CN113621633B

CN113621633B - 一种杧果萜烯合成酶基因tps1及其应用

Info

Publication number: CN113621633B
Application number: CN202110946265.0A
Authority: CN
Inventors: 罗海燕; 丛汉卿; 洪继旺; 代学慧; 赵德庆; 王荣香; 乔飞; 霍婷
Original assignee: Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Current assignee: Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2041-08-18
Also published as: CN113621633A

Abstract

本发明公开了一种杧果萜烯合成酶基因TPS1，还公开了包含上述杧果萜烯合成酶基因TPS1的重组表达载体、重组表达工程菌和重组杧果萜烯合成酶TPS1。以及上述杧果萜烯合成酶基因TPS1、杧果萜烯合成酶、重组表达载体、重组工程菌或重组TPS1在调控牻牛儿基二磷酸和橙花二磷酸合成萜类化合物方面的应用。本发明针对杧果中功能基因研究基础薄弱的现状，首次从杧果中克隆得到催化牻牛儿基二磷酸和橙花二磷酸底物合成萜类化合物的杧果萜烯合成酶基因TPS1，该基因为杧果萜类化合物合成路径中的关键基因之一，为今后利用基因工程或细胞工程技术在杧果育种中的应用提供了重要的理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。

Description

一种杧果萜烯合成酶基因TPS1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杧果萜烯合成酶基因TPS1及其应用，尤其是涉及一种杧果中催化萜类化合物合成的杧果萜烯合成酶基因(Terpenesynthase 1，TPS1)及其编码蛋白和应用。

背景技术

杧果为漆树科杧果属常绿果树，是著名的热带水果，素有“热带国王”之美誉，是我国热区重要的水果产业之一，也是我国热带地区农民的重要经济来源之一。杧果果实外观美丽、香气浓郁、风味佳美，深受消费者喜爱，杧果的香味是芒果风味品质的重要指标，香味物质变化与杧果品质密切相关。随着人民生活水平的不断提高，对农产品品质的要求越来越高，风味品质要求也随之提高。随着资源的进化和品种驯化，杧果果实的某些香味逐渐减退或失去，而且许多杧果在后熟过程中，香味释放不完全，这些都对杧果风味品质产生较大影响，对杧果的商品价值也产生一定影响。香味物质的形成还与产地、栽培管理措施、采收成熟度、贮藏条件，以及品种不同等均有关系。已报道的芒果中挥发性成分约有500多种，其中萜类化合物有150多种，约占总挥发物的28％，是杧果中最丰富的一类挥发性化合物，其在忙果风味形成方面起重要作用。

萜类化合物是植物次生代谢物中最大的一类，其在植物与环境因子的互作中发挥重要作用，如吸引昆虫传粉、参与植物间接防御反应，也是植物香味的重要成分，还具有重要的药用和保健价值。萜类化合物的生物合成途径通常被分为3个阶段：C5前体异戊烯基二磷酸酯(isopentenyl diphosphate,IPP)及其双键异构体二甲基烯丙基二磷酸酯(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)生成阶段；直接前体(法尼基二磷酸FarnesylDiphosphate,FPP、牻牛儿基二磷酸Geranyl diphosphate，GPP、橙花二磷酸NerylDiphosphate，NPP、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸Geranylgeranyl Diphosphate，GGPP等)生成阶段；萜类生成及修饰阶段(氧化还原、酰化、糖基化等)。其中，前两个阶段已经比较清楚，且为所有的萜类化合物所共享。第三个阶段决定了萜类化合物结构多样性，是植物次生代谢研究的重点领域。杧果中萜类化合物是由萜烯合成酶(TPS)催化形成，但参与其生物合成途径中的相关功能基因均未得以揭示，该基因及其编码的蛋白序列尚不清楚，因此，获得萜烯合成酶基因并进行功能验证，对于了解杧果中萜类香味物质形成意义重大。

发明内容

本发明的目的在于一种杧果萜烯合成酶基因TPS1及其编码蛋白和制备方法。

本发明的目的还在于提供一种包含上述杧果萜烯合成酶基因TPS1的重组表达载体、重组表达工程菌和重组杧果萜烯合成酶TPS1。

本发明的最后一个目的在于提供上述杧果萜烯合成酶基因TPS1、编码蛋白、重组表达载体、重组工程菌或重组杧果萜烯合成酶TPS1在调控牻牛儿基二磷酸GPP或橙花二磷酸NPP合成萜类化合物方面的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种杧果萜烯合成酶基因TPS1，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种杧果萜烯合成酶TPS1，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

