CN113249282B - 一种产β-榄香烯重组菌及其构建方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产β‑榄香烯重组菌株及其构建方法和应用，涉及代谢工程、合成生物学和生物制药等技术领域。该重组菌株表达来自加拿大一枝黄花的吉玛烯A合酶(ScGAS)，并引入包含大肠杆菌的atoB、idi、ispA和酿酒酵母的ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1重组质粒，经过发酵条件优化，该重组菌株的β‑榄香烯产量达到156.94mg/L。本发明中构建的重组菌具备产量高、纯度高、低成本、无污染等特点,适于工业化生产β‑榄香烯。

Description

一种产β-榄香烯重组菌及其构建方法和用途
技术领域
本发明涉及代谢工程、合成生物学和生物制药等技术领域，特别涉及一种产β-榄香烯菌株的构建方法及用途。
背景技术
以β-榄香烯(β-elemene)为主要成分的榄香烯类化合物，为国家Ⅱ类非细胞毒性抗肿瘤新药。β-榄香烯具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖、转移和主动免疫保护等作用，临床上可以单独或与其他化疗药物联合用于治疗各种癌症，此外还具有抗氧化、抗菌、抗病毒、改善微循环等药效，因此具有良好医药价值和应用前景。
目前市场的β-榄香烯主要是从中药莪术中提取获得。该获取方法成本高、纯度低，而常规化学全合成方法的步骤繁琐、反应条件苛刻、得率低、环境不友好，限制了β-榄香烯的供给和应用。因此，寻找新的β-榄香烯经济可行的量产技术，对该类药物的推广应用具有重要意义。
合成生物学的发展，为规模化生产自然界中含量低、结构复杂、应用价值高的天然产物提供了新的方法。利用微生物生长速度快、周期短、成本低、遗传背景清楚有利于遗传改造等优点，通过构建重组细胞、异源重组天然产物的合成途径，已有快速、大量获取中间体和终产物的成功范例：在酿酒酵母中构建青蒿素的生物合成途径，其前体青蒿酸的产量达到25g/L(Paddon,C.J.,et al.Nature 496.7446(2013):528.)。
β-榄香烯是植物中比较常见的一类倍半萜类化合物，但目前尚无β-榄香烯合酶被克隆，β-榄香烯是由吉玛烯A经cope重排而来的，而吉玛烯A则是经吉玛烯A合酶催化底物法呢烯基焦磷酸FPP获得。研究开发一种快速、高产、环境友好的β-榄香烯的制备方法成为当前亟待研究的重要课题。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供了一种产β-榄香烯菌株及其构建方法。本发明通过构建产生倍半萜类化合物的前体法呢烯基焦磷酸(FPP)的重组质粒和构建来源于加拿大一枝黄花(Solidago canadensis)的吉玛烯A合酶ScGAS重组质粒，获得含有上述重组质粒的大肠杆菌工程菌株，并通过优化温度、诱导剂浓度、诱导时间和诱导时菌液浓度，从而实现快速、高产地制备β-榄香烯。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种产β-榄香烯的重组菌，所述重组菌表达吉玛烯A合酶ScGAS、乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA。
进一步地，所述吉玛烯A合酶ScGAS的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述吉玛烯A合酶ScGAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ IDNO.3所示，
进一步地，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、甲羟戊酸激酶ERG12的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，焦磷酸异戊烯脂异构酶idi的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示、法呢烯基焦磷酸合酶ispA的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。
进一步地，所述重组菌为重组大肠杆菌或重组酵母菌。
进一步地，所述吉玛烯A合酶ScGAS的表达载体为pGEX-4T1载体。
进一步地，所述重组菌表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA的表达载体为pACYCDuet-1载体。
进一步地，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1的基因连接到pACYCDuet-1的多克隆位点MCS1位点，所述甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA的基因连接到pACYCDuet-1的MCS2位点。
本发明另一方面提供了上述产β-榄香烯的重组菌的构建方法，主要包括以下步骤：
(1)将吉玛烯A合酶ScGAS基因连接到pGEX-4T1载体中，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒pGEX-4T1-ScGAS；
(2)将乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB基因、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13基因、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1基因、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi基因和法呢烯基焦磷酸合酶ispA基因连接到pACYCDuet-1载体中，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒pACYCDuet-FPP；
(3)将步骤(1)所得的pGEX-4T1-ScGAS重组质粒和步骤(2)所得的pACYCDuet-FPP共同转化感受态细胞，挑取阳性克隆即得产β-榄香烯的重组菌株。
进一步地，步骤(3)中的感受态细胞为E.coil BL21(DE3)。
