggtatt ggtgctgcta catgtagatt gttggctgaa agaggtgctg ctgttttgtg 120

tgtttgtgat atttctccta aaaacttcga tgatttgaag atttctatta agaagattaa 180

cccatccact aaagttcatt gtgctactgt tgatgttaca tcttctgttg aagttagaca 240

atggattgaa ggtattattt ctgatttcgg tgatttgcat ggtgctgtta atgctgctgg 300

tattgctcaa ggtgctggta tgagaaatac tcctacaatt gctgaagaag ttgatgaaga 360

atggactaga attatgaata ctaacttgaa cggtgttttc tattgtacta gagaagaagt 420

tagagctatg aaaggtttgc cagctactga tagatccatt gttaatgttg gtagtattgc 480

ttctgtttcc catatgccag atgtttacgc ttatggtacc tctaaaggtg cttgtgctta 540

ttttaccact tgtgttgctg ctgatgcttt tcctttgggt attagaatta ataacgtttc 600

tcctggtgtt actaatactc caatgttgcc acaatttgct cctatggcta agacttttga 660

agaaattgaa gaatcttaca agaaggaagg tttgtctttg attgaagcag aagatgttgc 720

tagaactatt gtttggttgt tgtctgaaga tagtagacct gtttttggtg caaatattaa 780

tgttggtgct tgtatgccat aaaggagacc gcggccgc 818

<210> 7

<211> 962

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggccgcgg tctccaatgg ttcaaattta cttgccaaga ttgtctatga gattaggtta 60

tcatgataag aacaacaaga tgactatttt gttgactggt ggtagaggta aaactgcttc 120

tcatattgct tccttgttgc aagctgctaa agttccattt attgttgcaa gtagatcctc 180

tgatccatca tcttcttccc catattatca aaactgtttt gattggttgg atgaaaaaac 240

ttatggtgat gttttgactt ctaaagattc tatgcaacca atttctacta tttggttggt 300

tccaccacca atttttgatt tggctccatt gatgattaaa tttgttgatt ttgcttctag 360

aaaaggtgtt aaaagatttg ttttgttgtc tgcttctact attaaaaaag gtggtccagc 420

tatgggtcaa gttcatgaat atttggcttc tttgggtggt attgaatatg ctgttttgag 480

gcctacttgg tttatggaaa atttttctta tccacaagaa ttgcaaagat tggctattaa 540

aaatgaaaat aaaatttatt ctgctgctgg tgatggtaaa ttgccatttg tttctgttgc 600

tgatattgct agagttgctt ttagaacttt gactgatgaa aaatctcata atactgatta 660

tgttttgttg ggtccagaat tgattactta tgatcaagtt gctgaaactt tgtctactgt 720

tttgggtaga actattactc atattaaatt gactgaagaa gaattggtta aaagattgga 780

aaattctggt atgccagctg aagatgctaa aatgttggct ggtatggata cttctatttc 840

tgatggtgct gaagatagat tgaataatgt tgttaaacat gttactggtg ctgatccaag 900

aacttttttg gattttgcta ctcatcaaaa agctacttgg ggttaaagga gaccgcggcc 960

gc 962

<210> 8

<211> 905

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcggccgcgg tctccaatga cagttttgtt gaccggtggt accggtagaa ccgctaaaca 60