该杧果萜烯合成酶基因TPS1的制备方法，包括以下步骤：将红象牙杧果果肉的总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对进行PCR扩增获得。

具体的，本发明通过红象牙杧果基因组测序结果进行分析，设计一对特异引物(PF正向引物:5’-cgcggcagccatATGGCACTACATCTCTCTAG-3’，和PR反向引物:5’-gtggtggtgctcgagTTAAATGGGATCAATTATTAC-3’，分别如SEQ ID NO：3所示和SEQ ID NO：4所示)，对杧果果肉样品cDNA进行PCR扩增，获得了催化杧果果肉中GPP与NPP合成萜类化合物的功能基因CDS序列(全长1773bp)，TPS1基因的CDS序列具体如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种重组表达载体，包括上述的杧果萜烯合成酶基因TPS1和表达载体。

优选的，所述表达载体为pET28a。

具体的，所述重组表达载体为pET28a-TPS1。

本发明还提供了一种重组表达工程菌，将杧果萜烯合成酶基因TPS1构建到表达载体pET28a上，用所得重组表达载体转化BL21(DE3)，筛选阳性菌株构建大肠杆菌工程菌，得到重组表达工程菌。

本发明还提供了一种重组杧果萜烯合成酶TPS1，包括用上述的重组表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得杧果重组萜烯合成酶TPS1。

优选的，所述寄主细胞为大肠杆菌。

此外，除了重组表达载体、重组表达工程菌和重组杧果萜烯合成酶TPS1之外，还可以是包括所述杧果萜烯合成酶基因TPS1的表达盒、转基因细胞系等。

本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的杧果萜烯合成酶基因TPS1、上述的杧果萜烯合成酶TPS1、上述重组表达载体、上述重组表达工程菌或上述的重组杧果萜烯合成酶TPS1在调控牻牛儿基二磷酸GPP或橙花二磷酸NPP合成萜类化合物方面的应用。

本发明可实现杧果萜烯合成酶基因TPS1、所述基因的编码蛋白(杧果萜烯合成酶TPS1)、含有所述杧果萜烯合成酶基因TPS1的表达盒、重组表达载体、重组表达工程菌、重组杧果萜烯合成酶基因TPS1等在调控TPS合成萜类化合物中的应用之外，还可以在基因工程、细胞工程等生物合成技术中的应用；进一步的，还可以利用基因工程技术进行杧果品种改良，以期获得特殊香味或者香味浓郁品种。

本发明具有如下优点：本发明针对杧果中功能基因研究基础薄弱的现状，首次从杧果中克隆得到催化牻牛儿基二磷酸GPP或橙花二磷酸NPP底物合成萜类化合物的杧果萜烯合成酶基因TPS1，该基因为杧果萜类化合物合成路径中的关键基因之一，为今后利用基因工程或细胞工程技术在杧果育种中的应用提供了重要的理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。

附图说明

图1是实施例3中TPS1蛋白酶促反应产物的TIC图；

图2是实施例3中阴性对照的酶促反应TIC图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sam brook等分子克隆实验手册(Sam brook J&R ussell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1杧果萜烯合成酶基因TPS1的克隆

根据前期红象牙杧果基因组测序结果进行分析(基因组数据库中的基因ID：mango018422，红象牙基因组数据已存入BIG Genome Sequence Archive数据库，登录号为PRJCA002248)，设计一对特异引物(PF正向引物:5’-cgcggcagccatATGGCACTACATCTCTCTAG-3’和PR反向引物:5’-gtggtggtgctcgagTTAAATGGGATCAATTATTAC-3’分别如SEQ ID NO：3所示和SEQ ID NO：4所示)，采用天根RNAprep Pure Kit总RNA提取试剂盒从红象牙杧果果肉中提取总RNA，并反转录合成cDNA，利用上述引物PF和PR从反转录得到的cDNA中扩增出如SEQ ID NO：1所示的杧果中催化萜类化合物生成的杧果萜烯合成酶基因TPS1基因的CDS序列，杧果萜烯合成酶基因TPS1的CDS序列全长1773bp。

