CN111004763A

CN111004763A - 一种生产β-石竹烯的工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN111004763A
Application number: CN201911367224.5A
Authority: CN
Inventors: 张汝兵; 李依婷; 咸漠; 张凯; 杨爱国; 王元英
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS; Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS; Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-04-14
Anticipated expiration: 2039-12-26
Also published as: CN111004763B

Abstract

一种生产β‑石竹烯的工程菌及构建方法与应用，属于生物工程技术领域。为了提高β‑石竹烯生物合成的效率，本发明提供了用于生产β‑石竹烯工程菌及其构建方法与应用，包括如下步骤：向能够产生法尼基焦磷酸的受体菌株中导入从烟草中克隆的β‑石竹烯合成酶的编码基因，得到重组菌；从所述重组菌中获得所述用于生产β‑石竹烯的工程菌。本发明成功运用生物工程技术实现了β‑石竹烯生物合成途径的异源重建及产物的联产，摇瓶发酵法β‑石竹烯产量达到25.06mg/L；通过重组菌株在发酵罐中的高密度发酵技术，β‑石竹烯产量提高约85倍。

Description

一种生产β-石竹烯的工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种生产β-石竹烯的工程菌及其构建方法与应用。

技术背景

β-石竹烯(又称β-丁香油精，学名是反-(1R,9S)-8-亚甲基-4,11,11-四甲基双环[7.2.0]十一-4-烯，β-caryophyllen)是一种双环倍半萜类化合物，天然存在于柠檬、园柚、肉豆蔻、胡椒、覆盆子、黑加仑、肉桂叶油、丁香叶油中，是肉桂油、丁香油等的主要成分之一。石竹烯具有辛香、木香、柑橘香、樟脑香，温和的丁香香气，因此可以用于调配食用香精，也可以用来合成乙酰基石竹烯等其他更有价值的香料。同时石竹烯也具有一定的药理价值，先前的研究表明石竹烯具有抗癌、消炎、抗菌等生物活性。

石竹烯可以从天然产物中提取获得，主要通过真空分馏已经去除丁香酚的丁香油；石竹烯也可以通过化学方法合成获得，以十二烷为底物，在磷钨酸或PW/SiO₂为催化剂，在酸性条件下剧烈搅拌，在一定温度下反应，最后分离获得石竹烯。也可以(+)-六氢-3a-羟基-7a-甲基-1H-茚-1,5(6H)-二酮为原料，经过还原、脱水、碱重排、羟基缩合等反应生成石竹烯。但是化学合成需要在强酸强碱条件下进行，同时存在合成效率底下，条件复杂等缺点，且化学合成产物“非天然”，作为食品添加剂，消费者的认可度低，影响了产品的下游应用。

发明内容

为了提高β-石竹烯生物合成的效率，本发明通过在能够产生法尼基焦磷酸的大肠杆菌宿主菌中表达烟草来源的β-石竹烯合成酶NtCAS构建了一种生产β-石竹烯的工程菌，用于β-石竹烯的合成。技术方案如下：

第一，本发明提供了一种生产β-石竹烯的工程菌，所述工程菌过表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS2、法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和β-石竹烯合成酶基因NtCAS；宿主菌为大肠杆菌。

进一步地限定，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，GenBank No.AAG02438；所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，GenBank No.AAG02439；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBankNo.NM_001182715.1；所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，GenBank NO.NM_001182727.1；所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBank NO.X97557.1，所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBank NO.NM_001183931.1；所述牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS2来源于北美冷杉(Abies grandis)，GenBank No.AF513112.1，所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，GenBank No.AM946981.2；所述β-石竹烯合成酶基因NtCAS来源于烟草，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

更进一步地限定，所述β-石竹烯合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二，本发明还提供了上述的生产β-石竹烯的工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)克隆烟草β-石竹烯合成酶基因NtCAS；

(2)表达载体的构建：将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS2，法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和步骤(1)克隆的β-石竹烯合成酶基因NtCAS连接到载体上，得到重组质粒pmiNtCAS；

(3)重组菌转化：将pYJM14质粒与步骤(2)所得重组质粒pmiNtCAS转化大肠杆菌，得到用于生产β-石竹烯的工程菌。

进一步地限定，步骤(1)具体为：提取烟草叶片组织的RNA，采用逆转录酶将RNA转化为cDNA模板，以逆转录反应得到的cDNA为模板，正向引物为：5'-ATGGATTTGAGCAAAGGCTTGCCGGT-3'，反向引物为：5'-TTATGGAACAGGATCAACCAATATTG-3'，进行PCR扩增获得目的基因NtCAS。