tattgctggt atttttagac aaaccaacgt tccatttttg gttgcttcta gatcctcttc 120

cgctggtacc gctgaaaatc atagaaaatt tgattggttg gatgaagaaa ctttcccaaa 180

cgctttgtca gttgatcaag gtatgaagcc tatttctgtt gtttggttgt gtcctccacc 240

attgtatgat ttggctactc cagttattaa attcattgat ttcgctgttt cccaaaatgt 300

taagaagttt gttttgttgt ccgcttccgt tattcaaaag ggtggtcctg ctatgggtaa 360

gattcatggt catttggata gtattaagga tgttacttac actgttttga ggcctacttg 420

gtttatggaa aatttttcta ctaagggtga aattcaatgt gaagctatta gaagagattc 480

tactgtttat tctgctacag aaaatggtaa aattcctttc atttccgttg ttgatattgc 540

tagagttgct gcttgtgctt tgactgctga aactttgaaa aattctgatc atattttgca 600

aggtccagat ttgttgactt atgatgaagt tgctcaagct ttgactggtg ttttgggtag 660

aaaaattact catactaaga tgactgaagg tgaattggct gaaaaattaa tggaagaagg 720

tgttactcct gaagaagctt atatgcatgc tgctatggat tctatgatta agtctggttc 780

agaagaaaga gttgtttctg atgaagttaa agaatggact ggtgttaaac caagaggttt 840

tattaatttc gctttgtctg aaaaggctgc ttggagagct agaaagtaaa ggagaccgcg 900

gccgc 905

<210> 9

<211> 905

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcggccgcgg tctccaatga caattttggt tttgggtggt agaggtaaga ctgcttctag 60

attgtccttg ttgttggata atgctggtgt tccatttttg gttggttctt cttctacttc 120

ttatgttggt ccatataaga tgactcattt tgattggttg aacgaagata cttggactaa 180

tgtttttttg agagcttctt tggatggtat tgatcctatt tctgctgttt atttggttgg 240

tggtcatgct cctgaattgg ttgatcctgg tattagattt attaacgttg ctagagctca 300

aggtgttaat agatttgttt tgttgtctgc ttctaacatt gctaagggta ctcattctat 360

gggtattttg catgctcatt tggattcttt ggaagatgtt caatatgttg ttttgaggcc 420

tacttggttt atggaaaatt tgttggaaga tccacatgtt tcttggatta aaaaggaaga 480

taagatttac tccgctactg gtgatggtaa aattccattc attagtgctg atgatattgc 540

aagagttgct ttttcagttt tgacagaatg gaaaagtcaa agagctcaag aatattttgt 600

tttgggtcca gaattgttgt cttatgatca agttgctgat attttgacta ctgttttagg 660

tagaaagatt actcatgttt cattggctga agctgatttg gctagattgt tgagagatga 720

tgttggtttg cctcctgatt ttgctgctat gttggcttct atggaaaccg atgttaagca 780

tggtactgaa gttagaaatt ctcatgatgt taagaaggtt acaggtagtt tgccatgttc 840

ttttttggat tttgctgaac aagaaaaggc tagatggatg agacattaaa ggagaccgcg 900

gccgc 905

<210> 10

<211> 1175

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcggccgcgg tctccaatgt caacctctaa cttgtttacc ccattgcaat ttggtaaatg 60