本发明提供了一种利用上述产β-榄香烯的重组菌生产β-榄香烯的方法，所述方法主要包括以下步骤：
(1)在转速50～300rpm，温度20～32℃的培养条件下，培养上述产β-榄香烯的重组菌，待重组菌液浓度A600为0.2～2时，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.01～1.0mM，继续培养至12-120h；
(2)使用有机溶剂萃取发酵液中的β-榄香烯，离心收集有机相，即得。
进一步地，所述培养的培养基为液体LB培养基。
进一步地，所述有机溶剂为乙酸乙酯、己烷、石油醚或氯仿中的一种或2种以上的混合物。
进一步地，所述有机溶剂与发酵液的体积比2:1～1:20。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
1.本发明构建的产β-榄香烯重组菌具备产量高、纯度高、低成本、无污染等特点,适于工业化生产β-榄香烯。
2.本发明的产β-榄香烯重组菌经发酵条件优化后β-榄香烯产量高达156.94mg/L。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1重组质粒pACYCDuet-FPP示意图。
图2重组菌株和β-榄香烯的产量对应图。
图3共同表达pGEX-4T1-ScGAS和pACYCDuet-FPP重组菌发酵条件正交实验组合中的β-榄香烯产量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
下述实施例中，采用的pGEX-4T1载体、pACYCDuet-1购自于上海生工生物有限公司，E.coli Trans-1和E.coil BL21(DE3)感受态细胞购自于上海源叶生物科技有限公司。
实施例1重组质粒pGEX-4T1-ScGAS构建
依据NCBI数据库中加拿大一枝黄花来源的吉玛烯A合酶ScGAS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。由生工生物工程(上海)股份有限公司依据大肠杆菌密码子进行优化、合成基因和测序，获得密码子优化后的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，并插入到pBlueScript II SK(+)载体中，构成pBlueScript II SK(+)-ScGAS重组质粒。
将pBlueScript II SK(+)-ScGAS重组质粒和pGEX-4T1质粒分别用EcoR I与Sal I进行双酶切后(20μl酶切总体系中，10×Quic.Cut Green Buffer 2μl，EcoR I与Sal I各1μl，质粒pBlueScript II SK(+)-ScGAS或pGEX-4T1各8μl，ddH2O 8μl)，跑1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收后，连接入pGEX-4T1载体(10μl连接总体系中，Solution I 5μl，pGEX-4T1线性化载体1μl，ScGAS片段4μl，16℃反应3小时)，转化E.coli Trans-1感受态细胞，涂布含100mg/L的LB/Amp平板，37℃培养过夜，挑取转化子进行菌落PCR验证(20μlPCR体系中，10×ExTaq Buffer 2μl，dNTP 2μl，ScGAS-F和ScGAS-R各1μl，菌液1μl，ExTaq酶0.3μl，ddH2O12.7μl；PCR反应条件首先98℃变性5min；其次98℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，32个循环；最后72℃再延伸15min；引物序列见表1)，提取阳性菌落的质粒即pGEX-4T1-ScGAS重组质粒。
表1.引物序列表
Figure GDA0003133389030000041
Figure GDA0003133389030000051
实施例2重组质粒pACYCDuet-FPP构建
2.1基因全长序列的获得
提取大肠杆菌Trans-1和酿酒酵母S288C全基因组序列。依据NCBI上公布的atoB、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、idi、ispA基因序列设计引物(7-22号引物，序列见表1)，以上述大肠杆菌基因组DNA为模板扩增atoB、idi、ispA，以酵母基因组DNA为模板扩增ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1，使用高保真酶PrimeSTARGXL(Takara)进行扩增(50μlPCR体系中，5×PrimeSTAR Buffer 10μl，dNTP 4μl，引物-F和引物-R各1μl，模板1μl，PrimeSTAR酶0.5μl，ddH2O 32.5μl；PCR反应条件首先98℃变性5min；其次98℃变性10sec，55-60℃退火5sec，68℃延伸1-2min，32个循环；最后，68℃再延伸15min)，跑1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收后，回收产物使用ExTaq酶进行加A尾反应，与pMD18-T载体连接后，转化E.coli Trans-1感受态细胞，涂布含100mg/L的LB/Amp平板，37℃培养过夜，挑取转化子进行菌落PCR验证，阳性克隆送上海生工生物有限公司进行测序，测序正确的菌落，提取质粒后可作为后续载体构建的模板。
2.2利用重叠PCR原理构建操纵子A和B
操纵子A中包含基因atoB、ERG13、tHMG1，操纵子B中包含基因ERG12、ERG8、MVD1、idi、ispA。分别以步骤2.1中含有atoB、ERG13、tHMG1质粒为模板，用高保真酶PrimeSTARGXL进行PCR扩增，使用各自基因正反向引物(23-28号引物，序列见表1)，进行第一轮PCR反应，分别扩增上述3个基因(PCR反应条件首先98℃变性5min；其次98℃变性10sec，55-60℃退火5sec，68℃延伸1-2min，15个循环；最后，68℃再延伸15min)，然后以上述PCR产物各1μl为模板，使用23号和28号引物，进行第二轮PCR反应(PCR反应条件首先98℃变性5min；其次98℃变性10sec，55-60℃退火5sec，68℃延伸1-2min，32个循环；最后，68℃再延伸15min)，跑1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收后，即为操纵子A。操纵子B的构建过程类似操纵子A，仅使用不同引物扩增不同基因，第一轮PCR使用29-38号引物分别扩增ERG12、ERG8、MVD1、idi、ispA基因，第二轮使用29号和38号引物。