进一步地限定，步骤(2)具体为：将β-石竹烯合成酶基因NtCAS进行TA克隆，连接到pEASY-Blunt克隆载体中，得到重组质粒pEASY-NtCAS；以重组质粒pEASY-NtCAS为模版，采用正向引物：NtCAS-F 5'-CAGCGTAATAAATAATCTGGTAAGGAGATATAATGGATTTGAGCAAAGGCTTGC-3'和反向引物：NtCAS-R 5'-GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTATGGAACAGGATCAACCAATATTG-3'进行PCR扩增，回收目的基因NtCAS片段；以重组质粒pYJM26为模版，采用正向引物mmG-F 5'-TAATAAGGAGATATACCATGGCTAAAACAGTAGTTATTATTGATGCATTACG-3'和反向引物mmG-R 5'-CGACTTAAGCATTATGCGGCCGCTTAGTTCTGACGGAAAGCAACG-3'进行PCR扩增，回收目的片段mvaE-mvaS-GPPS2，简称mmG；以大肠杆菌DH5α基因组DNA为模版，采用正向引物ispA-F 5'-TAAGAAGGAGATATACATATGGACTTTCCGCAGCAACTCGA-3'和反向引物ispA-R 5'-CCAGATTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCC-3'进行PCR扩增，回收目的基因片段法尼基焦磷酸合成酶基因ispA；

回收后将目的基因片段ispA和NtCAS与经NdeI和XhoI双酶切的pACYCDuet-1质粒按照摩尔比1:1:1的比例进行同源重组，得到重组质粒piNtCAS；将目的片段mmG与经NcoI和NotI双酶切的piNtCAS质粒按照摩尔比2:1的比例进行同源重组，得到重组质粒pmiNtCAS。

进一步地限定，所述pYJM14质粒，携带有来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因ERG12，GenBank No.NM_001182715.1，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8，GenBank NO.NM_001182727.1，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19，GenBank NO.X97557.1和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，GenBank NO.NM_001183931.1的pTrcHis2B。

进一步地限定，所述重组质粒pYJM26携带有来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBankNo.AAG02438；来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，GenBank No.AAG02439和来源于北美冷杉(Abies grandis)的牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS2，GenBank No.AF513112.1。

第三，本发明还提供了上述工程菌在发酵生产β-石竹烯中的应用。

进一步地限定，所述发酵生产β-石竹烯的方法为：将所述的工程菌接种于一级种子培养基中，培养为一级种子液，再将一级种子液接种于二级种子培养基中，培养为二级种子液，然后将二级种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养。

更进一步地限定，所述一级种子培养基为LB液体培养基，一级种子液的培养温度为37℃，培养时间为8-12h。

所述一级种子培养基和二级种子培养基中均含有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素(Amp)和终浓度为34μg/mL的氯霉素(Cm)。

所述二级种子培养基为M9培养基，一级种子液接种到二级种子培养基中的质量分数为2％(wt)；二级种子液的培养温度为37℃，培养时间为4-6h。

所述发酵培养基包括酵母粉、K₂HPO₄·3H₂O、一水柠檬酸、柠檬酸铁铵、葡萄糖、MgSO₄·7H₂O、1000×微量元素母液、氨苄青霉素、氯霉素。

发酵培养基中各组分含量为：5g/L酵母粉，9.8g/L K₂HPO₄·3H₂O，2.1g/L一水柠檬酸，0.3g/L柠檬酸铁铵，20g/L葡萄糖，0.4g/L MgSO₄·7H₂O；1ml/L的1000×微量元素母液，发酵液中氨苄青霉素和氯霉素终浓度分别为100μg/mL和34μg/mL；发酵培养基pH7.0。

发酵培养基制备方法为：其中：K₂HPO₄·3H₂O 9.8g/L，一水柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH₄)₂SO₄ 3.0g/L混合后调至pH 7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。1000×微量元素母液采用0.22μm滤菌膜过滤除菌；转接种子液时，发酵培养基中分别补加单独除菌的葡萄糖、MgSO₄·7H₂O、1000×微量元素母液及氨苄青霉素和氯霉素。

所述1000×微量元素母液中含有(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 3.7g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.9g/L，H₃BO₃ 24.7g/L，CuSO₄·5H₂O 2.5g/L，MnCl₂·4H₂O 15.8g/L。

二级种子液接种到发酵培养基中的质量份数为5％，在发酵罐中发酵。发酵条件为：5L小型发酵罐，通气量1-2vvm，溶氧0-20％，转速400-1000rpm，37℃培养至OD₆₀₀为20时添加终浓度为0.3mM的IPTG，用氨水调pH，控制pH在7.0，30℃诱导表达继续发酵48h。发酵过程中维持葡萄糖浓度为0.1-0.5g/L。