tttgttgcaa cataagttgg ttttgtcccc aatgaccaga tttagagctg ataacgaagg 120

tgttccattg ccatatgtta aaacttacta ttgtcaaaga gcttctttgc caggtacttt 180

gttgttgacc gaagcaactg ctatttccag aagagctaga ggttttccaa atgttccagg 240

tatttggtca caagaacaaa ttgctggttg gaaagaagtt gttgatgctg ttcatgctaa 300

gggttcttat atttggttgc aattgtgggc tactggtaga gctgctgaag ttggtgtttt 360

gaaagctaat ggttttgatt tggtttcttc ttctgctgtt cctgtttctc ctggtgaacc 420

aactccaaga gctttgtctg atgatgaaat taattcctat attggtgatt tcgttcaagc 480

tgctaaaaat gctgttttgg aagctggttt tgatggtgtt gaattgcatg gtgctaacgg 540

ttttttgatt gatcaatttt tgcaatcccc ttgtaatcaa agaactgatc aatggggtgg 600

ttgtattgaa aatagatcaa gatttggttt ggaaattacc agaagagtta ttgatgctgt 660

tggtaaagat catgttggta tgaaattgtc tacttggagt acttttcaag gtatgggtac 720

tatggatgat ttgattcctc aatttgaaca tttcattatg agattgagag aaattggtat 780

tgcatatttg catttggcta attctagatg ggttgaagaa gaagatccaa caattagaac 840

tcatccagat attcataacg aaacttttgt tagaatgtgg ggtaaagaaa agccagtttt 900

attggctggt ggttatggtc cagaatctgc taaattggtt gttgatgaaa cttattccga 960

tcataaaaac attggtgttg tttttggtag acattatatt tcaaaccctg atttgccttt 1020

tagattgaag atgggtttac cattgcaaaa atataacaga gaaacctttt acattccatt 1080

ctctgatgaa ggttatttgg attatccata ctccgaagaa tatattactg aaaataagaa 1140

gcaagctgtt ttggcataaa ggagaccgcg gccgc 1175

<210> 11

<211> 1181

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcggccgcgg tctccaatgt catcctctaa cttgtttaag ccaattccat tgggtagaaa 60

agttttgcaa cataaagttg ttttgtcccc aatgaccaga ttcagagctg ataacgatgg 120

tgttccattg tcctacgtta aatcttatta tggtcaaaga gcttccatta gaggtacttt 180

gttgattaca gaagctgttg ctatttgtcc aagagcaaag ggtttttcta attgtccagg 240

tatttggcat caagatcaaa ttgctgcatg gaaagaagtt gttgatgaag ttcattctaa 300

gggttcagtt atttggttgc aattgtgggc tactggtaga gcttctgatg ctgatacttt 360

aaaagaatca ggttttcatt tggaatcctc tagtgatgtt ccagttgctc ctggtgaacc 420

agttccaaga cctttgtcag aagatgaaat tgaatcatat attagagatt acgttaccgg 480

tgctattaat gctgttcaag gtgctggttt cgatggtatt gaaattcatg gtgctaatgg 540

ttttttggtt gatcaatttt tgcaagcttc ttgtaatact agagctgatc aatggggtgg 600

ttctattgaa aatagaagta gatttggttt ggaaattacc agaagagttg ttgatgctgt 660

tggtaaagat agagttggtg ttaaattgtc tccttggtca acttttcaag gtatgggtac 720

tatggatgat ttggttgctc aatttgaaca ttttatttcc agattgagag aaatggatat 780

tgcttatatt catttggtta acaccagatg gttggaagaa gaagaaccag gtattaaaac 840

tcatccagat gttgataacc aaactttcgt tagaatgtgg ggtaataaga ccccaatttt 900

attggcaggt ggttatgatg cagatagtgc tagaagattg gttgatgaaa catattccga 960

tcaaaataac attatggttg ttttcggtag acattatatt tctaacccag atttgccttt 1020

tagattgaga ttgggtattc cattgcaaaa atataacaga gatacctttt acattccatt 1080

ctctgatgaa ggttatttgg attatccatt ttgtcaagaa ttcttggatc aacaagatgt 1140

tgatcaagtt gttgttgctg cttaaaggag accgcggccg c 1181

<210> 12

<211> 1142

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcggccgcgg tctccaatgt caacctctaa cttgttttcc accgttccat ttggtaaaaa 60