2.3使用OK Clon DNA连接试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)具体操作方法见试剂盒说明书，将操纵子A同源重组到pACYCDuet-1载体的多克隆位点1(MCS2)的Sal I位点，将操纵子B同源重组到pACYCDuet-1载体的多克隆位点2的Xho I位点，即获得pACYCDuet-FPP重组质粒。
实施例3高产β-榄香烯重组菌的构建
3.1用质粒pGEX-4T1或pGEX-4T1-ScGAS与pACYCDuet-1或pACYCDuet-FPP共同转化E.coil BL21(DE3)感受态，涂布LB/Amp&Cm抗性平板，过夜培养后，挑取单克隆使用pGEX-4T1载体上的通用引物M13-F&M13-R和pACYCDuet-1载体上的通用引物Cm-F&Cm-R(3-6号引物，序列见表1)进行菌落PCR鉴定，阳性克隆即分别为pGEX-4T1/pACYCDuet-FPP/BL21、pGEX-4T1-ScGAS/pACYCDuet-FPP/BL21、pGEX-4T1-ScGAS/pACYCDuet-1/BL21、pGEX-4T1/pACYCDuet-1/BL21重组菌株。
3.2上述步骤3.1获得的4种重组菌株分别接种到至含Amp&Cm抗生素的2mL液体LB培养基中，37℃恒温震荡培养箱中180rpm过夜培养。第二天以1：50的比例扩接至50mL含Amp&Cm抗生素的液体LB培养基中，37℃恒温震荡培养箱中继续培养至菌液浓度A600约为2，加入10μL浓度为0.5M的IPTG及10ml的正十二烷溶液，28℃恒温震荡培养箱内，180rpm培养48h。将发酵液冷却至室温，等体积分装至3个50mL离心管内，再在每个离心管内加入20mL乙酸乙酯，用封口膜封口震荡混匀抽提，并超声5分钟；室温下12000rpm离心10min，收集上清液至圆底烧瓶；在28℃，50rpm的旋转蒸发仪上旋至无乙酸乙酯，收集正十二烷；加入适量无水Na2SO4去除有机相内水分，再次离心收集上清，即为发酵产物。
3.3将步骤3.2发酵产物用0.22μm有机滤膜过滤，并用乙酸乙酯稀释200倍，加入终浓度为20mg/L乙酸壬酯为内参，样品使用GC-MS检测，通过β-榄香烯与内参的峰面积比值，计算β-榄香烯的含量(如图2所示)。GC-MS检测条件：石英毛细管柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：80℃，停留3min；10℃/min升至210℃，停留1min。载气：高纯氦气，流量设置为1mL/min；进样口及接口温度分别设置为250℃与280℃；进样量1μL；离子源EI；电子能量70eV；离子源温度250℃；扫描质量范围35～550amu；溶剂延迟6.5min。
结果表明，只表达pGEX-4T1-ScGAS的重组菌中β-榄香烯的产量为49.21mg/L(图2，ScGAS B)，而共同表达pGEX-4T1-ScGAS和pACYCDuet-FPP的重组菌中β-榄香烯的产量为146.88mg/L(图2，ScGAS D)，产量提高了2.98倍。因此，共同表达pGEX-4T1-ScGAS和pACYCDuet-FPP的重组菌可作为β-榄香烯的量产的重组菌株。
实施例4高产β-榄香烯重组菌的发酵条件优化
活化步骤3.1中获得的pGEX-4T1-ScGAS/pACYCDuet-FPP/BL21重组菌进行发酵条件优化。影响发酵产物产量的主因素包括IPTG添加时菌的浓度、培养温度、IPTG使用浓度及诱导时长，分别选择3个不同的实验条件(如表2所示)设计L9(34)正交实验表(如表3所示)，并使用正交实验的极差分析法分析4个因素对β-榄香烯产量的影响。按照方法3.2制备待检测样，使用3.3方法检测样品中β-榄香烯的含量变化，并计算和评估各因素对β-榄香烯产量的影响。
通过正交实验的极差分析法确定的各因素对β-榄香烯产量的主次关系结果如表4所示，不同发酵条件下，β-榄香烯产量如图3所示，最终确定发酵条件为重组菌的A600为0.5时添加IPTG，IPTG的终浓度为0.1mM，在28℃摇瓶发酵72h时，β-榄香烯的产量达到156.94mg/L。
表2.正交因素水平
Figure GDA0003133389030000081
表3.正交实验条件
Figure GDA0003133389030000082
表4.β-榄香烯的产量与各因素的关系表
Figure GDA0003133389030000083
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连大学
<120> 一种产β-榄香烯重组菌及其构建方法和用途
<130> 20210423
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1650
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggctgcta aacaagtaga ggttattcgc ccagttgcaa actatcatcc aagcctttgg 60
ggagatcagt ttctacacta tgatgagcaa gaggatgagc acgttgaggt agatcaacaa 120
atcgaaattt tgaaggaaga aacgcgaaaa gaaatacttg caagtttgga tgatccaaca 180
aaacatacaa atttgctgaa gctgattgat gttatccaac gtctcggtat agcctattat 240
tttgaacatg agattacgca agcattggac catatttata gtgtatacgg tgatgaatgg 300
aatggtggtc gtacttccct ttggtttcgg ctcctccgac aacaaggctt ttacgtttca 360
tgtgatattt tcaatatcta caagcttgat aatggatctt tcaaggattc cttaaccaag 420