基因全称及缩写解释说明：

乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因：mvaE；

3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因：mvaS；

甲羟戊酸激酶基因：ERG12；

甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因：ERG8；

甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因：ERG19；

异戊烯焦磷酸异构酶基因：IDI1；

牻牛儿基焦磷酸合成酶基因：GPPS2，该基因在GenBank中记载的名称为：香叶冷杉二磷酸合酶基因，本发明中二者为同一基因；

β-石竹烯合成酶基因：NtCAS，也称倍半萜合成酶基因，本发明中二者为同一基因。

有益效果

本发明从烟草中克隆到一种新的β-石竹烯合成酶NtCAS及其编码基因NtCAS，通过在能够产生法尼基焦磷酸的大肠杆菌体内表达该烟草β-石竹烯合成酶NtCAS，实现了以葡萄糖为原料生产石竹烯的代谢途径，可用于其大量生产，摇瓶发酵石竹烯产量达到25.06mg/L。并通过重组菌株的高密度发酵技术，β-石竹烯产量提高约85倍，产量达到2.13g/L。该路线原料廉价、可持续供应，具有规模化发展的潜力。

运用合成生物学策略实现萜类化合物生物合成途径的异源重建及产物的生产，积极促进β-石竹烯生物合成途径解析和利用。

附图说明

图1目的基因NtCAS的PCR电泳图，泳道M为DNA marker DL10000，泳道1和2为目的基因NtCAS；

图2β-石竹烯标准品GC图，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为色谱响应值峰高；

图3β-石竹烯标准品GC-MS分子碎片质谱图，横坐标为离子荷质比，纵坐标为离子碎片强度，图中结构式为β-石竹烯；

图4本发明的工程菌合成出的β-石竹烯GC-MS图，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为色谱响应值峰高；

图5本发明的工程菌合成出的产品(样品)与标准品β-石竹烯GC-MS分子碎片质谱对比图，横坐标为离子荷质比，纵坐标为离子碎片强度，图中结构式为β-石竹烯。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

石竹烯的检测方法：取发酵液2ml，然后12000g离心1min，取上清1ml并加入等体积乙酸乙酯于涡旋振荡器上混匀5min，然后静置10min，取上层有机相进行过滤后放置在液相小瓶中待测。检测条件：气相色谱质谱(GC-MS)仪器型号：岛津TQ8050；离子源：EI；检测器：四级杆；样品检测：取液相小瓶中液体进行检测。气相色谱(GC)仪器型号：岛津GC 2010Pro；色谱柱型号：Rtx-5MS；进样量：1μl；检测器：氢火焰检测器(FID)；柱温：50℃保温3min，然后以10℃/min的速度升温至290℃，保持5min。

pYJM26，该质粒记载在Yang J,et al.Metabolic engineering of Escherichiacoli for the biosynthesis ofalpha-pinene.Biotechnology for Biofuels,2013,6:60，公众可通过中国科学院青岛生物与能源过程研究所获得。

pYJM14，即pTrc-low，是携带有来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因(ERG12，GenBank No.NM_001182715.1)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8，GenBank NO.NM_001182727.1)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19，GenBankNO.X97557.1)和异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1，GenBank NO.NM_001183931.1)的pTrcHis2B。质粒pYJM14为本实验室已构建和保存的质粒，具体的构建方法如下：

分别以商品化质粒pTrcHis2B质粒(购自Invitrogen)和酿酒酵母(S.cerevisiae)基因组为模板，扩增出质粒pTrcHis2B的部分片段SFIBhB，SFB12hB，以及酿酒酵母MVA途径的下游4个基因片段ERG12(SF128h12，SFB12h12)；ERG8(SF128h8，SF819h8)；ERG19(SF819h19，SF19IhI)；IDI(SF19IhI，SFIBhI)，然后以这些片段或pTrcHis2B骨架为模板，通过普通PCR或者重叠PCR扩增出组装质粒的6个SFs片段SF128，SF819，SF19I，SFIB，SFB12，SF。4个基因ERG12，ERG8，ERG19，IDI之间的3个RBS序列是在PCR扩增时，通过设计引物时引入，使得4个基因由单一的trc(trp-lac promoter)启动子作用下进行表达。表1为pTrc-low质粒构建的过程中片段扩增的引物及模板，表2为所用到的引物序列汇总。

表1片段扩增的引物与模板

表2 pTrc-low构建引物序列汇总

将扩增的6个SFs片段SF128，SF819，SF19I，SFIB，SFB12，SFB按等摩尔比例在1.5mLEP管中混匀，密封后沸水浴使其变性，室温自然冷却(退火)。取适量体积连接液转化大肠杆菌感受态细胞，活化后，取100μL涂布LB平板(Amp抗性)，37℃培养过夜。挑取30个转化子37℃,180rpm振荡培养8h，各取2μL菌液为模板进行菌落PCR扩增鉴定，筛选阳性克隆。经PCR获得的阳性克隆扩大培养后，提取质粒，分别用不同的限制性内切酶进行单酶切和双酶切鉴定，以验证重组质粒的正确性。具体构建方法还可参见专利CN104120148A和文献Yang J,etal.Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis of alpha-pinene.Biotechnology for Biofuels,2013,6:60。

LB液体培养基(g/L)：10蛋白胨，5酵母粉，10NaCl，pH7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。灭菌结束后，发酵液中加入终浓度分别为100μg/mL和34μg/mL的氨苄青霉素和氯霉素，抗生素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌。