TPS1基因ORF序列具体如下所示：

ATGGCACTACATCTCTCTAGTTTTCCCATGCCTCATTTACAGGTCCAGGTACATAATCTTCACAGACCTAGATACCATCCACAAAGAGCACAGGATGGCGCTTCGATGAGTCGAAAAGTTACGTGTTGCGTGACAGCGACTACACAAACTTCCCGTGGTAGATCTGCAAATTACCAGCCAACCATTTGGGATTACAATTTTGTGCAGTCTCTACGGACTGAAGATGTGGATGAAGAATGCGAGAGCAAGGCAAAGAAGCTGGAGGAGGAGGTGAGGCGTATGATGAACAATGAAAATGCAGAATTGTTGAGCATTCTTGAATTGATTGACGACATTCAGCGACTAGGTTTAGGATACCGGTTCCATGAGGACATAAAGATAGCTCTTGACAGAATTAGTATGTCTTGGGAAGAATATGATGATGATGCCAAGGAAGAAAACAAACTCCATTCCACTGCTCTAAGATTCAGGCTCCTTAGACAAAATGGTTGTCATATTTCTCAAGATATTTTCAAGATTTTCATCGACCAAGAAGGCAATTACATGGAATACTTGAAAAAGGATGTCAAAGGGTTACTAAGTTTGTATGAAGCCTCATATCTTGCATTTGAAGGAGAAAAACTCTTGGATGAGGCCAAAACCTTCTCACTAACACATCTCACTCAATTAAATAGAAAAATTGACCCAATCATGTCAGATCTTGTTACACATGCTTTAGAGAATCCGTTGCATCATAGATTGCAAAGGCTGGAAGCTCGGTGGTATATTGAAGTCTACAGTAAAAGAAATGATGCAAATCATTCCCTACTTGAATTTGCCCGGCTTGATTTTAACAGGGTGCAATTAATATACAAAAAAGATCTTAAAGATTTATCAAGGTGGTGGAAAGAAATTGATCTAGCAAGCAAAGTGAAATTTGCTAGAGACAGGTTGATGGAATGCTTTTTTTGGACAATTGGAATGATCCCAGATCCACAATCTAATAATTGTCGTAAGGGACTTACGAAAGTAGTTTCACTTATAACAATCCTGGATGACGTCTATGATTTACATGGTTCTTTAGATGAATTGGAGCTATTTACAAATGCGGTTGAAAGATGGGATATCAATTGTGTGAATCAACTACCAAACTATATGAAATTATGCTTCCTAGCACTCTACAACAGTGTTAATGAGATGGGTTATGACACTCTAAAAGAACAAGGAGTGAACATTATTCCATCCCTCACGAAAGCGTGGCTAGACTTGTGCAAAGCATTTTTAGAAGAAGCAAAATGGAGTTATAATAAATACACTCCAACATTTGAGGAATATCTACACTACGCATGGCTATCATCATCGGGGACACTTCTTTTGGTTCATTCCTACTTTTTATTTAATCAAGGTATCACCGATGAAGCGCTCGACTCTTTAGAAAAGTATCATAATCTGTGTCGCAGGCCATCTGTTATTTTTCGACTTTACAATGATTTAAGTACTTTCAAGGCTGAGGAAGAAAGAGGTGAAACCGCAAGTTCAATATTATGCTATATGCAAGAAAGAGGTTTATCAGAGGAAATTGCTCGTGAAGATATAAAGAAACTTATTGAGAAAAACTGGAGACAAATGAATAAGGAGGTGAGTGAAAAGCATCCATTTTCACAAGCTTTTGTAGAAACAGTTATTCATCTTGCTCGGACAGCCCATTGCACATACCAAAATGGAGATGGACATGGACATCCAGATGCTAGAATTAAGAAAAGAATCCTATCGGTAATAATTGATCCCATTTAA，具体如如SEQ ID NO：1所示。