gatattgaat gcatgcttga gttatatgag gcagcctata tgagggtgca aggcgaaatc 480
attctagatg aggctcttga gtttacaaaa actcatcttg aacacattgc aaaggatcca 540
cttcgttgca acaacacgct ctctagacac atacatgaag cactagagcg gcctgtacag 600
aaaaggttgc caagactaga tgcaatacga tacatacctt tctatgaaca acaagattct 660
cacaacaagt ccttactaag acttgcaaag ttggggttca accggcttca atccttgcat 720
aagaaggagc ttagccaact ttccaaatgg tggaaagaat ttgatgctcc aaagaatcta 780
ccttacgtaa gagatagatt ggttgaactc tacttttgga tactaggtgt ctacttcgaa 840
cctcaatatt ctcgttcgag aatattcttg acaaaaacaa ttaaaatggc agcaattcta 900
gacgacacgt atgatatcta tggtacttac gaagaacttg agatattcac caaagccgtt 960
caaaggtggt caattacctg catggatacg cttccagatt acatgaaagt gatttataag 1020
agcctcttgg atgtttatga agaaatggag gaaatcatag aaaaggatgg aaaagcatat 1080
caagttcact atgcaaaaga gtcgatgata gatttggtta caagttatat gaccgaagca 1140
aaatggttac atgagggtca tgtgccaaca tttgacgagc ataactcagt tacaaacata 1200
actggtggct ataaaatgct tacagcatca agctttgttg gcatgcatgg tgatatagtt 1260
acacaagagt ctttcaaatg ggttctcaac aatcctccac ttataaaagc ttcatctgac 1320
attagtagga ttatgaatga tatcgtcggt cacaaggagg agcaacaaag aaagcatatt 1380
gcatctagtg tggaaatgta catgaaagaa tataatctcg cggaggagga cgtctatgat 1440
tttctcaaag aaagagttga agatgcatgg aaagatataa accgagaaac attaacatgt 1500
aaagacattc atatggctct taagatgcct ccgatcaacc tggcacgcgt aatggatatg 1560
ctatacaaaa acggtgataa tttaaaaaat gttggacaag aaatccaaga ttatatgaaa 1620
tcttgtttca ttaatcctat gagtgtttga 1650
<210> 2
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Ala Lys Gln Val Glu Val Ile Arg Pro Val Ala Asn Tyr His
1 5 10 15
Pro Ser Leu Trp Gly Asp Gln Phe Leu His Tyr Asp Glu Gln Glu Asp
20 25 30
Glu His Val Glu Val Asp Gln Gln Ile Glu Ile Leu Lys Glu Glu Thr
35 40 45
Arg Lys Glu Ile Leu Ala Ser Leu Asp Asp Pro Thr Lys His Thr Asn
50 55 60
Leu Leu Lys Leu Ile Asp Val Ile Gln Arg Leu Gly Ile Ala Tyr Tyr
65 70 75 80
Phe Glu His Glu Ile Thr Gln Ala Leu Asp His Ile Tyr Ser Val Tyr
85 90 95
Gly Asp Glu Trp Asn Gly Gly Arg Thr Ser Leu Trp Phe Arg Leu Leu
100 105 110
Arg Gln Gln Gly Phe Tyr Val Ser Cys Asp Ile Phe Asn Ile Tyr Lys
115 120 125
Leu Asp Asn Gly Ser Phe Lys Asp Ser Leu Thr Lys Asp Ile Glu Cys
130 135 140
Met Leu Glu Leu Tyr Glu Ala Ala Tyr Met Arg Val Gln Gly Glu Ile
145 150 155 160
Ile Leu Asp Glu Ala Leu Glu Phe Thr Lys Thr His Leu Glu His Ile
165 170 175
Ala Lys Asp Pro Leu Arg Cys Asn Asn Thr Leu Ser Arg His Ile His
180 185 190
Glu Ala Leu Glu Arg Pro Val Gln Lys Arg Leu Pro Arg Leu Asp Ala
195 200 205
Ile Arg Tyr Ile Pro Phe Tyr Glu Gln Gln Asp Ser His Asn Lys Ser
210 215 220
Leu Leu Arg Leu Ala Lys Leu Gly Phe Asn Arg Leu Gln Ser Leu His
225 230 235 240
Lys Lys Glu Leu Ser Gln Leu Ser Lys Trp Trp Lys Glu Phe Asp Ala
245 250 255
Pro Lys Asn Leu Pro Tyr Val Arg Asp Arg Leu Val Glu Leu Tyr Phe