M9培养基(g/L)：20葡萄糖，15.2 Na₂HPO₄·12H₂O，3 KH₂PO₄，1 NH₄Cl，0.5 NaCl，0.4 MgSO₄，发酵液中氨苄青霉素和氯霉素终浓度分别为100μg/mL和34μg/mL，pH 7.0。其中：15.2 Na₂HPO₄·12H₂O，3 KH₂PO₄，1 NH₄Cl，0.5 NaCl混合后调至pH 7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。葡萄糖储液为500g/L，115℃，30min单独灭菌；MgSO₄·7H₂O储液为200g/L，121℃，20min单独灭菌；抗生素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌；转接种子液时，发酵培养基中分别补加单独除菌的葡萄糖、MgSO₄·7H₂O及抗生素。

发酵培养基(g/L)：5酵母粉，9.8 K₂HPO₄·3H₂O，2.1一水柠檬酸，0.3柠檬酸铁铵，20葡萄糖，0.4 MgSO₄·7H₂O；1ml/L的1000×微量元素((NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 3.7g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.9g/L，H₃BO₃ 24.7g/L，CuSO₄·5H₂O 2.5g/L，MnCl₂·4H₂O 15.8g/L)，发酵液中氨苄青霉素和氯霉素终浓度分别为100μg/mL和34μg/mL，pH7.0。其中：K₂HPO₄·3H₂O 9.8g/L，Citric acid·H₂O 2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH₄)₂SO₄ 3.0g/L混合后调至pH 7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。1000×微量元素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌；转接种子液时，发酵培养基中分别补加单独除菌的葡萄糖、MgSO₄·7H₂O、1000×微量元素储液及抗生素。

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1.克隆烟草β-石竹烯合成酶基因NtCAS。

提取烤烟品种红花大金元叶片(购买自中国烟草种质资源库)烟草叶片组织的RNA，采用逆转录酶将RNA转化为cDNA模板，以逆转录反应得到的cDNA为模板，正向引物为：5'-ATGGATTTGAGCAAAGGCTTGCCGGT-3'，反向引物为：5'-TTATGGAACAGGATCAACCAATATTG-3'，利用TakaRa公司PrimeSTAR Max DNA聚合酶进行PCR扩增；PCR条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，泳道M为DNA marker DL10000，泳道1和2为目的基因NtCAS，基因NtCAS片段大小约为1700bp，符合预期的大小。

采用琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒的方法回收目的基因片段，将目的片段进行TA克隆，连接到载体

-Blunt克隆载体中，然后将其转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株中，转化条件为：在100μL感受态细胞中加入5μL连接产物，轻轻混匀后冰浴30min；迅速放入42℃水浴中热激90s，立即置于冰上2-3min；加入800μL LB液体培养基，37℃慢摇培养1h；将菌液6000rpm离心1min，弃700μL上清，悬浮菌体，涂布于含有氨苄抗生素(Amp，100mg/L)的LB平板上，37℃倒置暗培养12～16h。采用菌落PCR进行阳性克隆筛选，挑选阳性单克隆菌落，提取质粒后送交测序。经测序分析，克隆得到烟草的基因NtCAS，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其含有1671个碱基，编码的蛋白命名为NtCAS，共556个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。并由此得到将基因NtCAS插入到

-Blunt克隆载体的重组质粒，命名为pEASY-NtCAS。

实施例2.利用β-石竹烯合成酶NtCAS生物合成β-石竹烯。

通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS)；来源于酿酒酵母的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1)；来源于北美冷杉的牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GPPS2)；来源于大肠杆菌的法尼基焦磷酸合成酶基因(ispA)和来源于烟草的β-石竹烯合成酶基因(NtCAS)，利用葡萄糖为原料生物合成石竹烯。具体方法如下：

(1)克隆烟草β-石竹烯合成酶基因NtCAS，方法参照实施例1；

(2)表达载体的构建：

以实施例1构建的质粒pEASY-NtCAS为模版，采用正向引物NtCAS-F(5'-CAGCGTAATAAATAATCTGGTAAGGAGATATAATGGATTTGAGCAAAGGCTTGC-3')和反向引物NtCAS-R(5'-GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTATGGAACAGGATCAACCAATATTG-3')进行PCR扩增基因NtCAS；以质粒pYJM26为模板，采用正向引物mmG-F(5’-TAATAAGGAGATATACCATGGCTAAAACAGTAGTTATTATTGATGCATTACG-3’)和反向引物mmG-R(5’-CGACTTAAGCATTATGCGGCCGCTTAGTTCTGACGGAAAGCAACG-3’)PCR扩增基因mvaE-mvaS-GPPS2，简称mmG；采用正向引物ispA-F(5’-TAAGAAGGAGATATACATATGGACTTTCCGCAGCAACTCGA-3’)和反向引物ispA-R(5’-CCAGATTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCC-3’)PCR扩增基因ispA。