氨基酸序列：

MALHLSSFPMPHLQVQVHNLHRPRYHPQRAQDGASMSRKVTCCVTATTQTSRGRSANYQPTIWDYNFVQSLRTEDVDEECESKAKKLEEEVRRMMNNENAELLSILELIDDIQRLGLGYRFHEDIKIALDRISMSWEEYDDDAKEENKLHSTALRFRLLRQNGCHISQDIFKIFIDQEGNYMEYLKKDVKGLLSLYEASYLAFEGEKLLDEAKTFSLTHLTQLNRKIDPIMSDLVTHALENPLHHRLQRLEARWYIEVYSKRNDANHSLLEFARLDFNRVQLIYKKDLKDLSRWWKEIDLASKVKFARDRLMECFFWTIGMIPDPQSNNCRKGLTKVVSLITILDDVYDLHGSLDELELFTNAVERWDINCVNQLPNYMKLCFLALYNSVNEMGYDTLKEQGVNIIPSLTKAWLDLCKAFLEEAKWSYNKYTPTFEEYLHYAWLSSSGTLLLVHSYFLFNQGITDEALDSLEKYHNLCRRPSVIFRLYNDLSTFKAEEERGETASSILCYMQERGLSEEIAREDIKKLIEKNWRQMNKEVSEKHPFSQAFVETVIHLARTAHCTYQNGDGHGHPDARIKKRILSVIIDPI*，具体如如SEQ ID NO：2所示。

获取杧果萜烯合成酶基因TPS1的具体步骤如下：

(1)将新鲜红象牙杧果肉用液氮冷却研磨，称取100mg粉末加入液氮预冷的2mL离心管中，并加入天根RNAprep Pure Kit总RNA试剂盒裂解液，涡旋混匀后静置10min；

(2)根据天根RNAprep Pure Kit总RNA试剂盒操作说明书步骤提取植物叶片总RNA；

(3)从红象牙杧果果肉中提取的总RNA为模板，利用反转录酶试剂盒PrimeScript^TMRT Master Mix(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件按照试剂盒说明书进行；

(4)利用上述引物PF和PR从RNA反转录得到的cDNA中扩增出植物中催化生成杧果萜烯合成酶基因TPS1的植物CDS序列；

(5)反应条件：95℃预变性3min；95℃30sec，55℃30sec，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min，溶液体系根据制造商说明书添加；

(6)将扩增获得的PCR产物采用进行切胶回收，切胶回收具体方法参照GelExtraction Kit(Omega)试剂盒制造商说明书。

实施例2杧果TPS1表达载体构建与转化：

选择载体pET28a进行酶切线性化，酶切位点为NdeI与XhoI(购自NEB)，酶切反应体系为(50μL体系)：

NdeI 1μL；

XhoI 1μL；

10×NEBuffer 5μL(1x)；

质粒 500ng；

ddH₂O补足至50μL。

37℃×1h，65℃×20min，酶切反应产物进行切胶回收，切胶回收具体方法参照GelExtraction Kit(Omega)试剂盒制造商说明书。

将回收的目的产物使用In-Fusion克隆(购自Clontech公司)连入表达载体pET28a，转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因，获得的含目的基因的重组表达载体命名为pET28a-TPS1，将所得的阳性菌株中加入等体积的50％已灭菌的甘油得菌液，混合均匀后置于-80℃冰箱保存。

实施例3杧果TPS1基因功能验证

为分析芒果基因TPS1的催化功能，将实施例2中得到的重组菌株进行诱导表达，得到粗酶，通过体外饲喂该基因催化反应前体化合物GPP、NPP、FPP、GGPP检测产物的合成来验证其基因功能。

具体步骤如下：

将实施例2中得到的重组菌株进行诱导表达：

(1)将实施例2保存的菌液按1％的体积接种至50mL LB培养基中(加入0.1％体积的50mg/mL kana工作液)，在37℃摇床中200rpm振荡培养过夜；

(2)过夜培养的菌液按1％的体积接种到1L LB培养基中(加入0.1％体积的50mg/ml kana工作液)，在37℃摇床中以200rpm的转速振荡培养2-4h，直至菌液OD600＝0.6～1.0；