260 265 270
Trp Ile Leu Gly Val Tyr Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Arg Ser Arg Ile
275 280 285
Phe Leu Thr Lys Thr Ile Lys Met Ala Ala Ile Leu Asp Asp Thr Tyr
290 295 300
Asp Ile Tyr Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Glu Ile Phe Thr Lys Ala Val
305 310 315 320
Gln Arg Trp Ser Ile Thr Cys Met Asp Thr Leu Pro Asp Tyr Met Lys
325 330 335
Val Ile Tyr Lys Ser Leu Leu Asp Val Tyr Glu Glu Met Glu Glu Ile
340 345 350
Ile Glu Lys Asp Gly Lys Ala Tyr Gln Val His Tyr Ala Lys Glu Ser
355 360 365
Met Ile Asp Leu Val Thr Ser Tyr Met Thr Glu Ala Lys Trp Leu His
370 375 380
Glu Gly His Val Pro Thr Phe Asp Glu His Asn Ser Val Thr Asn Ile
385 390 395 400
Thr Gly Gly Tyr Lys Met Leu Thr Ala Ser Ser Phe Val Gly Met His
405 410 415
Gly Asp Ile Val Thr Gln Glu Ser Phe Lys Trp Val Leu Asn Asn Pro
420 425 430
Pro Leu Ile Lys Ala Ser Ser Asp Ile Ser Arg Ile Met Asn Asp Ile
435 440 445
Val Gly His Lys Glu Glu Gln Gln Arg Lys His Ile Ala Ser Ser Val
450 455 460
Glu Met Tyr Met Lys Glu Tyr Asn Leu Ala Glu Glu Asp Val Tyr Asp
465 470 475 480
Phe Leu Lys Glu Arg Val Glu Asp Ala Trp Lys Asp Ile Asn Arg Glu
485 490 495
Thr Leu Thr Cys Lys Asp Ile His Met Ala Leu Lys Met Pro Pro Ile
500 505 510
Asn Leu Ala Arg Val Met Asp Met Leu Tyr Lys Asn Gly Asp Asn Leu
515 520 525
Lys Asn Val Gly Gln Glu Ile Gln Asp Tyr Met Lys Ser Cys Phe Ile
530 535 540
Asn Pro Met Ser Val
545
<210> 3
<211> 1650
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggccgcca aacaggttga agtgatccgc ccggtggcaa attatcatcc gagcctgtgg 60
ggcgatcagt ttctgcatta tgatgaacag gaagatgaac atgttgaagt tgatcagcag 120
attgaaatcc tgaaagaaga aacccgtaaa gaaattctgg cctcactgga tgatccgacc 180
aaacatacga acctgctgaa actgattgat gtgattcagc gtctgggaat tgcttattat 240
tttgaacatg aaattaccca ggcactggat catatttata gtgtttatgg tgatgaatgg 300
aatggtggtc gtacctcact gtggtttcgt ctgctgcgtc agcagggctt ttatgtttct 360
tgtgatattt ttaatatcta taaactggat aatggttctt ttaaagatag tctgactaag 420
gatattgaat gcatgctgga actgtatgaa gcagcgtata tgcgtgtaca gggggaaatt 480
attctggatg aggcgctgga atttacaaaa acccatctgg aacatattgc caaagatccg 540
ctgcgctgta ataatacgct gagtcgccat attcatgaag cactggaacg tccggtgcag 600
aaacgtctgc cacgtctgga tgccattcgt tatattccgt tttatgaaca gcaggattct 660
cataataaaa gcctgctgcg tctggcaaaa ctgggtttta atcgtctgca gtctctgcat 720
aaaaaagagc tgagccagct gagtaaatgg tggaaagaat ttgatgcccc aaaaaatctg 780
ccatatgttc gtgatcgcct ggtggaactg tatttttgga ttctgggtgt ttattttgaa 840
ccacagtata gccgcagtcg tatttttctg accaaaacca ttaaaatggc cgccattctg 900
gatgatacat atgatatcta tggcacttat gaagaactgg aaatttttac aaaagcagtg 960
cagcgttggt cgattacttg tatggataca ctgccggatt atatgaaagt tatttataaa 1020
tcccttttag atgtgtatga agaaatggaa gaaattatag aaaaagatgg caaagcctat 1080