PCR扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸30s，以上变性、退火、延伸三步重复进行35个循环后，72℃再延伸5min。利用胶回收试剂盒(购自Omega)回收目的基因片段。将载体pACYCDuet-1用NdeI和XhoI进行双酶切，载体与外源片段ispA、NtCAS按摩尔比1:1:1的比例使用TaKara公司的

Ultra One Step CloningKit进行同源重组，50℃重组15min，重组产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34mg/L氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒piNtCAS(pACYC-ispA-NtCAS)后，使用NcoI和NotI进行双酶切，与外源片段mvaE-mvaS-GPPS2按摩尔比1:2进行同源重组，然后涂布加有34mg/L氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pmiNtCAS(即pACYC-mvaE-mvaS-GPPS2-ispA-NtCAS)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

(3)重组工程大肠杆菌菌株的转化

将pmiNtCAS和pYJM14共同热激转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素素和氯霉素抗生素的LB固体平板，获得含有pmiNtCAS和pYJM4的工程大肠杆菌(即本发明所述的工程菌)。

实施例3.利用实施例2制备的工程菌发酵生产β-石竹烯。

挑取实施例2获得的白色单克隆工程大肠杆菌菌株在20ml的LB液体培养基中(含Cm和Amp抗性)，于37℃摇床培养活化，作为种子。种子菌浓度为1.0左右时，取扩培后的菌液按2％(wt)接种量接入50ml的M9培养基中，37℃培养，菌浓度长至0.6左右加入终浓度为0.2mM的IPTG，在30℃继续培养。

(1)产物检测

发酵24h后，取最终发酵液检测产量，产物的GC和GC-MS图分别如图4和5所示，通过与β-石竹烯标准品的GC和GC-MS图(图2和3)进行比对，表明合成出来产物为β-石竹烯，通过定量分析表明获得了25.06mg/L的石竹烯。

实施例4.生产β-石竹烯工程菌株的高密度发酵

(1)重组工程大肠杆菌菌株的构建

按照实施例2所述的构建方法，得到生产石竹烯的大肠杆菌工程菌。

(2)高密度发酵产β-石竹烯

在LB液体培养基中接种固体LB平板上制备得到的工程菌单菌落，并加入终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素，37℃生长8-12h，得到一级种子液；将得到的一级种子液分别按2％(wt)接种量转接至500mL发酵摇瓶中，含100mL的M9培养基，得到二级种子液。将二级种子液按5％的接种量接种至含有2L发酵培养基的5L小型发酵罐中，通气量1-2vvm，培养温度37℃，溶氧控制在0-20％左右，转速400-1000rpm，用氨水调pH，控制pH在7.0。当OD₆₀₀生长到约为12时，添加终浓度为0.3mM的IPTG，并将培养温度调整为30℃，继续培养12h。得到的β-石竹烯产物通过GC-MS对其进行定性和定量分析。培养过程中对发酵液中残余葡萄糖进行检测，并通过变速流加浓度为700g/L的糖液，维持发酵液中葡萄糖浓度在0.5g/L以下。采用与气相色谱连接的在线气体进样对尾气进行进样分析。GC结果表明，发酵产生了2.13g/L的β-石竹烯。