(3)将菌液冷却至室温，加入诱导剂IPTG至终浓度达到1μM，20℃，200rpm振荡培养10～12h；

(4)将菌液在超高速低温冷冻离心机中4℃、14,000rpm离心10min，收集菌体；

(5)加入10mL预冷的Lysis Buffer重悬洗涤菌体，在超高速低温冷冻离心机中4℃、14,000rpm离心10min，收集菌体；

(6)加入100mL预冷的Lysis Buffer重悬菌体；

(7)将重悬的菌体置于冰水浴中，超声破菌(40Hz，超声5s，间隔2s，持续10min)；

(8)在超高速低温冷冻离心机中4℃、14,000rpm离心30min，重复离心1次，取上清即为粗酶；

(9)将空白载体pET28a转化进BL21(DE3)菌株中，并进行同样的诱导处理，所得粗酶作为阴性对照。

粗酶体外功能验证试验步骤如下：反应总体积为5mL，其中加入10μM·L^-1底物(分别添加GPP、NPP、FPP、GGPP四种底物，购买于Echelon Biosciences)，杧果TPS1粗酶2mL，添加反应缓冲液至总体积达5mL；将空白载体pET28a转化进BL21(DE3)菌株中，并进行同样的诱导处理，所得粗酶作为阴性对照，阴性对照中加入此粗酶2mL，其余组分同上。

以上试剂均加入气质小瓶中密封，置于28℃，150rpm摇床反应40分钟。

反应缓冲液为：15mM MOPSO，13％(v/v)甘油，1mM抗坏血酸，1μL·mL^-1吐温20，1mM氯化镁，2mM DTT，调PH至7.5。

反应结束后，将固相微萃取纤维(Supelco 50/30μm；CAR/PDMS/DVB)插入气质小瓶中，室温下萃取30min。随后使用GC-MS进行产物检测。

GC-MS条件为：气相色谱(Agilent GC7890B；Agilent MSD5977A)采用HP-5ms(Agilent)毛细管柱(30m×0.25mm inner diameter with 0.25μm film thickness，膜厚0.25-制片商m)。以氦气为载气，流速为1mL/min，分流比为20：1。进样口温度为250℃，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃。升温程序为：初始温度60℃，保持1分钟，以4℃/min的速度升温至120℃；再以5℃/min的速度升温至200℃并保持3min。电离方式为EI，电子能量为70eV。质量扫描范围为35-500m/z。

GC-MS的检测结果使用Masshunter软件进行分析，并从NIST14.L库中对气体产物进行匹配，筛选出匹配分数在85以上，并且相对含量大于1％的物质列于表1。

TPS1蛋白酶促反应产物的TIC图如图1所示，阴性对照的酶促反应TIC图如图2所示。

从表1与图1可看出，在异源表达分析中，TPS1蛋白能催化GPP生成单萜烯trans-.beta.-Ocimene(trans-β-Ocimene)；能催化NPP生成多种单萜烯产物Sabenene(桧烯)，beta.-Myrcene(β-月桂烯)，D-Limonene(D-柠檬烯)，其中主要产物为D-Limonene(D-柠檬烯)，次要产物为beta.-Myrcene(β-月桂烯)和Sabenene(桧烯)，不能催化FPP与GGPP生成相应的倍半萜烯和二萜烯。

表1TPS1蛋白酶促反应产物

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

<120> 一种杧果萜烯合成酶基因TPS1及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1773

<212> DNA

<213> 杧果萜烯合成酶基因TPS1(Terpene synthase 1)