caggttcatt atgctaaaga atcaatgatt gatctggtta ctagttatat gactgaagcg 1140
aaatggctgc atgaaggcca tgttccgacc tttgatgaac ataatagcgt gacgaatatt 1200
acaggcggtt ataaaatgct gaccgcgagc agttttgtcg gtatgcatgg tgatattgtt 1260
acccaggaaa gttttaaatg ggtgctgaat aacccgccgc tgattaaagc gagcagcgat 1320
atttcacgca ttatgaatga tattgttggt cataaagaag aacagcagcg taaacatatt 1380
gcaagcagtg ttgaaatgta tatgaaagaa tataatctgg ctgaagaaga tgtttatgat 1440
tttctgaaag aacgcgttga agatgcatgg aaagatatta atcgtgaaac cctgacctgt 1500
aaagatattc atatggctct gaaaatgccg ccgattaatc tggcacgtgt tatggatatg 1560
ctgtataaaa atggtgataa tctgaaaaac gtgggtcagg aaatacagga ttatatgaaa 1620
agctgcttta ttaatccgat gagtgtttaa 1650
<210> 4
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgaaaaatt gtgtcatcgt cagtgcggta cgtactgcta tcggtagttt taacggttca 60
ctcgcttcca ccagcgccat cgacctgggg gcgacagtaa ttaaagccgc cattgaacgt 120
gcaaaaatcg attcacaaca cgttgatgaa gtgattatgg gtaacgtgtt acaagccggg 180
ctggggcaaa atccggcgcg tcaggcactg ttaaaaagcg ggctggcaga aacggtgtgc 240
ggattcacgg tcaataaagt atgtggttcg ggtcttaaaa gtgtggcgct tgccgcccag 300
gccattcagg caggtcaggc gcagagcatt gtggcggggg gtatggaaaa tatgagttta 360
gccccctact tactcgatgc aaaagcacgc tctggttatc gtcttggaga cggacaggtt 420
tatgacgtaa tcctgcgcga tggcctgatg tgcgccaccc atggttatca tatggggatt 480
accgccgaaa acgtggctaa agagtacgga attacccgtg aaatgcagga tgaactggcg 540
ctacattcac agcgtaaagc ggcagccgca attgagtccg gtgcttttac agccgaaatc 600
gtcccggtaa atgttgtcac tcgaaagaaa accttcgtct tcagtcaaga cgaattcccg 660
aaagcgaatt caacggctga agcgttaggt gcattgcgcc cggccttcga taaagcagga 720
acagtcaccg ctgggaacgc gtctggtatt aacgacggtg ctgccgctct ggtgattatg 780
gaagaatctg cggcgctggc agcaggcctt acccccctgg ctcgcattaa aagttatgcc 840
agcggtggcg tgccccccgc attgatgggt atggggccag tacctgccac gcaaaaagcg 900
ttacaactgg cggggctgca actggcggat attgatctca ttgaggctaa tgaagcattt 960
gctgcacagt tccttgccgt tgggaaaaac ctgggctttg attctgagaa agtgaatgtc 1020
aacggcgggg ccatcgcgct cgggcatcct atcggtgcca gtggtgctcg tattctggtc 1080
acactattac atgccatgca ggcacgcgat aaaacgctgg ggctggcaac actgtgcatt 1140
ggcggcggtc agggaattgc gatggtgatt gaacggttga attaa 1185
<210> 5
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgaaactct caactaaact ttgttggtgt ggtattaaag gaagacttag gccgcaaaag 60
caacaacaat tacacaatac aaacttgcaa atgactgaac taaaaaaaca aaagaccgct 120
gaacaaaaaa ccagacctca aaatgtcggt attaaaggta tccaaattta catcccaact 180
caatgtgtca accaatctga gctagagaaa tttgatggcg tttctcaagg taaatacaca 240
attggtctgg gccaaaccaa catgtctttt gtcaatgaca gagaagatat ctactcgatg 300
tccctaactg ttttgtctaa gttgatcaag agttacaaca tcgacaccaa caaaattggt 360
agattagaag tcggtactga aactctgatt gacaagtcca agtctgtcaa gtctgtcttg 420
atgcaattgt ttggtgaaaa cactgacgtc gaaggtattg acacgcttaa tgcctgttac 480
ggtggtacca acgcgttgtt caactctttg aactggattg aatctaacgc atgggatggt 540