tgttttgaac cataagattg ttttgtcccc aatgaccaga tttagagctg atgataacgg 120

tgttccattg tcttatatga aaacttttta cgctcaaaga gcttctgtta gaggtacttt 180

gttggttact gatgctgttg ctatttgtcc aagaacaaaa ggttttccaa atgttccagg 240

tatttggcat aaagatcaaa ttgctgcttg gaaagaagtt gttgatgaag ttcattcaaa 300

gggttctttt atttggttgc aattgtgggc tactggtaga gctgctgatt tggaagcttt 360

gacttctcaa ggtttgaaat tggaatcttc ttctgaagtt cctgttgctc caggtgaacc 420

aactcctaga gctttggatg aagatgaaat tcaacaatat attttggatt acgttcaagg 480

tgctaaaaat gctgttcatg gtgctggttt tgatggtgtt gaaattcatg gtgctaacgg 540

ttttttgatt gatcaatttt tgcaatcctc ctgtaataga agaactgatc aatggggtgg 600

ttccattgaa aatagaagta gatttggttt ggaaattacc agaggtgttg ttgatgctgt 660

tggtcatgat agagttggta tgaaattgtc tccatggtca acttttcaag gtatgggtac 720

tatggatgat ttggttcctc aatttgaaca ttttattacc tgtttgagag aaatggatat 780

tgcttatttg catttggcta attctagatg ggttgaagaa gaagatccat ctattagaac 840

tcatccagat tttcataacc aaacttttgt tcaaatgtgg ggtaaaaaga ggcctatttt 900

gttggctggt ggttatgatc cagattctgc tagaagattg gttgatcaaa catattctga 960

tagaaacaac gttttggttg tttttggtag acattatatt tccaacccag atttgccttt 1020

tagattgaga atgggtattg cttgtagatc cacaattgaa actcattcta ttttcccagc 1080

aagagaaaga gctatgtgga ctattccatc cgttaagaat atttaaagga gaccgcggcc 1140

gc 1142

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggttttagc atttgctctg ggcac 25

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacattctag ccgtgttcta tgcaaac 27

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tttacggttg aggttggagt gcac 24

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgtggtgtgt gcttagtttt tccacc 26

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acggcgttga caaggaagaa gcg 23

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgggagtgga gttagcctcg taag 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agatcgcaac taaccagatc cttg 24

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gctcaattca tggtttctaa caaactg 27

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccgtatggtt gaccaattaa accttc 26

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atcaacgtta caaagtctgc accac 25

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccatcagtag agtaccattg aactgtc 27

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

agctaacgtt cctaccgttc ccgg 24

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

accaaaggcg gccttaatga tcacc 25

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tggtcaatag cattgtcagg taatgaag 28

Claims (10)

1.辅因子调节酶在合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物中的应用；

所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；

所述药物包括麦角酸衍生物；

所述辅因子调节酶包括UTR1，MAE1，POS5或PYC2中的一种或多种的组合酶。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，经UTR1，POS5，MAE1或PYC2中的一种或两者以上的组合酶调节内源辅因子平衡。

3.表达盒，其特征在于，在功能表达盒WN414中插入UTR1，MAE1，POS5或PYC2中的一种或多种。

4.如权利要求3所述的表达盒，其特征在于，所述插入的位置包括Pgal1-TDH1t之间。

5.质粒，其特征在于，转化有如权利要求3或4所述的表达盒。

6.菌株，其特征在于，转化有如权利要求5所述的质粒。

7.如权利要求6所述的菌株，其特征在于，其包括第一表达模块、第二表达模块、第三表达模块和/或内源模块；

所述第一表达模块包括dmaW-easF；所述第一表达模块的整合位点包括XV染色体的Δ22位点；和/或

所述第二表达模块包括easE-easC；所述第二表达模块的整合位点包括XVI染色体的Δ15位点；和/或

所述内源模块包括ero1-fad1；所述内源模块的整合位点包括VIII染色体的Δ14位点；和/或

所述第三表达模块包括：

来源于C.fusiformis、Claviceps purpurea或N.lolii的easA；和/或

来源于Claviceps purpurea、Aspergillus fumigatus或N.lolii的easG；和/或

来源于Claviceps purpurea或Aspergillus fumigatus的easD；

其中，来源于Claviceps purpurea或Aspergillus fumigatus的easD的整合位点包括GAL1/7/10。

8.添加前体底物和/或甲基供体在合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物中的应用；

所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；

所述药物包括麦角酸衍生物；

所述前体底物包括色氨酸；和/或

所述甲基供体包括SAM。

9.培养基，其特征在于，包括前体底物和/或甲基供体；

所述前体底物包括色氨酸；和/或

所述甲基供体包括SAM。

10.合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物的方法，其特征在于，取如权利要求6或7所述的菌株，经如权利要求9所述的培养基培养，获得田麦角碱；取所述田麦角碱制备获得麦角生物碱和/或药物；所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；所述药物包括麦角酸衍生物。

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