以上所述仅为本发明的实施例，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

氨基酸核苷酸序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所、中国农业科学院烟草研究

<120> 一种生产β-石竹烯的工程菌及其构建方法与应用

<130>

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1671

<212> DNA

<213> β-石竹烯合成酶基因NtCAS

<400> 1

atggatttga gcaaaggctt gccggtggga gttcatgaag tctctcgtcg ccctgcaaat 60

tatcatcgaa gcatttgggg agactatttc cttgattgtg tttctgattc cacgattatt 120

aatcctctgg aacagaaaca agttcaagac ttgagagaag aagtgaggaa gatgttaatg 180

gaagtccatg acacgtcttc agaaaagctc gagttgattg ataaaatcca acgcttagga 240

gtatcatatc attttgaaga ggaaattgag gcatcgctac aaaggatgta cgaagcctac 300

cgtgaatgca acaacatata tggggatgac ctttatcttg ttgctcttgg ttttcgttta 360

ctaagacaac aaggccattt tgtatcttgt gatgtgttcg aaaagttcaa ggacaatgaa 420

ggaaattttg agaaggcatt gacgactaac gtgccagcaa tgttaagttt gtatgaagct 480

gcacatatga gagtcgatgg agaggatatt ctcgaggaag ccttagtctt catatcaaat 540

cattttaaat caatgattcc tatcttgagt gattccttta gggaacaagt aatgcatgcc 600

ctaaatcagc caatccatat gagcttaaca agggtagaag caaggatatt cctatctagg 660

taccgaagtt attatgacac aaagaatgaa ctactattag aatttgcaaa gttggatttc 720

aacttgttgc aaaaggagca taggaaggag ctaagttcta ttacaaggtg gtggaaagat 780

ttggacattg taaccaagtg tccttttgca cgagatcgat tagtagagag ctatttttgg 840

gcattgggag tgtactttga gccaaaattt gctattgcaa gaagaatgct cgctaaagta 900

attggcttgg ctaccattat cgacgacatc tacgatgtgt atggaactta cgatgaactt 960

atgtgtttca cagaggcaat tgagagatgg gacgttagtg ccattgataa attgccgcca 1020

tacatgaaat cgtgttatct tgccattctc gatgtttatg ctgaaatgga ggaggaattg 1080

gccaagagag gagaatctta tcgggttgac tacgctaaaa atgagatgaa aaagttgact 1140

agggcatatt ttgaagaggc aaagtggtct cattcagctt gttatgtccc aacttttgag 1200

gagtacatga aggttgcact tgtttctagt ggttacatga tggttgcaac aacttcttta 1260

gttggcatag acgataattt gataaacaag aatgtcatgg attgggttac acataaacct 1320

ttaattgttc aagcttcaac ggtaattgcc agactgatgg atgacatggc tggacatgaa 1380

tttgaacagg aaagaggaca tgaaccttca gcagtagagt gctacatgaa gcagcatgga 1440

acatcaaaag aagaggtgtt tttggagctt caaaaattag taagtaatgc atggaaagat 1500

ataaacagac aatgtttgta tccaagagaa gtaccaatgc ttattctcat gcgagttctc 1560

aatcttgcac gcgtgataga tctcctttac aaagatgaag atgcatttac acattccact 1620

accaagctca agaacatcat tacttcaata ttggttgatc ctgttccata a 1671

<210> 2

<211> 556

<212> PRT

<213> β-石竹烯合成酶

<400> 2

Met Asp Leu Ser Lys Gly Leu Pro Val Gly Val His Glu Val Ser Arg

1 5 10 15

Arg Pro Ala Asn Tyr His Arg Ser Ile Trp Gly Asp Tyr Phe Leu Asp

20 25 30

Cys Val Ser Asp Ser Thr Ile Ile Asn Pro Leu Glu Gln Lys Gln Val

35 40 45

Gln Asp Leu Arg Glu Glu Val Arg Lys Met Leu Met Glu Val His Asp

50 55 60

Thr Ser Ser Glu Lys Leu Glu Leu Ile Asp Lys Ile Gln Arg Leu Gly

65 70 75 80

Val Ser Tyr His Phe Glu Glu Glu Ile Glu Ala Ser Leu Gln Arg Met

85 90 95

Tyr Glu Ala Tyr Arg Glu Cys Asn Asn Ile Tyr Gly Asp Asp Leu Tyr

100 105 110

Leu Val Ala Leu Gly Phe Arg Leu Leu Arg Gln Gln Gly His Phe Val

115 120 125

Ser Cys Asp Val Phe Glu Lys Phe Lys Asp Asn Glu Gly Asn Phe Glu

130 135 140

Lys Ala Leu Thr Thr Asn Val Pro Ala Met Leu Ser Leu Tyr Glu Ala

145 150 155 160

Ala His Met Arg Val Asp Gly Glu Asp Ile Leu Glu Glu Ala Leu Val

165 170 175

Phe Ile Ser Asn His Phe Lys Ser Met Ile Pro Ile Leu Ser Asp Ser

180 185 190

Phe Arg Glu Gln Val Met His Ala Leu Asn Gln Pro Ile His Met Ser

195 200 205

Leu Thr Arg Val Glu Ala Arg Ile Phe Leu Ser Arg Tyr Arg Ser Tyr

210 215 220

Tyr Asp Thr Lys Asn Glu Leu Leu Leu Glu Phe Ala Lys Leu Asp Phe

225 230 235 240