agagacgcca ttgtagtttg cggtgatatt gccatctacg ataagggtgc cgcaagacca 600
accggtggtg ccggtactgt tgctatgtgg atcggtcctg atgctccaat tgtatttgac 660
tctgtaagag cttcttacat ggaacacgcc tacgattttt acaagccaga tttcaccagc 720
gaatatcctt acgtcgatgg tcatttttca ttaacttgtt acgtcaaggc tcttgatcaa 780
gtttacaaga gttattccaa gaaggctatt tctaaagggt tggttagcga tcccgctggt 840
tcggatgctt tgaacgtttt gaaatatttc gactacaacg ttttccatgt tccaacctgt 900
aaattggtca caaaatcata cggtagatta ctatataacg atttcagagc caatcctcaa 960
ttgttcccag aagttgacgc cgaattagct actcgcgatt atgacgaatc tttaaccgat 1020
aagaacattg aaaaaacttt tgttaatgtt gctaagccat tccacaaaga gagagttgcc 1080
caatctttga ttgttccaac aaacacaggt aacatgtaca ccgcatctgt ttatgccgcc 1140
tttgcatctc tattaaacta tgttggatct gacgacttac aaggcaagcg tgttggttta 1200
ttttcttacg gttccggttt agctgcatct ctatattctt gcaaaattgt tggtgacgtc 1260
caacatatta tcaaggaatt agatattact aacaaattag ccaagagaat caccgaaact 1320
ccaaaggatt acgaagctgc catcgaattg agagaaaatg cccatttgaa gaagaacttc 1380
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gacaaattta gaagatctta cgatgttaaa aaataa 1476
<210> 6
<211> 1506
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<400> 6
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tcgagctcat caggaccttc atcatctagt gaggaagatg attcccgcga tattgaaagc 120
ttggataaga aaatacgtcc tttagaagaa ttagaagcat tattaagtag tggaaataca 180
aaacaattga agaacaaaga ggtcgctgcc ttggttattc acggtaagtt acctttgtac 240
gctttggaga aaaaattagg tgatactacg agagcggttg cggtacgtag gaaggctctt 300
tcaattttgg cagaagctcc tgtattagca tctgatcgtt taccatataa aaattatgac 360
tacgaccgcg tatttggcgc ttgttgtgaa aatgttatag gttacatgcc tttgcccgtt 420
ggtgttatag gccccttggt tatcgatggt acatcttatc atataccaat ggcaactaca 480
gagggttgtt tggtagcttc tgccatgcgt ggctgtaagg caatcaatgc tggcggtggt 540
gcaacaactg ttttaactaa ggatggtatg acaagaggcc cagtagtccg tttcccaact 600
ttgaaaagat ctggtgcctg taagatatgg ttagactcag aagagggaca aaacgcaatt 660
aaaaaagctt ttaactctac atcaagattt gcacgtctgc aacatattca aacttgtcta 720
gcaggagatt tactcttcat gagatttaga acaactactg gtgacgcaat gggtatgaat 780
atgatttcta aaggtgtcga atactcatta aagcaaatgg tagaagagta tggctgggaa 840
gatatggagg ttgtctccgt ttctggtaac tactgtaccg acaaaaaacc agctgccatc 900
aactggatcg aaggtcgtgg taagagtgtc gtcgcagaag ctactattcc tggtgatgtt 960
gtcagaaaag tgttaaaaag tgatgtttcc gcattggttg agttgaacat tgctaagaat 1020
ttggttggat ctgcaatggc tgggtctgtt ggtggattta acgcacatgc agctaattta 1080
gtgacagctg ttttcttggc attaggacaa gatcctgcac aaaatgttga aagttccaac 1140
tgtataacat tgatgaaaga agtggacggt gatttgagaa tttccgtatc catgccatcc 1200
atcgaagtag gtaccatcgg tggtggtact gttctagaac cacaaggtgc catgttggac 1260
ttattaggtg taagaggccc gcatgctacc gctcctggta ccaacgcacg tcaattagca 1320
agaatagttg cctgtgccgt cttggcaggt gaattatcct tatgtgctgc cctagcagcc 1380