<400> 1

atggcactac atctctctag ttttcccatg cctcatttac aggtccaggt acataatctt 60

cacagaccta gataccatcc acaaagagca caggatggcg cttcgatgag tcgaaaagtt 120

acgtgttgcg tgacagcgac tacacaaact tcccgtggta gatctgcaaa ttaccagcca 180

accatttggg attacaattt tgtgcagtct ctacggactg aagatgtgga tgaagaatgc 240

gagagcaagg caaagaagct ggaggaggag gtgaggcgta tgatgaacaa tgaaaatgca 300

gaattgttga gcattcttga attgattgac gacattcagc gactaggttt aggataccgg 360

ttccatgagg acataaagat agctcttgac agaattagta tgtcttggga agaatatgat 420

gatgatgcca aggaagaaaa caaactccat tccactgctc taagattcag gctccttaga 480

caaaatggtt gtcatatttc tcaagatatt ttcaagattt tcatcgacca agaaggcaat 540

tacatggaat acttgaaaaa ggatgtcaaa gggttactaa gtttgtatga agcctcatat 600

cttgcatttg aaggagaaaa actcttggat gaggccaaaa ccttctcact aacacatctc 660

actcaattaa atagaaaaat tgacccaatc atgtcagatc ttgttacaca tgctttagag 720

aatccgttgc atcatagatt gcaaaggctg gaagctcggt ggtatattga agtctacagt 780

aaaagaaatg atgcaaatca ttccctactt gaatttgccc ggcttgattt taacagggtg 840

caattaatat acaaaaaaga tcttaaagat ttatcaaggt ggtggaaaga aattgatcta 900

gcaagcaaag tgaaatttgc tagagacagg ttgatggaat gctttttttg gacaattgga 960

atgatcccag atccacaatc taataattgt cgtaagggac ttacgaaagt agtttcactt 1020

ataacaatcc tggatgacgt ctatgattta catggttctt tagatgaatt ggagctattt 1080

acaaatgcgg ttgaaagatg ggatatcaat tgtgtgaatc aactaccaaa ctatatgaaa 1140

ttatgcttcc tagcactcta caacagtgtt aatgagatgg gttatgacac tctaaaagaa 1200

caaggagtga acattattcc atccctcacg aaagcgtggc tagacttgtg caaagcattt 1260

ttagaagaag caaaatggag ttataataaa tacactccaa catttgagga atatctacac 1320

tacgcatggc tatcatcatc ggggacactt cttttggttc attcctactt tttatttaat 1380

caaggtatca ccgatgaagc gctcgactct ttagaaaagt atcataatct gtgtcgcagg 1440

ccatctgtta tttttcgact ttacaatgat ttaagtactt tcaaggctga ggaagaaaga 1500

ggtgaaaccg caagttcaat attatgctat atgcaagaaa gaggtttatc agaggaaatt 1560

gctcgtgaag atataaagaa acttattgag aaaaactgga gacaaatgaa taaggaggtg 1620

agtgaaaagc atccattttc acaagctttt gtagaaacag ttattcatct tgctcggaca 1680

gcccattgca cataccaaaa tggagatgga catggacatc cagatgctag aattaagaaa 1740

agaatcctat cggtaataat tgatcccatt taa 1773

<210> 2

<211> 590

<212> PRT

<213> 杧果萜烯合成酶基因TPS1(Terpene synthase 1)

<400> 2

Met Ala Leu His Leu Ser Ser Phe Pro Met Pro His Leu Gln Val Gln

1 5 10 15

Val His Asn Leu His Arg Pro Arg Tyr His Pro Gln Arg Ala Gln Asp

20 25 30

Gly Ala Ser Met Ser Arg Lys Val Thr Cys Cys Val Thr Ala Thr Thr

35 40 45

Gln Thr Ser Arg Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Gln Pro Thr Ile Trp Asp

50 55 60

Tyr Asn Phe Val Gln Ser Leu Arg Thr Glu Asp Val Asp Glu Glu Cys

65 70 75 80

Glu Ser Lys Ala Lys Lys Leu Glu Glu Glu Val Arg Arg Met Met Asn

85 90 95

Asn Glu Asn Ala Glu Leu Leu Ser Ile Leu Glu Leu Ile Asp Asp Ile

100 105 110

Gln Arg Leu Gly Leu Gly Tyr Arg Phe His Glu Asp Ile Lys Ile Ala

115 120 125

Leu Asp Arg Ile Ser Met Ser Trp Glu Glu Tyr Asp Asp Asp Ala Lys

130 135 140

Glu Glu Asn Lys Leu His Ser Thr Ala Leu Arg Phe Arg Leu Leu Arg

145 150 155 160

Gln Asn Gly Cys His Ile Ser Gln Asp Ile Phe Lys Ile Phe Ile Asp

165 170 175

Gln Glu Gly Asn Tyr Met Glu Tyr Leu Lys Lys Asp Val Lys Gly Leu

180 185 190

Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ser Tyr Leu Ala Phe Glu Gly Glu Lys Leu