Asn Leu Leu Gln Lys Glu His Arg Lys Glu Leu Ser Ser Ile Thr Arg

245 250 255

Trp Trp Lys Asp Leu Asp Ile Val Thr Lys Cys Pro Phe Ala Arg Asp

260 265 270

Arg Leu Val Glu Ser Tyr Phe Trp Ala Leu Gly Val Tyr Phe Glu Pro

275 280 285

Lys Phe Ala Ile Ala Arg Arg Met Leu Ala Lys Val Ile Gly Leu Ala

290 295 300

Thr Ile Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Tyr Asp Glu Leu

305 310 315 320

Met Cys Phe Thr Glu Ala Ile Glu Arg Trp Asp Val Ser Ala Ile Asp

325 330 335

Lys Leu Pro Pro Tyr Met Lys Ser Cys Tyr Leu Ala Ile Leu Asp Val

340 345 350

Tyr Ala Glu Met Glu Glu Glu Leu Ala Lys Arg Gly Glu Ser Tyr Arg

355 360 365

Val Asp Tyr Ala Lys Asn Glu Met Lys Lys Leu Thr Arg Ala Tyr Phe

370 375 380

Glu Glu Ala Lys Trp Ser His Ser Ala Cys Tyr Val Pro Thr Phe Glu

385 390 395 400

Glu Tyr Met Lys Val Ala Leu Val Ser Ser Gly Tyr Met Met Val Ala

405 410 415

Thr Thr Ser Leu Val Gly Ile Asp Asp Asn Leu Ile Asn Lys Asn Val

420 425 430

Met Asp Trp Val Thr His Lys Pro Leu Ile Val Gln Ala Ser Thr Val

435 440 445

Ile Ala Arg Leu Met Asp Asp Met Ala Gly His Glu Phe Glu Gln Glu

450 455 460

Arg Gly His Glu Pro Ser Ala Val Glu Cys Tyr Met Lys Gln His Gly

465 470 475 480

Thr Ser Lys Glu Glu Val Phe Leu Glu Leu Gln Lys Leu Val Ser Asn

485 490 495

Ala Trp Lys Asp Ile Asn Arg Gln Cys Leu Tyr Pro Arg Glu Val Pro

500 505 510

Met Leu Ile Leu Met Arg Val Leu Asn Leu Ala Arg Val Ile Asp Leu

515 520 525

Leu Tyr Lys Asp Glu Asp Ala Phe Thr His Ser Thr Thr Lys Leu Lys

530 535 540

Asn Ile Ile Thr Ser Ile Leu Val Asp Pro Val Pro

545 550 555

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 3

atggatttga gcaaaggctt gccggt 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 4

ttatggaaca ggatcaacca atattg 26

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 正向引物NtCAS-F

<400> 5

cagcgtaata aataatctgg taaggagata taatggattt gagcaaaggc ttgc 54

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 反向引物 NtCAS-R

<400> 6

ggtttcttta ccagactcga gttatggaac aggatcaacc aatattg 47

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> 正向引物mmG-F

<400> 7

taataaggag atataccatg gctaaaacag tagttattat tgatgcatta cg 52

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 反向引物mmG-R

<400> 8

cgacttaagc attatgcggc cgcttagttc tgacggaaag caacg 45

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 正向引物ispA-F

<400> 9

taagaaggag atatacatat ggactttccg cagcaactcg a 41

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 反向引物ispA-R

<400> 10

ccagattatt tattacgctg gatgatgtag tcc 33

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> SF128Ws

<400> 11

tcattaccgt tcttaacttc tgcac 25

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> SF128Wa

<400> 12

attctgcatg cagctacctt aagttattta tcaagataag tttccggatc 50

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> SF819Ws

<400> 13

acccttaagg aggaaaaaaa catgtcagag ttgagagcct tca 43

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> sf819wa

<400> 14

gcgatgcagc gaattgatct tattcctttg gtagaccagt ctt 43

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> SF19IWs

<400> 15

tcgcccttaa ggaggaaaaa aaaatgaccg tttacacagc atccg 45

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> SF19IWa

<400> 16

ttatagcatt ctatgaattt gcctgtc 27

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> SFIBWs

<400> 17

ccttaggagg taaaaaaaaa tgactgccga caacaatagt atgcc 45

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> SFIBWa

<400> 18

cacgaacccc ccgttcagc 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> SFBWs