ggccatttgg ttcaaagtca tatgacccac aacaggaaac ctgctgaacc aacaaaacct 1440
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<400> 7
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ataagcgagt catctgcacc agatactatt gaattggact tcccggacat tagctttaat 180
cataagtggt ccatcaatga tttcaatgcc atcaccgagg atcaagtaaa ctcccaaaaa 240
ttggccaagg ctcaacaagc caccgatggc ttgtctcagg aactcgttag tcttttggat 300
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cccatcggtg ctgggttggg ctcaagcgcc tctatttctg tatcactggc cttagctatg 480
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ctaacctata ctagaattcc aaggtctaca aaagatcttg ttgctcgcgt tcgtgtgttg 780
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ctacaaggct tagagatcat gactaagtta agtaaatgta aaggcaccga tgacgaggct 900
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Claims (8)

1.一种产β-榄香烯的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达吉玛烯A合酶ScGAS、乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA；
所述吉玛烯A合酶ScGAS的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述吉玛烯A合酶ScGAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.3所示，乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、甲羟戊酸激酶ERG12的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，焦磷酸异戊烯脂异构酶idi的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示、法呢烯基焦磷酸合酶ispA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述吉玛烯A合酶ScGAS的表达载体为pGEX-4T1载体；所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA的表达载体为pACYCDuet-1载体。
3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1的基因连接到pACYCDuet-1的多克隆位点MCS1，所述甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA的基因连接到pACYCDuet-1的多克隆位点MCS2。
4.权利要求2或3所述的重组菌的构建方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)将吉玛烯A合酶ScGAS基因连接到pGEX-4T1载体中，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒pGEX-4T1-ScGAS；
(2)将乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB基因、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13基因、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1基因、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi基因和法呢烯基焦磷酸合酶ispA基因连接到pACYCDuet-1载体中，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒pACYCDuet-FPP；
(3)将步骤(1)所得的pGEX-4T1-ScGAS重组质粒和步骤(2)所得的pACYCDuet-FPP共同转化感受态细胞，挑取阳性克隆即得产β-榄香烯的重组菌株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中的感受态细胞为E.coilBL21(DE3)。
6.利用权利要求1-3任一项所述的重组菌生产β-榄香烯的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)在转速50～300rpm，温度20～32℃的培养条件下，培养权利要求1-5任一项所述的重组菌，待重组菌液浓度A600为0.2～2时，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.01～1.0mM，继续培养至12-120h；
(2)使用有机溶剂萃取发酵液中的β-榄香烯，离心收集有机相，即得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养的培养基为液体LB培养基。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯、己烷、石油醚或氯仿中的一种或2种以上的混合物，所述有机溶剂与发酵液的体积比2:1～1:20。
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