195 200 205

Leu Asp Glu Ala Lys Thr Phe Ser Leu Thr His Leu Thr Gln Leu Asn

210 215 220

Arg Lys Ile Asp Pro Ile Met Ser Asp Leu Val Thr His Ala Leu Glu

225 230 235 240

Asn Pro Leu His His Arg Leu Gln Arg Leu Glu Ala Arg Trp Tyr Ile

245 250 255

Glu Val Tyr Ser Lys Arg Asn Asp Ala Asn His Ser Leu Leu Glu Phe

260 265 270

Ala Arg Leu Asp Phe Asn Arg Val Gln Leu Ile Tyr Lys Lys Asp Leu

275 280 285

Lys Asp Leu Ser Arg Trp Trp Lys Glu Ile Asp Leu Ala Ser Lys Val

290 295 300

Lys Phe Ala Arg Asp Arg Leu Met Glu Cys Phe Phe Trp Thr Ile Gly

305 310 315 320

Met Ile Pro Asp Pro Gln Ser Asn Asn Cys Arg Lys Gly Leu Thr Lys

325 330 335

Val Val Ser Leu Ile Thr Ile Leu Asp Asp Val Tyr Asp Leu His Gly

340 345 350

Ser Leu Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Asn Ala Val Glu Arg Trp Asp

355 360 365

Ile Asn Cys Val Asn Gln Leu Pro Asn Tyr Met Lys Leu Cys Phe Leu

370 375 380

Ala Leu Tyr Asn Ser Val Asn Glu Met Gly Tyr Asp Thr Leu Lys Glu

385 390 395 400

Gln Gly Val Asn Ile Ile Pro Ser Leu Thr Lys Ala Trp Leu Asp Leu

405 410 415

Cys Lys Ala Phe Leu Glu Glu Ala Lys Trp Ser Tyr Asn Lys Tyr Thr

420 425 430

Pro Thr Phe Glu Glu Tyr Leu His Tyr Ala Trp Leu Ser Ser Ser Gly

435 440 445

Thr Leu Leu Leu Val His Ser Tyr Phe Leu Phe Asn Gln Gly Ile Thr

450 455 460

Asp Glu Ala Leu Asp Ser Leu Glu Lys Tyr His Asn Leu Cys Arg Arg

465 470 475 480

Pro Ser Val Ile Phe Arg Leu Tyr Asn Asp Leu Ser Thr Phe Lys Ala

485 490 495

Glu Glu Glu Arg Gly Glu Thr Ala Ser Ser Ile Leu Cys Tyr Met Gln

500 505 510

Glu Arg Gly Leu Ser Glu Glu Ile Ala Arg Glu Asp Ile Lys Lys Leu

515 520 525

Ile Glu Lys Asn Trp Arg Gln Met Asn Lys Glu Val Ser Glu Lys His

530 535 540

Pro Phe Ser Gln Ala Phe Val Glu Thr Val Ile His Leu Ala Arg Thr

545 550 555 560

Ala His Cys Thr Tyr Gln Asn Gly Asp Gly His Gly His Pro Asp Ala

565 570 575

Arg Ile Lys Lys Arg Ile Leu Ser Val Ile Ile Asp Pro Ile

580 585 590

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggcagcc atatggcact acatctctct ag 32

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggtggtgc tcgagttaaa tgggatcaat tattac 36

Claims

1.一种杧果萜烯合成酶基因TPS1，其特征是：它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种杧果萜烯合成酶TPS1，其特征是：它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1所述杧果萜烯合成酶基因TPS1的制备方法，其特征是包括以下步骤：将红象牙杧果果肉的总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对进行PCR扩增获得。

4.一种重组表达载体，其特征是：包括权利要求1所述的杧果萜烯合成酶基因TPS1和表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征是：所述表达载体为pET28a。

6.一种重组表达工程菌，其特征是：将权利要求1所述杧果萜烯合成酶基因TPS1构建到表达载体pET28a上，用所得重组表达载体转化BL21(DE3)，筛选阳性菌株构建大肠杆菌工程菌，得到重组表达工程菌。

7.一种重组杧果萜烯合成酶TPS1，其特征是：包括用权利要求5所述的重组表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得杧果重组萜烯合成酶TPS1。

8.权利要求1所述的杧果萜烯合成酶基因TPS1、权利要求2所述的杧果萜烯合成酶TPS1、权利要求4所述重组表达载体、权利要求6所述重组表达工程菌或权利要求7所述的重组杧果萜烯合成酶TPS1在调控牻牛儿基二磷酸GPP或橙花二磷酸NPP合成萜类化合物方面的应用。