<400> 19

ctgcagctgg taccatatgg 20

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> SFBWa

<400> 20

catggtttat tcctccttat ttaat 25

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> SFB12Ws

<400> 21

cacacagccc agcttgg 17

<210> 22

<211> 44

<212> DNA

<213> SFB12Wa

<400> 22

gcaggcctat cgcaaattag cttatgaagt ccatggtaaa ttcg 44

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> SF128h12s

<400> 23

ctcccgtgga aagctagcg 19

<210> 24

<211> 70

<212> DNA

<213> SF128h12a

<400> 24

catgtttttt tcctccttaa gggtgcaggc ctatcgcaaa ttagcttatg aagtccatgg 60

taaattcgtg 70

<210> 25

<211> 69

<212> DNA

<213> SF128h8s

<400> 25

taagctaatt tgcgataggc ctgcaccctt aaggaggaaa aaaacatgtc agagttgaga 60

gccttcagt 69

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> SF128h8a

<400> 26

agattttgcc caagcccg 18

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> SF819h8s

<400> 27

agaaggcagt tctgccgca 19

<210> 28

<211> 73

<212> DNA

<213> SF819h8a

<400> 28

ttttttttcc tccttaaggg cgaattctgc atgcagctac cttaagttat ttatcaagat 60

aagtttccgg atc 73

<210> 29

<211> 68

<212> DNA

<213> SF819h19s

<400> 29

cttaaggtag ctgcatgcag aattcgccct taaggaggaa aaaaaaatga ccgtttacac 60

agcatccg 68

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> SF819h19a

<400> 30

tgttacagcc gcgttttgac 20

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> SF19I h19s

<400> 31

gcctcatcag ctccgcata 19

<210> 32

<211> 69

<212> DNA

<213> SF19I h19a

<400> 32

gtcatttttt tttacctcct aagggcgatg cagcgaattg atcttattcc tttggtagac 60

cagtctttg 69

<210> 33

<211> 67

<212> DNA

<213> SF19IhIs

<400> 33

aataagatca attcgctgca tcgcccttag gaggtaaaaa aaaatgactg ccgacaacaa 60

tagtatg 67

<210> 34

<211> 17

<212> DNA

<213> SF19IhIa

<400> 34

tggtgggttt gtggccg 17

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> SFIBhIs

<400> 35

catgcggcta ttttgcctat 20

<210> 36

<211> 50

<212> DNA

<213> SFIBhIa

<400> 36

aattcccata tggtaccagc tgcagttata gcattctatg aatttgcctg 50

<210> 37

<211> 46

<212> DNA

<213> SFIBhBs

<400> 37

caggcaaatt catagaatgc tataactgca gctggtacca tatggg 46

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> SFIBhBa

<400> 38

cacgtagcga tagcggagtg 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> SFB12hBs

<400> 39

ttcaagaact ctgtagcacc 20

<210> 40

<211> 44

<212> DNA

<213> SFB12hBa

<400> 40

gcagaagtta agaacggtaa tgacatggtt tattcctcct tatt 44

<210> 41

<211> 42

<212> DNA

<213> SFB12h12s

<400> 41

attaaataag gaggaataaa ccatgtcatt accgttctta ac 42

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> SFB12h12a

<400> 42

ggtctgctta aatttcattc 20

Claims

1.一种生产β-石竹烯的工程菌，其特征在于，所述工程菌过表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS2、法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和β-石竹烯合成酶基因NtCAS；宿主菌为大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，GenBankNo.AAG02438；所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，GenBank No.AAG02439；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBank No.NM_001182715.1；所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBank NO.NM_001182727.1；所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBank NO.X97557.1，所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBank NO.NM_001183931.1；所述牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS2来源于北美冷杉(Abies grandis)，GenBank No.AF513112.1，所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，GenBank No.AM946981.2；所述β-石竹烯合成酶基因NtCAS来源于烟草，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述β-石竹烯合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1-3任意一项所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)克隆烟草β-石竹烯合成酶基因NtCAS；

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)具体为：提取烟草叶片组织的RNA，采用逆转录酶将RNA转化为cDNA模板，以逆转录反应得到的cDNA为模板，正向引物为：5'-ATGGATTTGAGCAAAGGCTTGCCGGT-3'，反向引物为：5'-TTATGGAACAGGATCAACCAATATTG-3'，进行PCR扩增，获得目的基因NtCAS。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)具体为：将β-石竹烯合成酶基因NtCAS进行TA克隆，连接到pEASY-Blunt克隆载体中，得到重组质粒pEASY-NtCAS；以重组质粒pEASY-NtCAS为模版，采用正向引物：NtCAS-F 5'-CAGCGTAATAAATAATCTGGTAAGGAGATATAATGGATTTGAGCAAAGGCTTGC-3'和反向引物：NtCAS-R 5'-GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTATGGAACAGGATCAACCAATATTG-3'进行PCR扩增，回收目的基因NtCAS片段；以重组质粒pYJM26为模版，采用正向引物mmG-F 5'-TAATAAGGAGATATACCATGGCTAAAACAGTAGTTATTATTGATGCATTACG-3'和反向引物mmG-R 5'-CGACTTAAGCATTATGCGGCCGCTTAGTTCTGACGGAAAGCAACG-3'进行PCR扩增，回收目的片段mvaE-mvaS-GPPS2，简称mmG；以大肠杆菌DH5α基因组DNA为模版，采用正向引物ispA-F 5'-TAAGAAGGAGATATACATATGGACTTTCCGCAGCAACTCGA-3'和反向引物ispA-R5'-CCAGATTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCC-3'进行PCR扩增，回收目的基因片段法尼基焦磷酸合成酶基因ispA；

回收后将目的基因片段ispA和NtCAS与经NdeI和XhoI双酶切的pACYC-Duet-1质粒按照摩尔比1:1:1的比例进行同源重组，得到重组质粒piNtCAS；将目的片段mmG与经NcoI和NotI双酶切的piNtCAS质粒按照摩尔比2:1的比例进行同源重组，得到重组质粒pmiNtCAS。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述pYJM14质粒，携带有来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因ERG12，GenBank No.NM_001182715.1，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8，GenBank NO.NM_001182727.1，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19，GenBank NO.X97557.1和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，GenBankNO.NM_001183931.1的pTrcHis2B。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒pYJM26携带有来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBank No.AAG02438；来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，GenBank No.AAG02439和来源于北美冷杉(Abies grandis)的牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS2，GenBank No.AF513112.1。

9.权利要求1-3任意一项所述的工程菌在发酵生产β-石竹烯中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述发酵生产β-石竹烯的方法为：将所述的工程菌接种于一级种子培养基中，培养为一级种子液，再将一级种子液接种于二级种子培养基中，培养为二级种子液，然后将二级种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养。